一种戴尔福特菌D39和俊片菌M1031的土壤修复复合菌剂及制备方法

一种戴尔福特菌d39和俊片菌m1031的土壤修复复合菌剂及制备方法
技术领域
1.本发明涉及土壤修复菌剂的技术领域，具体涉及一种戴尔福特菌d39和俊片菌m1031的土壤修复复合菌剂及制备方法。


背景技术：

2.辛硫磷是我国使用范围最广的有机磷杀虫剂之一，2015年在多种主要农作物中用药量排名第一。在喷洒过程中，只有少部分的农药发挥作用，50%~60%的辛硫磷会残留于土壤中。辛硫磷在无阳光直射的土内，降解缓慢，属于难消解农药。
3.迄今为止，从戴尔福特菌属中已分离到两种具有降解辛硫磷功能的菌株。2007年沈雨佳等报道了一株以辛硫磷为唯一碳源的戴尔福特菌xsp-1，可在7h内完全降解100mg/l的辛硫磷，同时该菌株对对甲基对硫磷、毒死蜱、杀螟硫磷也有较好的降解能力。2020年，发明人也分离到一株戴尔福特菌d39，专利cn109679875a中公开了利用戴尔福特菌d39制备一种降解辛硫磷的酶制剂，该酶制剂对粮仓的储粮及农产品加工的副产品中的辛硫磷残留能降解90%～99%以上。上述酶制剂通过超声破碎戴尔福特菌d39菌体制得，结合后续实验，验证了主要是d39胞内酶发挥降解辛硫磷的作用，d39胞外酶无降解辛硫磷的作用。而将酶制剂直接应用在土壤中，胞内酶容易失活，需要使用活菌菌剂修复土壤。而试验发现，当土壤中辛硫磷浓度大于150mg
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kg-1
时，d39土壤修复菌剂48 h对辛硫磷的降解率仅为81%左右，修复高污染土壤的能力较差。


技术实现要素：

4.为了提高戴尔福特菌d39菌剂对土壤中辛硫磷的降解效果，本发明提供一种戴尔福特菌d39和俊片菌m1031的土壤修复复合菌剂及制备方法，实现高效修复辛硫磷污染的土壤。
5.第一方面，本技术提供一种戴尔福特菌d39和俊片菌m1031的土壤修复复合菌剂，原料包括20~30重量份的戴尔福特菌（delftia sp.）d39发酵液、5~10重量份的俊片菌（lampropedia sp.）m1031发酵液、8~10重量份的润湿剂、60~70重量份的分散剂和1~5重量份的紫外保护剂；所述戴尔福特菌d39由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.16844，保藏日期为2018年11月30日，已公开于中国发明专利cn109679875a中。
6.所述俊片菌m1031由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.20988，保藏日期为2020年11月2日，已公开于中国发明专利cn113249274a中。
7.进一步的，所述润湿剂包括木质磺酸钙和萘磺酸盐缩聚物。
8.进一步的，所述木质磺酸钙与萘磺酸盐缩聚物的质量比为3:2。
9.进一步的，所述分散剂为硅藻土，所述紫外保护剂为羧甲基纤维素。
10.进一步的，所述土壤修复复合菌剂在土壤中的接种量为2~10g
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。
11.第二方面，本发明还提供一种上述土壤修复复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：（1）将戴尔福特菌d39发酵液、俊片菌m1031发酵液、润湿剂、分散剂、紫外保护剂混合，搅拌均匀；（2）将混合后的原料放入气流粉碎机粉碎，粉碎后过筛，制得土壤修复复合菌剂。
12.进一步的，所述戴尔福特菌d39发酵液采用以下方法制成：s1、取保藏的戴尔福特菌d39菌株划线于lb固体培养基上，25~30℃倒置活化培养1~2d，制得活化后的菌株；s2、向500ml三角瓶中装入100~150ml的lb液体培养基，lb液体培养基ph为7.0~7.5，取活化后的菌株接种于lb液体培养基中，接种量为4%~8%，于30~32℃摇床振荡培养2~3d，制得菌液；s3、向盛有发酵培养基a的500l发酵罐中，接种菌液，初始接种量4%，转速350r
∙
min-1
，溶氧5mmol
∙
l-1
，流加氨水控制ph=7.0，温度32℃，发酵40~52h，制得戴尔福特菌d39发酵液。
13.进一步的，所述发酵培养基a以质量份数计，包括玉米粉2份，豆粉2份，葡萄糖1份，硫酸铵0.1份，磷酸氢二钾0.2份，磷酸二氢钾0.2份，七水硫酸镁0.03份，去离子水补足至100份。
14.本发明的有益效果在于：本发明提供了一种含戴尔福特菌d39和俊片菌m1031的土壤修复复合菌剂，实验发现俊片菌m1031对戴尔福特菌d39降解辛硫磷具有一定的维稳增效作用，在长期降解过程中，俊片菌m1031有助于维持戴尔福特菌d39良好的活性，促进其降解辛硫磷。该土壤修复复合菌剂具有降解高效、活性期长、适用范围广的优点。
附图说明
15.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
16.图1是两种土壤修复菌剂在不同用量下对土壤修复效果的折线图。
17.图2是两种土壤修复菌剂对不同辛硫磷初始浓度土壤的修复效果的折线图。
18.图3是两种土壤修复菌剂对辛硫磷含量为300mg
•
kg-1
的土壤修复速率的折线图。
具体实施方式
19.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
20.实施例1 制备d39土壤修复菌剂
1.菌种来源：戴尔福特菌d39，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.16844，菌株分类命名为戴尔福特菌（delftia sp.），保藏日期为2018年11月30日。
21.2.培养基：
①
lb固体培养基：酵母抽提物5g，蛋白胨10g，nacl10g，琼脂15g，去离子水定容至1000ml，ph7.0，121℃灭菌20min。
22.②
lb液体培养基：酵母抽提物5g，蛋白胨10g，nacl10g，去离子水定容至1000ml，ph7.0，121℃灭菌20min。
23.③
发酵培养基a：玉米粉20g，豆粉20g，葡萄10g，硫酸铵1g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钾2g，七水硫酸镁0.3g，去离子水补足至1kg，ph7.0，115℃灭菌20min。
24.3.制备步骤：s1、取保藏的戴尔福特菌d39划线于lb固体培养基上，30℃倒置活化培养2d，制得活化后的戴尔福特菌d39菌株；s2、向500ml三角瓶中装入150 ml的lb液体培养基，取活化后的菌株接种于lb液体培养基中，接种量为4%，于30~32℃摇床振荡培养2d，制得d39菌液；s3、向盛有发酵培养基a的500l发酵罐中，接种d39菌液，初始接种量4%，转速350r
∙
min-1
，溶氧5mmol
∙
l-1
，流加氨水控制ph=7.0左右，温度32℃，发酵48h，制得戴尔福特菌d39发酵液；s4、取30重量份的戴尔福特菌d39发酵液，加入70重量份的硅藻土、6重量份的木质磺酸钙、4重量份的萘磺酸盐缩聚物morwet d425、2.5重量份的羧甲基纤维素，混合均匀；s5、将混合后的原料放入气流粉碎机粉碎，粉碎后过筛，制得d39土壤修复菌剂。
25.实施例2 制备d39-m1031土壤修复复合菌剂1.菌种来源：戴尔福特菌d39，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.16844，菌株分类命名为戴尔福特菌（delftia sp.），保藏日期为2018年11月30日，相关信息已公开于中国发明专利cn109679875a中。
26.俊片菌m1031，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.20988，菌株分类命名为俊片菌（lampropedia sp.），保藏日期为2020年11月2日，相关信息已公开于中国发明专利cn113249274a中。
27.2.培养基：lb固体培养基、lb液体培养基及发酵培养基a配制同实施例1。
28.发酵培养基b：玉米粉20g，豆粉20g，葡萄糖0.5g，硫酸铵1g，磷酸氢二钾0.5g，磷酸二氢钾0.5g，七水硫酸镁0.2g，去离子水补足至1kg，ph7.0，115℃灭菌20 min。
29.3.制备步骤：
①
戴尔福特菌d39发酵液制备方法同实施例1；
②
制备俊片菌m1031发酵液：s1、取保藏的俊片菌m1031菌株；
s2、向500 ml三角瓶中装入150 ml的lb液体培养基，取活化后的俊片菌m1031菌株接种于lb液体培养基中，接种量为4%，于30~32℃摇床振荡培养2d，制得俊片菌m1031菌液；s3、向盛有发酵培养基b的500l发酵罐中，接种俊片菌m1031菌液，初始接种量4%，转速200r
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min-1
，溶氧5mmol
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l-1
，流加氨水控制ph=7.0左右，温度30℃，发酵48h，制得俊片菌m1031发酵液。
30.③
取20重量份的戴尔福特菌d39发酵液和10重量份的俊片菌m1031发酵液，加入70重量份的硅藻土、6重量份的木质磺酸钙、4重量份的萘磺酸盐缩聚物morwet d425、2.5重量份的羧甲基纤维素，混合均匀；s5、将混合后的原料放入气流粉碎机粉碎，粉碎后过筛，制得d39-m1031土壤修复复合菌剂。
31.实施例3 两种土壤修复菌剂菌数及相关指标测定采用平板活菌计数法，测定实施例1、2制得的土壤修复菌剂的菌数。按照《中华人民共和国国家标准》对土壤修复菌剂的各项技术指标进行测定：润湿时间测定gb5451-2001，悬浮率测定gb/t14825-2006，细度测定gb/t16150-1995，水分测定gb/t1600-2001，ph值测定gb/t1601-1993。各项检测结果见表1，均符合国家标准。
32.表1 两种修复菌剂的技术指标实施例4 两种土壤修复菌剂的保存期d39土壤修复菌剂和d39-m1031土壤修复复合菌剂的含水量均在4%，ph为7.0。其保存期的存活率检测结果见表2。
33.表2 两种土壤修复菌剂不同保存期的活菌数量（
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108cfu
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g-1
）和存活率由表2可以看出，两种菌剂能维持较高的存活率，适合菌剂的加工和储存，具有较
长的货架期，且d39-m1031土壤修复复合菌剂的存活率相对较高。
34.实施例5 两种土壤修复菌剂对辛硫磷污染土壤的修复效果测定（1）辛硫磷含量的测定方法采用高效液相色谱法（hplc法），取待测液1 ml，置于具塞的刻度试管中，加入5ml二氯甲烷，剧烈振荡后静置分层，弃去上层水相，有机相经无水硫酸钠脱水后，取1ml于微量离心管中，氮气吹干后加入1 ml甲醇溶解（色谱纯）。测定条件如下，流动相为甲醇：水=80：20，流速为1ml/min，进样量为10μl，色谱柱为tc-c18色谱柱，5μm，250mm
×
4.6mm，可变波长检测器的工作波长为280 nm，采用外标法定量。
35.（2）土壤中菌剂最佳用量的测定称取200g土壤，风干过20目筛后，加入一定量的辛硫磷溶液使其浓度为50mg
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kg-1
，混匀。将200g土壤平均分成10份，随机分成a、b两组，每组5份。a组掺入d39土壤修复菌剂，b组掺入d39-m1031土壤修复复合菌剂，使得每组菌剂浓度分别为0.5g
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kg-1
、1g
·
kg-1
、2g
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kg-1
、4g
·
kg-1
、10g
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kg-1
，在实验室自然条件下培养2d。
36.五点取样法取土样2g，用hplc法测定辛硫磷的含量并计算辛硫磷的降解率，以不加菌剂的土壤作对照，每处理三次重复。以上各处理土样持水量保持在50%，不足以蒸馏水补施。统计计算结果并制成折线图，如图1所示。
37.从图1中可以看出，随着土壤中菌剂浓度从0.5g
·
kg-1
增加到4g
·
kg-1
，辛硫磷的降解率呈上升趋势，这说明在含有一定浓度辛硫磷的土壤中，菌剂用量越大，辛硫磷降解速率越快，土壤修复速度越快。
38.菌剂用量增加到10g
·
kg-1
时，d39土壤修复菌剂组的辛硫磷的降解率有所降低，而d39-m1031土壤修复复合菌剂的辛硫磷的降解率仍有增加，但增长幅度不明显。因此，当d39土壤修复菌剂的剂量过高时，辛硫磷降解速率反而降低，而添加同等剂量的d39-m1031土壤修复复合菌剂，辛硫磷降解速率稍有增长，可以看出俊片菌m1031对戴尔福特菌d39降解辛硫磷具有一定的维稳增效作用。
39.由此可知，d39-m1031土壤修复复合菌剂的最佳用量为4g
·
kg-1
，继续加大菌剂用量对辛硫磷的降解并无明显促进作用。
40.（3）菌剂在不同浓度辛硫磷土壤中的修复效果称取200g土壤，风干过20目筛后，200g土壤平均分成10份，随机分成a、b两组，每组5份。每组每份加入辛硫磷农药，使得辛硫磷的浓度在土样中的含量分别为10mg
·
kg-1
、50mg
·
kg-1
、75mg
·
kg-1
、100mg
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kg-1
、150mg
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kg-1
。a组每个浓度的土样中加入d39土壤修复菌剂，b组每个浓度的土样中加入d39-m1031土壤修复复合菌剂，使得菌剂浓度为4g
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，在实验室自然条件下培养48h。
41.五点取样法取土样2g，用hplc法测定辛硫磷的含量并计算辛硫磷的降解率，以不加菌剂的土壤作对照，每处理三次重复。以上各处理土样持水量保持在50%，不足以蒸馏水补施。统计计算结果并制成折线图，如图2所示。
42.从图2中可以看出，随着土壤中辛硫磷初始浓度的增加，辛硫磷的降解率呈下降趋势。当土壤中辛硫磷的含量≤50mg
·
kg-1
时，修复菌剂48h可以完全降解，降解率为100%。当土壤中辛硫磷浓度介于50~100mg
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时，d39土壤修复菌剂48h的辛硫磷降解率≥92.08%，d39-m1031土壤修复复合菌剂48h的辛硫磷降解率≥95.11%。当土壤中辛硫磷浓度为
150mg
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kg-1
时，d39土壤修复菌剂48h对辛硫磷的降解率降为81.05%，而d39-m1031土壤修复复合菌剂48h对辛硫磷的降解率可达90%以上，修复土壤效果更好。
43.（4）菌剂对辛硫磷污染严重土壤的修复速率将采集的土样掺入辛硫磷，使得土壤中辛硫磷含量为300mg
·
kg-1
，将土样分为a、b、c三组，a组不加修复菌剂的土壤作为对照组，b组加d39土壤修复菌剂，c组加d39-m1031土壤修复复合菌剂，加修复菌剂的土壤处理方法如下：将修复菌剂掺入土壤中使得菌剂浓度为4g
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kg-1
。每组处理设置三个重复，在实验室自然条件下培养7天。于第1d、2d、3d、5d、7d取土样置于-20℃冰箱中保存，待测修复后的辛硫磷降解率。以上各处理土样持水量保持在50%，不足以蒸馏水补施。用hplc法测定辛硫磷的含量并计算辛硫磷的降解率，统计计算结果并制成折线图，如图3所示。
44.从图3中可以看出，当土壤中辛硫磷含量为300mg
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kg-1
时，施加d39土壤修复菌剂，随着降解时间的增加，辛硫磷的降解率呈现先增高后降低的趋势。在前5d之内，辛硫磷的降解率随着时间的增加而提高到92.67%，等到第7d时辛硫磷的降解率则降低为81.30%。
45.当土壤中辛硫磷含量为300mg
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kg-1
时，施加d39-m1031土壤修复复合菌剂，在7d之内，随着降解时间的增加，辛硫磷的降解率一直呈现增高趋势，增长速度逐渐放缓，第7d时辛硫磷的降解率达到了98.01%。由此可知，在高浓度辛硫磷的长期降解过程中，俊片菌m1031有助于维持戴尔福特菌d39活性，促进戴尔福特菌d39降解辛硫磷，因此，d39-m1031土壤修复复合菌剂修复土壤的能力更加持久。
46.实施例6 两种土壤修复菌剂的定殖作用将采集的土壤灭菌后掺入辛硫磷，使得土壤中辛硫磷含量为150mg
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kg-1
，修复菌剂的接种量为4g
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kg-1
，在实验室自然条件下于第8h、12h、24h、36h、48h取土样进行活菌计数。以上各处理土样持水量保持在50%，不足以蒸馏水补施。修复菌剂的定殖结果见表3。
47.表3 两种土壤修复菌剂的定殖结果从表3中可以，看出戴尔福特菌d39能在辛硫磷污染的土壤中定殖，随着时间的延长d39定殖菌数呈现先增加后降低的趋势。
48.在d39土壤修复菌剂施用24h后，定殖菌数最高为6.32
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108cfu
·
g-1
；当d39土壤修复菌剂施用48h后，定殖菌数降低为5.39
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107cfu
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g-1
，这可能是由于后期土壤中辛硫磷含量减少导致菌株可利用的碳源含量降低的缘故。
49.在d39-m1031土壤修复菌剂施用1h时，定殖菌数略低于d39土壤修复菌剂，24h后，
定殖菌数最高为7.51
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108cfu
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g-1
，超过了d39土壤修复菌剂；当d39-m1031土壤修复复合菌剂施用48h后，定殖菌数降低为6.12
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108cfu
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g-1
，但是仍高于d39土壤修复菌剂。由此可以看出，d39-m1031土壤修复菌剂的定殖速率更快，定殖菌数的最高值更大，且定殖菌数降低速率慢。
50.尽管通过参考附图并结合优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。