一种从Raffaelealauricola中提取对苯二甲酸二丁酯的方法

一种从raffaelea lauricola中提取对苯二甲酸二丁酯的方法
技术领域
1.本发明属于从微生物分离活性物质的技术领域，具体涉及一种从raffaelea lauricola中提取对苯二甲酸二丁酯（1-butyl 4-(2-methylpropyl) 1,4-benzenedicarboxylate）的方法。


背景技术：

2.raffaelea lauricola是食菌小蠹（ambrosia beetle）携带的高致病性伴生真菌，是引起树木枯萎病的病原真菌 ，人们一直在研究其致病机制，随着研究的不断深入，在该属其他菌株中已分离到一些抑制植物生长、抗菌等活性物质。这预示该菌在生物农药或医药上存在很大应用价值。
3.目前，尚未发现从raffaelea lauricola分离1-butyl 4-(2-methylpropyl) 1,4-benzenedicarboxylate的报道。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种从raffaelea lauricola中提取对苯二甲酸二丁酯（1-butyl 4-(2-methylpropyl) 1,4-benzenedicarboxylate）的方法，以促进其进一步在医药领域的研究和开发。
5.为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：一种从raffaelea lauricola中提取对苯二甲酸二丁酯（1-butyl4-(2-methylpropyl) 1,4-benzenedicarboxylate）的方法，包括以下步骤：1)将raffaelea lauricola活化后，取菌块接种到pdb培养基中，在，在140～180 r/min、20~28℃条件下连续培养5~10天，按15wt%~20wt%接种量转接到改良的大米培养基中，继续在20～28℃条件下静置培养28～40天，得到菌丝体。
6.2）将步骤1）得到的菌丝体在室温下干燥后研磨粉碎，用1~2倍体积的乙酸乙酯浸泡12~24小时，超声40~60分钟，收集萃取液，残渣中再加入菌丝体1~2倍体积的乙酸乙酯，超声40~60分钟，收集萃取液，重复以上步骤，共得到三份萃取液合并浓缩得到粗提物浸膏；3）将浸膏用氯仿或二氯甲烷溶解，然后用反相硅胶c
18
进行拌样，干法装柱，以甲醇：水自体积比1:9-9:1梯度洗脱，收集甲醇：水体积比为9:1部分洗脱液，旋蒸浓缩得组分a。
7.4）用1倍体积的氯仿溶解组分a，过200-300 目硅胶柱，石油醚：乙酸乙酯体积比为30:1开始梯度洗脱，收集石油醚：乙酸乙酯体积比为10:1 部分洗脱液，旋蒸浓缩得浸膏，再过200-300目硅胶柱，以石油醚：氯仿体积比为8:1开始梯度洗脱，收集石油醚:氯仿体积比为2:1部分洗脱液，悬蒸得到白色粉末状1-butyl 4-(2-methylpropyl) 1,4-benzenedicarboxylate，其结构式如下：
。
8.进一步地，所述步骤1）中改良的大米培养基：大米100 g，木屑10 g，加入纯水120 ml，121℃高压灭菌20min备用。
9.进一步地，所述步骤1）中接种菌块的大小为0.5
×
0.5 cm，接种量为4块。
10.进一步地，所述步骤2）中超声的功率为400 w，频率为35 khz。
11.进一步地，所述步骤3）中使用的反相硅胶c
18
粒径40-60 μm，孔径120
ꢀå
。
12.进一步地，所述步骤3）中梯度洗脱比例为甲醇：水体积比1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 6:4, 7:3, 8:2, 9:1。
13.进一步地，所述步骤4）中梯度洗脱中石油醚：乙酸乙酯体积比依次为30:1, 20:1, 10:1, 8:1, 6:1, 3:1，石油醚：氯仿体积比依次为8:1, 6:1, 4:1, 2:1。
14.本发明的显著优点：本发明的分离纯化方法简单，成本低，易操作；且制备得到的1-butyl 4-(2-methylpropyl) 1,4-benzenedicarboxylate纯度高，重复性好。
附图说明
15.图1为1-butyl 4-(2-methylpropyl) 1,4-benzenedicarboxylate化合物的1h nmr谱（cdcl3）；图2为1-butyl 4-(2-methylpropyl) 1,4-benzenedicarboxylate化合物的
13
c nmr谱（cdcl3）；图3为1-butyl 4-(2-methylpropyl) 1,4-benzenedicarboxylate化合物的dept135谱（cdcl3）；图4为1-butyl 4-(2-methylpropyl) 1,4-benzenedicarboxylate化合物的cosy谱（cdcl3）；图5为1-butyl 4-(2-methylpropyl) 1,4-benzenedicarboxylate化合物的hmbc谱（cdcl3）；图6为1-butyl 4-(2-methylpropyl) 1,4-benzenedicarboxylate化合物的hsqc谱（cdcl3）。
具体实施方式
16.为让本发明的上述特征和优点能更明显易懂，下文特举实施例，作详细说明。本发明的方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。
17.本发明所使用的raffaelea lauricola菌株编号为hulcr7161。
18.实施例11)取raffaelea lauricola为材料，无菌条件下挑取大小为0.5
×
0.5 cm的菌块4块接种到pdb 培养基（马铃薯葡萄糖粉3.9 g,纯水100 ml,装入250 ml锥形瓶，在121℃高
压下灭菌20 min）中，在160 r/min、25℃条件下连续培养7天即初级培养，按10wt%接种量转接到改良的大米培养基（大米100 g,木屑10 g,加入纯水120 ml，121℃高压灭菌20min）中，继续在25℃条件下静置培养35天即次级培养。
19.2)收集培养35天后得到的菌丝体在室温下干燥之后研磨粉碎，加1倍体积的乙酸乙酯浸泡12小时，超声40分钟，过滤得萃取液，残渣中再次加入菌丝体1倍提及的乙酸乙酯，超声40分钟，收集萃取液，再次重复上述步骤，共得到三份萃取液合并浓缩得到粗提物浸膏。
20.3)将浸膏溶解于氯仿，使用40-60μm粒径反相c
18
硅胶拌样，干法装柱，以甲醇：水自1:9体积比开始梯度洗脱（甲醇：水体积比为1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 6:4, 7:3, 8:2, 9:1），收集甲醇：水体积比9:1部分旋蒸得粗品。
21.4)用1倍体积的氯仿溶解粗品，上200-300目硅胶柱，石油醚：乙酸乙酯体积比为30:1（梯度洗脱比例为30:1, 20:1, 10:1）开始梯度洗脱，收集石油醚：乙酸乙酯体积比为10:1部分洗脱液，旋蒸浓缩得浸膏，再过200-300目硅胶柱，以石油醚：氯仿体积比为8:1开始梯度洗脱（梯度洗脱比例为8:1, 6:1, 4:1, 2:1），收集石油醚:氯仿体积比为2:1部分洗脱液，悬蒸得到白色粉末状1-butyl 4-(2-methylpropyl) 1,4-benzenedicarboxylate。
22.本实施例中，步骤2）中超声的功率为400 w，频率为35 khz；经计算其提取率为0.67%（提取率%=重量/菌丝体浸膏总量
×
100%）。
23.实施例21）取raffaelea lauricola为材料，无菌条件下挑取大小为0.5
×
0.5 cm的菌块4 块接种到pdb 培养基（马铃薯葡萄糖粉3.9 g，纯水100 ml，装入250 ml锥形瓶，在121℃高压下灭菌20 min）中，在140 r/min、20℃条件下连续培养5天即初级培养，按20wt% 接种量转接到改良的大米培养基（大米100 g，木屑10 g，加入纯水120 ml，121℃高压灭菌20 min）中，继续在20℃条件下静置培养25天即次级培养。
24.2) 收集培养25天菌丝体在室温下干燥之后研磨粉碎，加1倍体积的乙酸乙酯浸泡12小时，超声40分钟，过滤得萃取液，残渣中再加入菌丝体1倍体积的乙酸乙酯，超声40分钟，收集萃取液，再次重复上述步骤，共得到三份萃取液合并浓缩得到粗提物浸膏。
25.3) 将浸膏溶解于氯仿，使用40-60 μm粒径反相c
18
硅胶拌样，进行减压粗分，以甲醇：水自1:9体积比开始梯度洗脱（甲醇：水比例为1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 6:4, 7:3, 8:2, 9:1），收集甲醇：水体积比为9:1部分旋蒸得粗品。
26.4) 用1倍体积的氯仿溶解粗品，上200-300目硅胶柱，石油醚：乙酸乙酯体积比为30:1开始梯度洗脱（梯度洗脱比例为30:1, 20:1, 10:1），收集石油醚：乙酸乙酯体积比为10:1部分洗脱液，旋蒸浓缩得浸膏，再过200-300目硅胶柱，以石油醚：氯仿8:1开始梯度洗脱（梯度洗脱比例为8:1, 6:1, 4:1, 2:1），收集石油醚:氯仿体积比2:1部分洗脱液，旋蒸得到白色粉末状1-butyl 4-(2-methylpropyl) 1,4-benzenedicarboxylate。
27.本实施例中，步骤2）中超声的功率为400 w，频率为35 khz；经计算其提取率为0.72%（提取率%=重量/菌丝体浸膏总量
×
100%）。
28.实施例31）取raffaelea lauricola为材料，无菌条件下挑取大小为0.5
×
0.5 cm的菌块4 块接种到pdb 培养基（马铃薯葡萄糖粉3.9 g,纯水100 ml，装入250 ml锥形瓶，在121℃高
压下灭菌20min）中，在180 r/min、28℃条件下连续培养10天即初级培养，按25wt% 接种量转接到改良的大米培养基（大米100 g，木屑10 g，加入纯水120 ml，121℃高压灭菌20 min）中，继续在28℃条件下静置培养40天即次级培养。
29.2) 收集培养40天菌丝体在室温下干燥之后研磨粉碎，加1倍体积的乙酸乙酯浸泡12小时，超声90分钟，过滤得萃取液，残渣中再加入菌丝体1倍体积的乙酸乙酯，超声90分钟，收集萃取液，再次重复上述步骤，共得到三份萃取液合并浓缩得到粗提物浸膏。
30.3) 将浸膏溶解于氯仿，使用40-60 μm粒径反相c
18
硅胶拌样，干法装柱，以甲醇：水自1:9体积比开始梯度洗脱（甲醇：水比例为1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 6:4, 7:3, 8:2, 9:1），收集甲醇：水体积比为9：1部分旋蒸得粗品。
31.4) 用1倍体积的氯仿溶解粗品，上200-300目硅胶柱，石油醚：乙酸乙酯体积比为30:1开始梯度洗脱（梯度洗脱比例为30:1, 20:1, 10:1），收集石油醚：乙酸乙酯体积比为10:1部分洗脱液，旋蒸浓缩得浸膏，再过200-300目硅胶柱，以石油醚：氯仿体积比为8:1开始梯度洗脱（梯度洗脱比例为8:1, 6:1, 4:1, 2:1），收集石油醚:氯仿体积比为2:1部分洗脱液，悬蒸得到白色粉末状1-butyl 4-(2-methylpropyl) 1,4-benzenedicarboxylate。
32.本实施例中，步骤2）中超声的功率为400 w，频率为35 khz；经计算其提取率为0.74%（提取率%=重量/菌丝体浸膏总量
×
100%）。
33.以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。