一种NMNH的纯化工艺的制作方法

一种nmnh的纯化工艺
技术领域
1.本发明属于化工领域，更具体地涉及一种高纯nmnh的纯化工艺。


背景技术：

2.nmnh是还原烟酰胺腺单核苷酸(β-nicotinamide mononucleotide,reduced form,disodium salt)的缩写，是一种自然存在的生物活性还原性核苷酸。因烟酰胺属于维生素b3，因此nmn属于维生素b族衍生物范畴，其广泛参与人体多项生化反应，与免疫、代谢息息相关。
3.人体内固有的物质，也富含在一些水果和蔬菜中。在人体中nmnh是nad 最直接的前体，其功能是通过nad 体现。nad 又叫辅酶ⅰ，全称烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，存在每一个细胞中参与上千项反应。在多种细胞代谢反应中，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)分子都扮演着重要角色，是细胞保持活力的重要支撑。
4.目前市场尚未有企业大批量的生产nmnh，主要都是一些实验室合成的nmnh作为研发使用；合成数量少，成本高以及使用有机试剂等生产工艺；本工艺使用离子树脂生产的nmnh，有着以下优点：
5.1)生产绿色环保，所使用的都是可食用、无毒害的无机盐；2)生产成本低，所使用的溶剂都是水溶液，成本低，不需要回收；3)生产工艺易放大，本工艺使用离子树脂不受设备及工艺的影响，易快速放大。
6.总结而言，本nmnh生产工艺绿色环保、简单、易放大等特点，且生产的nmnh成本低，有利于市场的竞争。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种nmnh的纯化工艺。
8.本发明所采取的技术方案是：
9.本技术提供一种nmnh的分离提纯工艺，包括以下步骤：
10.(1)、将nmnh粗产物进行过滤；
11.(2)、将步骤(1)过滤后的产物上阴离子树脂柱，上样完成后依次用杂质洗脱剂、洗脱nmnh的洗脱剂淋洗离子柱，得洗脱液；
12.(3)、步骤(2)的洗脱液经浓缩、干燥处理后即得纯化后的nmnh。
13.在本发明的一些实施方式中，在步骤(1)之前，将nmnh粗产物的ph值调至7.0-11.0。
14.在本发明的一些实施方式中，步骤(1)中所述过滤具体为：离心、微滤或超滤。
15.在本发明的一些实施方式中，所述离心转速为2000-4000r/min。
16.在本发明的一些实施方式中，所述微滤膜孔径为0.2-0.45μm。
17.在本发明的一些实施方式中，所述超滤膜孔径为5-10kd。
18.在本发明的一些实施方式中，所述超滤膜为孔径卷式膜或中空纤维膜。
19.在本发明的一些实施方式中，所述工艺中还包括对所述阴离子交换树脂的预处理步骤：用ph＝8.5
±
0.5的氢氧化钠溶液平衡2.0-3.0bv阴离子树脂。
20.在本发明的一些实施方式中，所述的阴离子树脂有效官能团可以是伯氨、季氨、叔氨等官能团，更优选的是有效官能团为季氨官能团。
21.在本发明的一些实施方式中，所述树脂填料和nmnh的质量比为20-35:1。
22.在本发明的一些实施方式中，所述层析柱的径高比为1：6-10。
23.在本发明的一些实施方式中，所述上样速度为0.8-1.5bv/h；上样后用纯水淋洗约3bv。
24.在本发明的一些实施方式中，所述杂质洗脱剂为0.01-0.1mol/l的氯化钠、氯化钾、氯化铵等一价盐；优选为氯化钠。
25.在本发明的一些实施方式中，所述杂质洗脱剂淋洗1.0-4.0bv；用于洗涤nmn及降解杂质。
26.在本发明的一些实施方式中，所述洗脱nmnh的洗脱剂为0.1-0.5mol/l乙酸钠、氯化铵、氯化钠、氯化钾等一价盐，优选为乙酸钠。
27.在本发明的一些实施方式中，用洗脱nmnh的洗脱剂洗脱nmnh，收集洗脱液，经检测≥98％的馏分作为合格。
28.在本发明的一些实施方式中，所述工艺还包括将所述阴离子交换树脂再生的步骤，具体为依次再生液i和再生液ii进行阴离子交换树脂再生。
29.在本发明的一些实施方式中，所述再生液i为0.5-3.0mol/l的氢氧化钠氢氧化钾、氢氧化锂溶液，再生体积为2.0-4.0bv。
30.在本发明的一些实施方式中，所述再生液ii为0.5-3.0mol/l的氯化钠、氯化铵或氯化钾溶液，再生体积为2.0-4.0bv。
31.在本发明的一些实施方式中，再生过程先用0.5-3.0mol/l的氢氧化钠淋洗2.0-4.0bv，淋洗完后用纯水淋洗至ph≤10.0，再用0.5-3.0mol/l的氯化钠溶液淋洗2.0-4.0bv，用纯水淋洗至ph≤9.0。
32.在本发明的一些实施方式中，所述浓缩处理依次包括微流、超滤和纳滤。
33.在本发明的一些实施方式中，所述微滤时的微滤膜孔径为0.2-0.45μm；所述超滤时的超滤膜的孔径为5-10kd，所述纳滤时的纳滤膜的孔径为100-300dal。
34.在本发明的一些实施方式中，所述微滤膜为中空纤维膜；所述超滤膜为孔径卷式膜或中空纤维膜。
35.在本发明的一些实施方式中，浓缩后的nmnh浓度为100-250g/l，优选为100-200g/l，该浓度范围利于冻干。
36.在本发明的一些实施方式中，所述干燥处理为真空冷冻干燥。该干燥方式使nmnh在干燥的过程中不易降解。
37.在本发明的一些实施方式中，纳滤浓缩后洗涤3-6次洗涤，用于将纯化过程中的低分子试剂去除。
38.本发明的有益效果是：
39.本技术使用阴离子树脂对nmnh进行纯化，工艺简单，该纯化方法的收率可达75％以上，纯化后的nmnh纯度可达98％以上，保证其在工业生产上可快速放大，市场竞争有力；
而且本技术使用阴离子树的离子交换的方法，减少有机试剂的使用，使用本工艺后，所得到的产品无有机试剂残留，且整个生产过程都不需要使用大型设备和有机试剂，投入较低，无重污染，绿色环保。
附图说明
40.图1为实施例1中nmnh酶促反应前nmn的高效液谱图。
41.图2为实施例1中nmnh酶促反应后的高效液谱图。
42.图3为实施例2中nmnh阴离子树脂纯化后的高效液相谱图。
43.图4为实施例2中nmnh冻干后的高效液谱图。
具体实施方式
44.以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
45.实施例1
46.nmnh反应液(nmnh粗产物)的制备方法如下：
47.向100l的反应釜中加入1.4kg的nmn、0.4kg的甲酸、1.0kg的tris-hcl缓冲液的底物溶液，用1.0mol/l的盐酸调节ph至7.0～8.0。然后加入催化酶，添加量分别为：5.0ml/l(粗酶液/底物溶液)的突变体v54n/a121k/e228k的上清粗酶液，定容至60l，搅拌速度设置为150rpm，反应温度控制在30℃，ph保持在7.0～8.0。反应过程用6.0mol/l的氢氧化钠溶液控制ph在7-8，反应4小时后，得到含粗品的溶液，通过hplc检测反应前底物溶液和反应后反应液1.2kg，其中酶促反应前nmn的高效液谱图见图1，酶促反应后nmnh的高效液谱图见图2。
48.其中所用催化酶为甲酸脱氢酶，详见专利文献cn114752572a，其他实施例同理。
49.采用获得的nmnh反应液进行纯化实验：
50.nmnh反应液60l，其中含nmnh 1.2kg，纯度为93.5％，ph＝7.49，用6.0mol/l的氢氧化钠调ph至9.15，经过离心得到60l清液含1.19kgnmnh，离心机转速为3000r/min；将澄清的nmnh溶液用1支微滤膜微滤，微滤膜的孔径为0.2um尺寸为100mm*1100mm，微滤后得到80l的微滤后nmnh溶液1.19kg，再将微滤后的溶液经过1支膜超滤，超滤膜的截留分子量为5kd，尺寸为100mm*1100mm、超滤后得到100l的溶液含1.18kgnmnh。
51.纯化柱的直径*高为200mm*1500mm，装填阴离子树脂35kg。先用ph＝8.4的氢氧化钠溶液平衡100l。将超滤后的160l的nmnh溶液上纯化柱，全过程中控制速度为1.0bv/h。nmnh溶液上完后用0.05mol/l的氯化钠洗杂质120l，再用0.2mol/l的乙酸钠洗涤得到合格体积为130l含0.95kg的nmnh，经检测纯度99.3％，阴离子树脂纯化后的高效液相谱图见图3；经过孔径0.2μm微滤、截留分子量为5kd的超滤、纳滤洗涤5次后浓缩得到8l的浓缩液，纳滤膜为截留分子量100dal的2540纳滤膜，浓缩液的nmnh为0.94kg，纯度为99.2％；将得到的浓缩液降温至-45℃以下，保持-45℃以下2-4小时；抽真空，真空压力≤50pa时，按照2℃/h速率升温，直至产品升温至25℃，恒温保持6-8小时；直至真空压力5min中变化≤3.0pa时冻干完成；经过冷冻干燥得到0.93kg的nmnh，纯度为99.0％，收率为77.5％，冻干后的高效液
相谱图见图4。
52.纯化柱的再生用0.8mol/l的氢氧化钠溶液淋洗4.0bv，淋洗完后用纯水淋洗至ph＝9.8，再用1.0mol/l的氯化钠溶液离心3.0bv，淋洗完后用纯水淋洗至流穿液ph＝9.0，备用。
53.实施例2
54.nmnh反应液(nmnh粗产物)的制备方法如下：
55.向1000l的反应釜中加入500l纯水，并依次加入16kg的nmn、4.6kg的甲酸、11.4kg的tris-hcl缓冲液的底物溶液，用1.0mol/l的盐酸调节ph至7.0～8.0。然后加入催化酶，添加量分别为：5.0ml/l(粗酶液/底物溶液)的突变体v54n/a121k/e228k的上清粗酶液，定容至600l，搅拌速度设置为150rpm，反应温度控制在30℃，ph保持在7.0～8.0。反应过程用6.0mol/l的氢氧化钠溶液控制ph在7-8，反应4小时后，得到含粗品的溶液，通过hplc检测反应前底物溶液和反应后反应液14.3kg。纯度为93.5％，ph＝7.65，用6.0mol/l的氢氧化钠调ph至9.35，经过离心得到600l清液含14.1kgnmnh，离心机转速为3000r/min；将澄清的nmnh溶液用4支微滤膜微滤，微滤膜的孔径为0.2um尺寸为100mm*1100mm，微滤后得到700l的微滤后nmnh溶液14.1kg，再将微滤后的溶液经过4膜超滤，超滤膜的截留分子量为5kd，尺寸为100mm*1100mm、超滤后得到900l的溶液含14.0kgnmnh。
56.纯化柱的直径*高为500mm*2500mm，装填阴离子树脂400kg。先用ph＝8.6的氢氧化钠溶液平衡2.0bv。将超滤后的1500l的nmnh溶液上纯化柱，全过程中控制速度为1.5bv/h。nmnh溶液上完后用0.05mol/l的氯化钠洗杂质2.5bv，再用0.2mol/l的乙酸钠洗涤得到合格体积为1800l含12.3kg的nmnh，经检测纯度99.0％；经过孔径0.2μm微滤、截留分子量为5kd的超滤、纳滤洗涤5次后浓缩得到72l的浓缩液，纳滤膜为截留分子量100dal的8040纳滤膜，浓缩液的nmnh为12.1kg，纯度为99.0％；将得到的浓缩液降温至-45℃以下，保持-45℃以下2-4小时；抽真空，真空压力≤50pa时，按照2℃/h速率升温，直至产品升温至25℃，恒温保持6-8小时；直至真空压力5min中变化≤3.0pa时冻干完成；经过冷冻干燥得到11.9kg的nmnh，纯度为99.0％，收率为83.2％。
57.纯化柱的再生用1.5mol/l的氢氧化钠溶液淋洗3.0bv，淋洗完后用纯水淋洗至ph＝9.5，再用1.0mol/l的氯化钠溶液离心2.0bv，淋洗完后用纯水淋洗至流穿液ph＝9.0，备用。
58.实施例3
59.nmnh反应液(nmnh粗产物)的制备方法如下：
60.向1000l的反应釜中加入500l纯水，并依次加入16kg的nmn、4.6kg的甲酸、11.4kg的tris-hcl缓冲液的底物溶液，用1.0mol/l的盐酸调节ph至7.0～8.0。然后加入催化酶，添加量分别为：5.0ml/l(粗酶液/底物溶液)的突变体v54n/a121k/e228k的上清粗酶液，定容至600l，搅拌速度设置为150rpm，反应温度控制在30℃，ph保持在7.0～8.0。反应过程用6.0mol/l的氢氧化钠溶液控制ph在7-8，反应4小时后，得到含粗品的溶液，通过hplc检测反应前底物溶液和反应后反应液14.5kg，纯度为94.5％，ph＝7.45，用6.0mol/l的氢氧化钠调ph至9.35，经过离心得到600l清液含14.4kgnmnh，离心机转速为3000r/min；将澄清的nmnh溶液用4支微滤膜微滤，微滤膜的孔径为0.2um尺寸为100mm*1100mm，微滤后得到700l的微滤后nmnh溶液14.3kg，再将微滤后的溶液经过4膜超滤，超滤膜的截留分子量为5kd，尺寸为
100mm*1100mm、超滤后得到900l的溶液含14.3kgnmnh。
61.纯化柱的直径*高为500mm*2500mm，装填阴离子树脂400kg。先用ph＝8.3的氢氧化钠溶液平衡1000l。将超滤后的1500l的nmnh溶液上纯化柱，全过程中控制速度为500l/h。nmnh溶液上完后用0.05mol/l的氯化钠洗杂质1500l，再用0.3mol/l的乙酸钠洗涤得到合格体积为2000l含12.6kg的nmnh，经检测纯度99.6％；经过孔径0.2μm微滤、截留分子量为5kd的超滤、纳滤洗涤5次后浓缩得到69l的浓缩液，纳滤膜为截留分子量100dal的8040纳滤膜，浓缩液的nmnh为12.5kg，纯度为99.0％；将得到的浓缩液降温至-45℃以下，保持-45℃以下2-4小时；抽真空，真空压力≤50pa时，按照2℃/h速率升温，直至产品升温至25℃，恒温保持6-8小时；直至真空压力5min中变化≤3.0pa时冻干完成；经过冷冻干燥得到12.3kg的nmnh，纯度为99.0％，收率为84.8％。
62.纯化柱的再生用1.5mol/l的氢氧化钠溶液淋洗3.0bv，淋洗完后用纯水淋洗至ph＝9.5，再用1.0mol/l的氯化钠溶液离心2.0bv，淋洗完后用纯水淋洗至流穿液ph＝9.0，备用。
63.实施例4
64.nmnh反应液(nmnh粗产物)的制备方法如下：
65.向1000l的反应釜中加入500l纯水，并依次加入16kg的nmn、4.6kg的甲酸、11.4kg的tris-hcl缓冲液的底物溶液，用1.0mol/l的盐酸调节ph至7.0～8.0。然后加入催化酶，添加量分别为：5.0ml/l(粗酶液/底物溶液)的突变体v54n/a121k/e228k的上清粗酶液，定容至600l，搅拌速度设置为150rpm，反应温度控制在30℃，ph保持在7.0～8.0。反应过程用6.0mol/l的氢氧化钠溶液控制ph在7-8，反应4小时后，得到含粗品的溶液，通过hplc检测反应前底物溶液和反应后反应液14.1kg。纯度为90.3％，ph＝7.75，用6.0mol/l的氢氧化钠调ph至9.45，经过离心得到1150l清液含14.0kgnmnh，离心机转速为3000r/min；将澄清的nmnh溶液用4支微滤膜微滤，微滤膜的孔径为0.2um尺寸为100mm*1100mm，微滤后得到700l的微滤后nmnh溶液14.0kg，再将微滤后的溶液经过4膜超滤，超滤膜的截留分子量为5kd，尺寸为100mm*1100mm、超滤后得到900l的溶液含14.0kgnmnh。
66.纯化柱的直径*高为500mm*2500mm，装填阴离子树脂400kg。先用ph＝8.6的氢氧化钠溶液平衡1000l。将超滤后的1500l的nmnh溶液上纯化柱，全过程中控制速度为2.5bv/h。nmnh溶液上完后用0.05mol/l的氯化钾洗杂质1100l，再用0.4mol/l的氯化钠洗涤得到合格体积为1600l含11.5kg的nmnh，经检测纯度98.6％；经过孔径0.2μm微滤、截留分子量为5kd的超滤、、纳滤洗涤5次后浓缩得到65l的浓缩液，纳滤膜为截留分子量100da的8040纳滤膜，浓缩液的nmnh为11.5kg，纯度为98.6％；将得到的浓缩液降温至-45℃以下，保持-45℃以下2-4小时；抽真空，真空压力≤50pa时，按照2℃/h速率升温，直至产品升温至25℃，恒温保持6-8小时；直至真空压力5min中变化≤3.0pa时冻干完成；经过冷冻干燥得到11.3kg的nmnh，纯度为98.5％，收率为80.1％。
67.纯化柱的再生用1.5mol/l的氢氧化钠溶液淋洗2.0bv，淋洗完后用纯水淋洗至ph＝9.5，再用1.0mol/l的氯化钠溶液离心2.0bv，淋洗完后用纯水淋洗至流穿液ph＝9.0，备用。
68.上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出
各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。