一种基因递送系统在将目的基因经静脉注射递送至肝脏的应用

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及基因递送系统在将目的基因经静脉注射递送至肝脏的应用。


背景技术：

2.肝脏是身体内以代谢功能为主的一个器官，并在身体里面扮演着去氧化、储存肝糖、分泌性蛋白质的合成等角色，是人体内脏里最大的器官，也是人体消化系统中最大的消化腺。此外，肝脏在天然代谢毒素降解方面起着重要作用，如氨和胆红素的降解。许多遗传性代谢紊乱(imd)起源于肝脏。肝脏调节的关键代谢途径的破坏可导致有毒产物的积累和随后的肝损伤，或导致正常代谢功能的关键蛋白质产生不当或不足，二者都可能产生一系列有害影响。今天，已报道的与肝脏相关的罕见单基因疾病超过400种(kattenhorn et al,2016,human gene therapy)。
3.治疗肝脏相关单基因疾病(包括imd)的理想目标是逆转致病基因的表达。从上世纪五十年代初关于苯丙酮尿症饮食控制的第一份报告开始，对相关病患的治疗取得了实质性的进展。与肝脏相关的单基因疾病特别适合基因治疗，因为这些疾病的性质及相关机制的研究进展，使得递送效果稳健且通过临床验证的生物标志基因成为可能。然而，通过静脉注射病毒载体药物容易产生抗体，不适合多次治疗，且高剂量病毒容易产生毒性。因此，有必要开发不同类型的且高效靶向肝脏的病毒载体。
4.鉴于此，本发明提供一种基因递送系统在将目的基因经静脉注射递送至肝脏的应用，以解决直接静脉注射病毒载体药物的方法不适合多次治疗和容易产生毒性的问题。


技术实现要素：

5.为了解决现有技术中直接静脉注射病毒载体药物的方法不适合多次治疗和容易产生毒性的问题，本发明提供了一种基因递送系统在将目的基因经静脉注射递送至肝脏的应用。
6.该基因递送系统在将目的基因经静脉注射递送至肝脏的应用，其中，所述基因递送系统包含腺相关病毒载体raav11，所述腺相关病毒载体raav11中还包含编码标记蛋白的基因和启动子。
7.进一步地，所述标记蛋白选自荧光蛋白和/或酶反应显色蛋白，所述荧光蛋白选自bfp、cfp、gfp、yfp、rfp、irfp、cerulean、venus、egfp、ecfp、eyfp、ebfp、dsred、dtomato、tdtomato、mcherry、mkate、mapple、mbanana、mcitrine、morange、mplum、tagrfp和tagbfp中的一种或多种，所述酶反应显色蛋白选自hrp、firefly luciferase和renilla luciferase中的一种或多种。
8.进一步地，所述启动子选自cag、cmv、tbg、lp1b、hubc、ef1α、nef、hsyn、camkiiα、vgat、thy1、tre、uas、gfap、gfaabc1d、th、rpe65、tre、cba、pgk、e-sare、c-fos、ram、sst、pv、
mdlx、npy、cr、tcap、sfrp2、chat、tph2、mth、gad67、gfap104、cd68、nestin、mbp、trpv1、l7/pcp2、moxt、rk、hgrk1、car、grm6、roh、nrl、mck、dmck和tmck中的一种或多种。
9.本发明的一个目的是提供一种腺相关病毒载体的在肝脏中表达目的蛋白或功能性rna的应用，或者在制备在肝脏中表达目的蛋白或功能性rna的试剂中的应用，其中，所述腺相关病毒载体为raav11，所述腺相关病毒载体中还包含编码目的蛋白或功能性rna的基因和启动子。
10.进一步地，所述目的蛋白选自标记蛋白和/或活性蛋白，所述活性蛋白选自激活神经元蛋白、抑制神经元蛋白、钙离子信号探针蛋白、小分子信号探针蛋白、介导凋亡蛋白、疾病相关突变蛋白、生理条件下的正常蛋白、细胞因子、抗病毒因子、病毒感染辅助受体、重组酶和基因编辑工具蛋白中一种或多种，所述功能性rna选自小rna、小干扰rna、小发卡rna、小向导rna、细胞器定位rna和用于rna测序或原位杂交分析的barcode rna中的一种或多种。
11.本发明的一个目的是提供一种在肝脏中表达目的蛋白或功能性rna的方法，所述方法包括将腺相关病毒载体注射小鼠尾静脉，
12.其中，所述腺相关病毒载体为raav11，所述腺相关病毒载体中还包含编码目的蛋白或功能性rna的基因和启动子。
13.进一步地，所述目的蛋白选自标记蛋白和/或活性蛋白，所述活性蛋白选自激活神经元蛋白、抑制神经元蛋白、钙离子信号探针蛋白、小分子信号探针蛋白、介导凋亡蛋白、疾病相关突变蛋白、生理条件下的正常蛋白、细胞因子、抗病毒因子、病毒感染辅助受体、重组酶和基因编辑工具蛋白中的一种或多种，所述功能性rna选自小rna、小干扰rna、小发卡rna、小向导rna、细胞器定位rna和用于rna测序或原位杂交分析的barcode rna中的一种或多种。
14.本发明的一个目的是提供一种腺相关病毒载体在制备治疗肝脏细胞异常导致的疾病的药物中的应用，所述腺相关病毒载体为raav11，所述腺相关病毒载体中还包含编码治疗用蛋白或功能性rna的基因和启动子。
15.进一步地，所述目的蛋白选自标记蛋白和/或活性蛋白，所述活性蛋白选自激活神经元蛋白、抑制神经元蛋白、生理条件下的正常蛋白、细胞因子、抗病毒因子和基因编辑工具蛋白中的一种或多种，所述功能性rna选自小rna、小干扰rna、小发卡rna和小向导rna中的一种或多种。
16.本发明发现了腺相关病毒raav11载体的新用途，raav11载体能够高效靶向肝脏，表达效率高，在显微镜下就能观察到明显的荧光信号，靶向效率可信度高。基于此，raav11载体可以携带目的基因用于肝脏相关疾病造模，也可以作为基因治疗的载体。
附图说明
17.图1为c57bl/6j小鼠尾静脉注射raav11-cmv-egfp-wpre-hgh polya病毒载体后，肝脏切片成像结果。
18.图2为c57bl/6j小鼠尾静脉注射raav11-tbg-egfp-wpre-hgh polya病毒载体后，肝脏切片成像结果。
19.图3为c57bl/6j小鼠尾静脉注射raav11-lp1b-egfp-wpre-hgh polya病毒载体后，
肝脏切片成像结果。
具体实施方式
20.为了使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
21.本发明利用raav11作为基因转移载体将目的基因递送到肝脏，能够在荧光显微镜下观察到明显的荧光表达，为肝脏相关基础研究、疾病模型建立和基因治疗等提供了更好的工具和技术支撑，具有广泛的应用价值和市场前景。
22.一、重组腺相关病毒的制备
23.病毒包装方法参考aav11 permits efficient retrograde targeting of projection neurons，han et al.biorxiv 2022.01.13.476170；doi:https://doi.org/10.1101/2022.01.13.476170，采用三质粒包装系统包装腺相关病毒方法，将装载核心元件的质粒paav-cmv-egfp-wpre-hgh polya、paav-tbg-egfp-wpre-hgh polya、paav-lp1b-egfp-wpre-hgh polya(均获自布林凯斯(深圳)生物技术有限公司)分别与paav-rc2/11血清型aav衣壳质粒、腺病毒元件辅助质粒pad-helper按质粒分子数1：1：1共转染hek-293t细胞，转染72小时后分别收集上清和细胞沉淀，用碘克沙醇密度梯度离心法进行浓缩和纯化，最后用sybr green qpcr法检测重组腺相关病毒滴度，最终获得raav11-cmv-egfp-wpre-hgh polya病毒的滴度为1.0
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vg/ml，raav11-tbg-egfp-wpre-hgh polya病毒的滴度为2.8
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vg/ml，raav11-lp1b-egfp-wpre-hgh polya病毒的滴度为1.2
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vg/ml。
24.二、重组腺相关病毒的活体应用
25.将制备的raav11-cmv-egfp-wpre-hgh polya、raav11-tbg-egfp-wpre-hgh polya、raav11-lp1b-egfp-wpre-hgh polya病毒分别经尾静脉注射至8-10周龄c57bl/6j小鼠(购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司)，每只小鼠注射剂量为5
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vg，3周后灌流取肝脏组织，小鼠肝脏经depc(焦碳酸二乙酯)处理过的pfa(多聚甲醛)溶液固定4小时后再用depc处理过的30％蔗糖-pbs溶液脱水48小时，将脱水后的肝脏用组织包埋剂充分包埋并用冰冻切片机切成40μm厚度的切片。贴片并使用玻片扫描仪显微镜对其进行成像。活体检测结果可以看出，在肝脏细胞可见raav11病毒标记的绿色荧光信号，表明11型重组腺相关病毒可以高效转导肝脏递送外源基因。