新型发光镧系元素螯合物报道分子、用新型发光镧系元素螯合物报道分子标记的生物特异性结合反应物及其用途的制作方法

1.本发明涉及新型发光镧系元素螯合物报道分子，其由二至三个独立的彼此共价缀合的镧系元素螯合部分形成以充当独特的标记反应物，并且其可连接至生物特异性反应物并用于各种测定。


背景技术：

2.采用长寿命发射发光镧系元素螯合物的时间分辨荧光测定(trf)已经应用于例如许多特异性结合测定，如免疫测定、dna杂交测定、受体结合测定、酶测定、生物成像如免疫细胞化学、免疫组织化学测定或基于细胞的测定，以在极低浓度下测量希望的分析物。此外，镧系元素螯合物已经用于磁共振成像(mri)和正电子发射断层显像术(pet)。
3.对于trf应用，最佳标记物必须满足几个要求。首先，其必须在基态和激发态均是光化学稳定的，并且其必须是动力学和化学稳定的。激发波长必须尽可能高，优选地超过300nm。其必须具有高效的阳离子发射，即亮度(激发系数
×
量子产率，εφ)。所观察到的发光衰减时间必须较长，并且螯合物必须具有良好的水溶性。出于标记的目的，其应当具有反应性基团以允许共价连接至生物特异性结合反应物，并且必须保持标记的生物分子的亲和力和非特异性结合特性。
4.自从公开了含有一至三个独立的4-(苯基乙炔基)吡啶的标记螯合物(us 4,920,195；takalo,h.等人,helv.chim.acta.79(1996)789)，设计的配体结构已应用于许多专利、专利申请和出版物中。一种通常使用的改善发光强度(即亮度)的方法是通过使若干独立的发色团部分(即4-(苯基乙炔基)吡啶)在结构设计中组合来增强螯合物的摩尔吸光系数，其提供了较高稳定性和发光量子产率(参见例如wo 2013/026790；wo 2013/092992；wo 2016/066641)。通常已知的是，也通过增加发色团的摩尔吸光系数连同量子产率来改善发光强度。可通过增加芳族发色团的π电子共轭来增强摩尔吸光系数(参见例如wo 2015/165826)。
5.尽管所公开的标记物可提供高灵敏测定，但测定中使用的抗体可能遭受高标记程度(即，每个抗体(ab)或生物分子的螯合物的量)。通常已知，可以通过增加生物分子(如igg)中标记的量来增加测定灵敏度。通常，标记程度过高意味着在ab标记期间更多的聚集体，并因此导致标记的ab的纯化问题。此外，抗体的亲和力降低并且背景增加。因此，大多数ab的标记程度必须被最优化，并且取决于所考虑的ab而实际上不能超过15-20eu/igg。此外，某些ab或生物分子(如寡肽或寡核苷酸)不含有多种被用于标记的官能团(如伯氨基基团)并且/或者无法耐受在一个ab上多个标记。与寡肽和寡核苷酸相关，通过使用固相标记解决了每个生物分子的标记足够量的问题，该固相标记允许将若干螯合物引入寡肽和寡核苷酸(参见例如hovinen,j.等人,bioconjugate chem.20(2009)404)。然而，所公开的标记方法和此类固相制备的标记不能用于水溶液中的正常生物分子标记(例如，用于ab)。而且，作为若干螯合物的主链的聚合物或树状大分子(dendrimer)可提供增加每个生物分子的螯合物量的可能性。然而，生物分子与此类具有螯合物的大体积聚合物分子的缀合引起纯化
问题和不希望的非特异性反应，并因此破坏了待标记的生物分子的功能性。因此，所公开的聚合物或树枝状螯合物标记的使用被限制于成像应用，如mri(参见例如andolina,c.m.等人,macromolecules,45(2012)8982)，并且不能实际用于生物分子如ab的特异性标记。
6.针对该背景，本发明的目的在于提供用于标记生物特异性结合反应物(如抗体)的发光镧系元素螯合物报道分子，其提供标记的生物特异性结合反应物增加的亮度而不降低其亲和力。
7.本发明的另一个目的在于提供用于标记生物特异性结合反应物如抗体的发光镧系元素螯合物报道分子，其提供标记的生物特异性结合反应物的增加的亮度，而不引起标记的生物特异性结合反应物的纯化问题。
8.本发明的又一个目的在于提供用于标记生物特异性结合反应物如抗体的发光镧系元素螯合物报道分子，其适用于标记仅具有少量待用于标记的官能团(如伯氨基基团)的生物特异性结合反应物。


技术实现要素：

9.已经发现，上述目的通过包含两个或三个独立的镧系元素螯合部分的发光镧系元素螯合物报道分子来解决，所述镧系元素螯合部分彼此共价拴连(tether)。
10.在一个方面，本发明因此涉及一种式(i)的化合物
[0011][0012]
或其盐，其中
[0013]
(i)实线表示共价键；
[0014]
(ii)虚线表示基团-l-z与基团che1、a1和che2中任一者的共价键；
[0015]
并且其中
[0016]
l在每种情况下独立地不存在，或者选自包含1至10个选自以下的部分的连接基团：-(ch2)
1-8-、-ch＝ch-、-c≡c-、-o-、-s-、-s-s-、-c(＝o)-、-c(＝o)nh-、-nhc(＝o)-、-c(＝o)n(c
1-c
6-烷基)-、-n(c
1-c
6-烷基)c(＝o)-、-nhc(＝s)nh-、-ch[(ch2)
0-6
c(＝o)o-]-、-ch[(ch2)
0-6
c(＝o)oh]-以及5至10元芳族或杂芳族单环或双环的双基，其中杂芳族环含有一个或多个相同或不同的杂原子n、o或s；
[0017]
z在每种情况下独立地选自反应性基团，所述反应性基团选自-n3、-c≡ch、-ch＝ch2、-nh2、-o-nh2、-c(＝o)oh、-ch(＝o)、-sh、-oh、马来酰亚胺基以及它们的活化衍生物，包括-nco、-ncs、-n

≡n、溴乙酰胺基、碘乙酰胺基、反应性酯、吡啶基-2-二硫基，以及6-取代的4-氯-1,3,5-三嗪-2-基氨基和4-氯-1,3,5-三嗪-2-基氧基；其中4-氯-1,3,5-三嗪-2-基氨基或4-氯-1,3,5-三嗪-2-基氧基的6位的取代基选自-h、-卤素、-sh、-nh2、-c
1-c
6-烷基、-o(c
1-c
6-烷基)、-o芳基、-s(c
1-c
6-烷基)、-s芳基、-n(c
1-c
6-烷基)2和n(芳基)2；
[0018]
其中前述基团的碳原子未被取代或者被一个或多个选自以下的取代基取代：-cn、-卤素、-sh、-c(＝o)h、-c(＝o)oh、c
1-c
6-烷基、c
1-c
6-卤代烷基、-o(c
1-c
6-烷基)、-c(＝o)(c
1-c
6-烷基)、-c(＝o)o(c
1-c
6-烷基)和苯基；
[0019]
a1为桥联基团，所述桥联基团包含一至三个独立的直链或支链的、饱和或不饱和的包括1至12个碳原子的碳基链，其中碳基链不含或者包含一至十个相同或不同的选自-o-、-s-、-nh-、-nr
1-、-c(＝o)nh-、-nhc(＝o)-、-c(＝o)nr
1-、-nr1c(＝o)-和-c(＝o)-的基团，
[0020]
或者
[0021]
a1为以下通式的桥联螯合部分-che
3-[0022][0023]
并且其中
[0024]
che1和che2独立地选自以下通式的螯合部分che i、che ii、che iii、che iv、che v、che vi和che vii：
[0025]
[0026][0027]
并且其中
[0028]
r1在每种情况下独立地选自c
1-c
6-烷基，并且选自表示一个或两个基团-l-z中的一者的选项；
[0029]
r2在每种情况下独立地选自-c(＝o)o-、-p(＝o)o
22-、p(＝o)meo-、-p(＝o)pho-以及它们的c
1-c
6-烷基酯，并且选自表示一个或两个基团-l-z中的一者的选项(from the option of representing one of the one or two groups-l-z)；
[0030]
r3在每种情况下独立地选自桥联基团-c(＝o)nh-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-nhc(＝o)-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-o-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-c(＝o)nh-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-s-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-nhc(＝o)-(c
1-c
6-亚烷基)-nhc(＝o)-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-nhc(＝o)-(c
1-c
6-亚烷基)-o-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-nhc(＝o)-(c
1-c
6-亚烷基)-c(＝o)nh-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-nhc(＝o)-(c
1-c
6-亚烷基)-s-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-o-(c
1-c
6-亚烷基)-nhc(＝o)-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-o-(c
1-c
6-亚烷基)-o-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-o-(c
1-c
6-亚烷基)-s-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-o-(c
1-c
6-亚烷基)-c(＝o)nh-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-nhc(＝o)-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-o-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-s-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-c(＝o)nh-和-p(＝o)o
22-；
[0031]
r4在每种情况下独立地选自-ch2n(ch2c(＝o)o-)2、-ch2n(ch2p(＝o)o
22-)2、-ch2n
(ch2p(＝o)meo-)2、-ch2n(ch2p(＝o)pho-)2，并且选自对r2所定义的选项；
[0032]
ln
3
在每种情况下独立地选自镧系元素离子eu
3
、tb
3
、sm
3
和dy
3
，其中镧系元素离子与螯合部分che1、che2和che3中的杂原子氧和氮形成七至十个配位键，以形成二至三个独立的内部螯合部分；
[0033]
ar1选自以下基团
[0034][0035]
ar2在每种情况下独立地选自以下基团
[0036]
[0037][0038]
并且其中
[0039]
g在每种情况下独立地选自i)共轭基团，ii)单键和iii)氢；
[0040]
其中每个共轭基团包含1、2或3个选自-ch＝ch-、-c≡c-、-c(＝o)-以及5至10元芳族或杂芳族单环或双环的双基的部分，其中杂芳族环含有一个或多个相同或不同的杂原子n、o或s，并且其中芳族或杂芳族单环或双环未被取代或者被1至5个相同或不同的取代基r5取代；
[0041]
其中如果存在于末端位置，每个共轭基团还可包含末端基团，所述末端基团选自-h、-卤素、-cn、-ch3，并且选自表示一个或两个基团-l-z中的一者的选项。
[0042]
其中r5独立地选自c
1-c
12-烷基、-(ch2)
0-6-c(＝o)oh、-(ch2)
0-6-c(＝o)o-、-(ch2)
0-6-s(＝o)2oh、-(ch2)
0-6-s(＝o)2o-、-c(＝o)nhr6、-c(＝o)nch3r6、-nhc(＝o)nhr6、-nhc(＝s)nhr6、-卤素、-oh、-sh、-or7、-sr7和亲水基团，所述亲水基团选自单糖、二糖、-(ch2)
1-6
ch2oh、-ch(ch2oh)2、-c(ch2oh)3、-(ch2)
1-3-o-(ch2ch2o)
0-5-h、-(ch2)
1-3-o-(ch2ch2o)
0-5-c
1-c
4-烷基、-o-(ch2ch2o)
1-6-h和-o-(ch2ch2o)
1-6-c
1-c
4-烷基；
[0043]
其中r6选自c
1-c 12-烷基、-(ch2)
1-6
c(＝o)oh、-(ch2)
1-6
c(＝o)o-、-(ch2)
1-6
s(＝o)2oh、-(ch2)
1-6
s(＝o)2o-和亲水基团，所述亲水基团选自单糖、二糖、-(ch2)
1-6
ch2oh、-ch(ch2oh)2、-c(ch2oh)3、-(ch2)
1-3-o-(ch2ch2o)
0-5-h、-(ch2)
1-3-o-(ch2ch2o)
0-5-c
1-c
4-烷基、-o-(ch2ch2o)
1-6-h和-o-(ch2ch2o)
1-6-c
1-c
4-烷基；
[0044]
其中r7选自-cf3、-c
1-c
12-烷基、-(ch2)
1-6
c(＝o)oh、-(ch2)
1-6
c(＝o)o-、-(ch2)
1-6
s(＝o)2oh、-(ch2)
1-6
s(＝o)2o-、-c(＝o)nhr6、-c(＝o)nch3r6、-nhc(＝o)nhr6、-nhc(＝s)nhr6、-(ch2)
1-6
n(ch3)
2 -(ch2)
1-6
s(＝o)2o-、-(ch2)
1-6
c(＝o)-(哌嗪-1,4-二基)-(ch2)
1-6
c(＝o)oh和亲水基团，所述亲水基团选自单糖、二糖、-(ch2)
1-6
ch2oh、-ch(ch2oh)2、-c
(ch2oh)3、-(ch2)
1-3-o-(ch2ch2o)
0-5-h、-(ch2)
1-3-o-(ch2ch2o)
0-5-c
1-c
4-烷基、-o-(ch2ch2o)
1-6-h和-o-(ch2ch2o)
1-6-c
1-c
4-烷基。
[0045]
式(i)的化合物可用于增加标记的生物特异性结合反应物(如抗体(ab))的亮度而不降低其亲和力。此外，标记的ab可有效地与过量的标记试剂和副化合物分离。式(i)的化合物含有1-2个用于ab标记的反应性基团。当使用两个反应性基团时，获得较高的标记程度，并且/或者较少的标记反应物可用于得到适当的标记程度。如果具有两个反应性基团的式(i)的化合物用于标记，则螯合物标记物将是刚性和紧凑的。因此，其减少了报道分子可能的热移动和旋转，并且减少了受激发报道分子的热失活过程，并且可增加发光(即标记的生物分子的亮度)。
[0046]
在另一方面，本发明涉及一种式(ii)的化合物
[0047][0048]
或其盐，其中
[0049]
l、z、r1、r2、r3、r4、ar1、ar2、g、r5、r6和r7如关于式(i)的化合物所定义，
[0050]
并且其中
[0051]
a1为桥联基团，所述桥联基团包含一至三个独立的直链或支链的、饱和或不饱和的包括1至12个碳原子的碳基链，其中碳基链不含或者包含一至十个相同或不同的选自-o-、-s-、-nh-、-nr
1-、-c(＝o)nh-、-nhc(＝o)-、-c(＝o)nr
1-、-nr1c(＝o)-和-c(＝o)-的基团，
[0052]
或者
[0053]
a1为以下通式的桥联螯合部分-che*
3-[0054][0055]
并且其中
[0056]
che*1和che*2独立地选自以下通式的螯合部分che*i、che*ii、che*iii、che*iv、che*v、che*vi和che*vii：
[0057][0058]
[0059]
式(ii)的化合物是根据式(i)的发光镧系元素螯合物报道分子的前体化合物。可以通过在可能的酯官能团脱保护后使式(ii)的化合物与镧系元素盐反应，由式(ii)的化合物获得式(i)的化合物。
[0060]
在另一方面，本发明涉及一种检测剂，该检测剂包含与如上所定义的式(i)或(ii)的化合物缀合的生物特异性结合反应物。
[0061]
在又一方面，本发明涉及一种在生物特异性结合测定中检测分析物的方法，所述方法包括以下步骤：
[0062]
a)在分析物与如上所定义的式(i)或(ii)的化合物或检测剂之间形成复合物；
[0063]
b)采用具有如上所定义的式(i)的化合物或检测剂的激发波长的辐射来激发所述复合物，从而形成激发的复合物；以及
[0064]
c)检测从所述激发的复合物发射的发射辐射。
[0065]
在又一方面，本发明涉及一种用如上所定义的式(i)或(ii)的化合物标记生物特异性结合反应物的方法，该方法包括以下步骤
[0066]
a)提供生物特异性结合反应物；以及
[0067]
b)使生物特异性结合反应物与式(i)或(ii)的化合物缀合。
[0068]
在又一方面，本发明涉及如上所定义的检测剂在利用特异性发光的时间分辨荧光测定的基于特异性生物亲和性的结合测定中的用途。
[0069]
在又一方面，本发明涉及如上所定义的式(i)或(ii)的化合物或如上所定义的检测剂用于体外检测样品中的分析物的用途。
[0070]
在又一方面，本发明涉及如上所定义的式(i)或(ii)的化合物或如上所定义的检测剂在生物成像应用中的用途。
[0071]
在又一方面，本发明涉及一种固体载体材料，该固体载体材料与如上所定义的式(i)或(ii)的化合物或如上所定义的检测剂缀合。
[0072]
定义
[0073]
如本文所用，术语“连接基团”是指通过至少两个共价键连接两个其他部分的部分。因此，连接基团是双基基团，特别是“距离形成双基”。
[0074]
如本文所用，术语“共轭基团”是指这样的部分：通过至少两个共价键连接两个其他部分，或者以使得该共轭基团与一个或多个部分共轭的方式(优选地通过π电子共轭方式)封端该部分。共轭基团的部分的排列优选地使得彼此共轭，从而进一步增加π电子共轭。如果共轭基团连接至其他部分，则其仅包含双基部分，以便形成共轭的“距离形成双基”。然而，如果共轭基团存在于末端位置中，则除了共轭的“距离形成双基”之外，其还包含末端基团，该末端基团可例如选自-h、-卤素、-cn、ch3等。
[0075]
如本文所用，术语“距离形成双基”是指这样的部分：其与两个其他部分形成键，目的是将两个其他基团彼此隔开，例如，作为两个其他基团之间的连接基，例如，以利于反应性基团定位在可用于与生物特异性结合反应物反应的位置中。距离形成双基可包含一个或多个双基部分。根据本发明的优选的双基部分包括一个或多个，优选地1至10个以下部分：亚烷基链-(ch2)
1-8-、亚乙烯基(-ch＝ch-)、乙炔二基(-c℃-)、醚(-o-)、硫醚(-s-)、二硫化物(-s-s-)、胺(-nh-或-nr
1-)、酰胺(-c(＝o)nh-、-c(＝o)n(c
1-c
6-烷基)-、-nhc(＝o)-或-n(c
1-c
6-烷基)c(＝o)-)、酮(-c(＝o)-)、硫脲(-nh-c(＝s)-nh-)以及(杂)芳族单环或双环的
双基(-het/ar-)，如亚苯基、亚吡啶基和亚三唑。共轭基团中的优选的双基部分包括一个或多个，优选地1至10个以下部分：亚乙烯基(-ch＝ch-)、乙炔二基(-c℃-)、羰基(-c(＝o)-)，以及(杂)芳族单环或双环的双基(-het/ar-)，例如亚苯基、亚联苯基、亚萘基、亚吡啶基、亚吡嗪基、亚嘧啶基、亚哒嗪基、亚呋喃基、亚噻吩基、亚吡咯基、亚咪唑基、亚吡唑基、亚噻唑基、亚异噻唑基、亚噁唑基、亚异噁唑基、亚呋咱基(fyrazanylene)、1,2,4-三唑-3,5-亚基和亚噁二唑基。以下提供了就本发明的合适的双基部分而言的进一步细节。
[0076]
如本文所用，术语“反应性基团”是指这样的官能团：其可在本发明化合物与生物特异性结合反应物的标记反应中反应，或者有利于与固体载体材料形成共价键。在螯合物具有聚合基团作为反应性基团的情况下，则可在制备颗粒的同时将螯合物引入固体载体(例如颗粒)中。在与生物特异性结合反应物反应时，反应性基团与所述生物特异性结合反应物建立连接。优选的反应性基团z尤其包括叠氮基(-n3)、炔基(-c℃h)、亚烷基(-ch＝ch2)、氨基(-nh2)、氨基氧基(-o-nh2)、羧基(-c(＝o)oh)、醛(-ch(＝o))、巯基(-sh)、马来酰亚胺基基团或它们的活化衍生物，包括异氰酸酯基(-nco)、异硫氰酸酯基(-ncs)、重氮基(-n

n)、溴乙酰胺基、碘乙酰胺基、反应性酯、吡啶基-2-二硫基，以及6-取代的4-氯-1,3,5-三嗪-2-基氨基和4-氯-1,3,5-三嗪-2-基氧基。以下提供了就这一点而言的进一步细节。
[0077]
由此得出，在与生物特异性结合反应物反应(进一步参见以下)时，反应性基团z与所述生物特异性结合反应物建立了例如以下类型之一的连接：硫脲(-nh-c(＝s)-nh-)、氨基乙酰胺(-nh-co-ch
2-nh-)、酰胺(-nh-co-、-co-nh-、-nch
3-co-和-co-nch
3-)和脂族硫醚(-s-)、二硫化物(-s-s-)、6-取代的-1,3,5-三嗪-2,4-二胺、(其中n＝1-6)；以及三唑(例如，通过所谓的“点击”化学)。
[0078]
如本文所用，术语“亲水基团”是指为了改善螯合物的水溶性而存在的部分。因此，包含亲水基团作为取代基的化合物在水中的溶解度高于不包含所述亲水基团的相应化合物。以下进一步提供了亲水基团的实例，并且尤其包括单糖和寡糖，如单糖和二糖，低聚亚烷基二醇(例如，具有1-20个重复单元的那些)，如低聚乙二醇和低聚丙二醇等。
[0079]
如本文所用，术语“单糖”旨在意指非环状或环状形式的c
5-c7碳水化合物。以下进一步提供了优选的实例。
[0080]
如本文所用，术语“寡糖”是指含有较小数量，通常3至10个以上所提及的单糖单元的糖聚合物，所述单糖单元优选地通过糖苷键连接在一起。
[0081]
如本文所用，术语“多糖”是指含有超过10个单糖单元的糖聚合物，所述单糖单元优选地通过糖苷键连接在一起。
[0082]
如本文所用，术语“螯合物”或“螯合部分”是由金属离子和螯合配体构成的化学结构或化合物，其含有螯合基团。螯合配体是指这样的部分：其尤其与针对螯合物的金属离子的螯合基团的若干键(即配位键)配位，并且与金属离子形成五至六元环。因此，螯合基团的实例包括但不限于包含伯胺、仲胺或叔胺、-c(＝o)-、-c(＝o)o-、-c(＝o)nh-、-p(＝o)o
22-、-p(＝o)meo-、-p(＝o)pho-基团中的至少一种的基团，其中氮或氧与螯合物的金属离子形成配位的配位键。根据本发明的优选的金属离子是镧系元素离子ln
3
。本发明的分子含
有二至三个独立的内部螯合部分，其优选地选自以下螯合部分：
[0083][0084]
在这些结构中，螯合基团与ln
3
离子之间的虚线表示所考虑的螯合部分的配位键。
[0085]
如本文所用，术语“镧系元素离子”或“ln
3 ”旨在意指元素周期表中镧系的三价离子，例如铕(iii)、铽(iii)、钐(iii)和镝(iii)(即eu
3
、tb
3
、sm
3
或dy
3
)。在许多实施方案中，铕(iii)(eu
3
)和铽(iii)(tb
3
)是优选的。eu
3
是特别优选的。
[0086]
应当理解，在一些实施方案中，式(i)的镧系元素螯合物(以及式(ii)的镧系元素螯合配体)的基本结构可包含至少两个负电荷，并甚至更多的负电荷，这取决于式(i)或(ii)中的取代基。如果螯合物或配体包含负电荷，则根据本领域的公知常识，它们可以与抗衡离子缔合形成盐。因此，应当理解，除了式(i)和式(ii)中所示的之外，化合物还可分别与作为抗衡离子的一种或多种阳离子进一步缔合形成“盐”。此类抗衡离子的实例为na

、ca
2
和k

。特别优选的是na

和k

。优选地，抗衡离子是来自元素周期表中ia和iia族的那些。由螯合物中的配位键结合的金属离子ln
3
不被视为盐中的抗衡离子。在其他实施方案中，镧系元素螯合物以及镧系元素螯合配体或螯合配体可具有中性净电荷，其中术语“净电荷”是指包含配体和一种或多种镧系元素离子的分子的正电荷和负电荷的总和。分子的净电荷当然取决于所选的螯合基团以及共轭基团中所用的取代基或基团或例如连接基团。例如，如果基团che1和che2被选择为式che v，螯合基团r2是-coo-并且适当地选择共轭基团中的取代基，则分子的净电荷可为中性，并因此分子不包含至少两个负电荷。
[0087]
如本文所用，术语“生物特异性结合反应物”是能够特异性地结合所关注分析物的化合物，以用于定量或定性分析样品(例如体液样品)中的所述分析物的目的。
[0088]
如本文所用，术语“抗体”是指通常已知的主要由浆细胞产生的y形蛋白，其被免疫系统用来中和病原体，如致病细菌和病毒。然而，如本发明上下文中所用，术语“抗体”还包含衍生自此类抗体的分子，如fab-片段、fab2、fc-片段、双抗体等。
[0089]
如本文所用，“抗原”是能够诱导产生抗体的免疫反应的分子。因此，抗原可为与抗体结合的分子。
[0090]
如本文所用，“受体配体”是已知结合细胞受体的分子。受体配体的实例是神经递质、激素、生长因子等。相应受体的实例是g-蛋白偶联受体、蛋白激酶受体等。
[0091]
如本文所用，术语“dna探针”或“rna探针”是指可作为“探针”与靶核酸序列杂交的核糖核酸或脱氧核苷酸。因此，探针可包含靶核酸序列的互补序列。
[0092]
如本文所用，术语“蛋白质”涵盖任何类型的蛋白质，包括与一种或多种靶分子特异性相互作用的酶或特异性结合蛋白。在本发明的意义上，术语蛋白质是指任何长度的氨基酸的任何聚合物，并因此也涵盖肽，例如，仅包含2至100个氨基酸的寡肽。
[0093]
如本文所用，术语“磷脂”是指作为所有细胞膜的主要组分的一类脂质。磷脂分子的结构通常由两个疏水性脂肪酸“尾部”以及由磷酸基团组成的亲水性“头部”组成。这两种组分通过甘油分子连接在一起。磷酸基团可用简单的有机分子如胆碱加以修饰。
[0094]
如本文所用，术语“pna”或“肽核酸”是指类似于rna或dna的人工合成聚合物。然而，dna和rna分别具有脱氧核糖和核糖骨架，而pna的骨架由通过肽键连接的重复的-n-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元构成。各种嘌呤和嘧啶碱基通过亚甲基桥(-ch
2-)和-(c＝o)-基团与骨架连接。
[0095]
如本文所用，术语“类固醇”是指以特定分子构型排列的具有四个环的有机化合物。实例包括膳食脂质胆固醇、性激素雌二醇和睾酮以及抗炎药地塞米松。类固醇具有两种主要的生物学功能：某些类固醇(如胆固醇)是改变膜流动性的细胞膜的重要组分，并且许多类固醇是活化类固醇激素受体的信号分子。
[0096]
类固醇核心结构由十七个碳原子构成，键结成四个“稠合”环：三个六元环己烷环和一个五元环戊烷环。类固醇通过与该四环核心连接的官能团以及环的氧化态而变化。甾醇是具有处于三位的羟基基团和衍生自胆甾烷的骨架的类固醇的形式。它们也可通过环结构的改变而更显著地变化，如例如在产生开环甾类化合物(如维生素d3)的环断裂中。
[0097]
如本文所用，术语“半抗原”是指仅在与大载体分子(如蛋白质)连接时引发免疫反应的分子，其中载体可为优选地自身不引发免疫反应的载体。
[0098]
如本文所用，术语“药物”是指可用于疾病的预防性或治疗性治疗的具有药理学特性的化合物。
[0099]
如本文所用，术语“凝集素”是指糖类结合蛋白，即，对糖部分高度特异性的大分子。
[0100]
如本文所用，术语“寡核苷酸”是指短dna或rna分子(包含少于30个单体)、寡聚物，其在遗传测试、研究和法医学中具有广泛的应用。通常在实验室中通过固相化学合成制备，这些小片段的核酸可被制造为具有任何用户指定序列的单链分子，并因此对于人工基因合成、聚合酶链反应(pcr)、dna测序、文库构建和作为分子探针是至关重要的。在自然界中，寡核苷酸通常被发现为在基因表达的调节中起作用的小rna分子(例如微rna)，或者是衍生自较大核酸分子的分解的降解中间体。
[0101]
寡核苷酸的特征在于构成整个分子的核苷酸残基序列。
[0102]“修饰寡核苷酸”是指包含一个或多个非天然核酸(即，不包含胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶作为碱基的核酸)的寡核苷酸。
[0103]“多核苷酸”是指由30个或更多个在链中共价键合的核苷酸单体构成的生物聚合物。
[0104]“修饰多核苷酸”是指包含一个或多个非天然核酸单体的多核苷酸。
[0105]
如本文所用，术语“分析物”是指样品中待定性和/或定量测定的所关注的目标参数。
[0106]
如本文所用，术语“生物特异性结合测定”或“基于特异性生物亲和性的结合测定”意指体外测定，其中在生物分子与靶分子之间形成特异性复合物，并且复合物的存在(即结合)可通过标准生化方法检测到。
[0107]
如本文所用，术语“生物特异性结合反应物”意指可在生物特异性结合测定中存在的条件下特异性地结合至所关注分析物的生物分子。
[0108]
如本文所用，术语“检测剂”意指例如在体外测定形式中，可例如通过发光或uv-vis吸光度检测到的化合物。
[0109]
如本文所用，术语“特异性发光”是指检测剂的发光，其中发光以确保发光与检测剂特异性相关的方式进行测量，例如，通过选择用于光测量的波长，其中检测剂显示出较高的光发射，例如，接近检测剂光谱中的最大发射。
[0110]
如本文所用，术语“发光”是指不是由热引起的物质的光发射。发光的实例是化学发光、生物发光、光致发光、磷光等。
[0111]
如本文所用，术语“样品”是指从患者收集用于体外生物测定以测定所关注的分析物参数的样品，其中样品通常为体液，如血液、唾液、尿液、脑脊液或组织样品，如活检样品。
[0112]
如本文所用，术语叠氮基(-n3)、-c℃h、-ch＝ch2、氨基(-nh2)、氨基氧基(-o-nh2)、羧基(-cooh)、醛(-cho)、巯基(-sh)和马来酰亚胺基基团的“活化衍生物”是指这些官能团的活化形式，其是反应性的，使得生物特异性结合反应物的标记是可能的。活化衍生物包括但不限于异氰酸酯基(-nco)、异硫氰酸酯基(-ncs)、重氮基(-n

n)、溴乙酰胺基、碘乙酰胺基、反应性酯、吡啶基-2-二硫基、6-取代的4-氯-1,3,5-三嗪-2-基氨基和6-取代的4-氯-1,3,5-三嗪-2-基氧基，其中6-取代的4-氯-1,3,5-三嗪-2-基氨基优选地为4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基氨基，并且6-取代的4-氯-1,3,5-三嗪-2-基氧基优选地为4-氯-1,3,5-三嗪-2-基氧基。
[0113]
如本文所用，术语“反应性酯”是指这样的酯：其被活化以例如用于酰胺键形成和肽偶联，并且具有比烷基或苄基酯更高的反应性。合适的反应性酯描述于christian a.g.n.montalbetti和v.falque的tetrahedron 61(2005)10827的文章中，并且优选地包括基于对硝基苯酚、五氟苯酚、2,4,5-三氯苯酚、n-羟基-5-降冰片烯-内-2,3-二羧酰亚胺、羟基苯并三唑、1-羟基-7-氮杂苯并三唑、磺基-n-羟基琥珀酰亚胺或n-羟基琥珀酰亚胺的芳族酯、基于鏻鎓-、脲鎓-或胍鎓基偶联剂的酯，以及三嗪基或吡啶鎓酯。
[0114]
在以上变量定义中所提及的有机部分—如术语卤素—是单独基团成员的单独列表的集合术语。前缀c
n-cm在每种情况下指示基团中可能的碳原子数。
[0115]
术语“卤素”在每种情况下表示氟、溴、氯或碘，特别是氟、氯和溴。
[0116]
如本文所用，术语“烷基”在每种情况下表示通常具有1至12个碳原子，常常1至6个碳原子，优选地1至4个碳原子，更优选地1至3个碳原子的直链或支链的的非环状饱和烃。代表性的直链-c
1-12
烷基基团包括甲基、-乙基、-正丙基、-正丁基、-正戊基、-正己基、正庚基、正辛基、正壬基和正癸基。代表性的支链-(c
1-c
12
)烷基基团包括异丙基、仲丁基、异丁基、叔丁基、异戊基、新戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、3-乙基丁基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、5-甲基己基、6-甲基庚基等。
[0117]
如本文所用，术语“卤代烷基”在每种情况下表示通常具有1至12个碳原子，常常1至6个碳原子，优选地1至4个碳原子的直链或支链的的烷基基团，其中该基团的氢原子部分或全部被卤素原子替代。优选的卤代烷基部分选自c
1-c
4-卤代烷基，更优选地c
1-c
3-卤代烷基或c
1-c
2-卤代烷基，特别地c
1-c
2-氟烷基，如氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、1-氟乙基、2-氟乙基、2,2-二氟乙基、2,2,2-三氟乙基、五氟乙基等。
[0118]
如本文所用，术语“5至10元芳族或杂芳族单环或双环”(其中芳族单环或双环也可称为芳基或-ar，且杂芳族单环或双环也可称为杂芳基(hetaryl)或杂芳基(heteroaryl)或het)表示具有5至10个原子作为环成员的芳族或杂芳族单环或双环。优选的杂芳族单环为5或6元环。优选的杂芳族双环为9或10元环。优选的芳族单环为6元环。优选的芳族双环为9或10元环。对于双环芳族或杂芳族环，仅要求两个环中的一者为芳族。或者，两个环均为芳族。虽然芳族环仅包含碳原子作为环成员，但在杂芳族环中，(一个或两个环的)至少一个碳原子被一个或多个相同或不同的选自氮(n)、氧(o)和硫(s)的杂原子替代。应当理解，硫原子可任选地以氧化形式存在。在一个实施方案中，双环-(5至10元)杂芳基环中的一者含有至少一个碳原子。在另一个实施方案中，双环-(5至10元)杂芳基环中的两者均含有至少一个碳原子。代表性的-(5至10元)杂芳基包括吡啶基、呋喃基、苯并呋喃基、苯硫基、苯并噻吩基、喹啉基、异喹啉基、吡咯基、吲哚基、噁唑基、苯并噁唑基、咪唑基、苯并咪唑基、噻唑基、苯并噻唑基、异噁唑基、噁二唑啉基(oxadiazolinyl)、吡唑基、异噻唑基、哒嗪基、嘧啶基、嘧啶碱基、吡嗪基、噻二唑基、三嗪基、噻吩基、噻二唑基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基等。代表性的-(6至10元)芳基基团包括茚基、-苯基和-萘基等。苯基是特别优选的。
[0119]
附图
[0120]
图1显示配体酯24和25，其为如本文所述的优选的式(ii)的化合物。
[0121]
图2显示eu螯合物26、27、28和29，其为如本文所述的优选的式(i)的化合物。
[0122]
图3显示配体酯34，其为如本文所述的优选的式(ii)的化合物。
[0123]
图4显示eu螯合物35和36，其为如本文所述的优选的式(i)的化合物。
[0124]
图5显示配体酯43和44，其为如本文所述的优选的式(ii)的化合物。
[0125]
图6显示eu螯合物45、46、47和48，其为如本文所述的优选的式(i)的化合物。
[0126]
图7显示配体酯55，其为如本文所述的优选的式(ii)的化合物。
[0127]
图8显示eu螯合物56和57，其为如本文所述的优选的式(i)的化合物。
[0128]
图9显示eu螯合物58和59，其为如本文所述的优选的式(i)的化合物。
[0129]
图10显示参考eu螯合物ref 1、ref 2和ref 3，其仅包含一个螯合部分。
具体实施方式
[0130]
如上所指出，本发明涉及一种式(i)的化合物
[0131][0132]
或其盐，其中
[0133]
(i)实线表示共价键；
[0134]
(ii)虚线表示基团-l-z与基团che1、a1和che2中任一者的共价键；
[0135]
并且其中
[0136]
l在每种情况下独立地不存在，或者选自包含1至10个选自以下的部分的连接基团：-(ch2)
1-8-、-ch＝ch-、-c≡c-、-o-、-s-、-s-s-、-c(＝o)-、-c(＝o)nh-、-nhc(＝o)-、-c(＝o)n(c
1-c
6-烷基)-、-n(c
1-c
6-烷基)c(＝o)-、-nhc(＝s)nh-、-ch[(ch2)
0-6
c(＝o)o-]-、-ch[(ch2)
0-6
c(＝o)oh]-以及5至10元芳族或杂芳族单环或双环的双基，其中杂芳族环含有一个或多个相同或不同的杂原子n、o或s；
[0137]
z在每种情况下独立地选自反应性基团，所述反应性基团选自-n3、-c≡ch、-ch＝ch2、-nh2、-o-nh2、-c(＝o)oh、-ch(＝o)、-sh、-oh、马来酰亚胺基以及它们的活化衍生物，包括-nco、-ncs、-n

≡n、溴乙酰胺基、碘乙酰胺基、反应性酯、吡啶基-2-二硫基，以及6-取代的4-氯-1,3,5-三嗪-2-基氨基和4-氯-1,3,5-三嗪-2-基氧基；其中4-氯-1,3,5-三嗪-2-基氨基或4-氯-1,3,5-三嗪-2-基氧基的6位的取代基选自-h、-卤素、-sh、-nh2、-c
1-c
6-烷基、-o(c
1-c
6-烷基)、-o芳基、-s(c
1-c
6-烷基)、-s芳基、-n(c
1-c
6-烷基)2和n(芳基)2；
[0138]
其中前述基团的碳原子未被取代或者被一个或多个选自以下的取代基取代：-cn、-卤素、-sh、-c(＝o)h、-c(＝o)oh、c
1-c
6-烷基、c
1-c
6-卤代烷基、-o(c
1-c
6-烷基)、-c(＝o)(c
1-c
6-烷基)、-c(＝o)o(c
1-c
6-烷基)和苯基；
[0139]
a1为桥联基团，所述桥联基团包含一至三个独立的直链的或支链的、饱和或不饱和的，包括1至12个碳原子的碳基链，其中碳基链不含或者包含一至十个相同或不同的选自-o-、-s-、-nh-、-nr
1-、-c(＝o)nh-、-nhc(＝o)-、-c(＝o)nr
1-、-nr1c(＝o)-和-c(＝o)-的基团，
[0140]
或者
[0141]
a1为以下通式的桥联螯合部分-che
3-[0142][0143]
并且其中
[0144]
che1和che2独立地选自以下通式的螯合部分che i、che ii、che iii、che iv、che v、che vi和che vii：
[0145]
[0146][0147]
并且其中
[0148]
r1在每种情况下独立地选自c
1-c
6-烷基，并且选自表示一个或两个基团-l-z中的一者的选项；
[0149]
r2在每种情况下独立地选自-c(＝o)o-、-p(＝o)o
22-、p(＝o)meo-、-p(＝o)pho-以及它们的c
1-c
6-烷基酯，并且选自表示一个或两个基团-l-z中的一者的选项；
[0150]
r3在每种情况下独立地选自桥联基团-c(＝o)nh-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-nhc(＝o)-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-o-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-c(＝o)nh-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-s-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-nhc(＝o)-(c
1-c
6-亚烷基)-nhc(＝o)-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-nhc(＝o)-(c
1-c
6-亚烷基)-o-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-nhc(＝o)-(c
1-c
6-亚烷基)-c(＝o)nh-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-nhc(＝o)-(c
1-c
6-亚烷基)-s-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-o-(c
1-c
6-亚烷基)-nhc(＝o)-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-o-(c
1-c
6-亚烷基)-o-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-o-(c
1-c
6-亚烷基)-s-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-o-(c
1-c
6-亚烷基)-c(＝o)nh-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-nhc(＝o)-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-o-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-s-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-c(＝o)nh-和-p(＝o)o
22-；
[0151]
r4在每种情况下独立地选自-ch2n(ch2c(＝o)o-)2、-ch2n(ch2p(＝o)o
22-)2、-ch2n(ch2p(＝o)meo-)2、-ch2n(ch2p(＝o)pho-)2，并且选自对r2所定义的选项；
[0152]
ln
3
在每种情况下独立地选自镧系元素离子eu
3
、tb
3
、sm
3
和dy
3
，其中镧系元素离子与螯合部分che1、che2和che3中的杂原子氧和氮形成七至十个配位键，以形成二至三个独立的内部螯合部分；
[0153]
ar1选自以下基团
[0154][0155]
ar2在每种情况下独立地选自以下基团
o-(ch2ch2o)
1-6-h和-o-(ch2ch2o)
1-6-c
1-c
4-烷基；
[0163]
其中r7选自-cf3、-c
1-c
12-烷基、-(ch2)
1-6
c(＝o)oh、-(ch2)
1-6
c(＝o)o-、-(ch2)
1-6
s(＝o)2oh、-(ch2)
1-6
s(＝o)2o-、-c(＝o)nhr6、-c(＝o)nch3r6、-nhc(＝o)nhr6、-nhc(＝s)nhr6、-(ch2)
1-6
n(ch3)
2 -(ch2)
1-6
s(＝o)2o-、-(ch2)
1-6
c(＝o)-(哌嗪-1,4-二基)-(ch2)
1-6
c(＝o)oh和亲水基团，所述亲水基团选自单糖、二糖、-(ch2)
1-6
ch2oh、-ch(ch2oh)2、-c(ch2oh)3、-(ch2)
1-3-o-(ch2ch2o)
0-5-h、-(ch2)
1-3-o-(ch2ch2o)
0-5-c
1-c
4-烷基、-o-(ch2ch2o)
1-6-h和-o-(ch2ch2o)
1-6-c
1-c
4-烷基。
[0164]
式(i)的化合物的优选实施方案在下文中定义。应当理解，就式(i)的化合物的基团和取代基而言的优选实施方案关于式(ii)的化合物，以及关于本发明的检测剂、本发明的方法和用途以及本发明的固体载体材料也是优选的。
[0165]
式(i)的化合物包含二至三个独立的彼此共价拴连的镧系元素螯合部分。具体地，che1和che2独立地选自如上所定义的螯合部分che i、che ii、che iii、che iv、che v、che vi和che vii。在本发明的一个实施方案中，a1表示桥联基团，所述桥联基团包含一至三个独立的直链或支链的、饱和或不饱和的包括1至12个碳原子的碳基链，其中碳基链不含或者包含一至十个相同或不同的选自-o-、-s-、-nh-、-nr
1-、-c(＝o)nh-、-nhc(＝o)-、-c(＝o)nr
1-、-nr1c(＝o)-和-c(＝o)-的基团。这产生仅包含两个镧系元素螯合部分che1和che2的式(i)的化合物。在本发明的另一个实施方案中，a1表示如上所定义的桥联螯合部分-che
3-。这产生包含三个镧系元素螯合部分(即che1、che2和che3)的式(i)的化合物。
[0166]
镧系元素螯合部分优选地包含一至三个单独的围绕发射镧系元素离子的发色团部分。优选地，镧系元素离子在每种情况下与螯合部分che1、che2和che3中的杂原子氧和氮形成七至十个配位键。
[0167]
在一个实施方案中，镧系元素离子ln
3
在每种情况下独立地选自镧系元素离子eu
3
、tb
3
、sm
3
和dy
3
，其中镧系元素离子与螯合部分che1、che2和che3中的杂原子氧和氮形成七至十个配位键。在一个优选的实施方案中，镧系元素离子ln
3
在每种情况下为eu
3
，其与螯合部分che1、che2和che3中的杂原子氧和氮形成七至十个配位键。
[0168]
式(i)的化合物还优选地包含一个或多个共轭基团作为取代基g，其中每个共轭基团包含1、2或3个选自-ch＝ch-、-c≡c-、-c(＝o)-以及5至10元芳族或杂芳族单环或双环的双基的部分，其中杂芳族环含有一个或多个相同或不同的杂原子n、o或s，并且其中芳族或杂芳族单环或双环未被取代或者被1至5个相同或不同的取代基r5取代，其中r5如上所定义；并且其中如果存在于末端位置，每个共轭基团还可包含末端基团，所述末端基团选自-h、-卤素、-cn、-ch3，并且选自表示一个或两个基团-l-z中的一者的选项。在一个优选的实施方案中，每个共轭基团包含1、2或3个选自-ch＝ch-、-c≡c-、-c(＝o)-、亚苯基、亚联苯基、亚萘基、亚吡啶基、亚吡嗪基、亚嘧啶基、亚哒嗪基、亚呋喃基、亚噻吩基、亚吡咯基、亚咪唑基、亚吡唑基、亚噻唑基、亚异噻唑基、亚噁唑基、亚异噁唑基、亚呋咱基、1,2,4-三唑-3,5-亚基和亚噁二唑基的部分，其中芳族或杂芳族单环或双环未被取代或者被1至5个相同或不同的取代基r5取代，并且更优选地每个共轭基团独立地选自亚苯基-c≡c-、亚苯基、亚噻吩基和亚呋喃基。
[0169]
通常，共轭基团连接至螯合部分的吡啶基团。由于芳族发色团的π电子共轭增加，这可通过增加发色团的摩尔吸光系数来增强发光强度。因此，在一个优选的实施方案中，每
个共轭基团包含1、2或3个部分，所述1、2或3个部分的排列使得彼此共轭并且以共轭基团与吡啶共轭的方式连接至相应的吡啶。
[0170]
式(i)的化合物还包含一个或两个反应性基团z，从而允许共价连接至生物特异性结合反应物。反应性基团z经由基团l连接至式(i)的化合物的基团che1、a1和che2中的任一者，该基团l为连接基团，也称为间隔基(spacer)，即距离形成双基，以便—如果必要或期望—将反应性基团z定位在可用于与生物特异性结合反应物反应的位置中。
[0171]
在本发明的一个实施方案中，
[0172]
l在每种情况下独立地不存在，或者选自包含1至10个选自以下的部分的连接基团：-(ch2)
1-8-、-ch＝ch-、-c≡c-、-o-、-s-、-s-s-、-c(＝o)-、-c(＝o)nh-、-nhc(＝o)-、-c(＝o)n(c
1-c
6-烷基)-、-n(c
1-c
6-烷基)c(＝o)-、-nhc(＝s)nh-、-ch[(ch2)
0-6
c(＝o)o-]-、-ch[(ch2)
0-6
c(＝o)oh]-以及5至10元芳族或杂芳族单环或双环的双基，其中杂芳族环含有一个或多个相同或不同的杂原子n、o或s。
[0173]
在本发明的一个优选的实施方案中，
[0174]
l在每种情况下独立地不存在，或者选自包含1至10个选自以下的部分的连接基团：-(ch2)
1-8-、-ch＝ch-、-c≡c-、-o-、-s-、-s-s-、-c(＝o)-、-c(＝o)nh-、-nhc(＝o)-、-c(＝o)n(c
1-c
6-烷基)-、-n(c
1-c
6-烷基)c(＝o)-、-nhc(＝s)nh-、-ch[(ch2)
0-6
c(＝o)o-]-、-ch[(ch2)
0-6
c(＝o)oh]-、亚苯基、亚吡啶基和亚三唑。
[0175]
在本发明的一个更优选的实施方案中，
[0176]
l在每种情况下独立地不存在，或者选自包含1至10个选自以下的部分的连接基团：-(ch2)
1-8-、-c≡c-、-o-、-c(＝o)-、-c(＝o)nh-、-nhc(＝o)-、亚苯基、亚吡啶基和亚三唑。
[0177]
在本发明的一个甚至更优选的实施方案中，
[0178]
l在每种情况下独立地不存在，或者选自包含1至10个选自以下的部分的连接基团：-(ch2)
1-8-、-o-、-c(＝o)-、-nhc(＝o)-、-c(＝o)nh-和亚苯基。
[0179]
在本发明的一个实施方案中，
[0180]
z在每种情况下独立地选自反应性基团，所述反应性基团选自-n3、-c≡ch、-ch＝ch2、-nh2、-o-nh2、-c(＝o)oh、-ch(＝o)、-sh、-oh、马来酰亚胺基以及它们的活化衍生物，包括-nco、-ncs、-n

≡n、溴乙酰胺基、碘乙酰胺基、反应性酯、吡啶基-2-二硫基，以及6-取代的4-氯-1,3,5-三嗪-2-基氨基和4-氯-1,3,5-三嗪-2-基氧基；其中所述4-氯-1,3,5-三嗪-2-基氨基或4-氯-1,3,5-三嗪-2-基氧基的6位的取代基选自-h、-卤素、-sh、-nh2、-c
1-c
6-烷基、-o(c
1-c
6-烷基)、-o芳基、-s(c
1-c
6-烷基)、-s芳基、-n(c
1-c
6-烷基)2和n(芳基)2；
[0181]
其中前述基团的碳原子未被取代或者被一个或多个选自以下的取代基取代：-cn、-卤素、-sh、-c(＝o)h、-c(＝o)oh、c
1-c
6-烷基、c
1-c
6-卤代烷基、-o(c
1-c
6-烷基)、-c(＝o)(c
1-c
6-烷基)、-c(＝o)o(c
1-c
6-烷基)和苯基；
[0182]
合适的反应性酯描述于christian a.g.n.montalbetti和v.falque的tetrahedron 61(2005)10827的文章中，并且优选地包括基于对硝基苯酚、五氟苯酚、2,4,5-三氯苯酚、n-羟基-5-降冰片烯-内-2,3-二羧酰亚胺、羟基苯并三唑、1-羟基-7-氮杂苯并三唑、磺基-n-羟基琥珀酰亚胺或n-羟基琥珀酰亚胺的芳族酯、基于鏻鎓-、脲鎓-或胍鎓基偶联剂的酯，以及三嗪基或吡啶鎓酯。优选的反应性酯选自以下反应性酯：
[0183][0184]
在本发明的一个优选的实施方案中，
[0185]
z在每种情况下独立地选自反应性基团，所述反应性基团选自-n3、-c≡ch、-ch＝ch2、-nh2、-o-nh2、-c(＝o)oh、-ch(＝o)、-sh、-oh、马来酰亚胺基、-nco、-ncs、-n

≡n、溴乙酰胺基、碘乙酰胺基、基于对硝基苯酚、五氟苯酚、2,4,5-三氯苯酚、n-羟基-5-降冰片烯-内-2,3-二羧酰亚胺、羟基苯并三唑、1-羟基-7-氮杂苯并三唑、磺基-n-羟基琥珀酰亚胺或n-羟基琥珀酰亚胺的芳族酯、基于鏻鎓-、脲鎓-或胍鎓基偶联剂的酯、三嗪基或吡啶鎓酯、吡啶基-2-二硫基，以及6-取代的4-氯-1,3,5-三嗪-2-基氨基和4-氯-1,3,5-三嗪-2-基氧基；其中所述4-氯-1,3,5-三嗪-2-基氨基或4-氯-1,3,5-三嗪-2-基氧基的6位的取代基选自-h、-卤素、-sh、-nh2、-c
1-c
6-烷基、-o(c
1-c
6-烷基)、-o芳基、-s(c
1-c
6-烷基)、-s芳基、-n(c
1-c
6-烷基)2和n(芳基)2；
[0186]
其中前述基团的碳原子未被取代或者被一个或多个选自以下的取代基取代：-cn、-卤素、-sh、-c(＝o)h、-c(＝o)oh、c
1-c
6-烷基、c
1-c
6-卤代烷基、-o(c
1-c
6-烷基)、-c(＝o)(c
1-c
6-烷基)、-c(＝o)o(c
1-c
6-烷基)和苯基；
[0187]
在一个更优选的实施方案中，
[0188]
z在每种情况下独立地为-ncs或-nh2。
[0189]
如上所指出，在一个实施方案中，a1可为桥联基团，所述桥联基团包含一至三个独立的直链或支链的、饱和或不饱和的包括1至12个碳原子的碳基链，其中碳基链不含或者包含一至十个相同或不同的选自-o-、-s-、-nh-、-nr
1-、-c(＝o)nh-、-nhc(＝o)-、-c(＝o)nr
1-、-nr1c(＝o)-和-c(＝o)-的基团。
[0190]
在一个优选的实施方案中，
[0191]
a1为桥联基团，所述桥联基团包含一至三个独立的直链或支链的、饱和或不饱和的包括1至12个碳原子的碳基链，其中碳基链不含或者包含一至十个相同或不同的选自-nr
1-、-c(＝o)nh-、-nhc(＝o)-、-c(＝o)nr
1-、-nr1c(＝o)-和-c(＝o)-的基团。
[0192]
关于就a1而言的以上实施方案，优选的是，
[0193]
r1在每种情况下独立地选自c
1-c
6-烷基，并且选自表示一个或两个基团-l-z中的一者的选项。
[0194]
优选地，r1在每种情况下表示一个或两个基团-l-z中的一者。
[0195]
如上所指出，在另一个实施方案中，a1可为如上所定义的桥联螯合部分-che
3-。就这一点而言，优选的是ar1为任一种以上所定义的基团。特别优选地，ar1为以下基团：
[0196]
[0197]
此外，关于-che
3-和就如上所定义的ar1而言优选的选项，优选的是
[0198]
r2在每种情况下独立地选自-c(＝o)o-、-p(＝o)o
22-、p(＝o)meo-、-p(＝o)pho-以及它们的c
1-c
6-烷基酯，并且选自表示一个或两个基团-l-z中的一者的选项；
[0199]
r3在每种情况下独立地选自桥联基团-c(＝o)nh-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-nhc(＝o)-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-o-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-c(＝o)nh-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-s-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-nhc(＝o)-(c
1-c
6-亚烷基)-nhc(＝o)-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-nhc(＝o)-(c
1-c
6-亚烷基)-o-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-nhc(＝o)-(c
1-c
6-亚烷基)-c(＝o)nh-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-nhc(＝o)-(c
1-c
6-亚烷基)-s-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-o-(c
1-c
6-亚烷基)-nhc(＝o)-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-o-(c
1-c
6-亚烷基)-o-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-o-(c
1-c
6-亚烷基)-s-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-o-(c
1-c
6-亚烷基)-c(＝o)nh-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-nhc(＝o)-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-o-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-s-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-c(＝o)nh-和-p(＝o)o
22-。
[0200]
更优选地，
[0201]
r2在每种情况下为-c(＝o)o-；
[0202]
r3在每种情况下选自桥联基团-c(＝o)nh-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-nhc(＝o)-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-o-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-c(＝o)nh-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-s-。
[0203]
此外，关于-che
3-和就如上所定义的ar1而言优选的选项，优选的是
[0204]
g在每种情况下独立地选自i)共轭基团，ii)单键和iii)氢；
[0205]
其中每个共轭基团包含1、2或3个选自-ch＝ch-、-c≡c-、-c(＝o)-以及5至10元芳族或杂芳族单环或双环的双基的部分，其中杂芳族环含有一个或多个相同或不同的杂原子n、o或s，并且其中芳族或杂芳族单环或双环未被取代或者被1至5个相同或不同的取代基r5取代，其中r5如上所定义；
[0206]
其中如果存在于末端位置，每个共轭基团还可包含末端基团，所述末端基团选自-h、-卤素、-cn、-ch3，并且选自表示一个或两个基团-l-z中的一者的选项。
[0207]
优选地，
[0208]
g在每种情况下独立地选自i)共轭基团，ii)单键和iii)氢；
[0209]
其中每个共轭基团包含1、2或3个选自以下的部分：-ch＝ch-、-c≡c-、-c(＝o)-、亚苯基、亚联苯基、亚萘基、亚吡啶基、亚吡嗪基、亚嘧啶基、亚哒嗪基、亚呋喃基、亚噻吩基、亚吡咯基、亚咪唑基、亚吡唑基、亚噻唑基、亚异噻唑基、亚噁唑基、亚异噁唑基、亚呋咱基、1,2,4-三唑-3,5-亚基和亚噁二唑基，其中芳族或杂芳族单环或双环未被取代或者被1至5个相同或不同的取代基r5取代。
[0210]
更优选地，
[0211]
g在每种情况下独立地选自i)共轭基团，ii)单键和iii)氢；
[0212]
其中每个共轭基团独立地选自亚苯基-c≡c-、亚苯基、亚噻吩基和亚呋喃基。
[0213]
如上所指出，che1和che2独立地选自如上所定义的螯合部分che i、che ii、che iii、che iv、che v、che vi和che vii。在一个优选的实施方案中，che1和che2独立地选自螯
合部分che i和che iv。关于前述螯合部分，特别是关于螯合部分che i和che iv，优选的是ar2为任一种以上所定义的基团。特别优选地，ar2为以下基团：
[0214][0215]
应当理解，-che
1-和che
2-可以彼此相同或不同。优选地，-che
1-和che
2-是相同的。
[0216]
此外，关于-che
1-和-che
2-以及就这一点而言的以上所提及的优选的实施方案，优选的是
[0217]
r2在每种情况下独立地选自-c(＝o)o-、-p(＝o)o
22-、p(＝o)meo-、-p(＝o)pho-以及它们的c
1-c
6-烷基酯，并且选自表示一个或两个基团-l-z中的一者的选项；
[0218]
r3在每种情况下独立地选自桥联基团-c(＝o)nh-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-nhc(＝o)-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-o-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-c(＝o)nh-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-s-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-nhc(＝o)-(c
1-c
6-亚烷基)-nhc(＝o)-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-nhc(＝o)-(c
1-c
6-亚烷基)-o-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-nhc(＝o)-(c
1-c
6-亚烷基)-c(＝o)nh-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-nhc(＝o)-(c
1-c
6-亚烷基)-s-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-o-(c
1-c
6-亚烷基)-nhc(＝o)-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-o-(c
1-c
6-亚烷基)-o-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-o-(c
1-c
6-亚烷基)-s-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-o-(c
1-c
6-亚烷基)-c(＝o)nh-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-nhc(＝o)-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-o-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-s-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-c(＝o)nh-和-p(＝o)o
22-；
[0219]
r4在每种情况下独立地选自-ch2n(ch2c(＝o)o-)2、-ch2n(ch2p(＝o)o
22-)2、-ch2n(ch2p(＝o)meo-)2、-ch2n(ch2p(＝o)pho-)2，并且选自对r2所定义的选项。
[0220]
更优选地，
[0221]
r2在每种情况下为-c(＝o)o-；
[0222]
r3在每种情况下选自桥联基团-c(＝o)nh-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-nhc(＝o)-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-o-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-c(＝o)nh-、-c(＝o)nh-(c
1-c
6-亚烷基)-s-；
[0223]
r4在每种情况下为-c(＝o)o-。
[0224]
此外，关于-che
1-和-che
2-以及就这一点而言的以上所提及的优选的实施方案，优选的是
[0225]
g在每种情况下独立地选自i)共轭基团，ii)单键和iii)氢；
[0226]
其中每个共轭基团包含1、2或3个选自-ch＝ch-、-c≡c-、-c(＝o)-以及5至10元芳族或杂芳族单环或双环的双基的部分，其中杂芳族环含有一个或多个相同或不同的杂原子n、o或s，并且其中芳族或杂芳族单环或双环未被取代或者被1至5个相同或不同的取代基r5取代，其中r5如上所定义；
[0227]
其中如果存在于末端位置，每个共轭基团还可包含末端基团，所述末端基团选自-h、-卤素、-cn、-ch3，并且选自表示一个或两个基团-l-z中的一者的选项。
[0228]
优选地，
[0229]
g在每种情况下独立地选自i)共轭基团，ii)单键和iii)氢；
[0230]
其中每个共轭基团包含1、2或3个选自以下的部分：-ch＝ch-、-c≡c-、-c(＝o)-、亚苯基、亚联苯基、亚萘基、亚吡啶基、亚吡嗪基、亚嘧啶基、亚哒嗪基、亚呋喃基、亚噻吩基、亚吡咯基、亚咪唑基、亚吡唑基、亚噻唑基、亚异噻唑基、亚噁唑基、亚异噁唑基、亚呋咱基、1,2,4-三唑-3,5-亚基和亚噁二唑基，其中芳族或杂芳族单环或双环未被取代或者被1至5个相同或不同的取代基r5取代。
[0231]
更优选地，
[0232]
g在每种情况下独立地选自i)共轭基团，ii)单键和iii)氢；
[0233]
其中每个共轭基团独立地选自亚苯基-c≡c-、亚苯基、亚噻吩基和亚呋喃基。
[0234]
本发明的化合物中的共轭基团可以用如关于r5、r6和r7所定义的亲水基团修饰。亲水基团的实施例为单糖和寡糖，如单糖和二糖，低聚亚烷基二醇(例如，具有1-20个重复单元的那些)，如低聚乙二醇和低聚丙二醇等。在一个优选的实施方案中，亲水基团选自单糖、二糖、-(ch2)
1-3-o-(ch2ch2o)
0-5-h、-(ch2)
1-3-o-(ch2ch2o)
0-5-c
1-4-烷基、-o-(ch2ch2o)
1-6-h和-o-(ch2ch2o)
1-6-c
1-4-烷基，特别是单糖。
[0235]
在本语境中，术语“单糖”旨在意指非环状或环状形式的c
5-c7碳水化合物。单糖的实例为c6碳水化合物，例如选自以下的那些：
[0236][0237]
在本语境中，术语“二糖”旨在意指优选地经由糖苷键连接在一起的两个单糖(参见上文)。
[0238]
应当理解，亲水基团也可包含间隔基(即距离形成双基)，如关于基团l所定义的那些。
[0239]
在特别优选的实施方案中，式(i)的化合物是如本文所定义的化合物6、7、26、27、28、29、35、36、45、46、47、48、56、57、58、59、65和66中的任一种(参见图2、4、6、8、9以及方案2
和13)。
[0240]
如所指出，本发明也涉及式(ii)的化合物，也称为配体和配体酯，其可用作式(i)的化合物(即(镧系元素)螯合物)的前体。以上就式(i)的化合物的基团和取代基而言所定义的优选实施方案对于式(ii)的化合物也是优选的。然而，螯合部分不含有镧系元素离子。
[0241]
在又一方面，本发明涉及一种检测剂，该检测剂包含与式(i)的化合物或其盐或者式(ii)的化合物或其盐缀合的生物特异性结合反应物。检测剂是可检测分子，其包含与本发明的式(i)的发光镧系元素螯合物或式(ii)的前体缀合的生物特异性结合反应物。缀合(即共价键的形成)通常借助于所述螯合物的反应性基团z来实现。生物特异性结合反应物应当能够特异性地结合所关注的分析物，以用于定量或定性分析样品中的所述分析物的目的。
[0242]
生物特异性结合反应物的实例是选自以下的那些：抗体、抗原、受体配体、特异性结合蛋白、dna探针、rna探针、寡肽、寡核苷酸、修饰寡核苷酸(例如，锁核酸(lna)修饰的寡核苷酸)、修饰多核苷酸(例如，lna修饰的多核苷酸)、蛋白质、寡糖、多糖、磷脂、pna、类固醇、半抗原、药物、受体结合配体和凝集素。在一个优选的实施方案中，生物特异性结合反应物选自抗体，例如肌钙蛋白i抗体(抗tni)。
[0243]
在另一方面，本发明涉及一种在生物特异性结合测定中检测分析物的方法，所述方法包括以下步骤：
[0244]
a)在分析物与本发明的式(i)或式(ii)的化合物或检测剂之间形成复合物；
[0245]
b)采用具有本发明的式(i)或式(ii)的化合物或检测剂的激发波长的辐射来激发所述复合物，从而形成激发的复合物；以及
[0246]
c)检测从所述激发的复合物发射的发射辐射。
[0247]
该方法遵循如技术人员显而易见的常规测定步骤。优选的激发波长在320-370nm的范围内。技术人员知道确切的激发波长取决于配体的具体结构。另外，技术人员知道发射波长对于所用镧系元素(tb
3
、eu
3
、dy
3
、sm
3
)是特定的。在根据本发明优选的eu
3
的情况下，优选的测量发射波长在610-620nm的范围内，优选地约615nm。
[0248]
在另一方面，本发明涉及一种用本发明的化合物标记生物特异性结合反应物的方法，该方法包括以下步骤
[0249]
a)提供生物特异性结合反应物；以及
[0250]
b)使生物特异性结合反应物与式(i)或式(ii)的化合物缀合。
[0251]
所得的化合物可为本发明的检测剂。缀合可以经由式(i)或式(ii)的化合物的反应性基团z发生。
[0252]
在另一方面，本发明涉及本发明的式(i)或式(ii)的化合物用于体外检测样品中的分析物的用途。
[0253]
本发明因此也涉及本发明的检测剂在例如利用特异性发光的时间分辨荧光测定的基于特异性生物亲和性的结合测定中的用途。在一个实施方案中，基于特异性生物亲和性的结合测定是非均相免疫测定、均相免疫测定、dna杂交测定、受体结合测定、免疫细胞化学或免疫组织化学测定。
[0254]
在另一方面，本发明涉及本发明的式(i)或式(ii)的化合物或本发明的检测剂在生物成像应用中的用途。如果本发明的式(i)或式(ii)的化合物是具有中性净电荷或几乎
中性净电荷的分子(即分子包含-3至 5的总净电荷)，则此类用途是特别有利的。这当然取决于取代基的选择。然而，本发明的化合物或本发明的检测剂可以例如用作造影剂。造影剂可例如用于mri或pet应用中。本发明的化合物或本发明的检测剂还可用于显微镜应用，例如在细胞培养实验中，如在共聚焦激光扫描显微镜和/或杂交实验中。
[0255]
本发明的又一方面涉及一种固体载体材料，该固体载体材料与本发明的式(i)或式(ii)的化合物或本发明的检测剂缀合。本发明的化合物或检测剂通常共价或非共价地固定至固体载体材料。
[0256]
在一些实施方案中，固体载体材料选自纳米粒子、微粒、载玻片、平板和固相合成树脂。
[0257]
通过以下实施例进一步说明本发明。
[0258]
实施例
[0259]
以下非限制性实施例旨在进一步展示本发明。所采用的结构和合成路线呈现于如在实验部分的末尾所提供的方案1-13中。此外，参考图1-9。图10提供了本技术中使用的参考螯合物ref 1-3的化学结构。
[0260]
在化合物6和7(方案2)、化合物65和66(方案13)以及化合物45-48(图6)中，两个eu(iii)离子形成同等的配位键，并且两个eu(iii)离子之一与两个吡啶氮原子、经ch2桥连接到吡啶环的三个叔氮原子以及四个羧基基团的带负电荷的氧原子形成配位键。在化合物26-29(图2)和35和36(图4)中，两个eu(iii)离子形成同等的配位键，并且两个eu(iii)离子之一与三个吡啶氮原子、经ch2桥连接到吡啶环的两个叔氮原子以及四个羧基基团的带负电荷的氧原子(吡啶部分之间的两个羧基基团和吡啶环中的两个羧基基团)形成配位键。在化合物56和57(图8)以及化合物58和59(图9)中，三个eu(iii)离子之一与两个吡啶氮原子、经ch2桥连接至吡啶环的两个叔氮原子、两个羧基基团的带负电荷的氧原子和两个酰胺基团(-conh-)形成配位键；剩余的两个eu(iii)离子形成同等的配位键，并且剩余的两个eu(iii)离子之一与三个吡啶氮原子、经ch2桥连接到吡啶环的两个叔氮原子以及四个羧基基团的带负电荷的氧原子(吡啶部分之间的两个羧基基团和吡啶环中的两个羧基基团)形成配位键。
[0261]
用bruker avance drx 500和600mhz记录1h-nmr光谱。四甲基硅烷用作内标。使用α-氰基-4-肉桂酸基质，在perseptive biosystems voyager de-pro maldi-tof仪器上记录质谱。在pharmacia ultrospec 3300pro上记录uv-vis光谱。采用perkin-elmer wallac victor平板荧光计来测定荧光效率。通过使用icp-ms仪器perkinelmer 6100drc plus，以定量模式测量eu螯合物和标记的抗体的eu含量。在varian cary eclipse荧光光谱仪上记录激发、发射光谱和衰减时间。
[0262]
用于hplc纯化运行的条件：反相hplc(rp-18柱)。溶剂为a：三乙基乙酸铵缓冲液(20mm，ph7)，以及b：含50％乙腈的三乙基乙酸铵缓冲液(20mm，ph7)。梯度从5％溶剂b开始，并且溶剂b的量在30分钟内线性升至100％。
[0263]
用填充有硅胶60(merck)的柱执行柱色谱法。fc＝快速色谱，rt＝室温。
[0264]
实施例1.化合物2的合成.
[0265]
将化合物1(0.23g，0.51mmol；takalo,h.等人,helv.chim.acta79(1996)789))、(6-氨基己基)氨基甲酸叔丁酯(55mg，0.25mmol)、无水k2co3(0.28g，2,04mmol)和无水mecn
(10ml)的混合物在氩气下于室温搅拌过夜。在过滤并用mecn洗涤之后，产物(0.24g，100％)未经进一步纯化即用于下一步骤。1h nmr(cdcl
3,
δppm):7.71(2h,d,j＝0.95hz),7.59(2h,d,j＝0.95hz),4.56(2h,s),4.15(8h,q,j＝7.15hz),4.02(4h,s),3.78(4h,s),3.60(8h,s),3.14-3.01(2h,m),2.62-2.49(2h,m),1.59-1.49(2h,m),1.49-1.41(6h,m),1.27(12h,t,j＝7.15hz).
13
c nmr(cdcl
3,
δppm):170.93,160.44,160.30,160.10,134.17,123.49,124.28,78.90,60.93,59.74,54.94,54.43,40.42,29.95,28.34,26.85,26.53,14.15.maldi tof-ms质量:计算值(m h

)957.30,959.30 961.30；实测值957.15,959.16,961.07.
[0266]
实施例2.化合物3的合成.
[0267]
将化合物2(0.23g，0.24mmol)和n-(4-乙炔基苯基)-2,2,2-三氟乙酰胺(0.12g，0.58mmol；sund,h.等人molecules 22(2017)1807)在无水tea(1ml)和thf(2ml)中的混合物用氩气脱气。在添加双(三苯基膦)氯化钯(ii)(10mg，14μmol)和cui(6mg，28μmol)之后，将混合物在55℃搅拌过夜。在蒸发至干之后，通过fc(硅胶，5％etoh/ch2cl2)纯化产物(0.27g，91％)。1h nmr(cdcl
3,
δppm):8.84(2h,s),7.65(2h,s),7.59(2h,s),7.56(4h,d,j＝8.70hz),7.50(4h,d,j＝8.70hz),4.17(8h,q,j＝7.10hz),4.04(4h,s),3.76(4h,s),3.61(8h,s),3.08-3.01(2h,m),2.57-2.50(2h,m),1.55-1.47(2h,m),1.47-1.38(6h,m),1.26(12h,t,j＝7.1hz).
13
c nmr(cdcl
3,
δppm):171.05,160.31,158.40,155.90,155.20,154.93,154.63,154.38,135.60,132.67,131.85,123.08,122.61,121.11,120.23,118.98,116.70,114.41,111.71,92.03,88.07,78.92,60.59,60.51,59.70,54.89,53.33,40.45,29.60,28.30,26.97,26.55,14.14.maldi tof-ms质量:计算值(m h

)1223.53；实测值1223.90
[0268]
实施例3.化合物4的合成.
[0269]
将化合物3(0.25g，0.19mmol)在tfa(2.8ml)中的混合物在室温搅拌2小时并蒸发至干。将残余物从二乙醚(2
×
20ml)中共蒸发，并且溶解于无水mecn(6ml)中。在添加dipea(0.66ml，3.8mmol)和化合物1(0.17g，0.38mmol)的无水mecn(6ml)溶液之后，将混合物在室温搅拌67小时。在蒸发至干之后，将残余物溶于ch2cl2(30ml)中，用h2o(3
×
15ml)洗涤并用na2so4干燥。通过(硅胶，10％etoh/ch2cl2)纯化产物(0.31g，88％)。1h nmr(cdcl
3,
δppm):9.04(2h,s),7.66(2h,s),7.63(2h,s),7.58(2h,s),7.54(2h,d.j＝8.60hz),7.49(2h,s),7.45(2h,d,j＝8.60hz),4.15(8h,q,j＝7.2hz),4.15(8h,q,j＝7.2hz),4.04(4h,s),3.96(4h,s),3.75(4h,s),3.66(4h,s),3.61(8h,s),3.57(8h,s),2.58-2.51(2h,m)2.51-2.42(2h,m),1.57-1.46(4h,m),1.27(12h,t,j＝7.2hz),1.25(12h,t,j＝7.2hz),1.20-1.10(4h,m).
13
c nmr(cdcl
3,
δppm):171.07,171.02,160.84,160.38,159.87,158.40,155.82,155.53,155.22,154.91,135.72,134.08,132.58,131.94,124.26,123.97,123.07,122.57,121.12,120.03,119.04,116.73,114.44,112.15,92.09,88.02,60.67,60.60,60.54,60.48,59.82,59.70,59.46,59.24,55.40,54.97,54.88,54.56,29.59,27.25,14.15,14.12.maldi tof-ms质量:计算值(m h

)1865.58,1866.58；实测值1864.34,1866.53
[0270]
实施例4.化合物5的合成.
[0271]
将化合物4(0.29g，0.155mmol)、2,2’,2
”‑
{[4-(乙炔基)苯-1,3,5-三基]-三(氧基)三乙酸三乙酯(0.15g，0.373mmol；sund,h.等人molecules22(2017)1807)在无水tea
(1ml)和thf(2ml)中的混合物用氩气脱气。在添加双(三苯基膦)氯化钯(ii)(10mg，14μmol)和cui(5mg，28μmol)之后，将混合物在55℃搅拌24小时。在蒸发至干之后，通过fc(硅胶，5％etoh/ch2cl2)纯化产物(0.32g，82％)。maldi tof-ms质量:计算值(m 2h

)；2522.59,实测值2523.66.
[0272]
实施例5.化合物6的合成.
[0273]
将0.5m koh/etoh(18.5ml)中的化合物5(0.30g，0.119mmol)的在室温搅拌30分钟。在添加h2o(9ml)之后，将混合物在室温进一步搅拌2小时。在蒸发etoh并在室温额外搅拌过夜之后，通过添加6m hcl将ph调节至6.5。在5分钟内添加水(1ml)中的eucl3(92mg，0.250mmol)，并且通过适当添加固体nahco3将ph维持在6.0-6.5。在室温搅拌过夜之后，用1m naoh将ph调节至8.5。通过离心除去沉淀，并使上清液蒸发至干。通过hplc纯化产物。收率：0.26g(72％)。rf(hplc)：16.5分钟。uv：352nm。
[0274]
实施例6.化合物7的合成.
[0275]
将h2o(1.4ml)中的化合物6(0.112g，37μmol)在5分钟内添加到cscl2(29μl，0.52mmol)和nahco3(49mg，0.59mmol)以及chcl3(1.4ml)的混合物中。在室温搅拌20分钟之后，用chcl3(3
×
1.4ml)洗涤水相。将产物用丙酮沉淀、离心并用丙酮洗涤。产物不经任何进一步纯化即用于抗体标记。
[0276]
实施例7.化合物8的合成.
[0277]
将4-硝基苯酚(1.39g，10mmol)、1,6-二氨基己烷(1.54ml，10mmol)、无水na2co3(4.24g，40mmol)和无水dmf(25ml)的混合物在100℃保持2.5小时。在蒸发至干并添加ch2cl2(50ml)之后，将混合物用h2o(25ml)、2m naoh(25ml)、5％nahco3(25ml)、h2o(25ml)洗涤，并且用na2so4(25ml)干燥。通过fc(硅胶，10％etoac/石油醚)纯化产物(0.84g，28％)。1h nmr(d
6-dmso,δppm):8.20(2h,d,j＝9.3hz),7.13(2h,d,j＝9.3hz),4.12(2h,t,j＝6.5hz),3.54(2h,t,j＝6.7hz),1.86-1.79(2h,m),1.79-1.72(2h,m),1.47-1.43(4h,m).
13
c nmr(d
6-dmso,δppm):164.49,141.17,126.34,115.44,68.99.35.52,32.62,28.69,27.69,23,99.maldi tof-ms质量:计算值(m h

)；302.04,304.04，实测值301.65,303.65.
[0278]
实施例8.化合物9的合成.
[0279]
在n,n'-(己烷-1,6-二基)双(2,2,2-三氟乙酰胺)(0.98g，3.18mmol)和nah(0.27g，6.68mmol；60％于油中)在无水dmf(10ml)中的混合物在室温搅拌30分钟之后，添加3-硝基苄基溴(1.44g，6.67mmol)。将反应混合物在室温搅拌过夜，并蒸发至干。在添加h2o(50ml)之后，将固体粗产物过滤并用h2o洗涤。将干燥的固体材料悬浮于30％etoac/石油醚中，过滤并用etoac/石油醚洗涤。收率：1.67g(91％)。maldi tof-ms质量:计算值(m h

)579.17；实测值579.02.
[0280]
实施例9.化合物10的合成.
[0281]
在n,n'-(己烷-1,6-二基)双(2,2,2-三氟乙酰胺)(0.42g，1.36mmol)和nah(0.11g，2.86mmol；60％于油中)在无水dmf(5ml)中的混合物在室温搅拌30分钟之后，添加化合物8(0.82g，2.72mmol)的无水dmf(6ml)溶液。将反应混合物在75℃搅拌22小时，并蒸发至干。将残余物溶解于ch2cl2(40ml)中，用h2o(2
×
20ml)洗涤并用na2so4干燥。通过fc(硅胶，30％至40％etoac/石油醚)纯化产物(0.51g，50％)。1h nmr(d
6-dmso,δppm):9.38(2h,s),8.20(4h,d,j＝9.1hz),7.13(4h,d,j＝9.1hz),4.12(4h,t,j＝5.8hz),3.38-3.30(4h,m),
3.17(4h,q,j＝6.5hz),1.80-1.70(4h,m),1.64-1.50(8h,m),1.50-1.40(8h,m),1.35-1.20(12h,m).
13
c nmr(d
6-dmso,δppm):154.49,156.75,156.47,155.89,155.61,141.18,126.35,120.37,118.96,115.78,115.44,113.51,68.99,68.96,47.42,46.83,28.70,28.56,28.53,28.51,26.66,26.64,26.30,26.26,26.19,26.15,26.07,25.91,25.49,25.43,maldi tof-ms质量:计算值(m h

)751.32；实测值751.33.
[0282]
实施例10.化合物11的合成.
[0283]
将化合物9(1.46g，2.52mmol)在0.5m koh(20ml)和ch2cl2(30ml)中的混合物在室温搅拌过夜之后，添加第二组ch2cl2(30ml)，并且将混合物用h2o(2
×
20ml)洗涤并用na2so4干燥。收率：0.97g(100％)。1h nmr(d
6-dmso,δppm):8.20(2h,s),8.07(2h,dd,j＝7.9and 1.6hz),7.77(2h,d,j＝7.9hz),7.59(2h,t,j＝7.9hz),3.80(4h,s),2.46(4h,t,j＝7.0hz),1.48-1.37(4h,m),1.32-1.24(4h,m).
13
c nmr(d
6-dmso,δppm):148.20,144.32,134.91,129.83,122.53,121.76,52.38,48.98,29.91,27.16.maldi tof-ms质量:计算值(m h

)387.21；实测值386.81.
[0284]
实施例11.化合物12的合成.
[0285]
使用与实施例10中所述的合成类似的方法由化合物10合成化合物12。收率：89％。1h nmr(d
6-dmso,δppm):8.19(4h,d,j＝9.3hz),7.13(4h,d,j＝9.3hz),4.14-4.08(4h,m),2.48-2.43(8h,m),1.78-1.70(4h,m),1.46-1.30(16h,m),1.29-1.22(4h,m).
13
c nmr(d
6-dmso,δppm):164.53,141.20,126.31,115.45,69.11,49.87,49.78,30.05,29.94,28.86,27.34,27.00,26.81,25.79.maldi tof-ms质量:计算值(m h

)559.35；实测值559.18.
[0286]
实施例12.化合物13的合成.
[0287]
将n-羟基琥珀酰亚胺(0.19g，1.69mmol)和n,n-二环己基碳二亚胺(0.35g，1.69mmol)添加到2-(4-碘苯氧基)乙酸(0.47g，1.69mmol)的无水1,4-二氧杂环己烷(5ml)溶液中。在室温搅拌2.5小时之后，添加化合物11(0.33g，0.85mmol)的无水1,4-二氧杂环己烷(2.5ml)溶液，并将混合物在室温搅拌24小时。将混合物过滤，用1,4-二氧杂环己烷(4
×
5ml)洗涤固体材料，并使滤液蒸发至干。将残余物溶解于ch2cl2(40ml)中，用10％naoh(20ml)、5％nahco3(20ml)、h2o(20ml)洗涤，并且用na2so4干燥。通过fc(硅胶，0％至1％etoh/ch2cl2)纯化产物(0.42g，55％)。maldi tof-ms质量:计算值(m h

)907.08；实测值906.94.
[0288]
实施例13.化合物14的合成.
[0289]
在将dipea(0.24ml，1.36mmol)和pyaop(0.35g，0.75mmol)添加到化合物12(0.19g，0.34mmol)和2-(4-碘苯氧基)乙酸(0.19g，0.68mmol)的无水dmf(7.5ml)溶液中之后，将混合物在室温搅拌2小时并蒸发至干。通过fc(硅胶，1％至2％etoh/ch2cl2)纯化产物(0.31g，84％)。maldi tof-ms质量:计算值(m na

):1101.77；实测值1101.35.
[0290]
实施例14.化合物15的合成.
[0291]
将4-溴-6-羟基甲基-2-羧乙基吡啶(1.56g，6.0mmol；takalo,h.等人,helv.chim.acta 79(1996)789)、双(三苯基膦)氯化钯(ii)(84mg，0.12mmol)和cui(46mg，0.24mmol)在无水tea(5ml)和thf(10ml)中的混合物用氩气脱气。在添加三甲基甲硅烷基乙炔(1.2ml，8.4mmol)之后，将混合物在室温搅拌过夜。在蒸发至干之后，通过fc(硅胶，2％至5％etoh/ch2cl2)纯化产物(1.66g，100％)。
[0292]
实施例15.化合物16的合成.
[0293]
将化合物15(0.277g，1.0mmol)和pbr3(113μmol)在无水chcl3(10ml)中的混合物在室温搅拌3小时。在添加chcl3(20ml)之后，用5％nahco3(20ml)中和混合物，用chcl3(10ml)萃取水相，用na2so4干燥合并的有机相。通过fc(硅胶，5％etoh/ch2cl2)纯化产物(0.27g，79％)。1h nmr(d
6-dmso,δppm):7.90(1h,s),7.86(1h,s),4.74(2h,s),4.37(2h,q,j＝7.1hz),1.34(3h,t,j＝7.1hz),0.27(9h,s).
13
c nmr(d
6-dmso,δppm):164.03,158.48,148.59,132.59,129.02,125.90,102.05,101.27,61.99,33.74,14.45,-0.16.maldi tof-ms质量:计算值(m h

)340.04,342.04；实测值339.62,341.62.
[0294]
实施例16.化合物17的合成.
[0295]
将4-溴-2,6-二溴甲基吡啶(3.50g，10mmol；takalo,h.等人acta chem,scand.ser.b 248(1988)373)、甘氨酸乙酯盐酸盐(14.0g，0.10mmol)和二异丙基乙胺(35ml)在无水mecn(130ml)中的混合物在室温搅拌过夜。在蒸发至干之后，将残余物溶解于ch2cl2(100ml)中，用h2o(3
×
50ml)洗涤，用na2so4干燥，并且通过fc(硅胶，10:20:70至15:30:55tea/etoac/石油醚)纯化产物。收率2.48g(64％)。1h nmr(cdcl3,δppm):7.43(2h,s),4.20(4h,q,j＝7.2hz),3.91(4h,s),3.46(4h,s),2.25-2.15(2h,bs),1.28(6h,t,j＝7.2hz).
13
c nmr(cdcl3,δppm):172.00,160.40,133.83,60.75,54.00,50.34,14.18.maldi tof-ms质量:计算值(m h

):388.09,390.09,实测值388.75,390.75.
[0296]
实施例17.化合物18的合成.
[0297]
在室温2小时内，将4-溴-6-溴甲基-2-羧乙基吡啶(2.06g，6.39mmol；takalo,h.等人helv.chim.acta 79(1996)789)分小批添加到化合物17(2.49h，6.39mmol)、无水k2co3(3.53g，25.6mmol)在无水mecn(215ml)中的混合物。在室温搅拌22小时之后，将混合物过滤并使滤液蒸发至干。通过fc(硅胶，10:25:65tea/etoac/石油醚)纯化产物。收率2.03g(50％)。1h nmr(cdcl3,δppm):8.12(1h,d,j＝1.7hz),8.07(1h,d,j＝1.7hz),7.55(1h,d,j＝1.5hz),7.43(1h,d,j＝1.5hz),4.46(2h.q,j＝7.2hz),4.19(4h,q,j＝7.2hz),4.09(2h,s),3.95(2h,s),3.90(2h,s),2.3-2.1(1h,bs),1.43(3h,t,j＝7.2hz),1.29(3h,t,j＝7.2hz),1.29(3h,t,j＝7.2hz).
13
c nmr(cdcl3,δppm):171.98,170.81,164.03,161.57,160.41,159.70,148.54,134.26,133.90,129.13,126.95,124.60,123.77,62.16,60.75,60.63,59.61,59.48,55.38,54.00,50.36,14.19,14.17,14.14.maldi tof-ms质量:计算值(m h

):629.06,631.05.633.06,实测值629.54,631.56,633.54.
[0298]
实施例18.化合物19的合成.
[0299]
将化合物18(0.75g，1.19mmol)和2,2’,2
”‑
{[4-(乙炔基)苯-1,3,5-三基]-三(氧基)三乙酸三乙酯(1.17g，2.86mmol)在无水tea(10ml)和dmf(20ml)中的混合物用氩气脱气。在添加双(三苯基膦)氯化钯(ii)(32mg，48μmol)和cui(18mg，95μmol)之后，将混合物在55℃搅拌过夜。在蒸发至干之后，通过fc(硅胶，10:90:0至10:88:2etoh/ch2cl2/tea)纯化产物(1.23g，80％)。1h nmr(d
6-dmso,δppm):7.86(1h,s),7.78(1h,s),7.35(1h,s),7.31(1h,s),6.25(2h,s),6.22(2h,s),4.88(4h,s),4.86(4h,s),4.82(2h,s)4.81(2h,s),4.34(2h,q,j＝7.1hz),4.20-4.13(12h,m),4.09-4.02(4h,m),3.96(2h,s),3.80(2h,s),3.54(2h,s),3.35(2h,s),1.32(3h,t,j＝7.1hz),1.24-1.14(24h,m).
13
c nmr(d
6-dmso,δppm):172.27,171.12,168.55,168.54,168.50,164.66,161.01,160.85,160.68,160.47,160.18,
158.43,147.80,133.34,132.55,127.05,124.50,122.53,121.56,94.61,94.26,93.88,93.77,93.41,93.38,89.00,87.20,65.77,65.72,65.38,61.67,61.08,60.26,59.25,59.19,54.93,53.96,50.18,46.04,14.43,14.41,14.38,14.36.maldi tof-ms质量:计算值(m h

)1285.49；实测值1285.26.
[0300]
实施例19.化合物20的合成.
[0301]
将化合物19(0.64g，0.50mmol)、16(0.20g，0.60mmol)和无水k2co3(0.28g，2.0mmol)在无水mecn(10ml)中的混合物在室温搅拌过夜。将混合物过滤，用mecn洗涤无机盐，并使滤液蒸发至干。通过fc(硅胶，5％至10％etoh/ch2cl2)纯化产物(0.54g，70％)。1h nmr(d
6-dmso,δppm):7.85(1h,d,j＝1.0hz),7.78(1h,d.j＝1.0hz),7.77(1h,s),7.37(1h,s),7.34(1h,s),6.24(2h,s),6.23(2h,s),4.87(4h,s),4.85(4h,s),4.82(2h,s),4.81(2h,s),4.36-4.28(4h,m),4.20-4.12(12h,m),4.07-4.01(6h,m),4.01(2h,s),3.95(2h,s),3.92(2h,s),3.53(2h,s),3.50(2h,s),1.31(3h,t,j＝7.2hz),1.29(3h,t,j＝7.1hz),1.24-1.13(26h,m),0.21(9h,s).
13
c nmr(d
6-dmso,δppm):171.13,171.08,168.53,168.49,164.65,164.39,161.05,160.99,160.85,160.62,160.47,158.61,158.52,147.77,133.38,132.65,131.70,127.94,127.06,124.98,124.52,123.03,122.96,101.92,100.89,94.50,94.28,93.89,93.78,93.41,88.99,87.42,65.77,65.73,65.39,61.72,61.65,61.07,61.03,60.27,60.24,59.40,59.37,59.20,55.27,55.21,54.89,14.37,-0.24.maldi tof-ms质量:计算值(m h

)1544.60；实测值1544.55.
[0302]
实施例20.化合物21的合成.
[0303]
将化合物20(1.43g，0.922mmol)和四丁基氟化铵(0.29mg，1.11mmol)在ch2cl2(30ml)中的混合物在室温搅拌70分钟。在添加ch2cl2(30ml)之后，将混合物用10％柠檬酸水溶液(30ml)、h2o(30ml)洗涤，并且用na2so4干燥。产物(1.36g，100％)未经任何进一步纯化即用于下一步骤。1h nmr(d
6-dmso,δppm):7.85(1h,d,j＝1.1hz),7.84(1h,s),7.83(1h,s),7.79(1h,d,j＝1.1hz),7.37(1h,s),7.36(1h,s),6.24(2h,s),6.22(2h,s),4.87(4h,s),4.86(4h,s),4.82(2h,s),4.81(2h,s),4.59(1h,s),4.36(4h,m),4.21-4.12(12h,m),4.07-4.00(6h,m),4.02(2h,s),3.95(2h,s),3.92(2h,s),3.52(2h,s),3.49(2h,s),1.34-1.26(6h,m),1.26-1.12(26h,m).
13
c nmr(d
6-dmso,δppm):171.10,168.54,168.52,168.50,168.48,164.66,164.43,161.09,160.99,160.85,160.66,160.47,158.68,158.58,147.84,144.79,133.35,132.63,131.50,128.22,127.09,125.20,124.53,122.96,122.88,94.55,94.27,93.89,93.79,93.40,88.97,87.38,86.48,80.81,65.77,65.73,65.39,61.73,61.65,61.08,61.04,60.26,60.25,59.42,59.34,59.25,57.95,55.10,54.95,14.38,14.35.maldi tof-ms质量:计算值(m h

)1472.56；实测值1472.45.
[0304]
实施例21.化合物22的合成.
[0305]
将化合物13(0.45g，0.50mmol)和sncl2×
2h2o(1.12g，5.0mmol)在无水etoh(50ml)中的混合物在85℃搅拌6小时。使混合物蒸发至约一半体积，添加h2o(20ml)。在用固体nahco3中和之后，用ch2cl2(40ml)和25％etoh/ch2cl2(3
×
20ml)萃取混合物，并用na2so4干燥合并的有机级分。产物(0.38g，90％)未经任何进一步纯化即用于下一步骤。maldi tof-ms质量:计算值(m h

)847.55；实测值847.11.
[0306]
实施例22.化合物23的合成.
[0307]
使用与实施例21中所述的合成类似的方法由化合物14合成化合物23。通过fc(硅胶，2％至5％etoh/ch2cl2)纯化产物(收率40％)。maldi tof-ms质量:计算值(m h

)1019.81；实测值1019.34.
[0308]
实施例23.配体酯24的合成.
[0309]
将化合物21(0.215g，0.146mmol)和22(59mg，70μmol)在无水tea(1ml)和dmf(2ml)中的混合物用氩气脱气。在添加双(三苯基膦)氯化钯(ii)(10mg，14μmol)和cui(6mg，28μmol)之后，将混合物在室温搅拌24小时。在蒸发至干之后，通过fc(硅胶，5％至10％etoh/ch2cl2)纯化产物(101mg，40％)。maldi tof-ms质量:计算值(m h

)3536.40；实测值3536.79.
[0310]
实施例24.配体酯25的合成.
[0311]
使用与实施例23中所述的合成类似的方法，在55℃搅拌22小时，由化合物23和21合成化合物25。通过fc(硅胶，5:89:1etoh/ch2cl2/tea)纯化产物(收率49％)。maldi tof-ms质量:计算值(m h

)3706.53；实测值3706.67.
[0312]
实施例25.eu螯合物26的合成.
[0313]
将配体酯24(48mg，13.6μmol)、0.5m koh在etoh(10ml)和ch2cl2(5ml)中的混合物在室温搅拌2小时，并蒸发至约一半体积。在添加h2o(5ml)之后，将混合物在室温搅拌30分钟。蒸发剩余的etoh，并将水溶液在室温搅拌过夜。通过添加6m hcl将ph调节至6.5。在5分钟内添加水(0.2ml)中的eucl3(11mg，30μmol)，并且通过适当添加固体nahco3将ph维持在6.0-6.5。在室温搅拌过夜之后，用1m naoh将ph调节至8.5。通过离心除去沉淀，并使上清液蒸发至干。通过hplc纯化产物。发现了两种异构体。收率：29mg(45％)。rf(hplc)：18.2和20.4分钟。maldi tof-ms质量:计算值(m h

)3273.53；实测值3273.46.
[0314]
实施例26.eu螯合物27的合成.
[0315]
使用与实施例25中所述的合成类似的方法由配体酯25合成eu螯合物27。通过hplc纯化产物(收率45％)。发现两种异构体。rf(hplc)：22.2和24.2分钟。maldi tof-ms质量:计算值(m h

)3443.70；实测值3441.79.
[0316]
实施例27.eu螯合物28的合成.
[0317]
使用与实施例6中所述的合成类似的方法由eu螯合物26合成eu螯合物28。产物不经任何进一步纯化即用于抗体标记。rf(hplc)：21.1和25.8分钟。
[0318]
实施例28.eu螯合物29的合成.
[0319]
使用与实施例6中所述的合成类似的方法由eu螯合物27合成eu螯合物29。产物不经任何进一步纯化即用于抗体标记。rf(hplc)：25.5分钟。
[0320]
实施例29.化合物30的合成.
[0321]
将化合物11(1.08g，2.80mmol)、brch2coo
t
bu(0.87ml，5.88mmol)、无水k2co3(1.55g，11.2mmol)在无水mecn(50ml)中的混合物在室温搅拌24小时。使混合物蒸发至干，并且通过fc(硅胶，ch2cl2至2％meoh/ch2cl2)纯化产物(1.54g，90％)。maldi tof-ms质量:计算值(m h

)615.73；实测值615.12.
[0322]
实施例30.化合物31的合成.
[0323]
将化合物31(1.52g，2.47mmol)在三氟乙酸(10ml)中的混合物在室温搅拌2.5小时，并蒸发至干。将产物通过et2o(100ml)沉淀，过滤，用et2o洗涤并在真空干燥器中干燥。将
作为tfa盐的产物溶解于10％naoh(30ml)中，用1m hcl使混合物成酸性(ph约2.0)，并且将产物分离并用h2o洗涤。收率：1.34g(98％)。maldi tof-ms质量:计算值(m h

)503.22；实测值502.89.
[0324]
实施例31.化合物32的合成.
[0325]
使用与实施例13中所述的合成类似的方法由化合物31和4-碘苯胺合成化合物32。通过fc(硅胶，etoac)纯化产物(0.45g，100％)。
[0326]
实施例32.化合物33的合成.
[0327]
使用与实施例2中所述的合成类似的方法，在80℃搅拌22小时，由化合物32合成化合物33。通过fc(硅胶，etoac)纯化产物(48％)。
[0328]
实施例33.配体酯34的合成.
[0329]
使用与实施例23中所述的合成类似的方法由化合物33和21合成配体酯34。通过fc(硅胶，7.5:91.5:1至10:89:1etoh/ch2cl2/tea)纯化产物(61％)。maldi tof-ms质量:计算值(m h

)3534.74；实测值3534.17.
[0330]
实施例34.eu螯合物35的合成.
[0331]
使用与实施例25中所述的合成类似的方法由配体酯34合成eu螯合物35。通过hplc纯化产物(收率24％)。rf(hplc)：21.3分钟。
[0332]
实施例35.eu螯合物36的合成.
[0333]
使用与实施例6中所述的合成类似的方法由eu螯合物35合成eu螯合物36。产物不经任何进一步纯化即用于抗体标记。
[0334]
实施例36.化合物37的合成.
[0335]
将2-(boc-氧基亚氨基)-2-苯乙腈(4.93g，20mmol)在20分钟内分小批添加到二亚乙基三胺(1.08ml，10mmol)、h2o(10ml)、1,4-二氧杂环己烷(10ml)和tea(4.18ml，30mmol)的溶液中。在室温搅拌过夜之后，添加h2o(20ml)，并用etoac(40ml 20ml)萃取混合物。将合并的有机相用10％naoh(2
×
15ml)、h2o(2
×
15ml)洗涤，并用na2so4干燥。通过fc(硅胶，5:95:0至20:79:1meoh/ch2cl2/tea)纯化产物(2.58g，78％)。1h nmr(cdcl
3,
δppm):4.94(2h,bs),3.21(4h,q,j＝5.8hz),2.73(4h,t,j＝5.8hz),1.45(18h,s).
13
c nmr(cdcl
3,
δppm):79.14,48.74,40.23,28.33.
[0336]
实施例37.化合物38的合成.
[0337]
将三氟乙酸酐(11.1ml，80mmol)在15分钟内添加到冰冷的4-氨基苯乙酸(3.02g，20mmol)的三氟乙酸(30ml)溶液中。在冰浴上搅拌15分钟之后，将混合物在室温搅拌2小时并添加h2o(50ml)。将冷却的混合物过滤，并将产物(3.93g，80％)用h2o洗涤并干燥。1h nmr(d
6-dmso,δppm):12.33(1h,s),11.22(1h,s),7.59(2h,d,j＝8.6hz),7.29(2h,d,j＝8.6hz),3.57(2h,s).
13
c nmr(d
6-dmso,δppm):171.50,155.23,154.94,154.64,154.35,135.16,132.86,130.30,121.39,119.63,117.34,115.04,112.75,40.43.
[0338]
实施例38.化合物39的合成.
[0339]
将n-羟基琥珀酰亚胺(0.575g，5.0mmol)和n,n-二环己基碳二亚胺(1.03g，5.0mmol)添加到化合物38(1.23g，5.0mmol)的无水1,4-二氧杂环己烷(20ml)溶液中。在室温搅拌4小时之后，将混合物过滤，并且将固体材料用1,4-二氧杂环己烷(3
×
5ml)洗涤，并使滤液蒸发至干。使残余物溶解于无水dmf(15ml)中，并且添加6-氨基己酸(0.655g，
5.0mmol)。将混合物在室温搅拌一周。使混合物蒸发至干，并且在添加h2o(25ml)之后，将冷却的混合物过滤，将产物(1.80g，100％)用h2o(3
×
10ml)洗涤并干燥。1h nmr(d
6-dmso,δppm):11.80(1h,bs),11.23(1h,bs),7.99(1h,t,j＝5.5hz),7.57(2h,d,j＝8.6hz),7.27(2h,d,j＝8.6hz),3.38(2h,s),3.02(2h,q,j＝6.9hz),2.18(2h,t,j＝7.4hz),1.53-1.43(2h,m),1.43-1.33(2h,m),1.30-1.20(2h,m).
13
c nmr(d
6-dmso,δppm):174.79,170.09,155.19,154.90,154.61,154.32,134.90,134.43,129.80,121.39,117.35,115.05,112.75,42.19,38.84,33.97,29.16,26.31,24.56.maldi tof-ms质量:计算值(m h

)361.34；实测值363.96.
[0340]
实施例39.化合物40的合成.
[0341]
将n-羟基琥珀酰亚胺(0.12g，1.0mmol)和n,n-二环己基碳二亚胺(0.21g，1.0mmol)添加到化合物39(0.36g，1.9mmol)在无水1,4-二氧杂环己烷(30ml)和dmf(5ml)的溶液中。在室温搅拌3小时之后，添加化合物37(0.30g，1.0mmol)的1,4-二氧杂环己烷(3ml)溶液，并将混合物在室温搅拌2天。在蒸发至干之后，将残余物溶解于1,4-二氧杂环己烷(10ml)中，过滤，并用1,4-二氧杂环己烷洗涤固体材料，并使滤液蒸发至干。将残余物溶解于ch2cl2(30ml)中，用h2o(3
×
10ml)洗涤并用na2so4干燥。用fc(硅胶，5％至7.5％meoh/ch2cl2)纯化产物(0.37g，57％)。1h nmr(d
6-dmso,δppm):11.21(1h,s),7.80(1h,t,j＝5.5hz),7.57(2h,d,j＝8.5hz),7.27(2h,t,j＝8.5hz),6.98(1h,t,j＝5.9hz),6.80(1h,t,j＝5.4hz),3.58(2h,s),3.27(2h,t,j＝6.5hz),3.23(2h,t,j＝6.5hz),3.05-2.97(4h,m),2,23(2h,t,j＝7.3hz),1.50-1.44(2h,m),1.44-1.34(2h,m),1.36(18h,s),1.28-1.21(2h,m).
13
c nmr(d
6-dmso,δppm):172.70,170.15,156.13,156,08,155.21,154.96,154.72,154.47,135.00,134.51,129.91,121.46,119.16,117.25,115.34,113.43,78.25,78.03,55.38,47.72,45.64,42.28,39.03,32.44,29.47,28.69,28.65,26.67,25.08.maldi tof-ms质量:计算值(m h

)646.34；实测值647.36.
[0342]
除希望的产物40外，还获得0.18g的39的nhs-活化形式，由其在dmf和tea中制备额外量的化合物40(0.164g，65％)。
[0343]
实施例40.化合物41的合成.
[0344]
将化合物40(0.52g，0.812mmol)在ch2cl2(20ml)和三氟乙酸(5ml)中的混合物在室温搅拌4.5小时，并蒸发至干。在添加et2o(30ml)之后，通过离心移除产物(0.532g，97％)，用et2o(2
×
15ml)洗涤，在真空干燥器中干燥。1h nmr(d
6-dmso,δppm):11.25(1h,s),8.06(1h,t,j＝5.5hz),7.99(2h,bs),7.79(2h,bs),7.57(2h,d,j＝8.5hz),7.27(2h,d,j＝8.5hz),3.53.3.45(4h,m),3.05-2.96(4h,m),2.96-2.90(2h,m),2.30(2h,t,j＝7.6hz),1.53-1.45(2h,m),1.45-1.37(2h,m),1.31-1.25(2h,m).
13
c nmr(d
6-dmso,δppm):174.01,170.22,159.17,158.95,158.72,158.50,155.25,155.00,154.76,154.52,135.02,134.50,129.92,121.50,118.17,117.90,117.25,115.94,115.33,113.99,44.99,43.13,42.27,39.03,37.58,37.36,32.48,29.50,26.53,24.68.maldi tof-ms质量:计算值(m 2h

)447.50；实测值447.16.
[0345]
实施例41.化合物42的合成.
[0346]
将化合物1(180mg，0.40mmol)、41(67mg，0.10mol)和dipea(209μl，1.2mmol)在无水mecn(5ml)中的混合物在52℃搅拌过夜。在蒸发至干之后，通过fc(硅胶，5％meoh/ch2cl2)
纯化产物(163mg，84％)。maldi tof-ms质量:计算值(m h

)1932.45,1930.45；实测值1932.59,1930.69.
[0347]
实施例42.配体酯43的合成.
[0348]
将化合物42(160mg，84.0μmol)和2,2'-{{4-[(三甲基甲硅烷基)乙炔基]-1,3-亚苯基}双(氧基)}二乙酸二乙酯(129mg，0.422mmol；sund,h.等人molecules 22(2017)1807)在无水tea(1ml)和thf(2ml)中的混合物用氩气脱气。在添加双(三苯基膦)氯化钯(ii)(10mg，14μmol)和cui(6mg，28μmol)之后，将混合物在55℃搅拌24小时。在蒸发至干之后，通过fc(硅胶，5％至10％etoh/ch2cl2)纯化产物(148mg，62％)。maldi tof-ms质量:计算值(m h

)2832.19；实测值2831.19.
[0349]
实施例43.配体酯44的合成.
[0350]
使用与实施例41中所述的合成类似的方法，由化合物42和2-(4-乙炔基-3-甲氧基苯氧基)乙酸乙酯合成该配体酯44。通过fc(硅胶，5％至10％etoh/ch2cl2)纯化产物(60％)。maldi tof-ms质量:计算值(m 2h

)2545.12；实测值2545.17.
[0351]
实施例44.eu螯合物45的合成.
[0352]
使用与实施例25中所述的合成类似的方法由配体酯43合成eu螯合物45。通过hplc纯化产物(46％)。rf(hplc)：12.8分钟。uv：348nm。
[0353]
实施例45.eu螯合物46的合成.
[0354]
使用与实施例25中所述的合成类似的方法由配体酯44合成eu螯合物46。通过hplc纯化产物(收率73％)。rf(hplc)：16.2分钟。uv：348nm。
[0355]
实施例46.eu螯合物47的合成.
[0356]
使用与实施例6中所述的合成类似的方法由eu螯合物45合成eu螯合物47。产物不经任何进一步纯化即用于抗体标记。
[0357]
实施例47.eu螯合物48的合成.
[0358]
使用与实施例6中所述的合成类似的方法由eu螯合物46合成eu螯合物48。产物不经任何进一步纯化即用于抗体标记。
[0359]
实施例48.化合物49的合成.
[0360]
将boc-gly-osu(0.27g，1.0mmol)和4-碘苯胺(0.22g，1.0mmol)在无水dmf(2.0ml)中的混合物在室温搅拌一周。在蒸发至干之后，通过fc(硅胶，50％etoac/石油醚)纯化产物(0.32g，85％)。1h nmr(d
6-dmso,δppm):10.3(1h,s),7.64(2h,d,j＝8.8hz),7.43(2h,d,j＝8.8hz),7.06(1h,t,j＝6.1hz),3.70(2h,d,j＝6.1hz),1.39(9h,s).
13
c nmr(d
6-dmso,δppm):168.91,156.40,139.26,137.86,121.71,87.04,78.54,44.29,28.67.maldi tof-ms质量:计算值(m 2h

)378.05；实测值378.71.
[0361]
实施例49.化合物50的合成.
[0362]
将化合物49(0.65g，1.73mmol)和tfa(10ml)的混合物在室温搅拌5小时，并蒸发至干。在添加et2o(50ml)之后，将混合物搅拌约30分钟，将产物(0.63g，93％)过滤，用et2o(50ml)洗涤并在真空干燥器中干燥。1h nmr(d
6-dmso,δppm):10.59(1h,s),8.15(2h,s),7.70(2h,d,j＝8.8hz),7.35(2h,d,j＝8.8hz),3.79(2h,s).
13
c nmr(d
6-dmso,δppm):165.49,158.79,158.58,158.38,158.17,138.48,138.16,121.76,120.75,118.77,116.78,88.08,41.57,31.18.maldi tof-ms质量:计算值(m h

)276.99；实测值276.53.
[0363]
实施例50.化合物51的合成.
[0364]
将化合物50(0.62g，1.59mmol)和dipea(1.38ml，7.95mmol)在无水mecn(20ml)中的混合物在室温搅拌，直至获得澄清混合物，并且添加brch2cooet(176μl，1.59mmol)。在55℃搅拌过夜之后，使混合物蒸发至干，并且通过fc(硅胶，50:49:1至75:24:1etoac/石油醚/tea)纯化产物(1.12g，67％)。1h nmr(d
6-dmso,δppm):9.98(1h,s),7.63(2h,d,j＝8.8hz),7.47(2h,d,j＝8.8hz),4.11(2h,q,j＝7.1hz),3.42(2h,s),1.19(3h,t,j＝7.1hz).
13
c nmr(d
6-dmso,δppm):172.63,170.65,139.02,137.82,121.82,87.17,60.55,52.66,50.48,14.60.maldi tof-ms质量:计算值(m h

)363.02；实测值362.63.
[0365]
实施例51.化合物53的合成.
[0366]
将化合物52(0.43g，0.90mmol；sund,h.等人molecules 22(2017)1807)、nh2ch2cooet
×
hcl(31mg，0.22mmol)、dipea(160μl，0.90mmol)在无水mecn(15ml)中的混合物在室温搅拌2小时。在蒸发至干之后，通过fc(硅胶，2％meoh/ch2cl2)纯化产物(130mg，66％)。
[0367]
实施例52.化合物54的合成.
[0368]
将化合物51(151mg，0.20mmol)、53(89mg，0.10mmol)和无水k2co3(55mg，0.40mmol)在无水mecn(5ml)中的混合物在室温搅拌3-4天。将混合物过滤，用mecn洗涤沉淀，并使滤液蒸发至干。通过fc(硅胶，2至5％meoh/ch2cl2)纯化产物(101mg，69％)。maldi tof-ms质量:计算值(m h

)1456.23；实测值1456.35.
[0369]
实施例53.配体酯55的合成.
[0370]
将化合物21(255mg，173μmol)和54(101mg，70μmol)在无水tea(1ml)和dmf(2ml)中的混合物用氩气脱气。在添加双(三苯基膦)氯化钯(ii)(10mg，14μmol)和cui(6mg，28μmol)之后，将混合物在室温搅拌24小时。在蒸发至干之后，通过fc(硅胶，5％至10％etoh/ch2cl2)纯化产物(193mg，67％)。maldi tof-ms质量:计算值(m na

)4166.50；实测值4166.02.
[0371]
实施例54.eu螯合物56的合成.
[0372]
使用与实施例25中所述的合成类似的方法由配体酯55合成eu螯合物56。通过hplc纯化产物(收率18％)。rf(hplc)：14.3分钟。maldi tof-ms质量:计算值(m h

)3756,52；实测值3756.51.
[0373]
实施例55.eu螯合物57的合成.
[0374]
使用与实施例6中所述的合成类似的方法由eu螯合物56合成eu螯合物57。产物不经任何进一步纯化即用于抗体标记。
[0375]
实施例56.eu螯合物58的合成.
[0376]
使用与实施例52至55中对eu螯合物56所述的合成步骤类似的方法，由2-{{2-{{2-[2-(4-碘苯氧基)乙酰胺基]乙基}氨基}-2-氧乙基}氨基}乙酸乙酯和53合成eu螯合物58。
[0377]
实施例57.eu螯合物59的合成.
[0378]
使用与实施例6中所述的合成类似的方法由eu螯合物58合成该eu螯合物59。产物不经任何进一步纯化即用于抗体标记。
[0379]
实施例58.化合物60的合成.
[0380]
将化合物52(0.24g，0.50mmol；sund,h.等人molecules 22(2017)1807)、nh(ch2cooet)2(95mg，0.50mmol)、无水k2co3(0.35g，2.5mmol)在无水mecn(10ml)中的混合物
在氩气下于室温搅拌5.5小时。在过滤并蒸发至干之后，通过fc(硅胶，30％etoac/石油醚)纯化产物(97mg，33％)。产物直接用于下一步骤，因为其不耐受储存。
[0381]
实施例59.化合物61的合成.
[0382]
将化合物60(90mg，0.154mmol)、bocnh(ch2)6nh2(0.17g，0.77mmol)、无水k2co3(0.21g，1.54mmol)在无水mecn(5ml)中的混合物在氩气下于室温搅拌3小时。在蒸发至干之后，通过fc(硅胶，10％meoh/ch2cl2)纯化产物(85mg，77％)。maldi tof-ms质量:计算值(m h

)720.36；实测值720.43.
[0383]
实施例60.化合物62的合成.
[0384]
将化合物61(106mg，0.15mmol)、化合物1(68g，0.15mmol)、无水k2co3(41mg，0.30mmol)在无水mecn(5ml)中的混合物在氩气下于室温搅拌7小时。在过滤并蒸发至干之后，通过fc(硅胶，5％meoh/ch2cl2)纯化产物(97mg，60％)。maldi tof-ms质量:计算值(m h

)1092.41,1090.41；实测值1092.00,1089.95.
[0385]
实施例61.化合物63的合成.
[0386]
将化合物62(97mg，89μmol)的三氟乙酸(1.3ml)溶液在室温搅拌2小时。使溶液蒸发至干，并且从二乙醚(2
×
20ml)中进一步蒸发两次。使残余物溶解于无水mecn(3ml)中，并且在添加dipea(0.32ml，1.8mmol)和化合物1(81mg，180μmol)之后，将混合物在氩气下于室温搅拌4天。在蒸发至干之后，通过fc(硅胶，5％meoh/ch2cl2)纯化产物(125mg，81％)。maldi tof-ms质量:计算值(m h

)1734.46,1732.46；实测值1734.64,1731.73.
[0387]
实施例62.配体酯64的合成.
[0388]
使用与实施例4中所述的合成类似的方法，由化合物63和在无水dmf而非thf中的2,2’,2
”‑
{[4-(乙炔基)苯-1,3,5-三基]-三(氧基)三乙酸三乙酯合成配体酯64。通过fc(硅胶，5至10％meoh/ch2cl2)纯化产物(收率33％)。maldi tof-ms质量:计算值(m h

)2716.12；实测值2715.52.
[0389]
实施例63.eu螯合物65的合成.
[0390]
使用与实施例5中所述的合成类似的方法由配体酯64合成eu螯合物65。通过hplc纯化产物(收率47％)。rf(hplc)：14.1分钟。uv：347nm。
[0391]
实施例64.eu螯合物66的合成.
[0392]
使用与实施例6中所述的合成类似的方法由eu螯合物65合成eu螯合物66。产物不经任何进一步纯化即用于抗体标记。
[0393]
实施例65.用标记试剂7、28、47、57、59和66标记抗体.
[0394]
通过使用350mm na2co3缓冲液(ph 9.8)作为反应缓冲液和300倍过量的标记试剂7、28、47、57、59或66，如sund,h.等人molecules 22(2017)1807所述类似地执行tni抗体的标记。反应在室温进行过夜。通过使用tris-盐水-叠氮化物缓冲液(50mm tris，0.9％nacl，ph 7.75)作为洗脱液，在superdex 200gl 10/30凝胶过滤柱(ge healthcare)上将标记的抗体与过量的螯合物分离。将含有抗体的级分合并，并通过uv来测量eu浓度。
[0395]
实施例66.肌钙蛋白i免疫测定
[0396]
针对心肌肌钙蛋白i，在夹心免疫测定中测试螯合物7、28、47、57、59和66标记的tni抗体。使用图10中的ref 1(von lode,p.等人,anal.chem.74(2003)3193)、ref 2(sund,h.等人,molecules 22(2017)180)和ref 3标记的抗体作为参考化合物。将10μl稀释的示踪
抗体(3ng/μl或5ng/μl)和35μl的tni标准溶液移液到预包被的测定孔(96孔板形式中的单个孔，用链霉亲和素和生物素化抗tni捕获抗体包被的孔，radiometer turku oy)中。将反应混合物在36℃和振荡下温育20分钟。将孔洗涤6次并干燥，然后用victor
tm
平板荧光计测量。根据新型螯合物和ref 1-3的测量信号，并通过使用ref 1-3的亮度值(其分别为8000、37200m-1
cm-1
(sund,h.等人molecules 22(2017)180)和22800m-1
cm-1
)来估计新型标记试剂的亮度。初步结果汇总于表1中。
[0397]
表1：
[0398]
螯合物标记εφ(m-1
cm-1
)73800028580004744000575500059750006641000
[0399]
如表1的值显示，所测得的亮度确实很高，并且基于观察，具有两个结合基团的标记似乎具有意料不到的高发光。
[0400]
[0401]
[0402]
[0403][0404]
[0405]
[0406]
[0407]
[0408]
[0409]
[0410]
[0411]
[0412]