一种肺癌类器官无血清专用培养基的制作方法

1.本发明涉及一种肿瘤类器官培养技术领域，尤其涉及一种肺癌类器官的无血清专用培养基和培养方法。


背景技术：

2.肺癌是中国发病数、死亡数居首位的恶性肿瘤，2015年统计数据报告新发病例73.3万例、死亡病例约61万例，是一种严重威胁人民群众健康的恶性疾病。肺癌是一种高度异质性疾病，在不同个体间、同一个体的不同病灶间、同一病灶内部不同亚群间均存在遗传表型、病理特征和临床表现的异质性，在临床上则表现为治疗反应的不确定性、预后的不确定性和诊疗方案的争议性。随着我国社会经济水平的快速发展和生物医学新技术的不断出现，对于肺癌的治疗效果、生存质量、长期预后都有了更高的要求。基于患者个体的个体化治疗和精准治疗有望更好的提高肺癌这种高度异质性疾病的诊疗效果，有效的方法之一就是在体外构建基于个体患者来源的肿瘤模型，用于测试治疗药物和方案的有效性、分析基因型与表型之间的相关性、准确模拟体内肿瘤的生物学特征，这对于个体化治疗、临床药敏检测、肿瘤研究、药物测试及新型抗肿瘤药物的高通量筛选有巨大的应用价值。
3.hans clevers团体在2019年首次建立了一种肺癌类器官的长期培养方法(sachs,n.,papaspyropoulos,a.,zomer-van ommen,d.d.,heo,i.,bottinger,l.,klay,d.,clevers,h.(2019).long-term expanding human airway organoids for disease modeling.embo j,38(4))，成功建立了18例患者来源的肺癌类器官样本库，来源于肺癌患者切除和活检肿瘤组织所建立的肺癌类器官保留了肿瘤组织病理学和肿瘤基因突变特征，可用于药物筛查、高通量药物筛选及个性化治疗。专利(公开号)cn112080471a、cn112080472a、cn112760288a、cn11259288a、cn114292816a亦公开了相似的肺癌类器官培养基的组成和相似的培养方法。然而，这些文献及专利所描述的肺癌类器官培养基组成中存在的共同点是，均包含需要单独制备的wnt条件培养基、r-spondin条件培养基或noggin条件培养基，或者需要添加wnt信号调节蛋白r-spondin或者发育调控蛋白noggin等重组蛋白，或者需要添加动物血清。因此，主要的缺点和不足在于，条件培养基的生产和制备操作复杂、每批次均需检测蛋白含量且难以控制，如购买相应的重组蛋白则价格昂贵、主要生产企业均位于国外，如添加动物血清会影响肿瘤类器官的表型从而导致错误的检测结果，这导致肺癌类器官专用培养基存在生产成本较高、主要添加成分需要进口、采购周期长且供应周期易受外部环境影响等问题。这些问题极大的阻碍了肺癌类器官的大规模培养、样本库的建立和更广范围的应用研究，因此，迫切希望开发更低成本、更易用的肺癌类器官无血清专用培养基。


技术实现要素：

4.为了解决上述问题，本发明提供了一种全新的肺癌类器官无血清专用培养基的组成和培养方法，其目的在于，提供一种无需单独制备条件培养基且无需添加昂贵重组蛋白
的肺癌类器官无血清专用培养基。
5.为实现上述目的，本发明提供的方案是这样实现的：一方面，本发明所述肺癌类器官无血清专用培养基由基础培养基和培养添加物两部分组成。基础培养基为含有1％青-链霉素、1％hepes缓冲液、1％glutamax溶液的advanced dmem/f12培养基。
6.进一步地，所述培养添加物包括生长因子fgf2、fgf7、fgf10，胰岛素，氢化可的松，小分子抑制剂y-27632、sb202190，牛垂体提取物(bpe)、b27 supplement。
7.进一步地，所述培养添加物的工作浓度为：fgf2：5-50ng/ml、fgf7：5-50ng/ml、fgf10：10-100ng/ml，胰岛素：0.5-50μg/ml，氢化可的松：50-500ng/ml，小分子抑制剂y-27632：1-10μm、sb202190：0.1-1μm，牛垂体提取物：5-50μg/ml、b27supplement：1％。
8.进一步地，所述肺癌类器官无血清专用培养基在使用时配制，按照工作浓度在已配制好的基础培养基，加入所有培养添加物，混合均匀后即可获得。
9.在本发明的另一个方面中，提供一种肺癌类器官体外培养的方法，包括以下步骤：
10.(1)将手术或活检获取的肺癌组织样本切成0.5mm
×
0.5mm大小，用10ml无菌pbs(不含ca
2
mg
2
)清洗三遍后，加入2ml基础培养基，用锋利的手术剪将肿瘤组织小块尽可能剪碎，然后加入8ml基础培养基，混匀后通过100μm孔径细胞滤网；
11.(2)将细胞滤液在500g离心5分钟后，重悬于2ml已配制好的肺癌类器官无血清专用培养基中，加入6孔细胞培养板的一个孔中，放入37℃细胞培养箱过夜；
12.(3)第二天，进行细胞团块计数后，按照8000个细胞团块/ml重悬于冷的cultrex
tm growth factor reduced bme type2中，接种于24孔细胞培养板，每孔40-60μl；
13.(4)待30分钟后含有细胞的bme固化后，每孔加入上述肺癌类器官无血清专用培养基400μl，放入5％co2浓度、37℃细胞培养箱培养，每2-3天更换一次上述肺癌类器官无血清专用培养基，7天左右即可获得所需肺癌类器官。
14.由于本发明采用的培养添加物中去除了价格昂贵的重组蛋白如wnt、r-spondin和noggin成分，无需单独制备wnt条件培养基、r-spondin条件培养基和noggin条件培养基，无需添加昂贵的动物血清，不使用胶原酶进行消化，从而可以得到以下有益效果：
15.(1)本发明所述培养基对于肺癌类器官的生长有较好的支持和促进作用，7天左右即可获得典型的肺癌类器官，在体外较好的保留了患者来源肿瘤一致性和保留异质性，为进一步进行研究应用奠定了基础；
16.(2)本发明所述培养基的成本较其他方法有明显下降，主要原因在于不需要单独制备条件培养基，并去除了价格较为昂贵的wnt信号调节蛋白r-spondin或者发育调控蛋白noggin等重组蛋白，使用其他成分替代，从而为以后进行大规模肺癌类器官培养用于药物筛选、个体化治疗等研究应用提供了可能。
17.(3)本发明所述培养方法步骤清晰简便，不需要使用胶原酶对组织进行消化，使用机械方法更好的保留肿瘤组织团块，提高肿瘤类器官培养成功率，操作人员对培养结果影响较小，提高了培养结果的一致性，为后续大规模培养提供了便利条件。
附图说明
18.以下结合附图对本发明做进一步详细描述。
19.附图1是本发明实施例中机械分离后形成的肿瘤组织团块光学显微镜下形态图；
20.附图2是本发明实施例中培养第二天的肺癌类器官光学显微镜下形态图；
21.附图3是本发明实施例中培养第六天的肺癌类器官光学显微镜下形态图；
22.附图4是本发明实施例中培养第七天的肺癌类器官光学显微镜下形态图；
23.附图5是本发明实施例中培养第八天的肺癌类器官光学显微镜下形态图。
具体实施方式
24.实施例：
25.如附图1～附图5所示，本发明的优选实施方式是，提供一种无需制备条件培养基、无需添加wnt通路调控蛋白r-spondin和发育调控蛋白noggin等重组蛋白的肺癌类器官无血清专用培养基及培养方法，所述培养基包括无血清基础培养基和培养添加物。所述基础培养基为含有1％青-链霉素、1％hepes缓冲液、1％glutamax溶液的advanced dmem/f12培养基，所述培养添加物由以下工作浓度的成分组成：fgf2：50ng/ml、fgf7：50ng/ml、fgf10：10ng/ml，胰岛素：50μg/ml，氢化可的松：500ng/ml，小分子抑制剂y-27632：10μm、sb202190：1μm，牛垂体提取物：50ng/ml、b27 supplement：1％。在使用时将所有培养添加物按照工作浓度加入所述基础培养基，即可获得所述肺癌类器官无血清专用培养基。
26.所述肺癌类器官培养方法为，将手术或活检获取的肺癌组织样本切成0.5mm
×
0.5mm大小，用10ml无菌pbs(不含ca
2
mg
2
)清洗三遍后，加入2ml基础培养基，用锋利的手术剪将肿瘤组织小块尽可能剪碎，然后加入8ml基础培养基，混匀后通过100μm孔径细胞滤网；将细胞滤液在500g离心5分钟后，重悬于2ml已配制好的肺癌类器官无血清专用培养基中，加入6孔细胞培养板的一个孔中，放入37℃细胞培养箱过夜；第二天，进行细胞团块计数后，按照8000个细胞团块/ml重悬于冷的cultrextm growth factor reduced bme type2中，接种于24孔细胞培养板，每孔40-60μl；待30分钟后含有细胞的bme固化后，每孔加入上述肺癌类器官无血清专用培养基400μl，放入5％co2浓度、37℃细胞培养箱培养，每2-3天更换一次上述肺癌类器官无血清专用培养基，7天左右即可获得所需肺癌类器官。可见所述肺癌类器官无血清专用培养基可以有效支持肺癌类器官的体外生长，且生长迅速，所形成的肺癌类器官呈现典型的三维球状或三维不规则细胞团块，为后续进一步研究提供了较好的研究样本。
27.对比例：
28.本发明的对比例采用已公开发表文献(sachs,n.,papaspyropoulos,a.,zomer-van ommen,d.d.,heo,i.,bottinger,l.,klay,d.,clevers,h.(2019).long-term expanding human airway organoids for disease modeling.embo j,38(4))中描述的方法，用基础培养基(advanced dmem/f12培养基 抗生素 10mm hepes 1％glutamax溶液)切碎、清洗肿瘤组织，气道类器官培养基(ao medium)为基础培养基中加入500ng/ml的重组蛋白r-spondin 1、100ng/ml的重组蛋白noggin、25ng/ml的fgf7、100ng/ml的fgf10、1％的b27 supplement、1.25mm的n-acetylcysteine、5mm的尼克酰胺、500nm a83-01、500nm的sb202190、5μm的y-27632。具体培养方法为，将清洗后的肿瘤组织碎片，加入10ml含1mg/ml胶原酶的气道类器官培养基在37℃摇床孵育1-2小时，通过100μm细胞过滤器，400g离心3分钟，将肿瘤细胞悬液重悬于cultrex
tm growth factor reduced bme type2中，在24孔细胞培养板每孔加40μl，等20分钟bme固化后，每孔加入气道类器官培养基400μl，放置于5％
co2、37℃细胞培养箱中，每4天换液一次，7天左右可以获得肺癌类器官，14天左右可以传代。本发明采用对比例的方法也能够获得所需肺癌类器官，所获得的肺癌类器官呈现典型的肿瘤类器官三维结构，生长良好。
29.综上，本发明所述肺癌类器官无血清专用培养基及培养方法能够有效支持肺癌类器官的体外生长，且生长迅速，所形成的肺癌类器官呈现典型的三维球状或三维不规则细胞团块，最大直径在100-200μm依然保持肿瘤类器官形态。与已公开文献与专利所述方法比较，本专利所述培养基不需要添加单独制备的条件培养基，去除了价格昂贵的重组蛋白类、动物血清等添加成分，改用其他生长因子替代，不需要胶原酶消化，从而极大地降低了专用培养基的成本，操作过程更加简便，且培养效果与已公开的方法一致。
30.以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本领域的技术人员应该了解本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都属于本发明保护的范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。