基于空间交错编码多组学芯片及其制备方法与应用与流程

1.本发明属于芯片制备领域，涉及多组学芯片，特别涉及基于空间交错编码多组学芯片及其制备方法与应用。


背景技术：

2.目前，空间转录组技术已经成为复杂生命体基因表达和多组学分析的研究利器。空间转录组是既能够保留组织空间位置信息又能够获得不同组织空间位点基因转录信息的一种技术，它融合了组织病理学、基因芯片、高通量测序、生物成像等技术。该技术被nature methods评为2020年年度技术。细胞在组织中的空间位置强烈影响着它们的功能，空间转录组技术可以高通量且全基因组范围内在单细胞水平对基因表达进行准确捕获研究。进而得到对于疾病机理和器官发育研究中非常重要的时空组学图谱。不同空间转录组方法的评价维度主要包括空间分辨率、每个特征点的基因分辨率和整体可检测的区域覆盖度三个方面。首先，每个特征点越小空间分辨率越高，分辨率包括区域分辨率、单细胞分辨率和亚细胞分辨率；其次，每个特征点里的捕获探针越多则检测到的有效基因数目越多；最后，空间转录组芯片或检测视野范围越大越有利于大尺度组织的研究。目前空间转录组研究的主要策略分为四类，基于原位杂交的空间转录组技术，基于原位测序的空间转录组技术，基于显微切割(lcm)的空间转录组技术和基于空间原位捕获的转录组技术。这些技术有各自独特的优势，但在不同方面都还有不足之处。比如geo-seq、niche-seq、proximid等，只对特定位点的细胞进行切割和测序，覆盖度不全。seqfish、starmap、fisseq等，这种基于原位杂交或原位测序的方法只能得到部分而非全部基因的表达信息，基因分辨率有限。基于寡核苷酸空间条形码捕获方法，比如st、slide-seq、dbit-seq、seq-scope等，通过原位添加空间位置条形码和异位构建转录组文库并测序，构建高分辨率空间转录组图谱；该方法代表未来发展的主流方向，但目前还存在空间分辨率低和覆盖度不全的问题。10
×
genomics visium是目前商业化最成功的空间转录组芯片技术，芯片尺寸为6.5mm
×
6.5mm，spot直径较大，达到55μm，实现的是区域分辨率而无法达到单细胞分辨率(人类细胞的平均直径为10μm)，检测尺度还比较小，另外每个点之间都会有45μm的距离不被覆盖在组织上；因此分辨率较低且不能对组织切片全覆盖位置标记。尽管空间转录组技术与单细胞建库联合使用，可获得单细胞分辨率的空间图谱，但耗时费力、通量较低且成本偏高。因此当前的空间转录组技术具有相当大的瓶颈，限制了广泛的应用。现需要一种技术能同时满足具有足够捕获面积的大尺度、单细胞分辨率和全覆盖的空间转录组芯片技术，并且满足更精确的全覆盖组织切片转录图谱三维重建的需求，以期成为替代目前的空间转录组技术的工具。


技术实现要素：

3.为了解决上述技术问题，本发明目的是提供基于空间交错编码空间多组学芯片及其制备方法与应用。
4.本发明基于3d喷墨原位dna合成技术利用空间交错编码策略制作高分辨率的大尺
度空间多组学芯片，进而使用空间原位捕获策略对组织切片进行高通量的原位转录组分析、原位表观组分析、原位非编码rna分析和原位蛋白组分析；实现了单细胞分辨率、大尺度空间覆盖，同时兼顾高的基因数目检出率；可用于器官或组织的三维全覆盖精确转录图谱或时空图谱构建。
5.本发明提供了基于空间交错编码空间多组学芯片的原位制备方法，包括如下步骤：
6.1)将基底用水虎鱼溶液进行表面处理然后等离子清洗，得到预处理的基底；
7.2)将所述预处理的基底用亲水性硅烷和疏水性硅烷的混合液浸泡，然后进行蒸镀或cvd表面处理；再依次加入spacer试剂、unylinker分子处理，得到表面处理的功能图案化芯片；
8.3)在所述表面处理的功能图案化芯片上通过高通量原位喷墨打印合成平台合成用于空间多组学分析的序列，得到空间转录组芯片；
9.4)将所述空间转录组芯片经过氨解脱去保护碱基处理后，得到蜂窝状全覆盖空间转录组芯片；
10.5)将所述蜂窝状全覆盖空间转录组芯片进行capture oligo杂交反应；
11.6)将和步骤5)中经所述探针转换的芯片利用无5
’‑3’
外切酶活性、无3
’‑5’
外切酶活性和无链置换活性的聚合酶和连接酶进行探针延伸和连接；
12.7)将经步骤6)处理的芯片清洗，即得到基于空间交错编码的高分辨率大尺度空间多组学芯片。
13.上述的方法中，所述表面处理的功能图案化芯片上利用相邻交错合成产生的长度多态性编码序列作为空间坐标条形码(spatial coordinate id,scid)进行所述空间多组学分析的序列的地址确认。
14.上述的方法中，所述表面处理的功能图案化芯片上包含三类spot区域，分别为1区spot、2区spot和3区spot；
15.所述2区定义为两个相邻圆形像素点交集部分，所述3区定义为三个相邻圆形交集的区域，所述1区定义为剩余未交集部分；
16.所述1区的空间坐标条形码的长度为n，则所述2区的空间坐标条形码长度为2n，所述3区的空间坐标条形码长度为3n。
17.上述的方法中，步骤3)中包括打开控制电脑将所述高通量原位喷墨打印合成平台中将如下合成序列输入高通量dna合成控制软件：
18.每个所述spot区域的序列从3端到5端依次为通用序列、空间编码序列(scid)、分子标签序列和搭桥序列；
19.在整个所述表面处理的功能图案化芯片上，所有所述spot序列中通用序列、所述分子标签序列和所述搭桥序列均相同，采用flow cell部件进行通用合成；
20.每个所述spot区域的序列包含一个唯一的空间编码序列，所述空间编码序列部分的合成由压电喷墨打印嵌套合成策略进行合成。
21.上述的方法中，对于所述空间编码序列部分的合成的控制软件程序如下：以所有点的所述1区圆心点建立坐标系，第一次按照奇数列进行合成，仅仅合成x＝1,5,9,13,17
…
列，其中x＝1行的坐标如下x＝1,y＝1；x＝1,y＝3；x＝1,y＝5；x＝1,y＝7，其他依次类推，
整个坐标系的其他点设置为空值，偶联之后完成氧化脱保护等步骤；第二次按照奇数列进行合成，仅仅合成x＝3,7,11,15,19
…
行，其中x＝3行的坐标如下x＝3,y＝1；x＝3,y＝3；x＝3,y＝5；x＝3,y＝7，其他依次类推(注意对于偶数行的坐标相对奇数行会向右侧整体偏移dμm)；整个坐标系的其他点设置为空值，偶联之后完成氧化脱保护等步骤；第三次按照偶数列进行合成，仅仅合成x＝2,6,10,14,18
…
列，其中x＝6列的坐标如下x＝2,y＝2；x＝2,y＝4；x＝2,y＝6；x＝2,y＝8；x＝2,y＝10，其他依次类推；整个坐标系的其他点设置为空值，偶联之后完成氧化脱保护等步骤；第四次按照偶数列进行合成，仅仅合成x＝4,8,12,16,20
…
列，其中x＝4列的坐标如下x＝4,y＝2；x＝4,y＝4；x＝4,y＝6；x＝4,y＝8；x＝4,y＝10，其他依次类推；整个坐标系的其他点设置为空值，偶联之后完成氧化脱保护等步骤；整个坐标系的其他点设置为空值，偶联之后完成氧化脱保护步骤；在所述表面处理的功能图案化芯片上，每层合成做一次循环，对于嵌套合成策略每层的序列都重复上述四次的循环。
22.上述的方法中，所述基底材料选自玻璃晶圆、石英晶圆和包含二氧化硅层的硅晶圆中的至少一种；
23.步骤2)中，所述亲水性硅烷与所述疏水性硅烷的质量比可为1:5～150，具体可为1：9，1：19，1：29，1：39，1：49，1：59，1：69，1：79，1：89，1：99；
24.所述亲水性硅烷选自5,6-环氧己基三乙氧基硅烷、3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基-三甲氧基硅烷、[8-(环氧丙基氧)-正辛基]三甲氧基硅烷、3-缩水甘油醚氧基丙基三乙氧基硅烷、11-(三乙氧基甲硅烷基)十一烷-1-胺、11-氨基十一烷基三甲氧基硅烷、3-缩水甘油基氧基丙基三甲氧基硅烷、n-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4-羟基丁酰胺、11-乙酰氧基十一烷基三乙氧基硅烷、正癸基三乙氧基硅烷、(3-氨丙基)三甲氧基硅烷、(3-氨丙基)三乙氧基硅烷和3-碘-丙基三甲氧基硅烷中的至少一种；
[0025]
所述疏水性硅烷选自十三氟四氢辛基-三乙氧基硅烷、氟辛基三氯硅烷、(十三氟-1,1,2,2-四氢辛基)三氯硅烷和(十三氟-1,1,2,2-四氢辛基)三甲氧基硅烷中的至少一种；
[0026]
所述spacer试剂选自五甘醇、六甘醇和peg 800中的至少一种；
[0027]
所述unylinker分子选自如下式(1)-(19)所示的linker、式(20)-(22)所示的可光裂解的linker、式(23)-(32)所示的可枝接多种官能团的linker中的至少一种：
[0028]
[0029][0030]
步骤5)中，所述杂交反应采用的反应体系如下：包含bridge和oligo dt探针(具体为5
×
ssc buffer、1μm capture oligo 1、1μm capture oligo 2)，并于37℃反应30min；
[0031]
步骤6)中，所述探针延伸和连接采用的聚合酶和连接酶体系如下：终浓度为1
×
rcutsmart buffer、200μm dntps、1mm atp、0.02u/μl mako dna polymerase(3
′→5′
exo-)或sulfolobus dna polymeraseⅳ、1u/μl t4 dna ligase或hi-t4 dna ligase，37℃反应30min；
[0032]
步骤7)中，采用0.1
×
所述ssc buffer进行清洗。
[0033]
本发明还提供了上述的方法制备得到所述基于空间交错编码空间多组学芯片。
[0034]
本发明还提供了所述基于空间交错编码多组学芯片在制备如下a)-d)中任一芯片中的应用：
[0035]
a)单细胞分辨率空间原位转录组分析芯片；
[0036]
b)单细胞分辨率空间原位表观组分析芯片；
[0037]
c)单细胞分辨率空间原位非编码rna分析芯片；
[0038]
d)单细胞分辨率空间原位蛋白组分析芯片。
[0039]
本发明还提供了所述基于空间交错编码空间多组学芯片在如下(a1)-(a3)任一中的应用：
[0040]
(a1)对组织切片进行全覆盖、单细胞分辨率和大尺寸的空间转录组分析，研究基因表达的空间特异性，制作三维转录图谱；
[0041]
(a2)在空间转录组基础上进行多组学时空图谱的分析；
[0042]
(a3)空间转录组技术。
[0043]
本发明进一步提供了所述基于空间交错编码空间多组学芯片在x1)-x7)任一中的应用：
[0044]
x1)癌症研究；
[0045]
x2)微生物与感染研究；
[0046]
x3)发育生物学研究；
[0047]
x4)植物与农业研究；
[0048]
x6)大脑与神经退行性疾病研究；
[0049]
x7)制备诊断领域的检测产品。
[0050]
本发明进一步提供了一种空间转录组芯片上的成套探针，它包括上述的方法中所述的成套探针：wafer ligated oligo、capture oligo1、capture oligo 2。
[0051]
本发明具有以下有益效果：
[0052]
本发明所提供的单细胞分辨率的大尺度空间转录组微阵列芯片制作与实验方法，可以满足大尺度、单细胞分辨率和全覆盖的更精确的空间转录图谱三维重建的需求。相比传统的空间转录组方案提高了空间分辨率，相比基于测序芯片的高空间分辨率空间转录组方案提高了单个细胞的基因检出分辨率。同时提供目前成熟方案中不具备的大尺寸组织一次性全覆盖的检测。因此本发明的单细胞分辨率的大尺度空间转录组微阵列芯片技术可以在癌症研究、微生物与感染研究、发育生物学研究、植物与农业研究、大脑与神经退行性疾病研究和制备诊断领域的检测产品等领域有着广泛的应用价值。
附图说明
[0053]
图1为相邻交错编码的scid示意图。
[0054]
图2为相邻交错编码的scid合成方式中相邻三个墨点中心的关系图。
[0055]
图3为空间交错编码策略中三个区域面积差异最小化的最优解函数关系。
[0056]
图4为相邻交错编码的空间转录组芯片设计图。
[0057]
图5为相邻交错编码的空间转录芯片的原位合成使用的坐标系。
[0058]
图6为相邻交错编码的空间转录芯片的原位合成坐标系的x，y轴关系。
[0059]
图7为相邻交错编码的空间转录芯片的原位合成过程示意图。
[0060]
图8为3d喷墨打印原位合成过程的墨滴形态观测图。
[0061]
图9为空间转录组芯片合成后探针后处理过程。
[0062]
图10为空间转录组芯片合成后探针后处理的实验结果。
[0063]
图11为空间mirna组实验流程图。
具体实施方式
[0064]
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0065]
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0066]
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0067]
下述实施例中，wafer ligated oligo的序列中“[barcode][umi]”参考文献doi:10.1126/science.aaf2403。
[0068]
本发明提供了基于空间交错编码多组学芯片及其制备方法与应用，包括如下步骤：利用3d喷墨原位dna合成技术制作单细胞分辨率的大尺度空间转录组微阵列芯片制作，空间转录组微阵列芯片的形式包括蜂窝状全覆盖空间转录组芯片和相邻交错编码的空间转录组芯片两种策略，使用空间原位捕获策略对组织切片进行高通量的原位转录组分析。满足具有足够捕获面积的大尺度、单细胞分辨率和全覆盖的空间转录组芯片技术，这项技术将会替代目前的空间转录组技术成为相关研究领域的有力工具。
[0069]
本发明提供的相邻交错编码的高分辨率大尺度空间多组学芯片的设计：
[0070]
1、常规空间转录组芯片上的探针点阵排列一般是标准xy坐标系阵列方式，相邻两个点的间距大于点的直径，也就是说两个圆点不交集，最近距离一般为40-50微米。这样的空间转录组芯片在检测过程中探针点阵未覆盖的空白区域组织信息就无法检测，分辨率无法提高。
[0071]
2、本技术设计了全新的相邻交错编码的高分辨率大尺度空间多组学芯片，如图1所示，以每个特征圆点为中心看，周围都有6个圆点和其有交集，周围的6个圆点之间又存在交集。把两个圆点的交集定义为2号区域，在图1中阴影部分标注2的部分。3个圆点交集的定义为3号区域，在图1中阴影部分标注3的部分。剩余的中心部分未与任何区域存在交集，定义为1号区域，在图1中白色部分标注1的部分。
[0072]
3、为了优化空间多组学芯片的分辨率，需要上述区域中的1号区域，2号区域和3号区域面积尽可能一直，通过模拟3个圆点的中心距，如图2所示，建立了圆点最优中心距和圆点半径的函数关系。如图3所示，当m＝1.285r时，为最优中心距，此时1区，2区和3区的面积最接近。
[0073]
4、基于上述的最优中心距，模拟了相邻交错编码的空间芯片点阵打印，如图4所示，黑色，白色和灰色分别代表上述的1区，2区和3区，从而实现了空间多组学芯片检测时的组织全覆盖设计。图5显示了相邻交错编码的空间芯片点阵的xy坐标系，该坐标系为不对等坐标系，将用于后续的喷墨打印合成过程，横轴方向坐标密度大于纵轴方向坐标密度。图6说明了x，y坐标系代表的坐标值关系。
[0074]
实施例1：相邻交错编码的高分辨率大尺度空间多组学芯片的原位合成
[0075]
1、将玻璃晶圆用水虎鱼溶液(1.5ml 30％过氧化氢水溶液/3.5ml 98％浓硫酸)进行表面处理然后等离子清洗处理半小时，然后用去离子水浸泡、清洗，乙腈清洗后氮气吹干备用。
[0076]
2、然后用亲水性硅烷3-缩水甘油醚氧基丙基三乙氧基硅烷氟辛基三氯硅烷(功能化)和疏水性硅烷(活性钝化)按照质量比5：95混合后进行浸泡(浸泡处理的时间0.5～4小时，具体为3小时)，蒸镀或cvd等表面处理，再用spacer用于延长合成臂，减少合成过程的空间位阻，最后加上unylinker分子，用以后续合成寡核苷酸的亚磷酰胺单体连接，并可以方
便从基底上裂解下来。
[0077]
3、经过上述表面处理的功能图案化芯片放置到dyhow高通量原位合成平台的input station上。打开设备进行一系列的前处理。打开控制电脑将合成序列输入高通量dna合成控制软件，每个spot包含一个唯一的空间编码序列，从3端到5端依次为通用序列，空间编码序列(scid)，分子标签序列和搭桥序列。除了空间编码序列(scid)部分，其他部分的序列在整张芯片上均相同，采用flow cell部件进行通用合成。对于空间编码序列部分的合成，以所有点的1区圆心点建立坐标系，如图7所示，第一次按照奇数列进行合成，仅仅合成x＝1,5,9,13,17
…
列，其中x＝1行的坐标如下x＝1,y＝1；x＝1,y＝3；x＝1,y＝5；x＝1,y＝7，其他依次类推，整个坐标系的其他点设置为空值，偶联之后完成氧化脱保护等步骤。第二次按照奇数列进行合成，仅仅合成x＝3,7,11,15,19
…
行，其中x＝3行的坐标如下x＝3,y＝1；x＝3,y＝3；x＝3,y＝5；x＝3,y＝7，其他依次类推(注意对于偶数行的坐标相对奇数行会向右侧整体偏移dμm)。整个坐标系的其他点设置为空值，偶联之后完成氧化脱保护等步骤。第三次按照偶数列进行合成，仅仅合成x＝2,6,10,14,18
…
列，其中x＝6列的坐标如下x＝2,y＝2；x＝2,y＝4；x＝2,y＝6；x＝2,y＝8；x＝2,y＝10，其他依次类推。整个坐标系的其他点设置为空值，偶联之后完成氧化脱保护等步骤。第四次按照偶数列进行合成，仅仅合成x＝4,8,12,16,20
…
列，其中x＝4列的坐标如下x＝4,y＝2；x＝4,y＝4；x＝4,y＝6；x＝4,y＝8；x＝4,y＝10，其他依次类推。整个坐标系的其他点设置为空值，偶联之后完成氧化脱保护等步骤。整个坐标系的其他点设置为空值，偶联之后完成氧化脱保护等步骤。相比于普通的合成流程，每层合成做一次循环，对于嵌套合成策略每层的序列都重复上述四次的循环，举例如下，如果x＝1，y＝1点的空间编码为atcgt，x＝2，y＝1点的空间编码为tcgac，x＝1，y＝2点的空间编码为gacta，那么他们交集的2区对应2n的空间交错编码分别为agtaccgtta，attccggatc，gtaccgtaac，3区对应3n的空间交错编码分别为agttacccggtatac。
[0078]
4、最后经过氨解脱去保护碱基处理后即可得到蜂窝状全覆盖空间转录组芯片。
[0079]
5、用合成好的空间转录组芯片进行capture oligo杂交用于探针转换，如图9所示。配制终浓度为5
×
ssc buffer(1x ssc buffer：150mm氯化钠、15mm柠檬酸三钠，ph 7.0)、1μm capture oligo 1、1μm capture oligo 2的反应体系(依据芯片大小调整体积)，并于37℃反应30min。
[0080]
6、探针延伸和连接，如图9所示。配制终浓度为1
×
rcutsmart buffer(50mm potassium acetate、20mm tris-acetate、10mm magnesium acetate、100μg/ml recombinant albumin，25℃，ph 7.9)、200μm dntps、1mm atp、0.02u/μl sulfolobus dna polymeraseⅳ、1u/μl hi-t4 dna ligase的反应体系，阴性对照不加sulfolobus dna polymeraseⅳ和hi-t4 dna ligase，并于37℃反应30min。如图10所示。图10中1和2是sulfolobus dna polymeraseⅳ hi-t4 dna ligase体系的两个重复；3和4是对应的阴性对照。需要的目的条带应为87bp，探针模板长63bp，capture oligo1为22bp，capture oligo2为39bp。1，2泳道的最上面条带清晰的显示为包含空间barcode和umi结构的反向探针分子。
[0081]
7、芯片清洗。0.1
×
ssc冲洗芯片两次，移液器移除芯片表面液体；使用含rnase inhibitor(ri)的nuclease-free water(nf-h2o)(2u/μl ri，现配现用)处理芯片1-2min，移液器移除液体；使用不含rnase inhibitor(ri)的nuclease-free water(nf-h2o)冲洗，移液器移除液体。吸水纸吸取芯片表面残余液体，37℃晾干。
[0082]
wafer ligated oligo
[0083]3’
gatgtgctgcgagaaggctaga[barcode][umi][aacagaaggattctg]5’[0084]
capture oligo1
[0085]5’
ctacacgacgctcttccgatct3’[0086]
capture oligo 2
[0087]5’
ttgtcttcctaagacttttttttttttttttttttttvn3’。
[0088]
上述实验中采用的试剂及其来源如表1所示。
[0089]
表1试剂及其来源
[0090][0091]
实施例2：高分辨率大尺度空间转录组芯片实验方法
[0092]
1、样本准备：成功制备样品是空间转录组实验成功的关键，要点是尽可能不让组织中rna降解。首先，新鲜样本取材时就要记好其空间方向，而后使用pbs冲洗，除去残留血液，利用实验室用纸吸干组织表面多余的液体，防止冷冻后冰晶的形成。用预冷的镊子或刮刀将组织完全浸没于已在液氮中预冷15min的异戊烷里，直至完全冰冻(～1min)。包埋盒上需标记组织样本的方向，用冷却的oct铺平包埋盒底部(放在干冰上使其冻结)，将冰冻后的组织，放置在包埋盒中心位置，继续倒入oct完全覆盖样本组织(组织周围不要产生气泡)。立即将含有组织和oct的包埋盒放在干冰粉上，直至完全冻结(约30min以上)。将包埋盒放置到密封袋中，干冰运输。在液氮预冷的异戊烷中进行oct包埋速冻(切片前-80℃保存)，冷冻切片机切成10μm厚度组织切片，切片大小最大可以支持150
×
150mm，常规切片机的尺寸可以支持50x80mm。