针对SARS-COV-2的抗体的制作方法

针对sars-cov-2的抗体
1.本国际专利申请要求2021年1月27日提交的pct申请号：pct/cn2021/073917的权益，其全部内容通过引用并入以用于所有目的。
技术领域
2.本发明涉及生物技术，尤其涉及纳米抗体、抗体、核酸分子、表达载体、重组细胞、抗体-药物缀合物、药物组合物及其用途。


背景技术：

3.由新型严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(sars-cov-2)引起的2019冠状病毒病(covid19)的爆发已经持续了一年，给国际经济和社会活动带来了不利影响，导致全球包括200万人死亡在内的超过9000万人发病以及本世纪最严重的经济崩溃。感染个体在感染后11.5天出现临床症状之前经历7.76天的预估中位数病毒潜伏期[1,2]。此外，症状前患者和约15.6％的无症状患者贡献了超过40％的病例[3,4]。这些流行特征极大地限制了流行病的防控，迫切需要开发有效的药物来预防病毒传播并为感染患者提供抗病毒治疗。然而，唯一获批用于临床的药物是瑞德西韦(remdesivir)，该药物被美国食品药品监督管理局(fda)批准用于仅覆盖所有病例的15％的住院患者[5,6]。
[0004]
sars-cov-2是属于β冠状病毒属的单链rna病毒，与sars-cov的基因组具有79.6％的同一性，与蝙蝠冠状病毒ratg13的基因组具有96.2％的同一性[7-10]。与其他β冠状病毒类似，sars-cov-2感染是由刺突(s)糖蛋白与其受体人血管紧张素转换酶2(hace2)结合介导的。s蛋白是病毒体表面的三聚体融合蛋白，与宿主细胞结合后，由细胞丝氨酸蛋白酶tmprss2和溶酶体蛋白酶组织蛋白酶切割成受体结合片段s1和融合片段s2[11,12]。s1通过其c末端的受体结合结构域(rbd)与hace2相互作用，然后将构象从“坐下”转换为“站立”以解离和暴露驱动病毒与细胞膜融合的s2。尽管与sars-cov具有相同的受体，但由于s1/s2切割位点的氨基酸不同，sars-cov-2s蛋白显示了与hace2更强的亲和力[12,16]，这部分解释了sars-cov-2更高的传播性。值得注意的是，由于hace2和tmprss2的普遍表达，sars-cov-2不仅攻击气道中的肺上皮细胞，还攻击如肠上皮细胞、胰腺β细胞的其他细胞类型[20-24]。感染趋向性的复杂性显著导致了疾病的严重程度和后遗症，因此首先阻断病毒感染对于疾病控制至关重要。
[0005]
目前有几种疫苗已获准紧急使用，并且多种疫苗和抗体正处于不同阶段的临床试验中[25]。在源自人或小型实验动物的所有抗体中，另一组名为纳米抗体的抗体表现出独特的特性[32-34]。纳米抗体(nb)，也称为vhh，是最初来源于骆驼科动物的单结构域抗体片段。不同于包含两条轻链和重链的传统igg抗体，纳米抗体仅呈现重链的单体靶标识别模块，同时保留了相似的特异性和亲和力。鉴于15kd的小尺寸，纳米抗体易于生产和操作，具有强大的热稳定性、溶解性和渗透性以及低免疫原性[35]。
[0006]
最近，基于纳米抗体的药物已成功获fda批准用于临床，验证了纳米抗体作为一类特殊治疗性抗体的成药性[36]。
[0007]
发明概述
[0008]
本发明部分地基于本发明人的以下发现。
[0009]
发明人从噬菌体展示的合成纳米抗体文库中筛选了一系列纳米抗体，这些纳米抗体能够以个位数纳摩尔浓度与sars-cov-2刺突糖蛋白(s)的受体结合结构域(rbd)结合，从而保护宿主细胞免受病毒感染。
[0010]
因此，在本公开的一个方面，提供了与sars-cov-2刺突糖蛋白结合的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体包含重链可变区(vh)，该重链可变区(vh)包含一个或多个具有选自seq id no:1-21或与seq id no:1-21至少90％相同的氨基酸序列的cdr。
[0011]
grtfrvnlmg(seq id no:1)。
[0012]
singfddityy(seq id no:2)。
[0013]
aydsdydgrlfnywg(seq id no:3)。
[0014]
gsiysfnfmg(seq id no:4)。
[0015]
tinsfddityy(seq id no:5)。
[0016]
vlgertgisygsafdywg(seq id no:6)。
[0017]
gftsrnyfmg(seq id no:7)。
[0018]
tinslssityy(seq id no:8)。
[0019]
vytpttgpgegsytpwhdywg(seq id no:9)。
[0020]
gfisnfnlmg(seq id no:10)。
[0021]
tinsfddityy(seq id no:11)。
[0022]
aevrssldyalwtsrrsafsywg(seq id no:12)。
[0023]
gfiysfnimg(seq id no:13)。
[0024]
sinwfsdityy(seq id no:14)。
[0025]
ayllrgddryyatysywg(seq id no:15)。
[0026]
gfisdadimg(seq id no:16)。
[0027]
sinsydsityy(seq id no:17)。
[0028]
vrvhsrdfsywg(seq id no:18)。
[0029]
gfiysfnimg(seq id no:19)。
[0030]
sissyddityy(seq id no:20)。
[0031]
ayllrgddryyatysywg(seq id no:21)。
[0032]
根据本发明实施方案的抗体可特异性靶向并结合sars-cov-2刺突糖蛋白rbd，抑制sars-cov-2刺突糖蛋白受体与人血管紧张素转化酶2(hace2)的结合。根据本发明实施方案的抗体是用于检测sars-cov-2和/或针对2019冠状病毒病(covid-19)的疾病控制的潜在候选物。
[0033]
在本公开的一些实施方案中，上述抗体可以具有以下附加特征中的至少一种：
[0034]
在本公开的一些实施方案中，vh包含：具有seq id no:1、4、7、10、13、16和19中任一项所示的或与seq id no:1、4、7、10、13、16和19中的任一项至少90％相同的氨基酸序列的cdrl；具有seq id no:2、5、8、11、14、17和20中任一项所示的或与seq id no:2、5、8、11、14、17和20中的任一项至少90％相同的氨基酸序列的cdr2；具有seq id no:3、6、9、12、15、18和21中任一项所示的或与seq id no:3、6、9、12、15、18和21中的任一项至少90％相同的
氨基酸序列的cdr3。
[0035]
在本公开的一些实施方案中，vh包含分别具有seq id no:1-3、seq id no:4-6、seq id no:7-9、seq id no:10-12、seq id no:13-15、seq id no:16-18或seq id no:19-21所示的氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3。
[0036]
在本公开的一些实施方案中，抗体为单价的、二价的或多价的。
[0037]
在本公开的一些实施方案中，抗体为单特异性的、双特异性的或多特异性的。
[0038]
在本公开的另一个方面，提供了与sars-cov-2刺突糖蛋白结合的纳米抗体。在本公开的一些实施方案中，纳米抗体包含一个或多个具有选自seq id no:1-21或与seq id no:1-21中的任一项至少90％相同的氨基酸序列的cdr。
[0039]
根据本发明实施方案的纳米抗体可特异性靶向并结合sars-cov-2刺突糖蛋白rbd，抑制sars-cov-2刺突糖蛋白受体与人血管紧张素转化酶2(hace2)的结合。根据本发明实施方案的纳米抗体是用于检测sars-cov-2和/或针对2019冠状病毒病(covid-19)进行疾病控制的潜在候选物。
[0040]
在本公开的一些实施方案中，上述纳米抗体可以具有以下附加特征中的至少一种：
[0041]
在本公开的一些实施方案中，纳米抗体包含：具有seq id no:1、4、7、10、13、16和19中任一项所示序列的cdr1；具有seq id no:2、5、8、11、14、17和20中任一项所示序列的cdr2；具有seq id no:3、6、9、12、15、18和21中任一项所示序列的cdr3。
[0042]
在本公开的一些实施方案中，纳米抗体包含分别具有seq id no:1-3、seq id no:4-6、seq id no:7-9、seq id no:10-12、seq id no:13-15、seq id no:16-18或seq id no:19-21所示氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3。
[0043]
在本公开的一些实施方案中，纳米抗体包含重链框架区，且所述重链框架区的至少一部分来源于小鼠抗体、人抗体、灵长类抗体及其突变体中的至少一种。优选地，当重链框架区来源于人抗体时，纳米抗体的免疫原性较低。
[0044]
在本发明的一些实施方案中，纳米抗体具有seq id no:22-28中任一项所示的氨基酸序列。
[0045]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgrtfrvnlmgwfrqapgkgrelvasingfddityypdsvegrftisrdnakrmvylqmnslraedtavyycaaydsdydgrlfnywgqgtqvtvss(seq id no:22)。
[0046]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgsiysfnfmgwfrqapgkgrelvatinsfddityypdsvegrftisrdnakrmvylqmnslraedtavyycavlgertgisygsafdywgqgtqvtvss(seq id no:23)。
[0047]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgftsrnyfmgwfrqapgkgrelvatinslssityypdsvegrftisrdnakrmvylqmnslraedtavyycavytpttgpgegsytpwhdywgqgtqvtvss(seq id no:24)。
[0048]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgfisnfnlmgwfrqapgkgrelvatinsfddityypdsvegrftisrdnakrmvylqmnslraedtavyycaaevrssldyalwtsrrsafsywgqgtqvtvss(seq id no:25)。
[0049]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgfiysfnimgwfrqapgkgrelvasinwfsdityypdsvegrftisrdnakrmvylqmnslraedtavyycaayllrgddryyatysywgqgtqvtvss(seq id no:26)。
[0050]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgfisdadimgwfrqapgkgrelvasinsydsityypdsvegrftisrdnakrmvylqmnslraedtavyycavrvhsrdfsywgqgtqvtvss(seq id no:27)。
[0051]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgfiysfnimgwfrqapgkgrelvasissyddityypdsvegrf
tisrdnakrmvylqmnslraedtavyycaayllrgddryyatysywgqgtqvtvss(seq id no:28)。
[0052]
具有seq id no:22所示氨基酸序列的纳米抗体对应于本公开的克隆vhh60；具有seq id no:23所示氨基酸序列的纳米抗体对应于克隆vhh35；具有seq id no:24所示氨基酸序列的纳米抗体对应于克隆vhh79；具有seq id no:25所示氨基酸序列的纳米抗体对应于克隆vhh80，seq id no:26所示的纳米抗体在本技术中称为vhh34，seq id no:27所示的纳米抗体在本技术中称为vhh43，seq id no:28中所示的纳米抗体在本技术中称为vhh82。
[0053]
在本公开的另一个方面，提供了编码上述纳米抗体或抗体的核酸分子。在本公开的一些实施方案中，可以将核酸分子引入宿主细胞以表达上述纳米抗体或抗体。
[0054]
在本公开的一些实施方案中，上述核酸分子可以具有以下附加特征中的至少一种：
[0055]
在本公开的一些实施方案中，核酸分子为dna。
[0056]
在本公开的一些实施方案中，核酸分子具有seq id no:29-35中任一项所示的核苷酸序列。
[0057]
gaggtgcagctggtggaaagcggcggaggactggtgcaacccggcggctctctgagactgagctgtgccgcctccggcagaacctttcgtgttaatcttatgggctggttcagacaagcccccggcaagggcagagagctggtggctagtattaacgggtttgatgatattacctattaccccgactccgtggagggaagattcaccatctctagagacaacgccaagaggatggtgtacctccagatgaactctctgagagccgaggacacagccgtgtattactgcgccgcttacgactctgactacgacggtcgtctgtttaattattggggacaaggcacccaagtgaccgtgagctcc(seq id no:29)。
[0058]
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[0059]
gaggtgcagctggtggaaagcggcggaggactggtgcaacccggcggctctctgagactgagctgtgccgcctccggctttacctctcgtaattattttatgggctggttcagacaagcccccggcaagggcagagagctggtggctactattaactcgcttagcagcattacctattaccccgactccgtggagggaagattcaccatctctagagacaacgccaagaggatggtgtacctccagatgaactctctgagagccgaggacacagccgtgtattactgcgccgtttacactccgactactggtccgggtgaaggttcttacactccgtggcatgactattggggacaaggcacccaagtgaccgtgagctcc(seq id no:31)。
[0060]
gaggtgcagctggtggaaagcggcggaggactggtgcaacccggcggctctctgagactgagctgtgccgcctccggctttatctctaactttaatcttatgggctggttcagacaagcccccggcaagggcagagagctggtggctactattaactcgtttgatgatattacctattaccccgactccgtggagggaagattcaccatctctagagacaacgccaagaggatggtgtacctccagatgaactctctgagagccgaggacacagccgtgtattactgcgccgctgaagttcgttcttctctggactacgctctgtggacttctcgtcgttctgcttttagttattggggacaaggcacccaagtgaccgtgagctcc(seq id no:32)。
[0061]
gaggtgcagctggtggaaagcggcggaggactggtgcaacccggcggctctctgagactgagctgtgccgcctccggctttatctatagttttaatattatgggctggttcagacaagcccccggcaagggcagagagctggtg
gctagtattaactggtttagcgatattacctattaccccgactccgtggagggaagattcaccatctctagagacaacgccaagaggatggtgtacctccagatgaactctctgagagccgaggacacagccgtgtattactgcgccgcttacctgctgcgtggtgacgaccgttactacgctacttatagctattggggacaaggcacccaagtgaccgtgagctcc(seq id no:33)。
[0062]
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[0063]
gaggtgcagctggtggaaagcggcggaggactggtgcaacccggcggctctctgagactgagctgtgccgcctccggctttatctatagttttaatattatgggctggttcagacaagcccccggcaagggcagagagctggtggctagtattagctcgtatgatgatattacctattaccccgactccgtggagggaagattcaccatctctagagacaacgccaagaggatggtgtacctccagatgaactctctgagagccgaggacacagccgtgtattactgcgccgcttacctgctgcgtggtgacgaccgttactacgctacttatagctattggggacaaggcacccaagtgaccgtgagctcc(seq id no:35)。
[0064]
seq id no:29所示的序列编码对应于克隆vhh60的纳米抗体；seq id no:30所示的序列编码对应于克隆vhh35的纳米抗体；seq id no:31所示的序列编码对应于克隆vhh79的纳米抗体；seq id no:32所示的序列编码对应于克隆vhh80的纳米抗体；seq id no:33所示的序列编码对应于克隆vhh34的纳米抗体；seq id no:34所示的序列编码对应于克隆vhh43的纳米抗体；seq id no:35所示的序列编码对应于克隆vhh82的纳米抗体。
[0065]
在本公开的另一个方面，提供了包含核酸分子的表达载体。如上所述，核酸分子编码本公开的纳米抗体或抗体。因此，根据本发明实施方案引入宿主细胞的表达载体可以在适合蛋白质表达的条件下表达纳米抗体或抗体。
[0066]
在本公开的一些实施方案中，上述表达载体可以具有以下附加特征中的至少一种：
[0067]
在本公开的一些实施方案中，表达载体为真核表达载体。
[0068]
在本公开的另一个方面，提供了包含用于表达上述抗体或纳米抗体的核酸分子或表达载体的重组细胞。
[0069]
在本公开的一些实施方案中，上述重组细胞可以具有以下附加特征中的至少一种：
[0070]
在本公开的一些实施方案中，重组细胞通过将上述表达载体引入宿主细胞而获得。
[0071]
在本公开的一些实施方案中，重组细胞为真核细胞。
[0072]
在本公开的一些实施方案中，重组细胞为哺乳动物细胞，例如cho。
[0073]
在本公开的另一个方面，提供了抗体-药物缀合物，其包含与治疗剂、诊断剂或显像剂缀合的上述抗体或纳米抗体。
[0074]
在本公开的一些实施方案中，抗体-药物缀合物包含所述纳米抗体或抗体、接头、以及治疗剂、诊断剂或显像剂。
[0075]
在本公开的一些实施方案中，治疗剂为小分子细胞毒性药物。
[0076]
根据本发明实施方案的抗体-药物缀合物可以在纳米抗体或抗体靶向的引导下靶向并作用于病毒，从而实现检测冠状病毒2或抑制冠状病毒2的靶向作用。
[0077]
在本公开的另一个方面，提供了包含上述纳米抗体、抗体、核酸分子、表达载体、重组细胞和/或抗体-药物缀合物的药物组合物。根据本发明实施方案的药物组合物是用于检测sars-cov-2或预防、治疗或减轻sars-cov-2感染引起的疾病的潜在候选物。
[0078]
在本公开的一些实施方案中，药物组合物还包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
[0079]
在本公开的另一个方面，提供了上述纳米抗体、抗体、核酸分子、表达载体、重组细胞和抗体-药物缀合物或药物组合物在制备用于预防、治疗或减轻由sars-cov-2感染引起的疾病的药物中的用途。
[0080]
在本公开的另一个方面，提供了纳米抗体、抗体、核酸分子、表达载体、重组细胞和抗体-药物缀合物或药物组合物在制备用于抑制sars-cov-2的刺突糖蛋白与人血管紧张素转化酶2的结合或阻断sars-cov-2感染的药物中的用途。
[0081]
在本公开的另一个方面，提供了上述纳米抗体、抗体、核酸分子、表达载体、重组细胞和抗体-药物缀合物或药物组合物，其用于预防、治疗或减轻由sars-cov-2感染引起的疾病。
[0082]
在本公开的另一个方面，提供了纳米抗体、抗体、核酸分子、表达载体、重组细胞、抗体-药物缀合物或药物组合物，其用于抑制sars-cov-2的刺突糖蛋白与人血管紧张素转化酶2的结合或阻断sars-cov-2感染。
[0083]
在本公开的另一个方面，提供了预防、治疗或减轻由sars-cov-2感染引起的疾病的方法。在本公开的一些实施方案中，该方法包括向患者施用治疗有效量的上述纳米抗体、抗体、核酸分子、表达载体、重组细胞、抗体-药物缀合物或药物组合物。
[0084]
在本公开的另一个方面，提供了抑制sars-cov-2的刺突糖蛋白与人血管紧张素转化酶2结合或阻断sars-cov-2感染的方法。在本公开的一些实施方案中，该方法包括给予样品或向受试者施用有效量的上述纳米抗体、抗体、核酸分子、表达载体、重组细胞、抗体-药物缀合物或药物组合物。
[0085]
在本公开的另一个方面，提供了用于检测sars-cov-2刺突糖蛋白rbd或sars-cov-2刺突糖蛋白或sars-cov-2的试剂盒。在本公开的一些实施方案中，试剂盒包含上述纳米抗体、抗体或抗体-药物缀合物。
[0086]
在本公开的另一个方面，提供了上述纳米抗体、抗体、核酸分子、表达载体、重组细胞和抗体-药物缀合物或药物组合物在制备用于检测sars-cov-2刺突糖蛋白rbd、sars-cov-2刺突糖蛋白或sars-cov-2的试剂盒中的用途。
[0087]
在本公开的另一个方面，提供了上述纳米抗体、抗体、核酸分子、表达载体、重组细胞、抗体-药物缀合物或药物组合物，其用于检测sars-cov-2刺突糖蛋白rbd、sars-cov-2刺突糖蛋白或sars-cov-2。
[0088]
在本公开的另一个方面，提供了检测sars-cov-2刺突糖蛋白rbd、sars-cov-2刺突糖蛋白或sars-cov-2的方法。在本公开的一些实施方案中，该方法包括将上述纳米抗体、抗体、核酸分子、表达载体、重组细胞和抗体-药物缀合物或药物组合物给予待测样品。
[0089]
下面将描述更多的方面和优点，其至少一部分将在以下结合附图的描述中变得清
楚，和/或从下文描述的实施方案中对本领域普通技术人员显而易见。
附图说明
[0090]
通过结合附图对以下实施方案的详细描述，本发明的上述特征和优点及其附加特征和优点将在下文中得到更清楚的理解，其中：
[0091]
图1显示了结合rbd的纳米抗体筛选的过程。噬菌体展示的合成纳米抗体文库用于针对固定化fc标记的rbd蛋白进行生物淘选。3轮淘选后，进行单克隆噬菌体elisa以鉴定结合rbd的纳米抗体。测序后，对独特的克隆进行vhh基因的pcr拯救，然后进行重叠pcr以组装启动子和fc片段，其中vhh作为vhh-fc哺乳动物表达盒。pcr产物转染到expicho细胞进行表达；上清液用于下游测定，以鉴定阻断rbd与hace2相互作用的纳米抗体。
[0092]
图2显示了rbd阻断纳米抗体的竞争elsia测定。表达vhh-fc的expicho细胞的培养基用于竞争elsia，以筛选阻断rbd与包被的hace2结合的纳米抗体。作为对照，hace2-fc和vhh72-fc(pc vhh-fc)显示rbd与包被的hace2蛋白结合的抑制作用。在实验孔中，hace2-fc由78个rbd vhh克隆中的每一个所替换。通过减少由rbd蛋白产生的od450信号来测量rbd与hace2结合的阻断。
[0093]
图3显示了纯化的fc标记的纳米抗体的sds-page测定。通过蛋白a树脂从expicho细胞的培养基中纯化fc标记的纳米抗体。2ug蛋白质用于还原和非还原条件下的sds-page分析。
[0094]
图4显示了fc标记的纳米抗体的elisa测试。将纯化的fc标记的纳米抗体系列稀释并加入rbd包被的免疫板以测试亲和力。fc标记的vhh72和hace2分别用作参考和阳性对照。
[0095]
图5显示了通过spr对fc标记的纳米抗体的多浓度亲和力测量。将fc标记的纳米抗体捕获到蛋白a芯片上，并使用一系列浓度的rbd蛋白来测量亲和力(稀释比：2；浓度水平：至少5(不包括不规则曲线或高背景曲线；包括重复浓度)。先对所有数据进行双重参考，然后使用biacore insight evaluation software v3.0,ge中的1:1动力学结合模型进行拟合来确定表观kd。
[0096]
图6显示了通过spr评估的rbd/hace2相互作用的阻断。如第一条曲线所示，将fc标记的纳米抗体和参考抗体(novoprotein中和抗体)捕获到蛋白a芯片上。当注射50nm rbd(covid-19s.p.rbd)时检测到第二条结合曲线。最后，注射100nm hace2(ace2)在所有实验中均未显示进一步的结合曲线。
[0097]
图7显示了用假病毒测试的纳米抗体的中和活性。测量了纳米抗体对由表达sars-cov-2s蛋白和荧光素酶的假病毒导致的sars-cov-2感染的抑制作用。计算反映病毒感染相对于对照的相对荧光素酶活性百分比，并拟合曲线以提取ic
50
值，ic
50
值显示在括号中(以nm为单位)。
[0098]
图8显示了通过真实sars-cov-2测试的纳米抗体的中和活性。通过vero e6细胞中的rna水平测量了由纳米抗体介导的sars-cov-2病毒对vero e6细胞的感染的中和作用。fc标记的纳米抗体介导的病毒中和作用表示为相对感染百分比，并拟合感染曲线以提取ic
50
值，ic
50
值显示在括号中(以nm为单位)。
[0099]
图9显示了vhh60介导的小鼠免受sars-cov-2致命感染的保护作用。a，动物攻击方案。将总计10只小鼠分到每组中，5只小鼠3d.p.i后处死，其余小鼠满足一定标准后处死。b，
357 768-a中。
[0111]
为了比较两个或更多个氨基酸序列，第一氨基酸序列和第二氨基酸序列之间的“序列同一性”百分比可以通过[第一氨基酸序列中与第二个氨基酸序列中相应位置的氨基酸残基相同的氨基酸残基数]除以[第一氨基酸序列中的核苷酸总数]乘以[100％]，其中第二个氨基酸序列中每个氨基酸残基的缺失、插入、替换或添加，与第一氨基酸序列相比，被认为是单个氨基酸残基(位置)的差异，即如本文所限定的“氨基酸差异”。
[0112]
或者，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度可以使用例如上述用于确定核苷酸序列的序列同一性程度的那些已知的计算机算法同样使用标准设置来计算。
[0113]
通常，为了根据上文概述的计算方法确定两个氨基酸序列之间“序列同一性”的百分比，将具有最多氨基酸残基的氨基酸序列作为“第一”氨基酸序列，另一个氨基酸序列将作为“第二”氨基酸序列。
[0114]
此外，在确定两个氨基酸序列之间的序列同一性的程度时，技术人员可以考虑所谓的“保守性”氨基酸取代，其通常可以描述为氨基酸残基被替换为具有类似化学结构的另一种氨基酸残基的氨基酸取代，其对多肽的功能、活性或其他生物学性质几乎没有影响或基本上没有影响。此类保守性氨基酸取代在本领域中是众所周知的，例如wo 04/037999，gb-a-2 357 768，wo 98/49185，wo 00/46383和wo 01/09300；并且(优选地)这些取代的类型和/或组合可以根据来自wo 04/037999以及wo 98/49185以及其中引用的进一步参考文献的相关教导来选择。
[0115]
此类保守性取代优选地是以下组(a)到(e)中的一个氨基酸被同组中的另一个氨基酸残基取代的取代：(a)小的脂肪族、非极性或弱极性残基：ala、ser、thr、pro和gly；(b)极性、带负电的残基及其(不带电的)酰胺：asp、asn、glu和gln；(c)极性、带正电的残基：his、arg和lys；(d)大的脂肪族、非极性残基：met、leu、he、val和cys；以及(e)芳香族残基：phe、tyr和trp。
[0116]
特别优选的保守性取代如下：ala到gly或到ser；arg到lys；asn到gln或到his；asp到glu；cys到ser；gln到asn；glu到asp；gly到ala或到pro；his到asn或到gln；ile到leu或到val；leu到ile或到val；lys到arg、到gln或到glu；met到leu、到tyr或到ile；phe到met、到leu或到tyr；ser到thr；thr到ser；trp到tyr；tyr到trp；和/或phe到val、到ile或到leu。
[0117]
本发明描述的应用于多肽的任何氨基酸取代也可以基于由schulz等人，principles of protein structure,springer-verlag,1978开发的不同物种的同源蛋白质之间的氨基酸变异频率的分析，基于chou和fasman，biochemistry 13：211,1974和adv.enzymol.,47：45-149,1978开发的结构形成潜能分析，以及基于eisenberg等人，proc.nat.acad sci.usa 81：140-144,1984；kyte&doolittle,j mol.biol.157：105-132,1981，以及goldman等人,ann.rev.biophys.chem.15：321-353,1986开发的蛋白质疏水性模式分析，这些文献通过整体引用并入本发明。纳米抗体的一级、二级和三级结构的信息在本文的描述和上面引用的通常背景技术中给出。此外，为此目的，来自美洲驼(llama)的vhh结构域的晶体结构例如由desmyter等人,nature structural biology,vol.3,9,803(1996)；spinelli等人,natural structural biology(1996)；vol.3,752-757；和decanniere等人,structure,vol.7,4,361(1999)给出。提供了在常规vh结构域中形成vh/vl界面的一些氨基酸残基以及这些位置上潜在的骆驼化取代的进一步信息。
[0118]
如果氨基酸序列和核酸序列在其全长上具有100％的序列同一性(如本文所限定)，则称它们是“相同的”。
[0119]
核酸序列或氨基酸序列被认为是“(处于)基本上分离的(形式)”，例如，与其天然生物来源和/或获得其的反应介质或培养基相比，当其已经与在所述来源或介质中通常与其结合的至少一种其他成分分离时，其他成分例如为另一种核酸、另一种蛋白质/多肽、另一种生物成分或大分子或至少一种污染物、杂质或次要成分。特别地，当核酸序列或氨基酸序列已被纯化至少2倍、特别是至少10倍、更特别至少100倍和最高达1000倍或更多时，其被认为是“基本上分离的”。“处于基本上分离的形式”的核酸序列或氨基酸序列优选地是基本上同质的，如使用合适的技术如合适的色谱技术如聚丙烯酰胺-凝胶电泳确定的。
[0120]
术语“抗原决定簇”是指抗原上由抗原结合分子(例如本发明的纳米抗体)识别的表位，更具体地由所述分子的抗原结合位点识别的表位。术语“抗原决定簇”和“表位”在本文中也可以互换使用。
[0121]
对特定抗原决定簇、表位、抗原或蛋白质(或其至少一部分、片段或表位)可以结合的、具有亲和力的和/或具有特异性的氨基酸序列(例如纳米抗体、抗体)被称为“针对”或“直接针对”所述抗原决定簇、表位、抗原或蛋白质。
[0122]
术语“特异性”是指特定抗原结合分子或抗原结合蛋白(例如本发明的纳米抗体或多肽)分子可以结合的不同类型的抗原或抗原决定簇的数量。抗原结合蛋白的特异性可以基于亲和力和/或亲合力来确定。亲和力由抗原与抗原结合蛋白解离的平衡常数(kd)表示，是抗原决定簇和抗原结合蛋白的抗原结合位点之间的结合强度的量度：kd值越小，抗原决定簇和抗原结合分子之间的结合强度越强(或者，亲和力也可以表示为亲和力常数(ka)，其为1/kd)。亲合力是抗原结合分子(例如本发明的纳米抗体)与相关抗原之间结合强度的量度。亲合力涉及抗原决定簇与抗原结合分子的抗原结合位点之间的亲和力以及抗原结合分子上存在的相关结合位点的数量。通常，抗原结合蛋白(例如本发明的纳米抗体和/或多肽)将以10-5
至10-12
摩尔/升或更小的解离常数(kd)结合，优选以10-7
至10-12
摩尔/升或更小，更优选以10-8
至10-12
摩尔/升的解离常数(kd)结合，和/或以至少107m-1
，优选至少108m-1
，更优选至少109m-1
，例如至少10
12
m-1
的结合亲和力结合。通常认为任何大于10-4
摩尔/升的kd值代表非特异性结合。优选地，本发明的纳米抗体将以小于500nm，优选小于200nm，更优选小于10nm，例如小于500pm的亲和力结合期望抗原。抗原结合蛋白与抗原或抗原决定簇的特异性结合可以通过本身已知的任何合适的方式测定，包括例如斯卡查德分析和/或竞争性结合测定，如放射免疫测定(ria)、酶免疫测定(eia)和三明治竞争测定和本领域中本身已知的不同变型。
[0123]
如本文进一步描述的，纳米抗体的氨基酸序列和结构可以被认为——但不限于此——包含四个框架区或“fr”，在本领域和本文中分别称为“框架区1”或“fr1”；“框架区2”或“fr2”；“框架区3”或“fr3”；和“框架区4”或“fr4”；这些框架区被三个互补决定区或“cdr”中断，这些互补决定区或“cdr”在本领域中分别称为“互补决定区1”或“cdr1”；“互补决定区2”或“cdr2”；和“互补决定区3”或“cdr3”。
[0124]
还如本文进一步描述的，纳米抗体中氨基酸残基的总数可以在120-130的范围内，优选为121-129，最优选为121。然而应当注意，纳米抗体的部分、片段、类似物或衍生物(如本文进一步描述的)对其长度和/或大小没有特别限制，只要这些部分、片段、类似物或衍生
物满足本文概述的进一步要求并且也优选地适用于本文描述的目的。
[0125]
纳米抗体的氨基酸残基根据kabat等人(“sequence of protein of immunological interest”,us public health services,nih bethesda,md,publication no.91)给出的vh结构域的通用编号进行编号，如上述参考的riechmann和muyldermans的文章中应用于骆驼科动物的v
hh
结构域(参见例如上述参考文献的图2)。在这方面，应当注意——正如本领域中对于vh结构域和对于v
hh
结构域所熟知的——每个cdr中的氨基酸残基的总数可以变化并且可能不对应于通过kabat编号表示的氨基酸残基的总数。也就是说，根据kabat编号的一个或多个位置可能不会占据于实际序列中，或者实际序列可能包含比kabat编号允许的数量更多的氨基酸残基。这意味着，通常，根据kabat的编号可能对应或可能不对应于实际序列中氨基酸残基的实际编号。
[0126]
对vh结构域的氨基酸残基进行编号的替代方法，也可以以类似的方式应用于来自骆驼科动物的v
hh
结构域和纳米抗体，其为chothia等人(nature 342,877-883(1989)描述的方法，所谓的“abm定义”和所谓的“contact定义”。然而，在本说明书、权利要求书和附图中，除非另有说明，将遵循如由riechmann和muyldermans应用于v
hh
结构域的根据kabat的编号。
[0127]
根据上述参考文献中使用的术语，存在于天然存在的重链抗体中的可变结构域也将被称为“v
hh
结构域”，以将其与存在于常规4链抗体中的重链可变结构域(下文将称为“vh结构域”)和存在于常规4链抗体中的轻链可变结构域(下文将称为“v
l
结构域”)区分开来。
[0128]
如上文提及的现有技术中所述，v
hh
结构域具有许多独特的结构特征和功能特性，这些结构特征和功能特性使得分离的v
hh
结构域(以及基于v
hh
结构域的与天然存在的v
hh
结构域共享这些结构特征和功能特性的纳米抗体)和含有分离的v
hh
结构域的蛋白质非常有利于用作功能性抗原结合结构域或蛋白质。特别地，但不限于此，v
hh
结构域(其本质上已经被“设计”以在不存在轻链可变结构域且不与轻链可变结构域发生任何相互作用的情况下与抗原功能性结合)和纳米抗体可以作为单一的、相对较小的、功能性抗原结合结构单元、结构域或蛋白质。这将v
hh
结构域与常规4链抗体的vh和v
l
结构域区分开来，后者本身通常不适合作为单一抗原结合蛋白或结构域实际应用，而是需要以某种形式组合以提供功能性抗原结合单元(例如在如fab片段的常规抗体片段中；在由与v
l
结构域共价连接的vh结构域组成的scfv片段中)。
[0129]
由于这些独特的特性，使用v
hh
结构域和纳米抗体作为单一抗原结合蛋白或抗原结合结构域(即作为较大蛋白质或多肽的一部分)与使用常规vh和v
l
结构域、scfv或常规抗体片段(例如fab或f(ab’)2片段)相比提供了许多显著优势：仅需要单个结构域以高亲和力和高选择性结合抗原，因此不需要存在两个单独的结构域，也不需要确保这两个结构域以正确的空间构象和构型存在(即通过使用专门设计的如scfv中的接头)。
[0130]vhh
结构域和纳米抗体可以由单个基因表达，不需要翻译后折叠或修饰。
[0131]vhh
结构域和纳米抗体可以很容易地改造为多价和多特异性形式(如本文进一步讨论的)。
[0132]vhh
结构域和纳米抗体是高度可溶的并且不具有聚集的趋势(如ward等人，nature,vol.341,1989,p.544中描述的“小鼠衍生的抗原结合结构域”)。
[0133]vhh
结构域和纳米抗体对热、ph、蛋白酶和其他变性剂或条件高度稳定(参见例如ewert等人，同上)。
[0134]vhh
结构域和纳米抗体即使在生产预期的规模上也易于相对便宜的制备。例如，v
hh
结构域、纳米抗体和包含它们的蛋白质/多肽可以使用微生物发酵(例如如下文进一步描述的)产生并且不需要使用如例如常规抗体片段所使用的哺乳动物表达系统。
[0135]
与传统的4链抗体及其抗原结合片段相比，v
hh
结构域和纳米抗体相对较小(约15kda，或比传统igg小10倍)，因此比此类常规的4链抗体及其抗原结合片段显示出更高的组织(包括但不限于实体瘤和其他致密组织)渗透性。
[0136]vhh
结构域和纳米抗体可以显示出所谓的空腔结合特性(尤其是由于其与常规vh结构域相比扩展的cdr3环)，因此还可以进入常规4链抗体和抗原结合片段无法进入的靶标和表位。例如，已经显示v
hh
结构域和纳米抗体可以抑制酶(参见例如wo 97/49805；transue等人，(1998)，同上；和lauwereys等人，(1998)，同上)。
[0137]
如上所述，本发明总体上涉及针对sars-cov-2刺突糖蛋白(s)受体结合结构域(rbd)的纳米抗体，以及包含或基本上组成为一种或多种此类纳米抗体的多肽，其可用于本文所述的预防、治疗和/或诊断目的。
[0138]
还如本文进一步描述的，本发明还涉及编码此类纳米抗体的核酸、制备此类纳米抗体的方法、表达或能够表达此类纳米抗体的宿主细胞、包含此类纳米抗体、核酸或宿主细胞的组合物、以及此类纳米抗体、核酸、宿主细胞或组合物的用途。
[0139]
通常，应当注意，如本文所用的术语纳米抗体具有其最广泛的含义而不限于特定的生物来源或特定的制备方法。
[0140]
在第一优选但非限制性的方面，本发明的纳米抗体可以具有结构
[0141]
frl-cdrl-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4
[0142]
其中fr1至fr4分别指框架区1至4，并且其中cdr1至cdr3分别指互补决定区1至3。
[0143]
本发明的人源化纳米抗体可以如本文所限定，但前提是与天然存在的v
hh
结构域的相应框架区相比，其在至少一个框架区中具有至少“一个氨基酸差异”(如本文所限定)。更具体地，根据本发明的一个非限制性方面，纳米抗体可以如本文所限定，但前提是与天然存在的v
hh
结构域的相应框架区相比，其在至少一个标志残基(包括在位置108、103和/或45的残基)具有至少“一个氨基酸差异”(如本文所限定)。通常，纳米抗体在fr2和/或fr4中的至少一个中，特别是fr2和/或fr4中的至少一个标志残基处，与天然存在的v
hh
结构域具有至少一个此类氨基酸差异。
[0144]
本发明的另一个实施方案是能够编码如上限定的纳米抗体或抗体的核酸。
[0145]
本发明的另一个实施方案是包含所述纳米抗体或所述抗体、接头和小分子细胞毒性药物的抗体-药物缀合物。抗体-药物缀合物(adc)是连接生物活性小分子药物与抗体(例如本发明的纳米抗体或抗体)的化学连接，其作为载体将小分子药物递送至靶细胞。
[0146]
本发明的另一个实施方案是包含如上限定的纳米抗体和/或核酸的组合物。
[0147]
本发明的另一个实施方案是进一步包含药学上可接受的载体的如上限定的组合物。
[0148]
本发明的另一个实施方案是如上限定的抗体、或如上限定的核酸、或如上限定的组合物用作药物。
[0149]
本发明的另一个实施方案是如上限定的多肽、或如上限定的核酸、或如上限定的组合物用于治疗、预防和/或减轻由sars-cov-2感染介导的疾病。
[0150]
本发明的另一个实施方案是如上限定的纳米抗体、或如上限定的核酸、或如上限定的组合物在制备用于治疗、预防和/或减轻由sars-cov-2感染介导的疾病的药物中的用途。
[0151]
本发明的另一个实施方案是如上限定的纳米抗体、核酸或组合物或其用途，其中所述病症是冠状病毒病2019(covid-19)。
[0152]
本发明的另一个实施方案是如上限定的纳米抗体、核酸或组合物或如上限定的纳米抗体的用途，其中所述纳米抗体通过静脉内、皮下、口服、舌下、鼻腔或吸入施用。
[0153]
本发明的另一个实施方案是预防性或治疗性治疗covid-19的方法，包括向患者施用有效剂量的如上限定的组合物。
[0154]
本发明的另一个实施方案是产生如上限定的纳米抗体的方法，包括：
[0155]
a)在允许多肽表达的条件下培养包含能够编码如上限定的多肽的核酸的宿主细胞，以及，
[0156]
b)从培养物中回收产生的多肽。
[0157]
本发明的另一个实施方案是如上限定的方法，其中所述宿主细胞是细菌、酵母或哺乳动物细胞。
[0158]
本发明的另一个实施方案是诊断由sars-cov-2感染介导的疾病或病症的方法，包括以下步骤：
[0159]
a)使样品与如上限定的纳米抗体接触，以及
[0160]
b)检测所述纳米抗体与所述样品的结合，以及
[0161]
c)将在步骤(b)中检测到的结合与标准进行比较，其中相对于所述样品的结合差异表示对以sars-cov-2感染为特征的疾病或病症的诊断。
[0162]
本发明的另一个实施方案是诊断由sars-cov-2感染介导的疾病或病症的方法，包括以下步骤：
[0163]
a)使样品与如上限定的纳米抗体接触，以及
[0164]
b)测定样品中刺突糖蛋白(s)或刺突糖蛋白(s)rbd的量，
[0165]
c)将步骤(b)中测定的量与标准进行比较，其中相对于所述样品的量的差异表示对以sars-cov-2感染为特征的疾病或病症的诊断。
[0166]
本发明的另一个实施方案是用于诊断由sars-cov-2感染介导的疾病或病症的试剂盒，其用于如上限定的方法中。
[0167]
本发明的另一个实施方案是用于检测sars-cov-2刺突糖蛋白rbd或sars-cov-2刺突糖蛋白或sars-cov-2的试剂盒，其用于如上限定的方法中。
[0168]
本发明的另一个实施方案是进一步包含一种或多种体内显像剂的如上限定的纳米抗体。
[0169]
本发明的一个实施方案涉及包含至少一种本发明的纳米抗体和至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。
[0170]
本发明的抗rbd纳米抗体与sars-cov-2刺突糖蛋白rbd结合。根据本发明的一个方面，抗rbd纳米抗体与靶标a-β结合，并抑制其与一种或多种其他hace2的相互作用。
[0171]
测量抗rbd纳米抗体的结合的elisa测定是众所周知的。
[0172]
如本文所公开的抗rbd多肽及其衍生物不仅具有常规抗体的有利特征，例如低毒
性和高选择性，而且其还表现出额外的特性。其更易溶解；因此，与常规抗体相比，其可以以更高浓度储存和/或施用。
[0173]
常规抗体在室温下不稳定，制备和储存必须冷藏，从而需要必要的冷藏实验室设备、储存和运输，从而而增加时间和费用。本发明的抗rbd纳米抗体在室温下稳定；因此，其可以在不使用制冷设备的情况下制备、储存和/或运输，从而节省成本、时间和环境。此外，常规抗体不适用于在生物活性温度范围以外的温度(例如37
±
20℃)下进行的测定或试剂盒。
[0174]
与常规抗体相比，本文所公开的抗-rbd纳米抗体的其他有利特征包括循环半衰期的调节，其可以根据本发明通过例如白蛋白偶联或通过偶联至一种或多种针对血清蛋白例如血清白蛋白的纳米抗体来调节。本发明的一个方面是双特异性抗rbd纳米抗体，其一种特异性针对血清蛋白例如血清白蛋白，而另一种针对如wo04/041865中所公开并作为参考并入本文的靶标。增加半衰期的其他方法包括将本发明的多肽与fc或其他针对rbd的纳米抗体(即产生多价纳米抗体——二价、三价等)偶联或与聚乙二醇偶联。可控制的半衰期是调节具有即时效果的剂量所期望的。
[0175]
常规抗体不适合在通常生理ph范围之外的环境中使用。其在低或高ph值下不稳定，因此不适合口服施用。骆驼科抗体可以抵抗例如极端ph、变性试剂和高温的苛刻条件，因此使本文公开的抗rbd抗体适合通过口服施用递送。骆驼科抗体对蛋白酶的作用具有抗性，而常规抗体的抗性较差。
[0176]
如本文所公开的抗a-β多肽的免疫原性低于常规抗体。已发现与人vh框架区具有95％氨基酸序列同源性的骆驼科抗体的亚类。这表明在人类患者中施用后的免疫原性可以预期为轻微的甚至不存在的。或者，如果需要，纳米抗体的人源化出人意料地只需要几个需要被取代的残基。
[0177]
本发明的一个方面是包含至少一种抗rbd重链抗体，特别是由其衍生的纳米抗体的抗rbd多肽。本发明的一个方面是这样的多肽可以包含其他组分。这样的组分可以是多肽序列，例如一种或多种抗a-rbd纳米抗体、一种或多种抗血清白蛋白纳米抗体。其他融合蛋白也在本发明的范围内，并且可以包括例如与载体多肽、信号分子、标签和酶的融合。其他组分可以包括例如放射性标记、有机染料、荧光化合物。
[0178]
根据本发明的一个方面，本发明的抗rbd多肽可以包含至少两个相同或不相同的抗rbd纳米抗体序列。本发明的一个方面可以是至少两个上述序列对rbd不具有相同的亲和力，因此形成组合弱亲和力和高亲和力结合序列的抗rbd多肽。
[0179]
构建二价多肽的方法是本领域已知的(例如us 2003/0088074)，并且也描述于下文中。
[0180]
可以期望在效应子功能方面修饰本发明的抗rbd多肽以增强其治疗功效。例如，与某些fc结构域尤其是与人来源的fc结构域融合的纳米抗体融合物可能是有利的。
[0181]
在顺序施用中，多肽可以在施用药剂之前和/或之后施用一次或任意次数并且以各种剂量施用。顺序施用可以与同时或顺序施用结合。
[0182]
本发明的另一个实施方案是如本文所述的抗rbd多肽，其中一个或多个纳米抗体是人源化的。人源化纳米抗体可以是抗rbd纳米抗体、抗血清白蛋白、根据本发明有用的其他纳米抗体或这些的组合。
[0183]
人源化是指突变使得在人类患者中施用时潜在的免疫原性很小或不存在。根据本发明，将多肽人源化可包括以下步骤：将一个或多个非人免疫球蛋白氨基酸替换为人共有序列或人种系基因序列中存在的人对应物而不使该多肽失去其典型特征，即人源化不会显著影响所得多肽的抗原结合能力。
[0184]
根据本发明的一个方面，人源化纳米抗体被限定为与人框架区具有至少50％同源性(例如，55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、100％)的纳米抗体。
[0185]
发明人已经确定了可以在不降低天然亲和力的情况下修饰纳米抗体的氨基酸残基，以降低其对异源物种的免疫原性。
[0186]
发明人还发现，纳米抗体多肽的人源化仅需要在单个多肽链中引入和诱变有限数量的氨基酸，而不会显著丧失结合和/或抑制活性。这与scfv、fab、(fab’)2和igg的人源化形成对比，后者需要在轻链和重链两条链中引入氨基酸变化，并维持两条链的组装。
[0187]
本发明的同源序列可以包括已经人源化的抗rbd多肽。新型纳米抗体的人源化将进一步降低在施用于人类个体时不期望的免疫应答的可能性。
[0188]
本发明的一个实施方案涉及包含至少一种纳米抗体的多肽，其中一个或多个氨基酸残基已被取代而基本上不改变抗原结合能力。
[0189]
技术人员将认识到本发明的抗rbd多肽可以被修饰，并且这样的修饰在本发明的范围内。例如，多肽可以用作药物载体，在这种情况下，其可以与治疗性活化剂融合，或者其溶解度特性可以通过与离子/双极性基团的融合而改变，或者其可以通过与合适的成像标志物融合用于成像，或者其可以包含修饰的氨基酸等。多肽也可以制备成盐。此类基本上保留与rbd结合的修饰在本发明的范围内。
[0190]
从本文的公开内容可以清楚地看出，使用如本文限定的本发明纳米抗体的天然或合成类似物、突变体、变体、等位基因、同源物和直系同源物(本文统称为“类似物”)，特别是seq id no 22-28的纳米抗体的类似物也在本发明的范围内。因此，根据本发明的一个实施方案，术语“本发明的纳米抗体”在其最广义上也涵盖此类类似物。
[0191]
通常，与本文限定的本发明纳米抗体相比，在此类类似物中，一个或多个氨基酸残基可能已被替换、缺失和/或添加。此类取代、插入或缺失可以在一个或多个框架区和/或一个或多个cdr中进行。当在一个或多个构架区中进行此类取代、插入或缺失时，它们可以在一个或多个标志残基和/或构架残基中的一个或多个其他位置进行，但是通常较不优选标志残基的取代、插入或缺失(除非这些是如本文所述的合适的人源化取代)。
[0192]
又一种修饰可以包括引入一个或多个可检测标签或其他产生信号的基团或部分，这取决于标记的纳米抗体的预期用途。用于附着、使用和检测纳米抗体的合适标签和技术对技术人员而言是清楚的，例如包括但不限于荧光标签(例如荧光素、异硫氰酸盐、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛、和荧光胺和例如
152
eu或其他镧系金属的荧光金属)、磷光标签、化学发光标签或生物发光标签(例如鲁米那、异鲁米诺、热吖啶酯、咪唑、吖啶鎓盐、草酸酯、二氧杂环丁烷或gfp及其类似物)、放射性同位素(例如3h、
125
i、
32
p、
35
s、
14
c、
51
cr、
36
cl、
57
co、
58
co、
59
fe、和
75
se)、金属、金属螯合物或金属阳离子(例如金属阳离子，例如
99m
tc、
123
i、
111
in、
131
i、
97
ru、
67
cu、
67
ga、和
68
ga或其他特别适用于体内、体外或原位诊断和成像的金属或金属阳离子，例如
157
gd、
55
mn、
162
dy、
52
cr、和
56
fe)、以及发色团和酶(如苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-v-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、磷酸
丙糖异构酶、生物素过氧化物酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-vi-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶)。其他合适的标签对技术人员而言是清楚的，例如包括可以使用nmr或esr光谱检测的部分。
[0193]
根据具体标签的选择，本发明的此类标记的纳米抗体和多肽可以例如用于体外、体内或原位测定(包括本身已知的免疫测定，例如elisa、ria、eia和其他“三明治测定”等)以及用于体内诊断和成像目的。
[0194]
如本领域技术人员将清楚的，另一种修饰可涉及引入例如螯合上述金属或金属阳离子之一的螯合基团。合适的螯合基团例如包括但不限于二亚乙基三胺五乙酸(dtpa)或乙二胺四乙酸(edta)。
[0195]
又一种修饰可以包括引入作为特异性结合对例如生物素-(链霉)抗生物素蛋白结合对的一部分的官能团。这样的官能团可用于将本发明的纳米抗体连接到与结合对的另一半结合的另一种蛋白质、多肽或化学化合物(即通过形成结合对)。例如，本发明的纳米抗体可以与生物素缀合，并连接至与抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白缀合的另一种蛋白质、多肽、化合物或载体。例如，此类缀合的纳米抗体可以用作报告基因，例如在可检测的信号产生剂与抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白缀合的诊断系统中。例如，此类结合对还可用于将本发明的纳米抗体与包括适用于药学目的的载体的载体结合。一个非限制性的实例是在cao和suresh，journal of drug targeting,8,4,257(2000)中描述的脂质体制剂的情况。此类结合对也可用于将治疗性活化剂连接至本发明的纳米抗体。
[0196]
其他潜在的化学和酶修饰对技术人员而言是清楚的。也可以出于研究目的(例如，研究功能-活性关系)引入此类修饰。参考例如lundblad和bradshaw,biotechnol.appl.biochem.,26,143-151(1997)。
[0197]
如上所述，本发明还涉及基本上由至少一种本发明的纳米抗体组成的蛋白质或多肽。“基本上由...组成”是指本发明多肽的氨基酸序列与本发明纳米抗体的氨基酸序列完全相同或与具有有限数量的氨基酸残基的本发明纳米抗体的氨基酸序列对应，有限数量的氨基酸残基例如为1-20个氨基酸残基，例如1-10个氨基酸残基，优选1-6个氨基酸残基，例如1、2、3、4、5或6个氨基酸残基，添加至纳米抗体的氨基酸序列的氨基末端、羧基末端或氨基末端和羧基末端。
[0198]
所述氨基酸残基可能会或可能不会改变、变更或以其他方式影响纳米抗体的(生物)性质，并且可能会或可能不会为纳米抗体添加进一步的功能性。
[0199]
根据另一个实施方案，本发明的多肽包含本发明的纳米抗体，该纳米抗体在其氨基末端、在其羧基末端、或在其氨基末端和在其羧基末端融合至少一个另外的氨基酸序列，即以提供包含本发明的所述纳米抗体和一个或多个另外的氨基酸序列的融合蛋白。这种融合在本文中也将被称为“纳米抗体融合”。
[0200]
一个或多个另外的氨基酸序列可以是任何合适的和/或期望的氨基酸序列。另外的氨基酸序列可能会或可能不会改变、变更或以其他方式影响纳米抗体的(生物)性质，并且可能会或可能不会为本发明的纳米抗体或多肽添加进一步的功能性。优选地，另外的氨基酸序列使得其赋予本发明的纳米抗体或多肽一种或多种期望的特性或功能性。
[0201]
本发明的核酸可以是单链或双链dna或rna的形式，优选地是双链dna的形式。例
如，本发明的核苷酸序列可以是基因组dna、cdna或合成dna(例如具有已特别适应在预期宿主细胞或宿主生物体中表达的密码子使用的dna)。
[0202]
根据本发明的一个实施方案，本发明的核酸处于如本文所限定的基本上分离的形式。
[0203]
本发明的核酸也可以是载体的形式、存在于载体中和/或作为载体的一部分，载体例如为质粒、粘粒或yac，其也可以是基本上分离的形式。
[0204]
本发明的核酸也可以是遗传构建体的形式、存在于遗传构建体中和/或作为遗传构建体的一部分，这对本领域技术人员而言是清楚的。此类遗传构建体通常包含至少一种本发明的核酸，该核酸任选地连接至本身已知的遗传构建体的一种或多种元件，例如一种或多种合适的调节元件(例如合适的启动子、增强子、终止子等)和本文提及的遗传构建体的其他元件。此类包含至少一种本发明核酸的遗传构建体在本文中也将被称为“本发明的遗传构建体”。
[0205]
本发明的遗传构建体可以是dna或rna，并且优选地是双链dna。本发明的遗传构建体还可以是适于转化期望宿主细胞或宿主生物体的形式，适于整合到期望宿主细胞的基因组dna中的形式，或适于在期望的宿主生物体中独立复制、维持和遗传的形式。例如，本发明的遗传构建体可以是例如质粒、粘粒、yac、病毒载体或转座子的载体的形式。特别地，载体可以是表达载体，即可以提供体外和/或体内表达(例如在合适的宿主细胞、宿主生物体和/或表达系统中)的载体。
[0206]
在优选但非限制性的实施方案中，本发明的遗传构建体包含：a)至少一种本发明的核酸，其可操作地连接到b)一个或多个调节元件，例如启动子和任选地合适的终止子；以及任选的c)本身已知的遗传构建体的一个或多个其他元件；其中术语“调节元件”、“启动子”、“终止子”和“可操作地连接”具有其在本领域中的通常含义(如本文进一步描述的)；并且其中存在于遗传构建体中的所述“其他元件”可以是例如3
’‑
utr或5
’‑
utr序列、前导序列、选择标志物、表达标志物/报告基因、和/或可以促进或增加转化或整合(效率)的元件。用于此类遗传构建体的这些和其他合适的元件对于技术人员而言是清楚的，并且可以例如取决于所使用的构建体的类型、期望的宿主细胞或宿主生物体；表达本发明的目的核苷酸序列的方式(例如，通过组成型、瞬时或诱导型表达)；和/或待使用的转化技术。例如，本身已知的用于表达和产生抗体和抗体片段(包括但不限于(单)域抗体和scfv片段)的调节序列、启动子和终止子可以以基本类似的方式使用。
[0207]
优选地，在本发明的遗传构建体中，所述至少一种本发明核酸和所述调节元件，以及任选的所述一种或多种其他元件，彼此“可操作地连接”，这通常意味着其相互之间存在功能关系。例如，如果所述启动子能够启动或以其他方式控制/调节编码序列的转录和/或表达(其中所述编码序列应理解为“在所述启动子的控制下”)，启动子被认为是“可操作地连接”至编码序列。通常，当两个核苷酸序列可操作地连接时，其将处于相同的方向并且通常也在相同的阅读框中。其通常也是基本上连续的，尽管这可能不是必需的。
[0208]
优选地，本发明的遗传构建体的调节元件和其他元件使得其能够在期望的宿主细胞或宿主生物体中提供其期望的生物学功能。
[0209]
例如，启动子、增强子或终止子在期望的宿主细胞或宿主生物体中应该是“可操作的”，这意味着(例如)所述启动子应该能够启动或以其他方式控制/调节与其可操作地连接
(如本文所限定)的核苷酸序列如编码序列的转录和/或表达。
[0210]
一些特别优选的启动子包括但不限于本身已知的用于在本文提及的宿主细胞中表达的启动子；并且特别是用于在细菌细胞中表达的启动子，例如本文提及的那些和/或实施例中使用的那些。
[0211]
选择标志物应该是允许——即在适当的选择条件下——已经(成功地)用本发明的核苷酸序列转化的宿主细胞和/或宿主生物体与没有被(成功)转化的宿主细胞/生物体区分开来的那些。此类标志物的一些优选但非限制性的实例是提供对抗生素(例如卡那霉素或氨苄青霉素)的抗性的基因、提供温度抗性的基因、或允许宿主细胞或宿主生物体在不存在对非转化细胞或生物体的存活至关重要的培养基中的某些因素、化合物和/或(食物)成分的情况下维持的基因。
[0212]
前导序列应该是允许在期望的宿主细胞或宿主生物体中进行期望的翻译后修饰和/或使得其将转录的mrna引导到细胞的期望部分或细胞器的那些。前导序列也可以允许从所述细胞分泌表达产物。因此，前导序列可以是在宿主细胞或宿主生物体中可操作的任何原序列、前序列或前原序列。在细菌细胞中的表达可以不需要前导序列。例如，本身已知用于表达和产生抗体和抗体片段(包括但不限于单结构域抗体和scfv片段)的前导序列可以以基本类似的方式使用。
[0213]
表达标志物或报告基因应该是允许在宿主细胞或宿主生物体中检测遗传构建体(存在于遗传构建体上的基因或核苷酸序列)的表达。表达标志物还可以任选地允许表达产物的定位，例如在细胞的特定部分或细胞器中和/或在多细胞生物体的特定细胞、组织、器官或部分中的定位。此类报告基因也可以表达为与本发明的氨基酸序列融合的蛋白质。一些优选但非限制性的实例包括例如gfp的荧光蛋白。
[0214]
合适的启动子、终止子和其他元件的一些优选但非限制性的实例包括可用于在本文提及的宿主细胞中表达的那些；并且特别是那些适合在细菌细胞中表达的那些，例如本文提到的那些和/或以下实施例中使用的那些。对于本发明的遗传构建体中可能存在/使用的启动子、选择标志物、前导序列、表达标志物和其他元件的一些(其他)非限制性实例——例如终止子、转录和/或翻译增强子和/或整合因子——参考例如上述提到的sambrook等人和ausubel等人的通用手册，以及在wo 95/07463、wo 96/23810、wo 95/07463、wo 95/21191、wo 97/11094、wo 97/42320、wo 98/06737、wo 98/21355、us-a-6,207,410、us-a-5,693,492和ep 1 085 089中给出的实例。其他实例对技术人员而言将是清楚的。还参考了上文引用的通常背景技术和本文引用的进一步参考文献。
[0215]
本发明的遗传构建体通常可以通过将本发明的核苷酸序列与上述一种或多种其他元件适当地连接来提供，例如使用如上述提到的sambrook等人和ausubel等人的通用手册中描述的技术。
[0216]
通常，本发明的遗传构建体将通过将本发明的核苷酸序列插入本身已知的合适(表达)载体中来获得。合适的表达载体的一些优选但非限制性的实例是在以下实施例中使用的那些以及本文提及的那些。
[0217]
本发明的核酸和/或本发明的遗传构建体可用于转化宿主细胞或宿主生物体，即用于表达和/或生产本发明的纳米抗体或多肽。合适的宿主或宿主细胞对技术人员而言将是清楚的，并且可以例如是任何合适的真菌、原核或真核细胞或细胞系或任何合适的真菌、
原核或真核生物。
[0218]
通常，对于本文提及的疾病和病症的预防和/或治疗，取决于待治疗的具体疾病或病症、待使用的本发明的具体纳米抗体和多肽的效力、具体施用途径和所使用的具体药物制剂或组合物，本发明的纳米抗体和多肽通常以每天每kg体重1克至0.01微克，优选每天每kg体重0.1克至0.1微克，例如每天每kg体重约1、10、100或1000微克的量，连续地(例如通过输注)作为每日单次剂量或作为一天中的多次分剂量施用。根据本文提及的因素，临床医生通常能够确定合适的日剂量。同样清楚的是在特定情况下，临床医生可能会例如基于上述因素及其专业判断选择偏离这些数量。一般而言，可以从针对相同靶标通过基本相同途径施用的可比较常规抗体或抗体片段的通常施用量中获得一些关于施用量的指导，但需要考虑到亲和力/亲合力、功效、生物分布、半衰期和技术人员熟知的类似因素的差异。
[0219]
还应注意，当本发明的纳米抗体含有一种或多种不同于上述优选cdr序列的其他cdr序列时，这些cdr序列可以以本身已知的任何方式获得，例如从纳米抗体(优选)、来自常规抗体的vh结构域(特别是来自人抗体)、重链抗体、常规4链抗体(例如常规人4链抗体)或针对a-β的其他免疫球蛋白序列中获得。此类针对a-β的免疫球蛋白序列可以如本领域技术人员将清楚的，以任何本身已知的方式产生，即通过用a-β免疫或通过用a-β筛选合适的免疫球蛋白序列文库或任何合适的组合。任选地，随后可以是诸如随机或定点诱变的技术和/或其他本身已知的亲和力成熟技术。用于产生此类免疫球蛋白序列的合适技术对于技术人员而言是清楚的，并且例如包括由hoogenboom,nature biotechnology,23,9,1105-1116(2005)综述的筛选技术。用于产生针对特定靶标的免疫球蛋白的其他技术包括例如纳米克隆技术(例如在未预先公开的美国临时专利申请60/648,922中描述的)、所谓的slam技术(例如在欧洲专利申请0 542 810中描述的)、使用表达人免疫球蛋白的转基因小鼠或众所周知的杂交瘤技术(参见例如larrick等人，biotechnology，vol.7，1989，p.934)。所有这些技术可用于产生针对a-β的免疫球蛋白，并且此类免疫球蛋白的cdr可用于本发明的纳米抗体，即如上所述。例如，可以确定、合成和/或分离此类cdr的序列，并将其插入本发明的纳米抗体的序列中(例如，以替换相应的天然cdr)，所有这些都使用如本文所述的那些的本身已知的技术，或包含此类cdr(或编码其的核酸)的本发明的纳米抗体可以再次使用本文提及的技术从头合成。
[0220]
现在将通过以下非限制性实施例和附图进一步描述本发明。
实施例
[0221]
1)材料和方法
[0222]
细胞系
[0223]
vero-e6(crl-1586)、caco2(htb-37)和293t(crl-3216)细胞在杜尔贝科改良伊格尔培养基(dmem，thermo fisher scientific，#12430112)中培养，提供10％胎牛血清(thermo fisher scientific,#26140079)、1％青霉素-链霉素(thermo fisher scientific,#15140148)，并于37℃、5％co2下增殖。expicho表达系统购自thermo fisher scientific(#a29133)。
[0224]
重组hace2和sars-cov-2刺突rbd蛋白的表达
[0225]
对于hace2-fc，人hace2的细胞外结构域(1-740氨基酸)(genbank:nm_021804.1)
从质粒(hg10108-acg,sinobiologic)中扩增，并与具有(gssss)3接头(seq id no:36)的人igg1 fc片段融合。将整个cds克隆到pcmv3表达载体中。根据手册，用expicho
tm
表达系统(a29133，thermo fisher scientific)表达构建体。通过蛋白质a亲和层析从培养上清液中纯化蛋白质，并在-70℃下储存在pbs缓冲液中。对于rbd构建体，sars-cov-2s蛋白(genbank:mn908947.3)的氨基酸319-541在n末端与信号肽mefglswvflvalfrgvqc(seq id no:37)或在c末端与6x his标签(对于rbd-his)和具有(gssss)3接头(seq id no:36)的人igg1 fc片段(对于rbd-fc)共表达。然后将这些构建体的整个cds克隆到pcmv3表达载体中。对于rbd-fc，根据手册在用pei max
tm
(24765-1,polysciences,inc.)转染的293f细胞中表达构建体。通过蛋白质a亲和层析从培养上清液中纯化蛋白质，并在pbs缓冲液中-70℃下储存。对于rbd-his，构建体用expicho
tm
表达系统表达。通过镍亲和层析从培养上清液中纯化蛋白质，并在-70℃下储存在pbs缓冲液中。
[0226]
对于镍亲和层析，来自瞬时表达产物的培养上清液通过3000g离心10分钟澄清，并与等体积的20mm咪唑、500mm nacl、20mm tris ph8.0混合。用histrap
tm
hp柱(17524701,cytiva inc.,marlborough ma,美国)纯化蛋白质，并用500mm咪唑、500mm nacl、20mm tris ph8.0洗脱。用ultra-15离心单元(milliporesigma life science center,burlington,massachusetts，美国)和适当的mwco将洗脱的级分浓缩并脱盐到pbs中。
[0227]
为使用羟基磷灰石色谱进行抛光，将样品缓冲液改为5mm磷酸钠、20mm mes、ph6.6，并加载到装有ca pure ha树脂(45039，tosoh bioscience llc，pa，日本)的自填充柱上；用400mm磷酸钠、20mm mes、ph6.6梯度洗脱对蛋白质进行洗脱，然后用ultra-15离心单元和适当的mwco将目标级分浓缩并脱盐到pbs中。
[0228]
通过sds-page和具有tskgel g3000swxl(08541，tosoh bioscience llc，pa，日本)的hplc检查所有蛋白质的纯度。
[0229]
通过寡核苷酸定向诱变构建噬菌体展示的合成vhh文库
[0230]
vhh模板(来自单峰骆驼(camelus dromedaries)的v种系基因ighv3s1*01的人源化vhh)的三个cdr使用编码定制的氨基酸多样性的合成寡核苷酸进行诱变。简而言之，每个cdr的诱变寡核苷酸在37 ℃下在包含70mm tris-hcl(ph 7.6)、10mm mgcl2、1mm atp和5mm二硫苏糖醇(dtt)的缓冲液中混合并通过t4多核苷酸激酶(new england biolabs)磷酸化1小时。通过使用缺陷大肠杆菌菌株cj236获得含有尿嘧啶的单链dna模板。然后通过在90℃下加热混合物2分钟，随后在热循环仪中以1℃/min降温至20℃，将磷酸化的寡核苷酸与vhh的尿嘧啶化单链dna模板以摩尔比为3:1(寡核苷酸：ssdna)退火。随后，将具有退火寡核苷酸的模板在含有0.32mm atp、0.8mm dntp、5mm dtt、t4 dna连接酶和t7 dna聚合酶(new england biolabs)的缓冲液中孵育，用于体外合成带有car突变的新dna菌株。在20℃孵育过夜后，将合成的dsdna脱盐和浓缩，然后电穿孔到大肠杆菌菌株er2738中，然后进行m13ko7辅助噬菌体感染和过夜培养。最后，收获展示纳米抗体的噬菌体作为培养基中的文库并通过聚乙二醇(peg)/nacl沉淀以供进一步使用。
[0231]
抗rbd抗体的筛选
[0232]
从噬菌体展示的合成vhh文库的筛选(生物淘选)中鉴定了rbd特异性vhh。重组rbd-fc(每孔2～5μg)在nunc 96孔maxisorb免疫板(nunc)中的pbs缓冲液(ph 7.4)中4℃下包被过夜，然后用pbst[0.05％(v/v)tween 20]中的5％脱脂牛奶封闭1小时。封闭后，将100
μl重悬的peg/nacl沉淀噬菌体文库(在封闭缓冲液中10
11-12
cfu/ml)在每孔中轻摇孵育1小时。用250μl pbst洗涤板10次，用200μl pbs洗涤2次。每孔用100μl 0.1m hcl/甘氨酸(ph 2.2)洗脱结合的噬菌体，立即用8μl 2m tris碱缓冲液(ph 9.1)中和。将洗脱的噬菌体与1ml大肠杆菌er2738(a600nm＝0.6)在37℃下混合30分钟；通过加入氨苄青霉素来消除未感染的细菌。30分钟后，细菌培养物在37℃下用100μl m13ko7辅助噬菌体(总共约10
11
cfu)感染1小时。最后将感染的er2738细胞与含有50μg/ml卡那霉素和100μg/ml氨苄青霉素的2x yt培养基混合，并在37℃剧烈摇动下培养过夜。第二天，扩增的噬菌体库用20％peg/nacl沉淀，并重悬于pbs中用于下一轮淘选。
[0233]
经过2-3轮选择-扩增循环后，随机挑取单个菌落到96孔深培养板中；每孔含850μl2yt和100μg/ml氨苄青霉素。在37℃振荡孵育3小时后，向板的每个孔中加入50μl m13ko7(总共约5
×
10
10
cfu)。一小时后，加入含有500μg/ml卡那霉素的100μl 2yt，在37℃下剧烈振荡培养过夜。第二天，将培养物在4℃下以3000g离心10分钟。将50μl培养基和50μl 5％脱脂牛奶/pbst添加到预包被有rbd-fc或fc蛋白(1μg/ml)并用5％脱脂牛奶/pbst封闭的96孔maxisorb免疫板(nunc)的相应孔中。室温孵育1 小时后，用pbst洗涤板，用m13-hrp抗体(1:3000，sinobiologic)孵育1小时检测噬菌体与抗原的结合。在另一次pbst洗涤后，阳性信号通过3,3',5,5'-四甲基-联苯胺过氧化物酶底物(kirkegaard&perry laboratories)显影，用1.0m hcl淬灭并用分光光度计在450nm下读取。通过以下标准选择阳性克隆：rbd-fc包被孔的elisa od450》0.2；fc孔的od450《0.1。通过对噬菌粒中的vhh基因进行测序来确定独特的克隆。
[0234]
阻断rbd和hace2相互作用的纳米抗体的筛选
[0235]
为了产生用于细胞瞬时表达的pcr产物，进行了两步pcr。来自噬菌体elisa的独特vhh序列和测序结果从噬菌体上清液进行pcr扩增。然后扩增一个含有cmv启动子和人胰蛋白酶原-2信号肽的片段和另一个含有12个氨基酸的接头(gsggggsggggs)(seq id no:38)、人igg1-fc和sv40polya信号的片段，然后分别通过重叠pcr融合到vhh基因的5和3原始末端。fc标记纳米抗体表达盒的pcr产物通过expicho表达系统表达。五天后，收集含有fc标记的纳米抗体的培养基并进行rbd阻断的elisa筛选。
[0236]
对于封闭elisa，将96孔maxisorp板在4℃下用hace2-fc(2μg/ml，每孔100μl)包被过夜，然后用封闭缓冲液(pbs中的2％bsa)封闭2小时。将50ul vhh-fc细胞上清液(pcr片段的表达产物)加入到50ul含有rbd-his(40ng/ml)的pbt中。vhh72-fc和不相关的vhh-fc(用相同方法产生)分别用作阳性和阴性对照。hace2-fc(pbs中2μg/ml)也作为参考。轻摇孵育1小时后，将90μl混合物转移到bsa封闭板中孵育20分钟。用抗his标签小鼠单克隆抗体(1:3000稀释，sinobiological，105327-mm02t)检测rbd-his与板的结合，然后用hrp缀合的抗小鼠igg(h l)山羊抗体(beyotime，a0216)检测。rbd结合信号通过3,3',5,5'-四甲基-联苯胺过氧化物酶底物(kirkegaard&perry laboratories)显影，用1.0m hcl淬灭并通过分光光度计在od 450nm处读取。
[0237]
fc标记的纳米抗体的表达和纯化
[0238]
对于fc标记的vhh构建体，特定的vhh结构域通过pcr从原始噬菌体克隆中扩增。将vhh基因片段亚克隆到具有人胰蛋白酶原-2上游信号肽和含接头(gsggggsggggs)(seq id no:38)的下游人igg1fc片段的pcmv3表达载体中。根据手册，构建体在expicho
tm
表达系统中
表达。通过以3000g离心10分钟澄清培养基中表达的vhh-fc蛋白，并与等体积的1.5m甘氨酸、3m nacl、ph 8.9混合。用hitrap
tm
mabselect
tm
sure
tm
柱(11003494，cytiva inc.)纯化蛋白质，并用20mm乙酸、ph 3.5洗脱。酸洗脱部分用1m tris-hcl、ph 9.0中和，并用ultra-15、pltk ultracel-pl膜(milliporesigma life science center，burlington，massachusetts，美国)和适当的mwco浓缩/脱盐到pbs中。
[0239]
rbd结合测定
[0240]
elisa用于以连续稀释方式测试选定纳米抗体的rbd特异性。简而言之，将rbd-fc抗原(每孔0.2μg)包被在nunc 96孔maxisorb免疫板上的pbs缓冲液(ph7.4)中，在4℃下过夜，然后用pbst中的5％脱脂牛奶封闭1小时。将在含有2.5％牛奶的pbst中以连续浓度制备的100μl vhh加入每个孔中，并轻摇孵育1小时。将板用pbst洗涤，然后加入100μl 1:2000稀释的与辣根过氧化物酶缀合的抗人igg，再孵育1小时。用pbst缓冲液和pbs洗涤板两次，用3,3',5,5'-四甲基-联苯胺过氧化物酶底物(kirkegaard&perry laboratories)显影3分钟，用1.0m hcl淬火并用分光光度计在450nm读数。
[0241]
表面等离子共振(spr)测定
[0242]
用spr测量抗rbd纳米抗体和rbd抗原的亲和力。生物传感器芯片s系列传感器芯片蛋白a(货号29127556，ge)，用于亲和捕获一定量的fc标记的待测试纳米抗体，然后在芯片表面上在浓度梯度下{稀释比：2；浓度水平：至少5(不包括不规则曲线或高背景曲线)}流经一系列covid-19s.p.rbd(货号40592-v08b,sb)。采用biacore 8k(serial no.29327020-2473040，ge)仪器实时检测反应信号，得到结合解离曲线。
[0243]
biacore 8k还用于确定抗rbd纳米抗体对hace2与rbd抗原结合的阻断作用。生物传感器芯片s系列传感器芯片蛋白a(货号29127556，ge)用于亲和捕获一定量的fc标记的待测试纳米抗体。接下来，注入50nm rbd(货号40592-v08b，sb)，然后使100nm人hace2(货号1010b-h08h，sb)流经芯片表面。biacore 8k用于实时检测反应信号以获得结合和解离曲线(所有的理论hace2 rmax》220ru和动力学模拟的hace2结合》160ru)。实验中使用的缓冲液是hbs-ep 溶液(ph 7.4，货号br100669，ge)。将实验所得数据用biacore insight evaluation software v3.0、ge软件以(1:1)结合模型拟合得到亲和力值。
[0244]
假病毒中和
[0245]
通过如先前所述降低萤光素酶活性来测量假病毒中和测定[39]。简而言之，通过将293t与表达sars-cov-2s蛋白和pnl-4-3-luc.-r-e的质粒共转染产生携带sars-cov-2s蛋白的假病毒。收获假病毒，过滤并储存在-80℃。在感染caco2细胞之前，将假病毒与连续稀释的纳米抗体在室温下孵育30分钟。根据bright-glo
tm
萤光素酶检测系统手册，在感染48小时后测量萤光素酶活性。未感染的细胞被认为是100％的抑制，并且仅感染病毒的细胞被设定为0％抑制。使用graphpad prism 5(graphpad software,inc.,san diego,ca,usa)通过非线性回归计算纳米抗体的ec
50
值。
[0246]
sars-cov-2中和测定
[0247]
sars-cov-2(ivcas 6.7512株)由中国科学院武汉病毒研究所国家病毒资源中心提供。所有与sars-cov-2活病毒相关的实验均获得武汉大学生物安全委员会三级(absl-3)的批准。所有涉及sars-cov-2的实验均在bsl-3和absl-3设施中进行。
[0248]
简而言之，将纳米抗体在培养基中连续稀释，并将100μl纳米抗体与100μl
(1000pfu)sars-cov-2混合30分钟。然后将混合物添加到48孔板中的vero e6细胞(atcc编号：crl-1586)中并孵育24小时。然后，添加trizol(invitrogen)以灭活sars-cov-2病毒，并根据制造商的说明提取rna。使用primescript rt试剂盒(takara)合成第一链cdna。实时定量pcr用于通过引物检测sars-cov-2病毒的存在(表1)。
[0249]
表1.sars-cov-2的rt-pcr引物
[0250][0251][0252]
使用taqman rt-pcr试剂盒(yeason)确定sars-cov-2病毒基因组拷贝的相对数量。为了准确量化sars-cov-2基因组拷贝的绝对数量，通过测量pcmv-n质粒中构建的sars-cov-2n基因来制作标准曲线。所有sars-cov-2基因组拷贝数相对于同一细胞中的gapdh表达进行归一化。
[0253]
纳米抗体介导的k18-hace2转基因小鼠针对sars-cov-2的保护测定
[0254]
由人上皮细胞细胞角蛋白-18(k18)启动子驱动的表达人ace2的k18-hace2转基因小鼠购自gempharmatech，并饲养在12小时明暗循环的随意获取食物和水的absl-3无病原体设施中。所有动物实验均经武汉大学动物保护与使用委员会批准。将年龄匹配(9-10周龄)的雌性小鼠分组以感染纳米抗体(0.5mg/kg)。一天后，通过鼻内途径给小鼠接种6
×
104pfu的sars-cov-2。在3和6d.p.i(感染后天数)监测体重。根据方案在3或6d.p.i处死动物，并收获组织用于病理学和组织学分析。
[0255]
肺组织匀浆的斑块测定
[0256]
使用tissue cell-destroyer 1000(nzk ltd)在1ml pbs中将右肺均质化。培养vero e6(atcc编号：crl-1586)细胞以确定病毒滴度。简而言之，将连续10倍稀释的样品添加到单层细胞中。37℃吸附后，除去病毒接种物，用pbs洗涤细胞两次，然后补充含有5％fbs和1.0％甲基纤维素的dmem。将板孵育2天，直至可以观察到明显的斑块。细胞在室温下用1％结晶紫染色4小时。计数斑块并将病毒滴度限定为pfu/ml。
[0257]
组织学分析
[0258]
用4％多聚甲醛固定肺样品，石蜡包埋并切成3.5mm的切片。固定组织样品用于苏木精-伊红(h&e)染色和间接免疫荧光测定(ifa)。组织学分析由wuhan servicebio technology有限公司进行。对于ifa，添加抗hace2抗体和抗sars-cov/sars-cov-2核衣壳抗体(货号10108-rp01和40143-mm05，sinobiological)作为一抗。使用全景midi系统(3dhistech，布达佩斯)和fv1200共聚焦显微镜(olympus)收集图像信息。
[0259]
数据分析
[0260]
所有测定均以至少两个生物重复进行。结果由以指定重复次数进行的代表性数据或平均值
±
sem表示。通过xlfit(idbs,boston,ma 02210)或prism 5(graphpad software,san diego,ca 92108)分析所有数据。
[0261]
2)结果
[0262]
针对sars-cov2的中和纳米抗体的产生
[0263]
为生成中和sars-cov-2的纳米抗体，使用了预先设计的合成纳米抗体文库技术。通过高速dna诱变方法将具有定制多样性的互补决定区(cdr)序列基因工程改造为优化的人源化纳米抗体框架。将所得纳米抗体作为文库展示在噬菌体上，以筛选针对重组rbd蛋白的结合剂(图1)。首先针对rbd筛选大小约为10
10
的噬菌体展示的合成纳米抗体文库。经过3轮噬菌体选择后，从噬菌体库中富集的单个克隆通过pcr扩增，并克隆到cmv启动子驱动的哺乳动物表达expicho系统中，用于通过与hace2竞争rbd结合来进行第二轮基于elisa的选择(图1)。最终鉴定出具有独特序列的78种纳米抗体，其中7种纳米抗体显示出与vhh72[37]相似的阻断能力(图2)。然后所有这7种抗体与fc-标签共表达以进行进一步表征(表2)。在蛋白a柱纯化后，纳米抗体以约40kda的单体形式存在于如图3所示的还原凝胶中。
[0264]
表2.7种纳米抗体的cdr序列
[0265][0266][0267]
合成的纳米抗体以高亲和力特异性结合sars-cov-2rbd
[0268]
进行elisa以评估纳米抗体与其原始靶rbd的结合能力。与vhh72参考相比，vhh35、vhh60、vhh79和vhh80显示出对重组rbd蛋白略高或相似的亲和力(图4)。接下来，通过表面等离子共振(spr)确定亲和力。在测试的纳米抗体中，vhh35显示出最低的对rbd的kd，0.535nm，其余纳米抗体均以个位数的纳摩尔解离常数与rbd结合(图5)。为了进一步证实纳
米抗体对rbd/hace2相互作用的阻断作用，在rbd首次被蛋白a芯片上捕获的纳米抗体结合后，还使用spr测量了hace2对rbd的亲和力。当rbd被纳米抗体预先占据时，检测不到hace2与rbd的结合曲线(图6)。elisa和spr数据表明，这7种纳米抗体能够阻断hace2与rbd的结合。
[0269]
vhh60在体外和体内抑制sars-cov-2病毒的感染和扩增
[0270]
为研究纳米抗体的中和活性，进行了基于假病毒的细胞进入试验。在感染caco-2细胞之前，将携带s蛋白和萤光素酶的假病毒与不同浓度的4种具有强结合亲和力的纳米抗体孵育30分钟。感染后48小时测量的萤光素酶活性结果表明，与vhh72和hace2对照相比，纳米抗体提供了强效的保护。特别是，vhh60提供了ic50为7.631nm的最好的保护(图7)。
[0271]
为了进一步评估vhh60的抗病毒作用，在体外对vero-e6细胞使用了真实sars-cov-2病毒。将病毒与连续稀释的纳米抗体预混合30分钟，然后添加到vero-e6细胞中增殖24小时。通过rt-pcr测量病毒rna水平。数据显示，vhh60以1.528nm的ic50抑制病毒感染，比参考vhh72的ic50(13.75nm)低8倍(图8)。
[0272]
然后在体内研究了vhh60的抗病毒潜力。在鼻内接种真实sars-cov-2病毒前24小时，每组10只表达人ace2的雌性k18-hace2转基因小鼠腹膜内施用0.5mg/kg的纳米抗体或对照(载体：pbs)。按计划在3d.p.i每组处死5只小鼠进行病理学分析(图9a)。载体组的其余小鼠均在4d.p.i死亡(5只中的5只，在第5天观察到)，但用纳米抗体(vhh60和vhh72)处理的小鼠存活了最长达6天，除了可以被认为是正常变化的vhh60组中的一只小鼠在5d.p.i死亡外(5只中的1只，在第6天观察到)(图9b)。所有经vhh60和vhh72处理的小鼠在感染后第6天处死，因为小鼠的体重下降最高达25％，这符合根据iacuc协议的终止标准。与先前的报道的病毒感染可能导致体重减轻[40]相一致，同样观察到在3d.p.i.，载体组的小鼠体重下降了20％。相比之下，用vhh60和vhh70处理的小鼠的体重仅略微降低(图9c)。
[0273]
为了更准确地评估保护作用，在当包括载体组在内的所有小鼠都存活的3d.p.i时评估病毒载量。在vhh60处理组中来自肺的病毒滴度被显著抑制到分别比载体组滴度低45倍和比vhh72组滴度低9倍的水平(图10a)。免疫荧光数据清楚地证实，vhh60和vhh72组中由绿色核衣壳染色所代表的病毒颗粒比载体组中的病毒颗粒要少得多(图10b)。观察到来自ace2染色的红色信号无显著差异，这可排除病毒滴度受ace2水平影响的可能性。
[0274]
总之，这些结果强烈支持vhh60在体外和体内都非常有效地抑制sars-cov-2的感染和增殖，减缓疾病进展并改善健康状况。
[0275]
vhh60阻断突变假病毒的感染
[0276]
鉴于sars-cov-2作为rna病毒的高诱变能力，已经研究和描述了对当前抗体或疫苗具有抗性的逃逸突变和变体[41-48]。抗体混合物或广泛中和抗体作为对抗covid19的新方式已经脱颖而出并获得了更多关注[49,50]。
[0277]
除了野生型s蛋白外，在假病毒进入试验中还用vhh60对携带一种以上突变的突变体和变体进行了测试。vhh60以纳摩尔ic50水平抑制所有单突变体e484k、n501y和d614g(图11a)。引人注目的是，vhh60还表现出以接近或甚至优于野生型s蛋白的ic50值抑制变体b1.1.7(ic50＝31.76nm)、b.1.351(ic50＝18.28nm)、p.1(ic50＝16.29nm)和b.1.525(ic50＝15.0nm)的强效活性(图11b)。
[0278]
结论
[0279]
结果明显表明，本发明的纳米抗体直接与sars-cov-2rbd结合，并有效阻断细胞中的病毒感染。vhh60有效地与hace2竞争结合rbd，并有效阻断sars-cov-2病毒与其宿主受体的相互作用，以防止细胞系和小鼠模型的感染。重要的是，vhh60还保持中和多种逃逸突变体和变体的广泛能力。这些纳米抗体被视为基于抗体疗法的革命性发现。与传统的单克隆抗体不同，纳米抗体在预防性使用方面具有天然优势，这对sars-cov-2通过飞沫和气溶胶传播尤其重要[38]。该研究的令人鼓舞的结果为进一步开发用于最终治疗应用的纳米抗体提供了强有力的支持。
[0280]
此外，这些纳米抗体可用于诊断目的，或作为衔接物与具有更有希望的抗病毒潜力的其他纳米抗体或试剂制备成异二聚体或聚合物。本领域的技术人员应该清楚，可以在本发明的范围或精神内对本发明进行变化和修改。因此，应当理解本发明不限于所公开的具体实施例以及旨在包括在所附权利要求的范围内的修改和其他实施方案。尽管本文采用了特定术语，但其仅用于一般性和描述性的意义而非为了限制的目的。
[0281]
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