一种从黑豆中同时提取分离异黄酮、原花青素和水溶性多糖的方法与流程

1.本发明涉及天然产物提取领域，具体涉及一种从黑豆中同时提取分离异黄酮、原花青素和水溶性多糖的方法。


背景技术：

2.黑豆，豆科植物大豆的黑色种子，呈肾形或类圆形，表面黑红色或紫红色，有光泽，种皮薄而脆，较易破碎，在我国各地均有种植。黑豆中含有非常丰富的营养成分，除蛋白质、不饱和脂肪酸、纤维素、维生素、异黄酮、多糖等，其表皮还含有原花青素等活性成分，具有降低胆固醇、清除自由基、调节免疫功能等作用。
3.黑豆中的异黄酮是一种植物性雌激素，会影响人体的激素分泌、代谢生物学活性、蛋白质合成、生长因子活性等，是天然的癌症化学预防剂，能有效抑制乳腺癌、前列腺癌和结肠癌，对防治中老年骨质疏松也很有帮助。
4.原花青素，是植物中广泛存在的一大类多酚类化合物的总称，其低聚物低聚原花青素(opc)是国际上公认的清除人体内自由基有效的天然抗氧化剂，具有很强的体内活性。
5.黑豆中富含的多糖成分作为一种高分子碳水化合物，具有多种生物活性，对糖尿病、心脑血管疾病、胆结石等具有良好的效果。其水溶性多糖还可作为食品添加剂，可以产生稳定的泡沫，具有防止蛋白质沉淀、优良乳化、保水、保油的性能，可用于烘焙、饮料、功能性保健食品等，具有广阔的市场前景。
6.现有技术中大豆异黄酮主要是以大豆为原料提取制备异黄酮。大豆和黑豆虽然都是富含异黄酮的豆类，但相比于大豆，黑豆中大豆异黄酮类化合物的黄豆苷(d)和燃料木苷(g)的含量要明显高于大豆，而大豆中大豆异黄酮类物质主要是丙二酰基葡萄糖苷型(md和mg为主)；此外，黑豆中游离型苷元的含量要远高于大豆。这就导致如果按照通常大豆提取异黄酮的技术对黑豆中异黄酮类物质进行提取，采用同样的工艺，会使提取率偏低，而且口感不好。现有技术中对大豆异黄酮提取时，主要关注的是提取率或者收率，而对于大豆黄酮类产品的口感较少关注。而在终端市场中，大豆异黄酮主要用于营养品，食品，保健品领域，消费者实际更关注的是产品的口感滋味。如果一味追求大豆黄酮的高提取率/收率，却忽视了产品口感问题，实际上得不偿失。
7.cn113527246a公开了一种从大豆豆萁中提取大豆异黄酮的方法，其实采用含水的深共熔溶剂，为氯化胆碱和氢键供体，获得了很高的大豆异黄酮提取率。一方面深共熔溶剂成本高昂，另一方面其使用不可避免在产品中引入溶剂残留，有一定的安全隐患。该专利方法缺乏工业上的实用性。
8.cn113005157a公开了一种大豆异黄酮苷元的制备方法，是对大豆异黄酮糖苷溶液加入葡萄糖苷酶液，并且进行高压脉冲电场处理。其利用了高压脉冲电场，设备昂贵，操作复杂，不适用于工业化的天然产物提取和食品产业。
9.现有技术中为了提高人体对大豆异黄酮的利用率，对其进行水解。主要分为酸水
解，碱水解，以及酶解。酸，碱水解会对其他活性成分造成破坏，酶水解具有特异性，能够高效完成对大豆异黄酮的酶解，提高异黄酮苷元的含量，但是需要使用酶，价格较为昂贵。现有技术还有采用有机酸，比如苹果酸/柠檬酸存在下催化水解，避免了硫酸，盐酸无机强酸对其他成分的破坏，但是要达到满足要求的水解效率，需要在110℃以上的高温，在此温度下，黑豆种的花青素几乎会被破坏。
10.综上，现有技术中，未同时提取分离提取异黄酮、原花青素和水溶性多糖；对黑豆的提取利用也仅限于粗多糖、多肽、黑豆蛋白的一种产品，以及黑豆皮制备花青素产品，造成了黑豆原料的浪费，也制约了黑豆产业的进一步发展。没有对黑豆中大豆异黄酮的口感滋味进行系统性研究，本

技术实现要素：
填补了这方面空白。
发明内容
11.本发明旨在至少解决现有技术中存在的上述技术问题之一。为此，本发明提供了一种从黑豆中同时提取分离异黄酮、原花青素和水溶性多糖的方法。
12.一种从黑豆中同时提取分离异黄酮、原花青素和水溶性多糖的方法，包括以下步骤：
13.(1)预处理：将黑豆干燥，粉碎，过筛得到黑豆粉，黑豆粉进行微波处理；
14.优选地，在步骤(1)中，所述过筛用筛网的目数为10-20目。
15.优选地，在步骤(1)中，所述微波处理是在功率500-700w，微波处理时间30s-60s。对黑豆进行一定的微波处理，能够促使其中异黄酮单元的转变，有利于提高苷元的含量，
16.(2)提取：向步骤(1)所得黑豆粉中加入水连续超声逆流提取，得到黑豆提取液；
17.优选地，在步骤(2)中，所述在提取温度为45-55℃，超声功率为200-300w，频率为25-50khz下连续逆流超声提取2～4h。
18.发明人经过大量实验发现，在上述步骤(1)的预处理的微波功率，微波频率，微波处理时间，配合步骤(2)超声提取时提取温度、超声功率和超声频率的条件，三种产品的收率，纯度得到很好的平衡，而且所得大豆异黄酮口感滋味好，容易获得消费者青睐，有利于终端产品的销售和溢价。
19.(3)异黄酮的分离：将黑豆提取液离心，然后通过纳滤膜，得到截留液与透过液。透过液通过极性大孔吸附树脂，并用乙醇洗脱，将洗脱液减压浓缩、干燥，得到黑豆异黄酮产品。
20.优选地，在步骤(3)中，所述纳滤膜的截留分子量为400-700da，过滤的压力为0.5mpa～1.0mpa。
21.优选地，在步骤(3)中，所述极性大孔吸附树脂的种类为nka-9、ads-22、ads-7，乙醇的体积浓度为75～85％，用量为1.5～2.5bv。
22.(4)原花青素和多糖的分离：将步骤(3)中截留液通过弱极性或非极性大孔吸附树脂，流出液再经过离子交换树脂，去除少量色素、蛋白质等杂质，得到水溶性多糖溶液；大孔树脂采用乙醇洗脱，将洗脱液减压浓缩、干燥，得到原花青素产品；
23.优选地，在步骤(4)中，所述弱极性或非极性大孔吸附树脂的种类为ab-8、lx-12、lsa-10、xda-6、lx-32等，乙醇的体积浓度为60～75％，用量为1.5～2.5bv。
24.优选地，在步骤(4)中，所述离子交换树脂的种类为d941、lx-94、lx-t5、lx-t8、
lxd-762等。
25.优选地，在步骤(4)中，在截留液加入黑豆原料0.1-0.2wt％天然抗氧化剂，比如虾青素、抗坏血酸、维生素c，β胡萝卜素中的至少一种。花青素容易发生降解，外加部分天然抗氧化剂，可以保护花青素不被氧化，提高收率；所加入的抗氧化剂都是来自于天然产物，可安全食用。
26.(6)多糖纯化：将步骤(4)中水溶性多糖溶液，减压浓缩，浓缩液中加入高度乙醇，沉淀3～5h后，经固液分离得到黑豆多糖沉淀，真空干燥得到水溶性多糖产品。
27.优选地，在步骤(5)中，所述浓缩液固形物浓度为50-60％。
28.优选地，在步骤(5)中，所述高度乙醇为90-100％乙醇，加入高度乙醇后多糖溶液乙醇浓度为70-80％。
29.现有技术中也有采用微波和超声协同辅助提取的，但是其目的主要是为了提高大豆异黄酮的提取效率和得率，其并没有关注大豆异黄酮的口感滋味问题，也没有关注提取大豆异黄酮时，对花青素的收率影响，因为其目的都是得到单一的产品。本发明的特色，是对各个工艺步骤的参数进行优化选择，能够连续化地同时得到三种产品，即大豆异黄酮，原花青素和水溶性多糖，并且大豆异黄酮的口感滋味也得到了改善。
30.本发明所用极性大孔树脂、弱极性或非极性大孔树脂、离子交换树脂均可重生、循环利用，大孔树脂的具体重生方法为：首先以蒸馏水淋洗树脂层至无醇味，然后以1～2bv/h的流速，用2-4％质量浓度的氢氧化钠溶液淋洗树脂层，最后以2～3bv/h的流速，用蒸馏水淋洗树脂层至中性；离子交换树脂具体重生方法为：首先以1～2bv/h的流速，用1％质量浓度的盐酸溶液淋洗树脂层，至流出液呈明显酸性，以2～3bv/h的流速，用蒸馏水淋洗树脂层至中性，再以1～2bv/h的流速，用2-4％质量浓度的氢氧化钠溶液淋洗树脂层，至流出液呈明显碱性，再以2～3bv/h的流速，用蒸馏水淋洗树脂层至中性。
31.本发明所用乙醇均可通过减压浓缩操作进行蒸出回收。
32.与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
33.(1)本发明从黑豆原料中，同时分离提取出了大豆异黄酮、原花青素和水溶性多糖，充分利用了黑豆的有效成分，提高了黑豆的综合开发水平，具有良好的经济和社会效益。黑豆原料提取温度＜60℃，减免了黑豆原料中原花青素等有效成分的破坏；较低的提取温度，节约了能源。
34.(2)本发明在对三种产品进行有效的提取分离时，还关注大豆异黄酮的口感滋味，这是现有技术往往为了单方面提高大豆异黄酮提取效率，难以兼顾其口感滋味，以及原花青素的收率。
35.(3)本发明提供的制备方法，用到的主要试剂为乙醇和水，生产过程无毒性挥发物，安全性高。
36.(4)本发明中，工艺过程简单，该工艺过程中所用的树脂、膜、溶剂均可以重复使用，工艺成本很低，适合工业化生产。
具体实施方式
37.以下是本发明的具体实施例，并结合实施例对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
38.本发明实施例所使用的黑豆购于黑龙江绥化，黑豆中异黄酮含量为0.62％，原花青素含量为0.22％，多糖含量12.15％。
39.本发明实施例所使用的d941型、lx-94型、lx-t8型阴离子交换树脂和nka-9型、lsa-10型、ads-22型、lx-32型、ads-7型、ab-8型大孔吸附树脂均购于西安蓝晓科技新材料股份有限公司；本发明实施例所使用纳滤膜购于南京福林德环保科技有限公司；本发明实施例所使用的原料或化学试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。
40.实施例1
41.s1.取干燥的黑豆粉碎，取10目筛下物1000g；对所得筛下物进行微波处理，微波功率500w，微波处理时间60s；
42.s2.在45℃下，以10l的水连续逆流超声提取步骤s1所得1000g筛下物4h，其中超声功率为200w，频率为25khz，提取后过滤、离心，得提取液；
43.s3.将所述提取液经孔径为400da纳滤膜，透过液以2bv/h流速过nka-9极性大孔吸附树脂，并以2bv/h流速依次用纯水、体积浓度为70％的乙醇水溶液洗脱，收集乙醇水洗脱液，减压浓缩、干燥，得到黑豆异黄酮产品。
44.s4.截留液中加入2g抗坏血酸，溶解后以2bv/h流速依次过lsa-10大孔吸附树脂d941离子交换树脂，再采用2bv纯水以2bv/h流速洗柱，水洗液与d941离子交换树脂柱流出液混合收集，减压浓缩至固形物浓度为50％，加入90％乙醇使溶液乙醇浓度为70％，沉淀3h，经固液分离得到黑豆多糖沉淀，真空干燥得到水溶性多糖产品。
45.s5.lsa-10大孔吸附树脂采用体积浓度为70％的乙醇水溶液以2bv/h流速洗脱，收集乙醇水洗脱液，减压浓缩、干燥，得到原花青素产品。
46.实施例2
47.其他操作，条件和实施例1相同，区别是：步骤s2中，在50℃下，连续逆流超声提取4h。
48.实施例3
49.其他操作，条件和实施例1相同，区别是：步骤s2中，在55℃下，连续逆流超声提取4h。
50.实施例4
51.其他操作，条件和实施例2相同，区别是：步骤s1中，微波处理的功率为700w，微波处理时间30s。
52.实施例5
53.其他操作，条件和实施例2相同，区别是：步骤s1中，微波处理的功率为500w，微波处理时间90s。
54.实施例6
55.其他操作，条件和实施例2相同，区别是：步骤s1中，微波处理的功率为800w，微波处理时间30s。
56.测试例1
57.本例检测了实施例1～3所得黑豆异黄酮、原花青素以及多糖的含量及提取率。具体的测试方法为：以hplc法，检测异黄酮的标准对照液，再测试步骤s2所得提取液配置的测试液，以标准对照法进行计算可得相应结果。以uv法，分别绘制原花青素和多糖的绘制标准
曲线，再测试实施例所得产品，即黑豆异黄酮，原花青素和水溶性多糖产品，以标准曲线法进行计算可得相应结果。
58.测试方法
59.(1)原花青素检测方法：分光光度法
60.标准曲线的绘制：准确吸取浓度为0、10、25、50、100、150、200、250μg/ml的原花青素标准系列工作液各1ml，置于安瓿瓶中，精密加入盐酸-正丁醇溶液6ml，硫酸铁铵溶液0.2ml，混匀，用封口钳将其密封，置沸水中加热40min后，取出，立即置冰水中冷却至室温，于546nm波长处测吸光度，显色在1小时内稳定。以吸光度为纵坐标，原花青素浓度为横坐标绘制标准曲线。
61.样品溶液的测定：取样品(10～100)mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加入30ml甲醇，超声处理(功率250w，频率50khz)20min，放至室温后，加甲醇至刻度，摇匀，离心或放至澄清后取上清液作为供试品溶液。精密吸取供试品溶液1ml，置于安瓿瓶中，然后按照标准曲线制作步骤执行。以相应试剂为空白，测定样品吸光度，用标准曲线计算试样中原花青素的含量。具体见公式(1)。
[0062][0063]
m：取样量(mg)；v：稀释倍数
[0064]
(2)异黄酮检测方法：高效液相色谱法
[0065]
色谱条件：symmetry c18(3.9
×
150mm)反向色谱柱，流动相a：甲醇：冰乙酸＝98:2，流动相b：水：甲醇：冰乙酸＝88:10:2，流速0.8ml/min。梯度洗脱：0-13min：流动相a 5％，流动相b 95％；14-30min：流动相a 40％，流动相b 60％；31-36min：流动相a 95％，流动相b 5％；37-40min：流动相a 5％，流动相b 95％。检测波长：260nm。
[0066]
标准液的配置：精密称大豆甙、黄豆黄甙、染料木甙、大豆甙元、染料木素对照品适量，于50ml容量瓶中，加甲醇超声溶解，冷却至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
[0067]
供试品溶液的制备：精密称定大豆提取物供试品适量，装入50ml容量瓶中，加甲醇适量，超声30分钟，放冷至室温，定容至刻度混匀，过0.45um的膜，即为供试品溶液。
[0068]
异黄酮含量计算见公式(2)：
[0069][0070]a样
：样品品的峰面积；c
标
：标准品溶液的浓度(mg/ml)；a
标
：标准品的峰面积；m：样品称样量(mg)，x为异黄酮含量。
[0071]
(3)多糖检测方法：分光光度法
[0072]
标准曲线的绘制：精密称取葡萄糖(恒重)50mg置于1000ml容量瓶中，加水溶解并定容。精密吸取上述标准溶液0.0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8ml分别置于10ml试管中并加水补充至1.0ml。加入5％的苯酚溶液1.0ml，混匀，再加入浓硫酸5.0ml，放置0.5h。紫外可见分光光度计在485nm处测定吸光度。以吸光度值为纵坐标，葡萄糖的浓度(mg)为横坐标绘制标准曲线或计算回归方程。
[0073]
样品的测定：精密称取提取物样品约20mg置500ml容量瓶中，加水溶解并定容，过滤。取上述滤液1.0ml置试管中，加入5％的苯酚溶液1.0ml，混匀，再加入浓硫酸5.0ml，放置
0.5h。紫外可见分光光度计在485nm处测定吸光度。以相应试剂为空白，测定样品吸光度，用标准曲线计算试样中多糖的含量。
[0074]
多糖含量计算见公式(3)：
[0075][0076]
m：取样量(mg)；v：稀释倍数
[0077]
为确保实验的精确度，本测试例中，各样品的纯度均为3次测试的平均值。
[0078]
测试结果
[0079]
依照式(1)～(3)的计算方法，对三种有效物质的含量及收率测试结果如表1所示。
[0080]
表1产品含量和收率测试结果
[0081] 实施例1实施例2实施例3实施例4实施例5实施例6异黄酮含量(％)65.3765.5165.1465.2864.4565.36异黄酮收率(％)87.3188.6489.4289.1589.5289.62原花青素含量(％)96.7895.6794.8995.3295.0694.35原花青素收率(％)91.5892.4189.1291.6290.5890.84多糖含量(％)81.0382.1580.8182.2581.9682.18多糖收率(％)82.9884.2585.1284.3584.4284.17
[0082]
综上，本发明提供的黑豆提取物的制备方法，可同时分离提取异黄酮、原花青素、水溶性多糖。收率为异黄酮≥87％，原花青素≥91％，水溶性多糖≥82％；产品纯度为异黄酮≥65.37％，原花青素≥95.67％，多糖≥80.81％。
[0083]
测试例2
[0084]
对实施例所得大豆异黄酮进行口感的测试，具体方法是：将不同实施例所得大豆异黄酮稀释20倍，请10名受试者品尝，对口感味道进行打分，打分为5分制，5分为最满意(基本没有苦涩味和豆腥味)，1分表示最低分(苦涩味和豆腥味明显)。结果如下表2所示。
[0085]
表2异黄酮产品口感测试
[0086]