哺乳动物细胞中非天然氨基酸掺入的增强平台的制作方法

哺乳动物细胞中非天然氨基酸掺入的增强平台
1.相关应用
2.本技术根据35u.s.c.
§
119(e)，主张2019年6月21日提交的美国临时申请第62/864,570号的权益，其全部内容通过引用纳入本文。
3.政府支持
4.本发明是在美国国立卫生研究院授予的r01 gm132471和美国国家科学基金会授予的che1900375的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。
5.ascii文本文件中的材料通过引用纳入
6.本技术通过引用将包含在以下ascii文本文件中的序列表纳入：
7.文件名：0342_0008wo1_sl.txt；创建于2020年6月19日，大小为17,574字节。
技术领域
8.本发明涉及生物技术领域，专注于开发用于在哺乳动物细胞中位点特异性地掺入非天然氨基酸表达蛋白质的有效平台。


背景技术：

9.非天然氨基酸(uaas)的位点特异性掺入对于探索和改造哺乳动物细胞的生物学具有很大的潜力。该技术的核心是无义抑制性氨酰-trna合成酶(aars)/trna对，它被改造成使目标uaa不与其任何宿主对应物发生交叉反应。这种“正交”的aars/trna对通常是从不同的生命领域输入到宿主细胞中的。异源阻抑型trna在新宿主中的性能通常不是最佳的，考虑到它必须直接与非天然翻译系统相互作用。事实上，一些研究已经证实，哺乳动物细胞中的uaa掺入效率受到异源阻抑型trna性能不佳的限制，必须大量过表达以获得可接受的uaa掺入效率。虽然这种高水平的trna表达可以通过在展现出高转染效率的特定哺乳动物细胞系中进行瞬时转染来实现，但在难以转染的细胞(例如原代细胞、神经元、干细胞等)中这样做具有挑战性。此外，它使生成稳定的抑制细胞系(从基因组表达改造的aars/trna)变得非常具有挑战性，因为必须将数百个trna基因拷贝插入基因组中以达到足够的无义抑制/uaa掺入效率。克服阻抑型trna性能不佳的能力将显著提高uaa诱变技术的稳健性，促进高级应用，例如轻松生成能够掺入uaa的稳定抑制细胞系以及在同一蛋白质的多个位点同时掺入uaas。


技术实现要素：

10.trna性能不佳的原因通常不清楚，这使得通过合理设计解决较差的性能具有挑战性。然而，改进的正交阻抑型trna经常通过定向进化生成，以用于大肠杆菌中的uaa掺入，已经开发出巧妙的选择系统，从大型合成库中轻松富集活性但正交的阻抑型trna突变体。在哺乳动物细胞中进行类似trna进化的能力具有创建改进抑制系统的巨大潜力，但目前没有合适的平台可用。在哺乳动物细胞中进行此类定向进化实验很重要，以确保根据它们与独特哺乳动物翻译系统的改进的相互作用来选择trna突变体。
11.哺乳动物细胞中现有的定向进化策略几乎完全依赖于靶基因在细胞系中的稳定整合，然后通过非靶向或靶向随机诱变产生序列多样性。相关的低诱变频率不适合trna进化，因为它的尺寸很小(《100bp)。此外，为了成功进化trna的干区(这是改造最常见的靶标)，任何突变都必须伴随另一侧的匹配突变，以保持碱基配对。只有使用合成的位点饱和突变库才能在小trna基因中捕获如此丰富的序列多样性。为了从此类库中富集在哺乳动物细胞中具有正交性和活性的阻抑型trna变体，有必要具有：i)库的受控递送，以便每个细胞接收单个变体；ii)富集活性trna突变体并去除交叉反应突变体的选择方案；iii)识别存活的突变体的能力。目前不存在符合这些标准的选择系统。
12.本文描述的是包含变体/突变无义阻抑型trna分子(本文中也称为阻抑型trna(suppressor trna))的组合物，其具有相对于相应野生型阻抑型trna分子增加的生物活性以将非天然氨基酸(uaa或uaa)掺入哺乳动物蛋白质；编码这些变体trna的表达载体(例如病毒载体)，其中载体适合感染哺乳动物细胞；包含这些表达载体(例如病毒载体)的哺乳动物细胞；使用本文所述的病毒辅助定向进化方法产生具有增加的生物活性的阻抑型trna的方法；使用这些具有增加的活性的trna来生产具有位点特异性掺入的非天然氨基酸的蛋白质的方法，以及含有包含变体trna的试剂和生产此类蛋白质所需的其他试剂的试剂盒。
13.特别地，本发明的组合物包含例如变体古细菌或细菌无义阻抑型trna分子，其中正交的活性变体trna相对于其“野生型”对应物阻抑型trna具有增加的活性以将各种非天然氨基酸(例如氨基酸类似物)掺入哺乳动物蛋白质。如本文所用，术语“野生型”对应物trna是指阻抑型trna分子，其尚未经过本文所述的病毒辅助定向进化方法以产生(选择和富集)具有增加的生物活性以以位点特异性方式将uaa掺入目标蛋白质的阻抑型trna分子群。
14.本发明涵盖的变体trna的活性比野生型trna增加例如约2.5至约200倍、约2.5至约150倍、约2.5至约100倍、约2.5至约80倍、约2.5至约60倍、约2.5至约40倍、约2.5至约20倍、约2.5至约10倍、约2.5至约5倍、约5至约200倍、约5至约150倍、约5至约100倍、约5至约80倍、约5至约60倍、约5至约40倍、约5至约20倍、约5至约10倍、约10至约200倍、约10倍至约150倍、约10至约100倍、约10至约80倍、约10至约60倍、约10至约40倍、约10至约20倍、约20至约200倍、约20至约150倍、约20至约100倍、约20至约80倍、约20至约60倍、约20至约40倍、约40至约200倍、约40至约150倍、约40至约100倍、约40至约80倍、约40至约60倍、约60至约200倍、约60至约150倍、约60至约100倍、约60至约80倍，约80至约200倍、约80至约150倍、约80至约100倍、约100至约200倍、约100至约150倍或约150至约200倍。
15.变体古细菌trna分子源自，例如，甲烷八叠球菌(methanosarcinacaea)或脱亚硫酸菌(desulfitobacterium)科，特别是源自巴氏甲烷八叠球菌(m.barkeri)(mb)、m.alvus(ma)、马氏甲烷八叠球菌(m.mazei)(mm)或d.hafnisense(dh)科中的任何一种。具体地，要求保护的发明涵盖变体trna，其是源自seq id no:1的吡咯赖氨酰trna(trna
pyl
)或与如表1所示变体trna分子的全长seq id no:2-27中的任何一种具有至少约80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的核酸序列。更具体地，在某些实施方案中，变体trna
pyl
包含选自由以下组成的组的序列：seq id no:2-27，或与全长seq id no:2-27具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的核酸序列。在某
些实施方案中，trna
pyl
包含相对于seq id no:1-27中的任何一种的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或超过10个突变(例如，取代)。适合被本文所述的变体古细菌衍生的trna掺入的非天然氨基酸可以是叠氮基赖氨酸(azk)(图18的结构1)或nε-乙酰赖氨酸(ack)(图18的结构2)，或任何其他赖氨酰类似物，例如图18中所示的结构3-6。此外，如本文所述(参见例如实施例9，(图19))，使用改造的吡咯赖氨酰-trna合成酶的任何其他uaa的掺入效率也可以通过使用这些改造的trna
pyl
突变体来增强。
16.本发明的变体细菌trna分子来源于，例如，大肠杆菌(e.coli)trna。具体地，要求保护的发明涵盖变体trna，其是来源于seq id no:28的亮氨酰trna(trna
leu
)。具体地，在某些实施方案中，变体trna
leu
包含seq id no:29-45中的任何一种，或与全长seq id no:29-45中的任何一种具有至少约80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的核酸序列。在某些实施方案中，trna
leu
包含相对于seq id no：28-45中的任何一种的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或超过10个突变(例如，取代)。任何合适的非天然氨基酸/类似物都可以与本文所述的方法一起使用以掺入目标蛋白质中。特别地，适合被本文所述的变体细菌衍生的trna掺入的非天然氨基酸可以是图18中所示的结构7-12，或在结构和功能上类似于结构7-12的uaas。此外，如本文所述(参见例如图19)，使用改造的大肠杆菌亮氨酰-trna合成酶的任何其他uaa的掺入效率也可以通过使用这些改造的trna
leu
突变体来增强。
17.本发明还涵盖包含变体古细菌或细菌阻抑型trna的表达载体(例如，病毒载体)，其中变体trna相对于如本文所述的其野生型对应物trna具有将非天然氨基酸掺入哺乳动物蛋白质的增加的活性。适用于本发明的病毒包括与哺乳动物细胞基因组整合或不整合的任何病毒。此类病毒包括腺病毒、腺伴随病毒、杆状病毒、慢病毒和逆转录病毒。更具体地，如本文所述，腺伴随病毒的任何血清型均可以用于本发明，特别是腺伴随病毒血清型2。本发明的表达载体(例如，病毒载体)还可以编码报告基因，例如mcherry、gfp或egfp或其他合适的检测分子。
18.本发明还涵盖一种细胞或包含本文所述的表达载体(例如病毒载体)的细胞，以及这些细胞的稳定细胞系。在特定的实施方案中，细胞是哺乳动物细胞，并且稳定的哺乳动物细胞包含基因组整合(或游离保持)的改造的trna。
19.本发明的细胞还可以包含一种或多种额外的表达载体(例如，质粒)，其编码病毒载体在细胞中的病毒复制所需的基因。更具体地，本发明的细胞可包含编码病毒复制所必需的所有遗传成分的表达载体(例如，质粒)，其中将无义密码子插入蛋白质序列中，使得病毒复制依赖于变体阻抑型trna的活性。
20.在一个实施方案中，必需病毒蛋白可以是无包膜病毒的vp1衣壳蛋白(cap)，例如腺伴随病毒aav2 seq no:46，或包含与seq id no:46具有约80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。阻抑密码子可以在选定位点插入衣壳蛋白(例如，tag-琥珀(amber)；taa-赭石(ochre)或tga-乳白(opal))中(agnew.chem.int.ed.2016,55,10645；agnew.chem.int.ed 2017,56,4234)。如本文所述，腺伴随病毒的必需病毒蛋白可以是在位置454处具有tag密码子的cap。可以在同源uaa rna合成酶(uaars)和uaa存在下培养细胞。在一个实施方案中，uaars是例如mb
pyl
rs并且uaa是例如azk或ack。在另一个实施方案中，变体trna是大肠杆菌亮氨酰
trna(trna
leu
)，aars是大肠杆菌leurs并且uaa是亮氨酸类似物，例如图18所示。
21.本发明还涵盖阻抑型trna变体的病毒辅助定向进化的方法，该变体相对于野生型阻抑型trna具有增加的生物活性。病毒在哺乳动物细胞中的复制需要表达依赖于目标trna变体活性的必需蛋白质。
22.该方法包括在病毒基因组中编码目标阻抑型trna变体库的步骤；用病毒载体以低感染复数(moi)感染哺乳动物宿主细胞群，并在适合细胞中病毒复制的条件下维持细胞群，其中哺乳动物细胞中的病毒复制需要表达依赖于目标trna变体的活性的必需蛋白质；收获并选择性扩增编码活性trna变体的病毒后代，以去除交叉反应性trna分子，从而回收具有增加的生物活性的正交阻抑型trna变体。然后可以对扩增的trna变体进行测序以确定它们的核酸序列并进行进一步评估。可以在选择之前和之后对病毒编码的trna库进行下一代测序，以确定库中每个可能的突变体的富集。这种富集因子可以作为trna活性的指标，并且可以构建和测试最富集的trna突变体来验证它们的活性。在某些实施方案中，所公开的方法所预期的方法导致编码活性trna的病毒比携带无活性trna的病毒富集10,000-30,000的20,000-30,000倍。
23.在更具体的实施方案中，如本文所述，将目标无义阻抑型trna的序列随机化以创建库并在合适的表达载体(例如，病毒载体)中编码。trna变体库将包含无活性的trna分子、活性和正交的trna分子以及有活性但具有交叉反应性的trna分子。
24.某些预期的方法包括使用感受态宿主细胞群。这种细胞通常是哺乳动物细胞，更具体地说是永生化的人类细胞。合适的宿主细胞可以以非常低到低的感染复数(moi)来感染病毒载体。在某些实施方案中，moi为约0.1至约15、约0.1至约10、约0.1至约5、约0.1至约3、约0.1至约1、约1至约15、约1至约10、约1至约5、约1至约3、约3至约15、约3至约10、约3至约5、约5至约15、约5至约10或约10至约15。在某些实施方案中，moi在0.1和5之间。在某些实施方案中，moi小于15、小于10、小于5、小于3、小于1或小于0.1。在某些实施方案中，编码变体trna的单一病毒载体是在细胞中表达必需病毒蛋白质和产生病毒后代所需的全部。更具体地，每个细胞接收单个病毒编码的trna变体。
25.随后(通常在病毒感染的几小时内)用一种或多种表达载体(例如质粒)转染细胞，其中表达载体(例如质粒)包含病毒复制所必需的所有遗传成分，其中无义密码子被插入到蛋白质序列中，使得病毒复制依赖于变体阻抑型trna的活性。在一个实施方案中，必需病毒蛋白质是在位置454具有tag密码子的cap(seq id no:46)。在某些实施方案中，表达载体(例如，质粒)还编码同源uaa rna合成酶(uaars)。例如，其中trna库是吡咯赖氨酰trna(trna
pyl
)库，uaars是mb
pyl
rs。转染时，也可以在培养基中加入适当浓度的uaa。在特定的实施方案中，uaa是azk。或者，变体trna是亮氨酰trna(trna
leu
)，aars是大肠杆菌
leu
rs并且uaa是azk，或图18的结构7-12中的任何一种。编码病毒复制所需遗传成分的额外表达载体(例如，质粒)也可以如本文所述转染到宿主细胞中。
26.在预期的方法中，在适合变体trna表达、必需病毒蛋白质表达和病毒复制的条件下，将感染/转染的细胞维持(即，培养)在含有uaa的培养基中。在某些实施方案中，收获细胞，分离病毒后代并进行进一步富集以去除具有交叉反应性但有活性的trna分子，并回收具有增加的生物活性的正交阻抑型trna变体。可以对富集的trna变体进行测序以获得它们的核酸序列。可以在选择前后对病毒编码的trna库进行下一代dna测序，以测量每个trna突
变体的丰度以及它们在选择时的变化情况。在选择时经历最强富集的trna突变体是可能具有最高活性的突变体。
27.在本发明的方法中，只有活性和正交的trna变体允许将uaa掺入到细胞中的必需病毒基因蛋白质以及病毒复制中。然而，在某些实施方案中，包含活性、交叉反应性trna的病毒也可以复制，因此需要额外的步骤来去除编码交叉反应性trna的病毒种群并富集编码所需trna的病毒种群。分离出的病毒后代可以富集具有增加的生物活性的trna变体。例如，分离的病毒后代可以通过光可切割部分如光可切割接头用连接的纯化手柄/标签来进行化学选择性标记。在一个实施方案中，该部分是光可切割的dbco-磺基-生物素缀合物。反应混合物含有掺入uaa蛋白的病毒、不含uaa蛋白的病毒、光可切割的生物素标记和作为淬灭剂的过量uaa。使用链霉素包被珠回收生物素缀合物标记的病毒，并使用合适的波长(例如365nm)从珠上洗脱病毒。回收的病毒粒子包含目标阻抑型trna，所述目标阻抑型trna具有相对于野生型阻抑型trna增加的生物活性。
28.可以裂解回收的病毒，扩增trna，然后测序以获得它们的核酸序列。或者，可以裂解回收的病毒，使用合适的载体如上所述扩增和克隆trna。然后可以选择菌落进行测序以获得目标阻抑型trna的核酸序列。此外，可以在选择之前和之后对病毒编码的trna库进行下一代dna测序(例如illumina)，以测量每个trna突变体的丰度以及它们在选择时的变化。在选择时经历最强富集的trna突变体是可能具有最高活性的突变体。然后可以构建并测试鉴定的突变体。
29.本发明进一步涵盖在哺乳动物细胞中生产目标蛋白质的方法，所述目标蛋白质在蛋白质的特定位置具有一个或多个氨基酸类似物。在一个实施方案中，该方法的步骤包括在适合生长的条件下在培养基中培养哺乳动物细胞，其中该细胞包含编码具有一个或多个选择密码子的蛋白质的核酸并且该细胞还包含变体古细菌衍生的吡咯赖氨酰trna，其具有增强的生物活性，识别选择密码子及其同源氨酰-rna合成酶。在适合于响应选择密码子将一种或多种赖氨酸类似物掺入蛋白质的条件下，细胞培养基可与一种或多种赖氨酸类似物接触(以适当的浓度添加)，从而产生具有一种或多种赖氨酸类似物的目标蛋白质(所需蛋白质)。
30.在一个实施方案中，变体trna是源自seq id no:1的吡咯赖氨酰trna(trna
pyl
)，或与任何全长seq id no:2-27具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的核酸序列。在特定实施方案中，变体trna
pyl
包含选自由以下组成的组的序列：seq id no:2-27，或与全长seq id no:2-27具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的核酸序列。赖氨酸类似物可以是任何赖氨酸类似物，特别是叠氮赖氨酸(azk)或乙酰赖氨酸(ack)或图18的结构3-6中的任何一种。此外，如实施例9(图19)中所述，使用改造的吡咯赖氨酰trna合成酶的任何其他uaa的掺入效率也可以通过使用这些改造的trna
pyl
突变体来增强。
31.在该方法的另一个实施方案中，变体阻抑型trna是具有增加的生物活性的大肠杆菌衍生的亮氨酰trna，其识别选择密码子及其同源氨基酰基-rna合成酶并响应选择密码子向目标蛋白质中掺入一种或多种亮氨酸类似物，从而产生具有一种或多种亮氨酸类似物的蛋白质。在一个实施方案中，变体trna是源自seq id no:28的亮氨酰trna(trna
leu
)。在特定
实施方案中，变体trna
leu
包含seq id no:29-45或与全长seq id no：29-45中的任何一种具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的核酸序列中的任何一种。适合由本文所述的变体细菌衍生的trna掺入的非天然氨基酸可以是图18中所示的结构7-12。此外，如实施例9中所述(图19)，使用改造的大肠杆菌亮氨酰trna合成酶的任何其他uaa的掺入效率也可以通过使用这些改造的trna
leu
突变体来增强。
32.本发明的方法还涵盖将一个或多个叠氮基赖氨酸(azk)或乙酰赖氨酸(ack)残基位点特异性地掺入细胞中的蛋白质或肽的方法，该方法包括在适合生长的条件下在培养基中培养细胞，其中细胞包含编码目标蛋白质或肽的核酸，在蛋白质或肽的特定位点具有一个或多个琥珀、赭石或乳白选择密码子，其中所述细胞进一步包含具有增加的识别选择密码子的生物活性的变体古细菌衍生的吡咯赖氨酰-trna
pyl
，并且进一步包含古细菌pyl-trna合成酶。然后可以在适合将一个或多个azk或ack残基在选择密码子的一个或多个位点掺入蛋白质或肽中的条件下，使细胞培养基与一个或多个azk或ack残基接触，从而产生具有一个或多个位点特异性掺入的azk或ack残基的目标蛋白质或肽。
33.在一个实施方案中，变体吡咯赖氨酰trna(trna
pyl
)源自seq id no:1。例如，变体trna
pyl
包含选自由以下组成的组的序列：seq id no:2-27，或与全长seq id no:2-27中的任何一种具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的核酸序列。还参见，例如，图18，结构1-6。
34.在另一个实施方案中，该方法将一个或多个亮氨酸类似物残基位点特异性地掺入细胞中的蛋白质或肽中，其中该细胞包含具有增加的识别选择密码子的生物活性的变体大肠杆菌衍生的trna
leu
，并且进一步包含大肠杆菌leu-trna合成酶。在适合将一种或多种亮氨酸类似物残基在选择密码子位点掺入蛋白质或肽的条件下，可以使细胞培养基与一种或多种亮氨酸类似物残基接触，从而产生具有一个或多个位点特异性掺入的亮氨酸类似物残基的目标蛋白质或肽。
35.具体地，在某些实施方案中，变体trna是源自seq id no:28的亮氨酰trna(trna
leu
)。例如，变体trna
leu
包含seq id no:29-45或与全长seq id no：29-45中的任何一种具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列中的任何一种。适合由本文所述的变体细菌衍生的trna掺入的非天然氨基酸可以是图18中所示的结构7-12。此外，如实施例9(图19)中所述，使用改造的大肠杆菌亮氨酰trna合成酶的任何其他uaa的掺入效率也可以通过使用这些改造的trna
leu
突变体来增强。
36.本发明还涵盖用于在细胞中生产目标蛋白质或肽的试剂盒，其中蛋白质或肽包含一种或多种赖氨酸类似物，该试剂盒包含含有编码变体古细菌衍生的trna
pyl
的多核苷酸序列的容器，该变体古细菌衍生的trna
pyl
具有识别细胞中目标核酸中的选择密码子的增强的生物活性。具体地，在某些实施方案中，变体trna
pyl
包含选自由以下组成的组的序列：seq id no：2-27(参见例如图18，结构1-6)，或与全长seq id no：2-27中的任何一种具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的核酸序列。该试剂盒还可包括含有编码古细菌pyl-trna合成酶的核苷酸序列的容器。该试剂盒还可以包含一种或多种赖氨酸类似物，例如叠氮赖氨酸(azk)或乙
酰赖氨酸(ack)。该试剂盒还可以包括用于生产目标蛋白质或肽的说明书。
37.在备选实施方案中，该试剂盒涉及在细胞中生产目标蛋白质或肽，其中该蛋白质或肽包含一种或多种亮氨酸类似物，该试剂盒包含含有编码变体大肠杆菌衍生的trna
leu
的多核苷酸序列的容器，该变体大肠杆菌衍生的trna
leu
具有识别细胞中目标核酸中的选择密码子的增加的生物活性，其中变体trna
leu
包含seq id no:29-45，或与全长seq id no:29-45中的任何一种具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列中的任何一种。该试剂盒还可包含含有编码大肠杆菌leu-trna合成酶的多核苷酸序列和一种或多种亮氨酸类似物(例如图18中的结构7-12)的容器。该试剂盒可以包括用于生产目标蛋白质或肽的说明书。
38.本发明还涵盖具有用于uaa掺入的、稳定整合的变体trna-pyl或trna-leu的哺乳动物细胞。在一个实施方案中，哺乳动物细胞包含变体trna-pyl-leu，其中变体trna-pyl-leu的序列选自由seq id no:2-27组成的组，并且其中uaa是选自由结构1-7中的任何一种组成的组的吡咯赖氨酰残基。在另一个实施方案中，细胞包含变体trna-leu，其选自由seq id no：29-45组成的组并且uaa是选自由结构7-12中的任何一种组成的组的亮氨酸类似物。
39.更具体地，本文涵盖改造的哺乳动物细胞，其包含少于250、200、150、100、75、50个拷贝的编码变体阻抑型trna的基因，所述变体阻抑型trna能够将非天然氨基酸掺入在细胞中表达的预选蛋白质中(例如，由含有过早终止密码子的基因表达的蛋白质)。预期细胞可包含25-250、25-200、25-150、25-100、25-75、25-50、50-250、50-200、50-150、50-100、50-75、75-250、75-200、75-150、75-100、100-250、100-200、100-150个拷贝的编码阻抑型trna的基因。鉴于使用vader方法开发的变体trna将氨基酸掺入靶蛋白的效率增加，因此与野生型trna相比，需要将更少的trna引入细胞以获得所需的蛋白质表达水平。预计引入细胞的外源trna数量越少，对宿主细胞的结构、功能或活力的破坏性作用就越小。
40.本发明示出了本领域普通技术人员在阅读所附详细说明后将变得显而易见的特征和优点。
41.现在将参照附图更具体地描述并在权利要求中指出本发明的上述和其他特征，包括构建的各种新颖细节和部件的组合以及其他优点。应当理解，体现本发明的特定方法和设备是通过说明的方式示出的，而不是作为对本发明的限制。在不脱离本发明的范围的情况下，本发明的原理和特征可以用于各种多种不同的实施方案中。
附图说明
42.在附图中，在不同的视图中，附图标记指代相同的部件。附图不一定按比例；相反，重点放在说明本发明的原理上。专利或申请文件至少含有一张彩色绘图。本专利或专利申请出版物的带有彩色附图的副本将根据要求并支付必要的费用后由专利局提供。附图中：
43.图1a-b示出了vader选择方案。a，哺乳动物细胞以低moi感染编码trna库的aav2。编码cap的tag突变体、aav复制所需的其他遗传成分和同源aars的质粒通过在合适的叠氮基-uaa存在下通过转染反式提供。活性和正交trna突变体促进了将uaa掺入到其衣壳中的包装的子代aav2的产生，其通过化学选择性生物素缀合和链霉素下拉来分离。b，两个aav2载体，编码i)大肠杆菌trna
tyr
和egfp(tyr-egfp)，以及ii)trna
pyl
和mcherry(pyl-mcherry)，以104:1的比例混合，并使用mbpylrs及其底物azk进行vader选择方案。存活群体
的facs分析显示pylmcherry的累计富集超过30,000倍。数据示出为平均值
±
标准差。(n＝3个独立实验)。
44.图2a-b示出了trnacua
pyl
的定向进化。a，创建四个不同的trnacua
pyl
库(a1、a2、t1、t2)的随机序列以四种不同的颜色突出显示。(图2a公开了seq id no：1)b，从每个库的选择中产生的trna序列的分析。c，使用egfp-39tag报告基因测量的每个独特的完全碱基配对的trna
pyl
选择子的tag阻抑效率。在存在或不存在1mm azk的情况下，将paav质粒(也包含野生型mcherry报告基因)中编码的trna与mbpylrs和egfp-39tag共转染到hek293t细胞中。在无细胞提取物中测量每个trna
pyl
突变体促进的egfp-39tag表达，相对于野生型mcherry表达进行归一化，并绘制为野生型trna
pyl
促进的报告基因表达的百分比。数据示出为平均值
±
标准差。(n＝3个独立实验)。
45.图3a-c示出了a2.1 trnacua
pyl
的效率提高。a，野生型(wt)和a2.1的序列。b，在存在( )和不存在(-)适当uaa的情况下，使用wt或a2.1 trna和wt或ack选择性mbpylrs表达egfp-39tag。c，在存在或不存在azk的情况下，分别使用trnauca
pyl
和trnauua
pyl
(对于wt和a2.1突变体)和mbpylrs表达egfp-39tga和egfp-39taa。在hek293t无细胞提取物中测量egfp-39tag的表达，并相对于其野生型对应物进行报告。数据示出为平均值
±
标准差。(n＝3个独立实验)。
46.图4a-b示出了单个aav2编码的trna基因可以促进tag灭活的衣壳基因(cap)的表达和子代病毒的产生。a，实验方案。hek293t细胞以非常低的moi用编码trnacua
pyl
和野生型egfp基因的aav2感染，然后用编码以下的质粒在存在或不存在1mm azk的情况下进一步转染：i)aav2 rep和cap-454-tag基因，ii)mbpylrs，和iii)adhelper。之前已经证明了包装aav2在cap的454位置掺入azk的可行性，并且它不会干扰病毒。1个在cap 454位置的tag密码子的抑制导致azk在表面暴露的位点掺入所有三个重叠的衣壳蛋白，vp1、vp2和vp3(共60个拷贝)。还进行了相同的实验，其中cap-454-tag被野生型cap取代。48小时后，从这些细胞中收获子代病毒，并通过感染新鲜接种的hek293t细胞进行滴定，然后进行facs分析。b，当使用cap-454-tag时，观察到azk依赖性子代病毒的产生(插图中放大)；效率显著低于使用野生型cap的相同实验。数据示出为平均值
±
标准差。(n＝3个独立实验)
47.图5a-c示出了aav2-454-azk可以通过光可切割的dbco-生物素缀合物的生物正交连接随后链霉素结合和光释放来分离。a，光可切割的dbco-生物素缀合物的结构。b，aav2-454-azk用不同浓度的dbco-生物素处理1小时，使用过量的azk淬灭反应，并通过透析去除小分子。使用链霉素-琼脂糖捕获生物素标记的病毒，然后通过365nm辐射释放。在处理前、生物素修饰后和光释放后测量病毒的感染滴度(通过感染hek293t细胞，然后进行facs)，然后针对体积变化进行归一化。绘制相对于未处理病毒的感染性。我们发现低程度的生物素化(以5μm试剂；每个病毒粒子含有60个azk残基)不会影响aav2感染性，但增加的衣壳的修饰(在更高的dbco-生物素浓度下)会影响。此外，使用5μm dbco-生物素，从链霉素树脂中以良好的效率(～30％)回收修饰的病毒，而当使用更高的试剂浓度时，收率很差。c，使用这种优化的标记/捕获策略，编码mcherry报告基因的aav2-454-azk可以从其混合物中富集，该混合物具有带有野生型衣壳(无叠氮化物)的egfp编码aav2。示出了在选择之前和之后感染混合病毒群的hek293t细胞的荧光显微镜图像。
48.图6示出了含有本研究中使用的各种trna和荧光蛋白的aav2货物的示意图。
49.图7示出了在选择之前、步骤1和步骤2之后感染混合病毒群(tyr-egfp：pyl-mcherry)的细胞的代表性显微镜图像。示出了每个来自egfp和mcherry通道的合并图像。对于这些实验，通过facs测量的两种病毒(pyl-mcherry:tyr-egfp)的比率如下所示。
50.图8a-c示出了表达无义-无活性的egfp报告基因的hek293t细胞的代表性荧光显微镜图像，使用野生型trna
pyl
或其最有效的进化突变体a2.1进行抑制。a，在存在或不存在1mm azk的情况下，共转染mbpylrs和egfp-39-tag报告基因和paav质粒(也编码野生型mcherry报告基因)中编码的野生型或a2.1 trna
pyl
。mcherry的表达示出为每个实验中的对照。b，分别使用trnaucapyl和trnauua
pyl
(对于野生型和a2.1突变体)表达egfp-39tga和egfp-39taa。在存在或不存在1mm azk的情况下，将pidtsmart载体中编码的trna与适当的egfp突变体和mbpylrs共转染。c，使用野生型和a2.1 trna
cuapyl
将ack掺入egfp-39tag。在存在或不存在5mm ack的情况下，将pidtsmart载体中编码的trna与egfp-39tag突变体和mbpylrs-ackrs3突变体共转染。
51.图9示出了来自四个库中每一个的完全碱基配对(包括g:u摆动配对)的选定trna的序列。有关其活性的表征参见图2c。trna的编号方案如下所示。
52.图10a-c示出了通过vader选择方案获得的突变体亮氨酰trna的改进活性。a，示出了野生型tag-阻抑型大肠杆菌亮氨酰trna(ecltr)的序列(seq id no：47-与seq id no：28相同，但具有t而非u)。b，示出了通过本文描述的方法鉴定的ecltr(ecltrh1)(seq id no：48-与seq id no：30相同但具有t而非u)的改进突变体中的一个的序列。c，示出了当与选择性负载uaas的改造的ecleurs突变体共转染时，ecltr和ecltr-h1在hek293t细胞中的活性。用于测量trna活性的全长egfp-39-tag报告基因的表达。ecltr-h1显示出非常高的效率。
53.图11示出了野生型吡咯赖氨酰trna(seq id no:1)的序列和二级结构，进一步示出了针对受体茎中每个位置的定制随机化产生。
54.图12示出了当进行vader选择方案时，使用下一代illumina dna测序(ngs)来表征trna库中每个突变体的富集程度的结果。由此产生的富集因子可以用于估算相应trna的效率。
55.图13示出了使用egfp-39tag报告基因在hek293t细胞中的表达证明的所选trna-pyl突变体的活性提高的评估测定结果，相对于野生型mcherry表达归一化，并绘制为野生型trna-pyl促进报告基因表达的百分比。
56.图14a-b上图(14a)以weblogo格式(https://weblogo.berkeley.edu/)示出了120种不同细菌亮氨酰-trna的受体干区的编译序列。在这种格式中，在这组trna序列中的特定位置发现的特定核苷酸的相对丰度由相应字母代码的相对高度表示。下图(14b)示出了野生型大肠杆菌亮氨酰-trna(seq id no:49/seq id no:28)的序列和二级结构，并进一步示出了由序列比对引导的针对受体干(acceptor stem)中每个位置的定制随机化。
57.图15示出了使用egfp-39tag报告基因在hek293t细胞中的表达证明的所选trna-leu突变体的活性提高的评估测定结果(如之前所述)，相对于野生型mcherry表达归一化，并绘制为由野生型trna-leu促进的报告基因表达的百分比。
58.图16a-b示出了在通过杆状病毒递送的受控trna表达下比较wt trna-pyl和trna-pyl-2(seq id no：2)的活性的结果。hek293t细胞用编码mbpylrs和egfp-39-tag的杆状病毒转导，固定moi为1，同时具有增加的编码mcherry报告基因和wt或改造的(seq id no:2)
trna-pyl的第二杆状病毒的moi(0.3到3)。除无azk对照外的所有表达均在1mm azk(mbpylrs的uaa底物)存在下进行。mcherry的表达显示在下图中，随着使用trna-mcherry病毒的moi增加而线性增加，并且在相同的moi下与wt和改造的trna-pyl病毒相当。上图示出了egfp-39-tag相对于在相同moi下编码野生型egfp的相同病毒的表达。与wt trna-pyl相比，改造的trna-pyl以低得多的表达水平(较低的moi)促进egf-39-tag表达。
59.图17a-b示出了在通过杆状病毒递送的受控trna表达下比较wttrna-leu和trna-leu-30(seq id no：30)的活性的结果。hek293t细胞用编码ecleurs和egfp-39-tag的杆状病毒转导，固定moi为1，同时具有增加的编码mcherry报告基因和wt或改造的(seq id no:30)trna-leu的第二杆状病毒的moi(3到15)。除无uaa对照外的所有表达均在1mm cap(ecleurs的uaa底物)存在下进行。mcherry报告基因的表达显示在下图中，随着使用trna-mcherry病毒的moi增加而线性增加，并且与在相同的moi下的wt和改造的trna-leu病毒相当。上图示出了egfp-39-tag相对于在相同moi下编码野生型egfp的相同病毒的表达。与wttrna-leu相比，改造的trna-leu以低得多的表达水平(较低的moi)促进egf-39-tag表达。
60.图18示出了在本文描述的方法中使用的uaas的结构。
61.图19a-b示出了评价改进的trna-pyl(seq id no:2；上图)和trna-leu(seq id no:30；下图)促进图18所示的各种uaas更有效掺入的分析结果。
62.图20示出了aav2 vpi衣壳蛋白的氨基酸序列(seq id no:46)。
63.优选实施方案的详细描述
64.本发明描述了在哺乳动物细胞中病毒辅助的trna定向进化(vader)的新策略，以获得高效的活性、正交trna变体分子。通过本文所述的方法产生的本文所述的trna变体的特征在于无义密码子抑制的生物活性增加(增强)和以位点特异性方式将非天然氨基酸掺入目标蛋白质中。选择这些高效trna变体的方法将阻抑型trna的活性与人类病毒(例如，腺伴随病毒或aav)的复制结合。在某些实施方案中，该方法包括：i)在病毒基因组中编码trna变体库以使其能够受控地递送至哺乳动物细胞；ii)在必需病毒蛋白中插入无义密码子，使病毒复制依赖于阻抑型trna的活性，促进编码活性trna变体的病毒粒子的选择性扩增；iii)通过分离并测序新扩增病毒的基因组，可以很容易地检索到富集的trna序列。
65.本发明的方法特别证明了相对于编码无活性trna的aav群体，富集编码活性阻抑型trna的aav群体的能力在约10,000至50,000倍的范围内并且通常为约》30,000倍，因此提供了强大的选择方案，以从幼稚trna库中富集活性突变体。特别是，通过本文所述的方法鉴定并分离的变体trna的活性增加了2.5倍至80倍。
66.在本文所述的vader选择方法之前和之后，可以进行病毒编码的trna库的下一代测序(此类技术是本领域技术人员已知的-参见例如可从illumina商购获得的试剂盒/试剂)以评估和确认库中每个可能的突变体/变体的富集。
67.本发明的技术可以进一步应用于进化通常用于在哺乳动物细胞中掺入uaa的不同阻抑型trna，包括例如来自古细菌的吡咯赖氨酰trna和来自大肠杆菌的亮氨酰trna。对两种trna进行合成突变库导致变体的鉴定，这些变体证明uaa掺入哺乳动物细胞的显著提高的活性。当以较低水平表达时，突变体相对于它们的野生型对应物表现出特别提高的效率，进一步证实了它们增强的内在效率。
68.作为本发明的结果，现在可以获得用于进化任何改造的阻抑型trna在哺乳动物细
biolabs(neb)。所有dna寡核苷酸均购自integrated dna technologies(idt)。sanger测序由eton bioscience进行。
81.非天然氨基酸叠氮-赖氨酸(azk)购自iris biotech gmbh(germany)。nε-乙酰赖氨酸(ack)购自bachem。
82.将模拟和库trna包装和滴定到aav(野生型衣壳)中。为了将各种货物包装到aav-2中，将800万个hek293t细胞接种在10cm组织培养皿中。第二天，使用聚乙烯亚胺(pei)(sigma)将细胞分别用8μg合适的货物质粒(paav-itr-trna-荧光蛋白)、phelper和paav-rc2转染。转染后24小时将培养基更换为新鲜的dmem。转染后72小时，将细胞重悬、沉淀，并如前所述通过冻/融裂解。1份病毒通过peg沉淀浓缩和半纯化，1份重悬于1ml含fbs的dmem中并快速冷冻。
83.实施例中描述的序列
84.实施例和整个申请中描述的野生型和衍生序列列于表中：
85.86.87.88.[0089][0090]
实施例1：阳性选择。
[0091]
800万个hek293t细胞各接种在三个10cm组织培养皿中。第二天，细胞用含有trnapyl库的病毒感染，表观moi为5(在转染试剂pei存在下，实际moi显著降低)。感染后4小时，使用pei，每培养皿用22μg的phelper和10μg的pidtsmart-rc2(t454tag)-pylrs转染细胞。此时还添加了1mm azk。转染一天后，将培养基更换为含有1mm azk的新鲜dmem。转染后三天收获细胞并裂解以进行病毒分离。保存培养基并与澄清的裂解物重组，并将该混合物用500u通用核酸酶(thermo scientific)处理30分钟。如前所述，使用11％聚乙二醇(fisher)通过peg沉淀回收病毒，并重新悬浮在3ml pbs中。小规模模拟阳性选择在12孔板中进行。第二天每孔接种70万个细胞，并用携带trnapyl-mcherry货物的aav感染。四小时后，如上述选择转染细胞，但转染混合物和azk按比例缩小15倍。对于仅pei孔，细胞接受相当数量的转染试剂但没有质粒。转染后第二天用含有1mm azk的新鲜dmem更换培养基。转染后三天收获病毒并如上文选择所述进行peg沉淀。用一个模拟选择孔的全部输出感染12孔板中的汇合细胞，并通过流式细胞术进行分析。
[0092]
实施例2：阴性选择。
[0093]
来自阳性选择的病毒(3ml)用浓度为5μm的光可切割的dbco-磺基-生物素(jena biosciences)在黑暗中混合标记1小时。标记后立即用azk(1mm终浓度)淬灭过量的dbco-生物素，并使用slide-a-lyzer 100kda mwco装置(thermo scientific)在4℃下用1l pbs透析过夜。将透析的病毒混合物分成三个2ml管，每个管在4℃下用400μl链霉素琼脂糖树脂(thermo scientific)旋转过夜。第二天，每管珠用含有额外nacl(最终浓度300mm)的1ml pbs洗涤八次，洗涤之间混合。最后，将洗涤过的珠重新悬浮在8ml pbs(300mm nacl)中，并使用365nm紫外线二极管阵列(larson electronics)通过四次30秒的照射从树脂中洗脱病毒，并在照射之间进行混合。
[0094]
实施例3：病毒dna的回收、扩增和克隆。
[0095]
使用amicon ultra-4 100kda mwco离心浓缩器(millipore)将洗脱的病毒从3ml浓缩至300μl。将该混合物加热至100℃10分钟，以使病毒衣壳蛋白变性并暴露dna。然后使
用酵母trna(ambion)通过乙醇沉淀净化和浓缩病毒dna，并重新悬浮在50μl的最终体积中。将20μl这种混合物加入到200μl pcr反应中，并用trnaamp-f和r引物进行扩增。得到的dna用kpni和ncoi消化，并使用与原始库生成相同的方案克隆到库克隆载体中。
[0096]
实施例4：使用pyl-mcherry和tyr-gfp的模拟选择。
[0097]
图1中所示的模拟选择遵循与上述相同的方案，不同之处在于起始库病毒是由paav-itr-pytr-mcherry制成的病毒与由paav-itr-ecytr-gfp制成的病毒的1:10,000混合物。如病毒滴度所述，通过流式细胞术分析模拟选择结果，但此处12孔板中的细胞在阳性或阴性选择后被200μl病毒库感染。对红色和绿色荧光细胞进行计数以确定病毒比例。
[0098]
实施例5：采样(hit)测序和表征。
[0099]
对于每个库，从上述产生的转化板中挑取30-50个菌落并送去进行sanger测序(eton bioscience)。所有随机碱基配对的所有序列都被视为潜在采样数(hits)，并将这些trna亚克隆到paav-itr-pytr-mcherry中用于分析。初始采样分析是通过在存在和不存在1mm azk的情况下，在24孔板中用0.5μg每种潜在采样的paav-itr-pytr-mcherry质粒、pidtsmart-mbpylrs和pacbac1-gfp(39tag)转染hek293t细胞进行的。转染两天后，用cellytic m缓冲液(sigma)裂解细胞，并在molecular devices spectramax m5酶标仪上测量egfp和mcherry荧光。减去未转染孔的值，并将egfp荧光归一化为每孔的mcherry荧光。选择最佳采样ac2.1(ggg/ccu)与其他终止密码子和不同的合成酶以及uaa、ackrs3和ack进行进一步分析。将12孔板中的hek293t细胞用0.375μg含有野生型或进化型trna的pidtsmart-pytr，0.375μg含有适当合成酶的pidtsmartaars，0.75μg含有一个或两个适当的终止密码子的pacbac1-egfp转染。野生型egfp对照孔使用相同比例的pidtsmart-pytr(tag，野生型)、pidtsmart-mbpylrs和pacbac1-egfp(野生型)。转染两天后，裂解细胞并通过酶标仪测量egfp荧光。减去来自未转染孔的值。
[0100]
实施例6：使用定制随机化的突变库进一步进化吡咯赖氨酰-trna。
[0101]
在第一代vader实验中，仅一次随机化trna的短片段(一次3个碱基对)以创建小的突变库，并对其进行选择。虽然它导致了改进突变体的鉴定，但我们推测随机化和选择更大序列空间的能力可导致鉴定更有效的突变体。然而，随机化更大的trna片段会指数增加库的大小。例如，在干区随机化一个额外的碱基对会使库成员的数量增加16倍。由于技术限制，目前使用vader平台处理大于105的库，同时确保完全覆盖所有可能的突变体具有挑战性。这个大小限制限制了我们为改造其活性而在trna的干区中不超过4个碱基对的完全随机化。然而，当trna干区中的碱基对完全随机化时，16个突变体中只有6个仍能保持碱基配对相互作用(a:t、g:c或g:u)，这对于干区的稳定性是必不可少的。大多数不能碱基配对的突变体会导致trna茎中间出现未配对的“气泡”，这通常会影响trna的性能。设想了不同的trna库合成方式，其中每个碱基对仅随机分配到所需的碱基配对序列。这种方法利用了dna合成技术的最新进展，能够合成大量具有显著长度(最多300个核苷酸)的不同dna寡核苷酸。这使得能够合成dna库，编码整个trna基因，其中可以指定每个库成员的每个位置，从而可以仅包括碱基配对的突变体并避免那些不配对的突变体。
[0102]
使用dna合成服务提供商twist bioscience，创建了吡咯赖氨酰-trna库，如图11所示，其中受体茎中的六个碱基对被随机化为碱基配对序列的所需组合。得到的库被包装在aav2中，并进行如上所述的vader选择方案，一式两份。在对aav2包装库进行vader选择之
前和之后，使用illumina平台对其进行测序以进行下一代测序(图12)。使用选择步骤前后的丰度计算每个突变体的富集度，并根据富集程度对突变体进行排序。重新合成在选择时表现出最高富集度的突变体，并使用如前所述的egfp-39-tag表达测定对其活性进行基准测试(图13)。如图13所示，26个trna-pyl突变体表现出的活性相对于野生型trna-pyl至少高250％，其中最有活性的突变体表现出相对于wt-trna-pyl的540％活性。
[0103]
实施例7：用于哺乳动物细胞中增强的无义抑制活性的大肠杆菌亮氨酰-trna的进化。
[0104]
用于在哺乳动物细胞中改造trna活性的vader选择方案的应用不仅限于吡咯赖氨酰trna。它还可以用于提高其他适合在哺乳动物细胞中的uaa掺入的trna的活性。此处描述的vader方法的使用还用于提高大肠杆菌亮氨酰trna(trna-leu)的活性，其与其同源大肠杆菌亮氨酰trna合成酶(ecleurs)一起先前已用于哺乳动物细胞中的uaa掺入(j.am.chem.soc.2004,126,14306；biochemistry 2018,57,441)。正如本文描述的关于trna-pyl的工作所示，改造的受体茎通常非常有吸引力，因为该区域与翻译系统的许多组件相互作用。为了设计“智能”库，将120个已知细菌trna序列进行序列比对以生成受体茎的共有序列(图14)。该共有序列可用作预测受体茎的哪些部分在trna-aars相互作用(同一元件)中可能很重要，以及哪些区域提供改变空间的指导。基于这种方法，设计了trna-leu受体茎的定制随机化库(图14)。该库被封装在aav2中，并按照上述vader选择方案进行处理。先前开发的多特异性ecleurs突变体(biochemistry 2018,57,441)可以为含叠氮基(叠氮基修饰的)uaa azk加载，在vader方案中用于为trna突变体加载。如上所述，使用下一代illumina dna测序来测量每个库成员在选择前后的富集情况，并使用先前描述的egfp-39-tag报告基因表达测定法重新合成和表征表现出最多富集的成员。如图15所示，17个trna-leu突变体的活性比野生型trna-leu至少高1,000％，最有活性的突变体表现出相对于wt-trna-leu的活性提高大约13,000％。这些trna序列，包括wt-trna-leu，在33位含有u，这是反密码子环中的第一个核苷酸。这种u到c的突变可以导致增强的无义抑制活性，因为它通常为无义抑制反密码子提供更好的背景。为了查明是否如此，突变体29(seq id no:29)中的33-u到c发生突变以产生突变体30(seq id no:30)。实际上，该突变体显示出相对于29(图15)显著提高的抑制活性。将此突变引入其他已鉴定的trna-leu突变体(seq id no：31-45)也应导致其活性的进一步提高。
[0105]
实施例8：当表达水平受控受限时，改造的trna突变体相对于它们的野生型对应物显示出进一步的改进。
[0106]
到目前为止，所有trna活性的所有评估都是通过将编码trna、aars和报告基因的质粒瞬时转染到哺乳动物细胞中来进行的。众所周知，哺乳动物细胞培养物的瞬时转染会导致dna递送的不受控制和异质水平，使得一些细胞以非常高的水平摄取和过度表达相关质粒，而其他细胞则不会。先前已经证明，由此产生的编码trna和aars的过度表达可以补偿它们较差的内在活性并夸大其内在效率的估计值(acs synth.biol.2017,6,13)。如本文所述，进一步证明，因此，通过瞬时转染比较两种不同的uaa掺入系统可能会产生不准确的估计，其中较弱的系统的效率被高估。据推测，使用瞬时转染分析观察到的效率差异可能低估了不同trna突变体相对于它们的野生型对应物的固有效率的实际改进程度。
[0107]
为了克服这一挑战，使用了先前开发的杆状病毒载体，该载体促进转基因向哺乳
动物细胞的受控且更均匀的递送(acs synth.biol.2017,6,13)。通过系统地改变病毒与细胞的比例，可以简单地控制转基因的表达水平。使用这种递送系统，可以在大范围的不同表达水平上比较两种不同的uaa掺入基因系统，从而更准确地揭示它们内在性能的差异。为了使用这种方法比较改造的trna-pyl和trna-leu突变体相对于它们的野生型对应物的活性，构建了杆状病毒载体来编码野生型mcherry报告基因以及四种trna之一：wttrna-pyl、wt-trna-leu、trna-pyl-2(seq id 2)或trna-leu-30(seq id 30)。开发了第二种杆状病毒以递送egfp-39-tag报告基因以及必需的aars(mbpylrs用于trna-pyl，或ecleurs用于trna-leu)。hek293t细胞用aars/egfp-39-tag杆状病毒转导，具有固定的moi(感染复数，或每个细胞添加的感染病毒颗粒数)为1，同时具有增加的wt或改造的trna病毒的moi(0.3至15)。在转染后48小时，使用其在无细胞提取物中的特征荧光记录mcherry(确认trna-杆状病毒以所需水平的递送)和egfp-39-tag(代表响应tag的uaa掺入效率)的表达。如图16所示，相对于wt trna-pyl，改造的trna-pyl以低得多的表达水平(较低的moi)促进egf-39-tag表达。例如，当wt trna-pyl病毒在moi 1使用时，egfp-39-tag的表达相对于野生型egfp对照仅为0.5％；而编码改造的trna-pyl(seq id no：2)的病毒在相同的moi下提供9.3％的egfp-39-tag表达，表明后者在该表达水平上＞18倍更高的效率。在更高的moi为3时，改造的trna显示出相对于野生型约14倍更高的活性，这强调了更高的表达如何低估内在活性的真实差异。我们还以相同的方式比较了野生型trna-leu及其改造的对应物之一(seq id no：30)的活性。如图17所示，改造的trna在测试的最高moi下提供了近29倍的改善的egfp-39-tag表达(15)。当trna以低水平表达时，差异更加明显；例如，在moi 5时，wt trna-leu无法检测到egfp-39-tag表达，而trna-leu-30允许其相对于野生型报告基因以16％的水平表达。改造的trna在较低表达水平下提供显著更高的效率非常重要，因为这将使生成具有基因组掺入的aars/trna的稳定哺乳动物细胞系变得更加容易，从而提供高uaa掺入效率。
[0108]
实施例9：改造的trna突变体更有效地掺入许多uaas。
[0109]
不受理论的约束，虽然改造的trna的活性提高尚未完全了解，但这些与哺乳动物翻译系统的相互作用可能比它们的野生型对应物好得多，其是从不同生物领域借鉴的。因此，这些trna的活性提高应该能够更有效地掺入所有uaas，这些uaas可以通过其同源aars的改造的突变体而被掺入。为了证明这一假设，使用上述egfp-39-tag表达测定评估可以使用改造的mbpylrs(结构1-6；图18)或ecleurs(结构7-12；图18)掺入的几种uaas的掺入效率。实际上，相对于它们的野生型对应物，这些uaas中的每一个都被改造的trna通过两个改造的trna以显著更高的效率掺入报告基因中(图19)。
[0110]
虽然已经参照本发明的优选实施方案具体地示出和描述了本发明，但是本领域技术人员应当理解，在不脱离所附权利要求所涵盖的本发明范围的情况下，可以在形式和细节上做出各种改变。