一种大刺鳅抗菌肽Hepcidin-like及其制备方法与流程

一种大刺鳅抗菌肽hepcidin
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like及其制备方法
技术领域
1.本公开涉及抗菌肽的技术领域，尤其涉及一种大刺鳅抗菌肽hepcidin
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like及其制备方法。


背景技术：

2.刺鳅(mastacembelus armatus)俗称角罗鳅、刀鳅、猪妈锯等，是一种珍贵的淡水鱼类，其肉质结实细嫩、味佳、无肌间刺，深受消费者欢迎的；主要分布于我国长江以南的各水系，如福建汀江、闽江、九龙江水系等，及广东、广西珠江水系，云南澜沧江、怒江水系等。其中，在福建省内以汀江水系较为常见。近年来，大刺鳅由于过度捕捞和环境污染等，野生资源日渐枯竭，已被福建、广东、贵州等省份列入重点保护的野生动物之一。目前，大刺鳅的养殖规模较小，容易受到病害侵袭造成死亡。
3.抗菌肽是生物体先天性防御系统产生的一类具有对抗外源性病原体活性的多肽类，在免疫系统中具重要的作用。近年来，随着抗生素药物的限量使用，特别是在饲料中禁止添加抗生素。抗菌肽作为天然的抑菌因子，其开发和应用受到广泛的关注。目前，在鱼类中已发现了近100种抗菌肽。hepcidin又称为铁调素，是肝脏组织特异表达的一种阳离子小分子抗菌肽，具有广谱的抗菌活性，是鱼类先天性免疫防御系统的重要组成之一，在防御细菌和病毒入侵发挥重要作用。有鉴于此，本发明人研究和设计了一种大刺鳅抗菌肽及其制备方法。


技术实现要素：

4.本公开提供了一种大刺鳅抗菌肽hepcidin
‑
like，可作为后续研究及开发药物的基础。
5.本公开还提供了一种大刺鳅抗菌肽hepcidin
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like的制备方法。
6.根据本公开的一个方面，一种大刺鳅抗菌肽hepcidin
‑
like，该抗菌肽的氨基酸序列如seq id no:1所示。
7.根据本公开的一个方面，一种大刺鳅抗菌肽hepcidin
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like的制备方法，包括以下步骤：
8.(a)以大刺鳅肝脏组织cdna为模板进行pcr扩增，克隆出hepcidin基因序列；
9.(b)将所述hepcidin基因序列进行电泳分离，回收纯化后连接至载体上，并转化至感受态细胞，得到第一重组质粒；双酶切电泳检测，将电泳鉴定正确的第一重组质粒进行测序；
10.(c)将上述测序正确的第一重组质粒和原核表达载体pet
‑
32a连接，得到第二重组质粒；
11.(d)将所述第二重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞bl21，挑选阳性单菌落测序；
12.(e)选取含阳性克隆的bl21，将其接种到含氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃，200rpm条件下振荡培养过夜，第2天以1：100接种到新鲜含氨苄青霉素的lb液体中，待od600
为0.6时，加入iptg至终浓度为0.1mmol/l，在诱导6
‑
8小时，5000rpm,10min离心收集菌沉淀；
13.(f)pbs重悬所述菌沉淀，通过超声波破碎，利用6x his纯化试剂盒纯化重组大刺鳅hepcidin蛋白，纯化后蛋白即为大刺鳅抗菌肽hepcidin
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like。
14.根据本公开的至少一个实施方式，所述步骤(a)中，所述pcr扩增：上游引物序列如seq id no:2所示；下游引物序列如seq id no:3所示。
15.根据本公开的至少一个实施方式，所述步骤(a)中，所述pcr扩增：pcr扩增反应体系为：扩增体系为25μl，其中2
×
transstart fastpfu pcr supermix12.5μl、上下游引物各1μl、模板1μl，补充灭菌ddh2o至终体积25μl。
16.根据本公开的至少一个实施方式，所述步骤(a)中，所述pcr扩增：pcr扩增反应条件为：94℃预变性2min后进入循环，94℃变性20s；55℃退火20s，72℃延伸1min，35个循环；72℃终延伸5min。
17.根据本公开的至少一个实施方式，所述步骤(b)中，所述载体为pmd18
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t载体。
18.根据本公开的至少一个实施方式，所述步骤(b)中，所述感受态细胞为大肠杆菌感受态细胞dh5α；所述双酶切的位点分别为ecori和hind iii。
19.根据本公开的一个方面，一种大刺鳅抗菌肽在制备疫苗中的应用。
20.根据本公开的一个方面，一种大刺鳅抗菌肽在制备检测试剂盒中的应用。
21.采用上述技术方案之后，本公开具有以下有益效果：
22.通过生物信息学软件的分析方法，对hepcidin蛋白可能存在的抗原表位区域进行预测分析，本发明人惊奇地发现其中一蛋白片段具备良好的抑菌活性，由此得到了本公开的hepcidin
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like重组蛋白，可作为后续研究和开发疫苗及相关诊断检测试剂盒的基础。
附图说明
23.附图示出了本公开的示例性实施方式，并与其说明一起用于解释本公开的原理，其中包括了这些附图以提供对本公开的进一步理解，并且附图包括在本说明书中并构成本说明书的一部分。
24.图1是本公开对金黄色葡萄球菌的抗菌试验结果。
25.图2是本公开对沙门氏菌的抗菌试验结果。
26.图3是本公开对大肠杆菌的抗菌试验结果。
具体实施方式
27.下面结合附图和实施方式对本公开作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于解释相关内容，而非对本公开的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与本公开相关的部分。
28.需要说明的是，在不冲突的情况下，本公开中的实施方式及实施方式中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施方式来详细说明本公开。
29.本公开提供了一种大刺鳅抗菌肽hepcidin
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like，该抗菌肽的氨基酸序列如seq id no:1所示。
30.本公开提供了一种大刺鳅抗菌肽hepcidin
‑
like的制备方法，包括以下步骤：
31.(a)以大刺鳅肝脏组织cdna为模板进行pcr扩增，克隆出hepcidin基因序列；所述pcr扩增：上游引物序列如seq id no:2所示；下游引物序列如seq id no:3所示；pcr扩增反应体系为：扩增体系为25μl，其中2
×
transstart fastpfu pcr supermix12.5μl、上下游引物各1μl、模板1μl，补充灭菌ddh2o至终体积25μl。pcr扩增反应条件为：94℃预变性2min后进入循环，94℃变性20s；55℃退火20s，72℃延伸1min，35个循环；72℃终延伸5min。
32.(b)将所述hepcidin基因序列进行电泳分离，回收纯化后连接至pmd18
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t载体上，并转化至dh5α感受态细胞，得到第一重组质粒；双酶切电泳检测，将电泳鉴定正确的第一重组质粒进行测序；双酶切的位点分别为ecori和hind iii；
33.(c)将上述测序正确的第一重组质粒和原核表达载体pet
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32a连接，得到第二重组质粒；
34.(d)将所述第二重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞bl21，挑选阳性单菌落测序；
35.(e)选取含阳性克隆的bl21，将其接种到含氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃，200rpm条件下振荡培养过夜，第2天以1：100接种到新鲜含氨苄青霉素的lb液体中，待od600为0.6时，加入iptg至终浓度为0.1mmol/l，在诱导6
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8小时，5000rpm,10min离心收集菌沉淀；
36.(f)pbs重悬所述菌沉淀，通过超声波破碎，利用6x his纯化试剂盒纯化重组大刺鳅hepcidin蛋白，纯化后蛋白即为大刺鳅抗菌肽。
37.本公开还提供了一种大刺鳅抗菌肽在制备疫苗中的应用。
38.本公开还提供了一种大刺鳅抗菌肽在制备检测试剂盒中的应用。
39.琼脂扩散发检测重组蛋白抑菌活性：
40.取金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌分别涂布在营养琼脂培养基上，在上述平板上放置牛津杯，分别加入20ul重组大刺鳅hepcidin蛋白溶液、pbs溶液。将平板与37℃培养12
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16小时，检测抑菌圈大小，如图1
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3所示，结果表明重组大刺鳅hepcidin蛋白周围出现明显的抑菌圈，pbs对照无抑菌圈。表明重组hepcidin蛋白对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌具有抑菌活性。
41.本公开通过生物信息学软件的分析方法，对hepcidin蛋白可能存在的抗原表位区域进行预测分析，本发明人惊奇地发现其中一蛋白片段具备良好的抑菌活性，由此得到了本公开的hepcidin
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like重组蛋白，可作为后续研究和开发疫苗及相关诊断检测试剂盒的基础。
42.在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例/方式”、“一些实施例/方式”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例/方式或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本技术的至少一个实施例/方式或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例/方式或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例/方式或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例/方式或示例以及不同实施例/方式或示例的特征进行结合和组合。
43.本领域的技术人员应当理解，上述实施方式仅仅是为了清楚地说明本公开，而并非是对本公开的范围进行限定。对于所属领域的技术人员而言，在上述公开的基础上还可以做出其它变化或变型，并且这些变化或变型仍处于本公开的范围内。