用于珊瑚养殖的抗ROS益生菌、菌剂筛选和使用方法及应用

用于珊瑚养殖的抗ros益生菌、菌剂筛选和使用方法及应用
技术领域
1.本发明涉及海洋益生菌剂技术领域，具体为一种用于珊瑚养殖的抗ros益生菌，还涉及一种用于珊瑚养殖的抗ros益生菌菌剂的筛选方法、一种用于珊瑚养殖的抗ros益生菌菌剂的使用方法和一种用于珊瑚养殖的抗ros益生菌菌剂的运用。


背景技术：

2.活性氧(reactive oxygen species,ros)是体内一类氧的单电子还原产物，概括的说是指机体内或者自然环境中由氧组成,含氧并且性质活泼物质的总称，主要有1种激发态的氧分子(一重态氧分子或称单线态氧分子o2)；3种含氧的自由基(超氧阴离子自由基、羟自由基-oh和氢过氧自由基ho2),2种过氧化物 (过氧化氢h2o2和过氧化脂质rooh)及一种含氮的氧化物no等。
3.珊瑚共生体由珊瑚虫和虫黄藻组成，虫黄藻一旦离开珊瑚，珊瑚虫就会变成白色，然后慢慢死亡，即珊瑚白化。与珊瑚虫共生的虫黄藻利用光照进行光合作用，能够为珊瑚提供高达90％的能源和骨骼生长所需的氧气，虫黄藻不仅稳定的在珊瑚虫体内生长，而且从珊瑚虫体内获得光合作用所需的二氧化碳、氮和磷等植物营养盐。珊瑚虫和虫黄藻这种共生关系不仅清除了珊瑚虫的代谢废物，为珊瑚虫创造了更好的生活环境，同时也为珊瑚生态系统净化海水环境提供了帮助。珊瑚白化现象频发，主要是由于微型海水生态系统自动调节能力弱，加上观赏珊瑚(特别是石珊瑚)自身对海水环境波动很敏感，如缸内温度、水质、光照、ph、水流、营养和离子等参数的波动都有可能导致珊瑚一夜之间“白化”。从生物学的角度来看，珊瑚白化最直接生物学机制是“氧化胁迫”，即当温度升高或光照辐射增强会导致共生藻的光合系统受损，而产生过量的ros自由基，并泄露到了宿主细胞内造成ros损伤，导致机体免疫力下降引发白化和病害。大部分观赏生物生长需要光合作用，在一定程度上说海缸系统中的“氧化胁迫”状态不可避免。如何有效防止珊瑚白化，目前还没有很好的方法。研究发现，通过微生态制剂技术快速有效降低海缸系统的ros自由基水平，实现海洋观赏生物ros平衡的稳态控制，是目前海洋微生态制剂面临的一大技术瓶颈。
4.珊瑚共生体在长期的进化中获得了一套特殊的抵抗环境变化、白化和病虫害等逆境机制—dmsp(二甲基硫丙酸)代谢活性物质，包括dms(丙二酸二甲酯)、aa(丙烯酸)、dmso(二甲基亚砜)、tda(间甲苯二胺)和其他化合物等，其活性物质在抵抗白化、抗菌性、后天免疫与非生物胁迫具有重要的作用。然而，目前海洋水族市场中还未有以dmsp代谢活性物质为基础开发的微生态制剂。
5.由于dmsp可与ros迅速反应被认为是破坏自由基的有效细胞清除剂，而且dmsp的分解产物dms和丙烯酸酯在实验室条件下比dmsp反应性更强,其氧化效率可高出20～60倍，这三种化合物合构成一种非常有效的抗氧化系统。本发明针对珊瑚的白化问题，基于dmsp活性微生物群在抗ros方面展现的巨大潜力，得到一种用于珊瑚养殖的抗ros益生菌、菌剂筛选和使用方法及应用，通过运用微生态制剂以提高海洋生物具备抗氧化能力的益生菌群活跃度，构建和培养珊瑚共生体的抗氧化功能系统，降低珊瑚水体的过氧化物水平，提高珊
瑚共生体的免疫力和抗逆潜力，改善海缸海水环境品质，降低珊瑚的白化和病害风险。


技术实现要素：

6.本发明意在提供一种用于珊瑚养殖的抗ros益生菌、菌剂筛选和使用方法及应用，以解决现有技术海缸内的珊瑚容易白化和病害的问题。
7.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
8.用于珊瑚养殖的抗ros益生菌，所述抗ros益生菌由a短波单胞菌属菌株d6菌体、终浓度不低于1
×
10
12
细胞/毫升的虫黄藻d型、终浓度不低于 1
×
108细胞/毫升的dmsp/dms/aa、维生素、氨基酸、微量元素、cacl2和人工海水组成；所述短波单胞菌株d6由中国丛生盔形珊瑚组织分离得到，于2021 年3月18日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国普通微生物保藏管理中心cgmcc，保存人为中国科学院微生物研究所，保藏菌号为cgmcc no.：22031。
9.进一步地，所述短波单胞菌株d6的培养温度为25～28℃，盐度为30～ 35
‰
。
10.进一步地，所述短波单胞菌株d6的培养ph值为7.85～8.45。
11.用于珊瑚养殖的抗ros益生菌菌剂的筛选方法，利用dmsp活性微生物筛选得到上述的用于珊瑚养殖的抗ros益生菌，包括以下步骤：
12.s1、dmsp代谢活性细菌的分离、纯化及鉴定：通过对观赏硬骨和软体珊瑚组织、骨骼及海水中内源细菌进行原位培养，以mams和masw基础培养基进行改良，利用dmsp或dms或aa作为唯一碳源，培养、分离和纯化dmsp 代谢活性细菌，并对纯化所得细菌的16s-rdna片段进行pcr扩增，通过序列比对分析结合形态学分析进行菌种鉴定；
13.s2、微生物的性状筛选和功能分析：利用pcr的方法对上述分离的菌株的 dmsp降解和氮循环功能基因进行扩增，筛选出具有硫循环和氮循环的代谢潜力的内源益生细菌；
14.s3、抗ros菌株筛选：现用过氧化氢酶试验筛选阳性具有抗ros菌株潜质的菌株，再用索莱宝过氧化氢酶活性检测试剂盒进行检测进一步筛选和验证具有较高氧化氢酶活性值菌株，最后，短波单胞菌属菌株d6的过氧化氢酶活性表现最强，氧化氢酶活性高达0.3768u/105细胞，并以菌株d6用于珊瑚抗ros菌剂的开发。
15.进一步地，在s2中，dmsp降解得到dmda、dddd、dddl和dddp，氮循环得到nifh和nirk。
16.用于珊瑚养殖的抗ros益生菌的使用方法，包括每100l水体中添加 10ml菌液，使得总活性微生物菌群数量≥5
×
10
10
/l；每10～15天添加一次菌剂，使得水体中菌群数量保持稳定；在4～8℃条件下进行低温储存；有效期6个月；使用前摇匀，使菌群分布均匀。
17.用于珊瑚养殖的抗ros益生菌在海水养殖珊瑚、鱼、虾、贝类养殖中的应用；在珊瑚礁修复中的应用。
18.技术方案的有益效果是：
19.本发明基于dmsp活性微生物群在抗ros方面展现的巨大潜力，制备得到一种用于珊瑚养殖的抗ros益生菌、菌剂筛选和使用方法及应用，通过运用微生态制剂以提高海洋生物具备抗氧化能力的益生菌群活跃度，构建和培养珊瑚共生体的抗氧化功能系统，降低珊瑚水体的过氧化物水平，提高珊瑚共生体的免疫力和抗逆潜力，改善海缸海水环境品质，有效的降低了珊瑚的白化和病害风险，对各类由“氧化胁迫”应激反应引起的各种疾病均具有
治疗和预防的效果。
附图说明
20.图1为本发明实施例2中短波单胞菌株d6的ph敏感性测试曲线图；
21.图2为本发明实施例3中短波单胞菌株d6的活力半衰期测试曲线图；
22.图3为本发明实施例4中制备得到的用于珊瑚养殖的抗ros益生菌菌剂产品的包装图。
具体实施方式
23.下面结合附图和实施方式对本发明作进一步的详细说明：
24.实施例1
25.过氧化氢酶活性测试与菌株筛选
26.本实验用索莱宝过氧化氢酶(cat)活性检测试剂盒进行检测，检测方法步骤如下：
27.(1)粗酶液提取
28.收集纯化三代细菌到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌加入1ml 提取液，超声波破碎细菌(功率20％，超声3s，间隔10s，重复30次)；8000r/min、 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
29.(2)酶标仪预热
30.1、30min以上，调节波长至240nm，蒸馏水调零；
31.2、cat检测工作液的配制：用时在试剂二中加入25ml试剂一，充分混匀，作为工作液；
32.3、测定前将cat检测工作液在25℃水浴10min以上；
33.4、在微量石英比色皿中加入10μl样本和190ul工作液，立即混匀并计时，记录240nm下初始吸光值a1在1min后的吸光值a2。
34.(3)cat活性计算
35.酶活力单位(u)的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化1nmolh2o2降解定义为一个酶活力单位(u)。
36.cat(u/104cell)＝[δa
×v反总
÷
(ε
×
d)
×
109]
÷
(v
样
÷v样总
×
500
÷
t)＝1.529
×
δa
[0037]
δa＝a1-a2
[0038]v反总
：反应体系总体积，2
×
10-4
l；
[0039]
ε：h2o2摩尔消光系数，4.36
×
104l/mol/cm；
[0040]
d：96孔板，光径：0.6cm；
[0041]v样
：加入样本体积，0.01ml；
[0042]v样总
：加入提取液体积，1ml；
[0043]
t：反应时间，1min；
[0044]
500：细菌总数，500万；
[0045]
109：单位换算系数，1mol＝109nmol
[0046]
如表1所示，在筛选出来得75株菌株中，大多数菌株的cat活性值基本介于0.01～
0.03之间，例如交替单胞菌株alteromonas sp.zd22-1(gdmcc 61647) cat值为0.029
±
0.0064，还有些菌株cat活性更是低于0.001u/105。通过筛选短波单胞菌属(brevundimonas.sp)菌株d6的抗氧化能力表现最强，cat活性高达 0.3768u/105，因此筛选短波单胞菌属(brevundimonas.sp)菌株d6用于珊瑚抗ros 菌剂的开发。
[0047]
表1不同菌株的过氧化氢酶活性
[0048]
[0049]
[0050][0051]
注：nd表示低于检测限
[0052]
实施例2
[0053]
如图1所示，短波单胞菌属(brevundimonas.sp)d6菌株的ph敏感性测试
[0054]
准备无菌的50ml锥形瓶，每个锥形瓶分别倒入前期经灭菌，调整好的ph 7.85，ph8.15，ph8.45的zobell 2216e培养基各25ml，接着加入20ul短波单胞菌属(brevundimonas.sp)d6菌株的菌液,充分混匀；接种完成后，放入28℃摇床培养，分别测培养不同时间时在600nm处的吸光度，并记录数据。结果表明，短波单胞菌属(brevundimonas.sp)菌株d6在ph值为7.85的生长状况优于ph8.15 和ph8.45；因此菌株zd71更适合的在酸性的海水条件下生长。
[0055]
实施例3
[0056]
如图2所示，短波单胞菌属(brevundimonas.sp)菌株d6的活力周期测定
[0057]
将短波单胞菌属(brevundimonas.sp)菌株d6培养至平台期，通过离心机进行 6000r/min离心收集菌体，用人工海水(35
‰
)稀释至od600＝1.0的目标浓度菌体，浓度约为1
×
109cfu/ml，并将目标浓度菌体投放至装有灭菌海水的珊瑚缸中。利用atp荧光检测仪检测珊瑚缸中投放的微生物残余浓度，检测频率为2～3天/ 次。atp荧光检测仪基于萤火虫发光原理，利用“荧光素酶—荧光素体系”快速检测三磷酸腺苷(atp)。由于所有生物活细胞中含有恒量的atp，所以atp含量可以清晰地表明样品中微生物的浓度或者生物量，具体操作方法参考仪器使用说明。并设置投放等量的无菌水作为空白对照。
[0058]
实验结果表明，短波单胞菌属(brevundimonas.sp)菌株d6的菌体投放后atp 荧光强度(rlu)均值为170，第22天rlu均值将为90，表明短波单胞菌属 (brevundimonas.sp)菌株d6的活力半衰期为17天，到第25天rlu均值与空白对照接近。为保证短波单胞菌属(brevundimonas.sp)菌株d6的菌体在开发的海水中具备较强的生物活性，基于实验结果设置投放频率为15～20天/周期。短波单胞菌属(brevundimonas.sp)菌株d6的活力周期测定实验将为未来珊瑚抗ros菌剂开发提供数据支持。
[0059]
实施例4
[0060]
珊瑚养殖的抗ros益生菌的配方与使用方法
[0061]
珊瑚养殖的抗ros益生菌的配方主要成分：抗ros活性益生菌—短波单胞菌属(brevundimonas.sp)菌株d6、虫黄藻d型、dmsp/dms/aa、维生素、氨基酸、微量元素、cacl2、人工海水等。如图3所示，设计规格为1升/瓶和500 毫升/瓶两种。
[0062]
具体制备步骤：
[0063]
1)通过离心方法5000～7000转/分钟收集短波单胞菌属(brevundimonas.sp) 菌株d6菌体。
[0064]
2)将盐度为30～35的海水在高温高压条件下灭菌；
[0065]
3)在灭完菌的海水中加入短波单胞菌属(brevundimonas.sp)菌株d6菌体，终浓度不低于1
×
10
12
细胞/毫升、虫黄藻d型，终浓度不低于1
×
108细胞/毫升、dmsp/dms0/aa，终浓度为100～1000μm、多维氨基酸适量、维生素适量、微量元素适量。
[0066]
使用方法：
[0067]
海洋微生态制剂—抗弧菌病原益生菌剂的使用注意事项：
[0068]
1)使用方法：每100l水体中添加10ml菌液，使得总活性微生物菌群数量≥5
×
10
10
/l；
[0069]
2)使用周期：每10～15天添加一次菌剂，使得水体中菌群数量保持稳定；
[0070]
3)储藏条件：应储存在4～8℃条件下进行低温保存；
[0071]
4)有效期：6个月；
[0072]
5)注意使用前需摇匀，使菌群分布均匀。
[0073]
实施例5
[0074]
用于珊瑚养殖的抗ros益生菌菌剂的效果评估
[0075]
a.活性菌引种试验及珊瑚温度胁迫实验
[0076]
设置两种温度(25～26℃和29～30℃)下短波单胞菌属(brevundimonas.sp)菌株d6引种的丛生盔形珊瑚处理实验组进行比较：
[0077]
(1)不接种益生菌对照组；
[0078]
(2)接种益生菌实验组。具体实验步骤：先将上述1～3组处理实验的珊瑚在正常温度25℃下驯化10天，取样品检测分析。随后同时将温度上升至29℃饲养，按第15天和第20天取样品检测分析。实验结果显示：29℃饲养20天后，不接种益生菌对照组出现的珊瑚白化率明显高于接种益生菌实验组。说明短波单胞菌属(brevundimonas.sp)菌株d6具有治疗的预防高温胁迫的作用。
[0079]
b.实验珊瑚的生理及健康指标检测
[0080]
检测上述实验阶段的样品，提取珊瑚组织及海洋样品的dna，通过16s tag 测序分析各实验处理中的珊瑚组织和海水的微生物群落结构变化；取珊瑚组织通过dcfh-da活性氧ros荧光探针，在激光共聚焦显微镜下检测各处理珊瑚 ros水平。实验结果显示在接种益生菌实验组的短波单胞菌属相对丰度明显高于不接种益生菌对照组。不接种益生菌对照组的活性氧ros水平明显高于接种益生菌实验组，说明交短波单胞菌属(brevundimonas.sp)菌株d6具有抗ros作用。
[0081]
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发
明实施的效果和专利的实用性。本技术要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。