一种高产金丝桃苷的桑黄菌丝体液体发酵方法与流程

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1.本发明涉及液体发酵技术领域，具体涉及一种高产金丝桃苷的桑黄菌丝体液体发酵方法。


背景技术：

2.桑黄是锈革孔菌科、桑黄孔菌属一类真菌的统称，在传统中医药中主要用于治疗盗汗、痢疾、血淋、脱肛泻血、脐腹涩痛、闭经、带下、脾虚泄泻等。桑黄含有粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、氨基酸、多糖、三萜、黄酮类、酚类等营养活性物质，具有增强免疫、抗炎、抗流感、抗氧化等药理作用。
3.由于受生理状态的特殊性和复杂性以及外部环境的制约，造成野生桑黄子实体的数量极少，无法形成稳定来源。而人工栽培的条件苛刻，生长周期长，重现度差，难以实现大规模生产。液体发酵法具有条件可控性强、生产周期短、产量高等优点，因此得到了广泛应用。
4.研究发现，金丝桃苷存在于桑黄液体发酵产物中。金丝桃苷又名槲皮素-3-o-β-d-吡喃半乳糖苷，属于黄酮醇苷类化合物，具有抗炎、解痉、利尿、止咳、降压、降低胆固醇、蛋白同化、局部和中枢镇疼以及对心、脑血管的保护作用等多种生理活性。但目前桑黄液体发酵产物中的金丝桃苷含量较低，需要通过改进发酵条件来提高金丝桃苷含量，同时要求不以繁琐操作为提高金丝桃苷含量的前提条件，因为这样一来会增大工作量和延长生产周期，也会增加不可控因素。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题在于提供一种高产金丝桃苷的桑黄菌丝体液体发酵方法，通过向液体发酵培养基中添加适量的水杉皮提取物，有效提高桑黄菌丝体中金丝桃苷的含量，使其达到2mg/g以上。
6.本发明所要解决的技术问题采用以下的技术方案来实现：
7.本发明的目的在于提供一种高产金丝桃苷的桑黄菌丝体液体发酵方法，包括以下步骤：
8.(1)将活化的桑黄菌种接种于液体种子培养基中，恒温培养，得到种子液；
9.(2)将步骤(1)制备的种子液接种于液体发酵培养基中，恒温发酵，得到液体发酵产物；
10.(3)将步骤(2)制备的液体发酵产物用纱布过滤，水洗，烘干，研磨，得到桑黄菌丝体粉末。
11.优选地，所述活化的桑黄菌种以2-10％液体种子培养基体积的接种量接种到液体种子培养基中。
12.优选地，所述恒温培养的温度为25-30℃，时间为3-7天。
13.优选地，所述液体种子培养基的组成为：马铃薯淀粉10-20g/l，葡萄糖5-15g/l，酵
母粉2-5g/l，蛋白胨2-5g/l，磷酸二氢钾0.5-2g/l，硫酸镁0.1-0.5g/l，维生素b1 0.01-0.05g/l，余量为水。
14.优选地，所述种子液以5-15％液体发酵培养基体积的接种量接种到液体发酵培养基中。
15.优选地，所述恒温发酵的温度为25-30℃，时间为3-7天。
16.优选地，所述液体发酵培养基的组成为：葡萄糖20-40g/l，酵母粉2-5g/l，蛋白胨2-5g/l，水杉皮提取物2-5g/l，磷酸二氢钾0.5-2g/l，硫酸镁0.1-0.5g/l，维生素b1 0.01-0.05g/l，余量为水。
17.优选地，所述烘干温度为50-70℃。采用低温烘干方式，避免高温对水杉皮活性成分造成不可逆破坏。
18.优选地，所述水杉皮提取物为新鲜水杉皮的乙醇提取物。采用新鲜水杉皮作为提取原料，以乙醇水溶液作为提取溶剂，收集提取液。
19.优选地，所述水杉皮的乙醇提取物是以质量百分比60-80％的乙醇水溶液作为提取溶剂，浸提温度为回流温度，浸提次数为2-3次，每次浸提时间为1-3h，合并提取液，经浓缩回收乙醇后冷冻干燥，得到水杉皮提取物。
20.水杉，裸子植物杉科，是世界上珍稀的孑遗植物，有“活化石”之称。根据《中国中药资源志要》记载，水杉具有祛风燥湿、括血止痛之功效。在研究过程中发明人分别对水杉叶和水杉皮进行了活性成分浸提，结果显示将水杉皮提取物添加到液体发酵培养基中可以起到有效提高桑黄菌丝体中金丝桃苷含量的技术效果。同时发明人将水杉皮提取物与专利cn 104278068a中采用的马褂木提取物进行了比较，结果显示水杉皮提取物对桑黄菌丝体中金丝桃苷含量的提高效果更好。
21.本发明的有益效果是：本发明采用液体发酵方法进行桑黄菌丝体的培养，通过对液体发酵培养基进行改进来有效提高发酵产物中金丝桃苷的含量，该方法可以大大简化操作，只需向液体发酵培养基中添加适量的水杉皮提取物并混合均匀即可，水杉皮提取物采用自制或者市购方式，无需变动其他液体发酵条件，不会影响生产周期，在显著提高金丝桃苷含量的同时尽可能地控制成本，从而适用于规模化生产。
具体实施方式：
22.为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
23.桑黄菌种购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，cgmcc 5.1265。
24.实施例1
25.1、水杉皮提取物的制备
26.向新鲜水杉皮中加入质量百分比70％的乙醇水溶液，然后加热至回流温度浸提3次，每次加入5倍水杉皮重量的乙醇水溶液，每次浸提时间2.5h，合并提取液，经浓缩回收乙醇后冷冻干燥，研磨，过120目筛，得到水杉皮提取物。
27.2、桑黄菌丝体的液体发酵
28.(1)将活化的桑黄菌种以5％液体种子培养基体积的接种量接种于液体种子培养基中，在25-30℃下恒温培养5天，得到种子液。
29.(2)将步骤(1)制备的种子液以10％液体发酵培养基体积的接种量接种于液体发酵培养基中，在25-30℃下恒温发酵7天，得到液体发酵产物。
30.(3)将步骤(2)制备的液体发酵产物用7层纱布过滤，水洗，在50-55℃下烘干至恒重，研磨，过120目筛，得到桑黄菌丝体粉末。
31.液体种子培养基的组成为：马铃薯淀粉15g/l，葡萄糖10g/l，酵母粉3g/l，蛋白胨2g/l，磷酸二氢钾1g/l，硫酸镁0.2g/l，维生素b1 0.05g/l，余量为水。
32.液体发酵培养基的组成为：葡萄糖30g/l，酵母粉4g/l，蛋白胨3g/l，水杉皮提取物3g/l，磷酸二氢钾1g/l，硫酸镁0.5g/l，维生素b1 0.02g/l，余量为水。
33.实施例2
34.1、水杉皮提取物的制备
35.向新鲜水杉皮中加入质量百分比60％的乙醇水溶液，然后加热至回流温度浸提3次，每次加入10倍水杉皮重量的乙醇水溶液，每次浸提时间3h，合并提取液，经浓缩回收乙醇后冷冻干燥，研磨，过120目筛，得到水杉皮提取物。
36.2、桑黄菌丝体的液体发酵
37.(1)将活化的桑黄菌种以5％液体种子培养基体积的接种量接种于液体种子培养基中，在25-30℃下恒温培养4天，得到种子液。
38.(2)将步骤(1)制备的种子液以10％液体发酵培养基体积的接种量接种于液体发酵培养基中，在25-30℃下恒温发酵7天，得到液体发酵产物。
39.(3)将步骤(2)制备的液体发酵产物用7层纱布过滤，水洗，在55-60℃下烘干至恒重，研磨，过120目筛，得到桑黄菌丝体粉末。
40.液体种子培养基的组成为：马铃薯淀粉15g/l，葡萄糖15g/l，酵母粉3g/l，蛋白胨3g/l，磷酸二氢钾1g/l，硫酸镁0.3g/l，维生素b1 0.02g/l，余量为水。
41.液体发酵培养基的组成为：葡萄糖25g/l，酵母粉4g/l，蛋白胨3g/l，水杉皮提取物3g/l，磷酸二氢钾1g/l，硫酸镁0.3g/l，维生素b1 0.03g/l，余量为水。
42.实施例3
43.1、水杉皮提取物的制备
44.向新鲜水杉皮中加入质量百分比80％的乙醇水溶液，然后加热至回流温度浸提2次，每次加入5倍水杉皮重量的乙醇水溶液，每次浸提时间2h，合并提取液，经浓缩回收乙醇后冷冻干燥，研磨，过120目筛，得到水杉皮提取物。
45.2、桑黄菌丝体的液体发酵
46.(1)将活化的桑黄菌种以8％液体种子培养基体积的接种量接种于液体种子培养基中，在25-30℃下恒温培养5天，得到种子液。
47.(2)将步骤(1)制备的种子液以10％液体发酵培养基体积的接种量接种于液体发酵培养基中，在25-30℃下恒温发酵5天，得到液体发酵产物。
48.(3)将步骤(2)制备的液体发酵产物用7层纱布过滤，水洗，在55-60℃下烘干至恒重，研磨，过120目筛，得到桑黄菌丝体粉末。
49.液体种子培养基的组成为：马铃薯淀粉15g/l，葡萄糖10g/l，酵母粉3g/l，蛋白胨2g/l，磷酸二氢钾0.5g/l，硫酸镁0.3g/l，维生素b1 0.05g/l，余量为水。
50.液体发酵培养基的组成为：葡萄糖40g/l，酵母粉5g/l，蛋白胨3g/l，水杉皮提取物
4g/l，磷酸二氢钾1.5g/l，硫酸镁0.5g/l，维生素b1 0.05g/l，余量为水。
51.实施例4
52.1、水杉皮提取物的制备
53.向新鲜水杉皮中加入质量百分比70％的乙醇水溶液，然后加热至回流温度浸提2次，每次加入8倍水杉皮重量的乙醇水溶液，每次浸提时间2h，合并提取液，经浓缩回收乙醇后冷冻干燥，研磨，过120目筛，得到水杉皮提取物。
54.2、桑黄菌丝体的液体发酵
55.(1)将活化的桑黄菌种以5％液体种子培养基体积的接种量接种于液体种子培养基中，在25-30℃下恒温培养5天，得到种子液。
56.(2)将步骤(1)制备的种子液以15％液体发酵培养基体积的接种量接种于液体发酵培养基中，在25-30℃下恒温发酵7天，得到液体发酵产物。
57.(3)将步骤(2)制备的液体发酵产物用7层纱布过滤，水洗，在60-65℃下烘干至恒重，研磨，过120目筛，得到桑黄菌丝体粉末。
58.液体种子培养基的组成为：马铃薯淀粉20g/l，葡萄糖10g/l，酵母粉3g/l，蛋白胨2g/l，磷酸二氢钾0.5g/l，硫酸镁0.2g/l，维生素b1 0.05g/l，余量为水。
59.液体发酵培养基的组成为：葡萄糖35g/l，酵母粉4g/l，蛋白胨4g/l，水杉皮提取物4g/l，磷酸二氢钾1g/l，硫酸镁0.4g/l，维生素b1 0.04g/l，余量为水。
60.实施例5
61.1、水杉皮提取物的制备
62.向新鲜水杉皮中加入质量百分比70％的乙醇水溶液，然后加热至回流温度浸提3次，每次加入8倍水杉皮重量的乙醇水溶液，每次浸提时间3h，合并提取液，经浓缩回收乙醇后冷冻干燥，研磨，过120目筛，得到水杉皮提取物。
63.2、桑黄菌丝体的液体发酵
64.(1)将活化的桑黄菌种以10％液体种子培养基体积的接种量接种于液体种子培养基中，在25-30℃下恒温培养5天，得到种子液。
65.(2)将步骤(1)制备的种子液以10％液体发酵培养基体积的接种量接种于液体发酵培养基中，在25-30℃下恒温发酵7天，得到液体发酵产物。
66.(3)将步骤(2)制备的液体发酵产物用7层纱布过滤，水洗，在55-60℃下烘干至恒重，研磨，过120目筛，得到桑黄菌丝体粉末。
67.液体种子培养基的组成为：马铃薯淀粉18g/l，葡萄糖10g/l，酵母粉3g/l，蛋白胨3g/l，磷酸二氢钾1g/l，硫酸镁0.25g/l，维生素b1 0.03g/l，余量为水。
68.液体发酵培养基的组成为：葡萄糖40g/l，酵母粉5g/l，蛋白胨4g/l，水杉皮提取物5g/l，磷酸二氢钾1g/l，硫酸镁0.5g/l，维生素b1 0.05g/l，余量为水。
69.对比例1
70.对比例1与实施例5的区别之处仅在于对比例1是将实施例5中的水杉皮提取物替换为马褂木提取物，而马褂木提取物的制备方法同实施例5中水杉皮提取物的制备方法。
71.对比例2
72.对比例2与实施例5的区别之处仅在于对比例2未在液体发酵培养基中添加水杉皮提取物。
73.对上述实施例1-5和对比例1-2制备的桑黄菌丝体粉末进行金丝桃苷含量测定，测定方法参照专利cn 104278068a实施例1，测定结果见表1，每组样品平行测试5次，取平均值。
74.表1
[0075][0076][0077]
由表1可以得知，相对于马褂木提取物来说，水杉皮提取物更有利于桑黄菌丝体中金丝桃苷含量的提高，使金丝桃苷含量提高至2mg/g以上。
[0078]
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。