水稻ALS突变型基因及其蛋白在抗除草剂方面的应用

水稻als突变型基因及其蛋白在抗除草剂方面的应用
技术领域
1.本发明属于植物蛋白和植物抗除草剂领域。具体而言，本发明涉及als突变蛋白，该突变蛋白能赋予植物尤其水稻抗除草剂的特性。本发明公开了该基因序列和突变蛋白的序列，以及它们在植物尤其水稻抗除草剂领域中的应用。


背景技术：

2.杂草由于具有很强的竞争力，与农作物争肥、争水、争光，严重威胁作物生产，导致作物大幅减产。其中杂草稻生长快、竞争力强，影响栽培稻的正常生长，不仅导致大幅度减产，还影响稻米品质，引发病虫害。杂草稻与栽培稻属于稻属的同一亚种，农艺性状非常相似，区分拔除非常困难，无良好的除草剂进行清除，只能通过人工清除，但近年来务农人员不断减少和人员工资的上涨，清除稻田中的杂草稻的成本越来越高，这些致使杂草稻危害越来越严重，尤其限制直播水稻的发展。
3.常规的除草剂利用杂草与水稻在茎叶或根系对除草剂的吸收和传导的差异性产生的选择性，或利用体内发生的生物化学反应不同，或活化使除草剂杀草活性增加，或降解使除草剂失去活性等差异进行清除杂草。杂草稻与栽培稻属于稻属，不仅农艺性状非常相似，各种代谢途径也非常相似，常规除草剂难以发挥良好的除草效果。如果通过某些基因或蛋白质的突变，改变植物机体代谢途径发生改变，开发对除草剂具有抗性(耐受性)的新种质，在通过抗除草剂水稻种植和除草剂配合使用，有效灭除田间杂草。但很多除草剂作用机理尚未完全清楚，很难提前预测具体氨基酸位点的突变是否会产生除草剂抗性，只能依赖于科研人员长期、艰苦的实践探索，并凭借一些运气才可能发现新的除草剂抗性位点。本发明是长期经过大量的实践和研究发现在同一个植株具有两个基因突变位点，在18倍大田常规浓度(2333g ai/ha)茎叶处理，产量、株高等农艺性状没有显著变化。


技术实现要素：

4.本发明通过研究发现水稻als突变基因，由此完成本发明。
5.本发明首先提供一种水稻als突变蛋白，其特征在于，所述als突变蛋白是野生型als蛋白的氨基酸序列第603位的亮氨酸变为苯丙氨酸，同时第627位的丝氨酸变为天冬酰胺，其氨基酸列如seq id no:2所示。
6.本发明因而提供所述的als突变蛋白的编码基因，优选地其核苷酸序列如seq id no:1所示。
7.进一步本发明提供含有所述的编码基因的表达盒、重组载体或重组细胞。
8.本发明还提供所述的als突变蛋白或其编码基因，所述的表达盒、重组载体或重组细胞在培育抗除草剂的植物中的应用，所述除草剂为咪唑啉酮类。
9.优选地，所述植物为小麦、烟草、拟南芥、水稻、玉米或高粱。
10.本发明进一步提供获得对除草剂抗性的植物的方法，其特征在于，包括如下步骤：通过导入包含所述的编码基因获得转基因植物，且所述转基因植物中表达出所编码的als
突变蛋白。
11.任选地，还包括杂交、回交或无性繁殖步骤获得纯合的对除草剂抗性的植物。
12.具体实施方式中，所述除草剂为咪唑啉酮类。优选地，所述植物为小麦、烟草、拟南芥、水稻、玉米或高粱。
13.本技术提供的als突变蛋白的其第603位的亮氨酸变为苯丙氨酸，第627位的丝氨酸变为天冬酰胺，通过试验表明，该突变可以使得突变体水稻具有抗除草剂活性，能够耐受18倍大田常规浓度(2333g ai/ha)的甲咪唑烟酸。
附图说明
14.图1筛选出抗除草剂水稻突变体植株；
15.图2各处理的水稻长势，其中各图上的数值编号代表不同的处理编号。
具体实施方式
16.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购获得的常规产品。
17.实施例1：水稻富源4号抗咪唑啉酮类除草剂突变体获取过程
18.将常规水稻富源4号，用清水浸泡2小时，再用1.0％(w/w)甲磺酸乙酯(ems)室温下浸泡8-10小时，期间每1小时摇动一次种子；弃去ems溶液，用清水翻动浸泡种子5次，每次5分钟，然后用清水冲洗种子过夜，次日进行田间播种，并进行常规肥水管理。植株成熟后，按地块种子混收、晾干，过冬保存。次年播种田间。待水稻幼苗长至3-4叶期时，喷施甲咪唑烟酸2ml/1l，30天后还呈正常绿色植株即为抗咪唑啉酮类除草剂的粳稻突变植株(如图1)。种子成熟后，单株收种、晾干，过冬保存。筛选出的抗除草剂水稻在t3继续复筛，获得稳定的抗除草剂水稻。
19.选择长势好的抗除草剂植株作为父本与富源4号(野生型)为母本杂交，选择抗性植株作父本，继续与富源4号(野生型)母本杂交，连续回交3代，将其他突变位点置换成野生型，选出遗传稳定，丰产性好的杂交植株，命名易稻1。
20.2020年区域试验表明，易稻1较对照富源4号增产4.7％；2021年区域试验，较对照富源4号增产4.17％，表明抗除草剂水稻易稻1增产极显著。
21.实施例2突变位点分析
22.用ctab法提取抗除草剂水稻易稻1植株的水稻叶片基因组。以提取的基因组dna为模板,引物f：catcgctactggtgttgggc，r：aggattaccatgccaagcacat，进行pcr扩增。pcr体系为dna模板(20ngμl
–1)2μl,10
×
pcr buffer 2μl,mgcl2(5mmol l
–1)2μl,dntp(2mmol l
–1)2μl,上游引物(2μmol l
–1)1μl,下游引物(2μmoll
–1)1μl,taq dna聚合酶(5uμl
–1)0.2μl,ddh 2o11.8μl。扩增条件为95℃5min；95℃20s,58℃20s,72℃60s,35个循环；72℃延伸10min,结束反应。
23.将上述pcr产物测序，获得水稻突变体基因序列。测序比对结果显示，相对于野生型，在水稻的als基因序列的第1807位和第1880位同时突变，第1807位核苷酸由胞嘧啶c突
变成胸腺嘧啶t，第1880位核苷酸由鸟嘌呤g突变成腺嘌呤a。其蛋白序列在leu603位和ser627位同时发生点发生突变。其第603位的亮氨酸变为苯丙氨酸，第627位的丝氨酸变为天冬酰胺，核苷酸序列如seq id no:1所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no:2所示。
24.实施例3、水稻耐als抑制剂类除草剂抗性鉴定试验
25.一、材料：易稻1。
26.二、试验地点：平罗县、贺兰县、永宁县。试验设计：试验共设置3个点(平罗县、贺兰县、永宁县)，采用完全随机区组设计，旱直播方式，小区面积20m2，20cm行距，区间40cm，重复间走道50cm。
27.田间杂草种类，永宁：稗草、杂草稻，贺兰：三棱草、杂草稻，平罗：稗草、杂草稻。
28.三、播种情况
29.各地播种情况见表1。
30.表1各地播种情况
[0031][0032]
四、处理
[0033]
1、甲咪唑烟酸130g ai/ha封闭 甲咪唑烟酸130g ai/ha茎叶喷药
[0034]
2、仲丁灵1800g ai/ha封闭 甲咪唑烟酸130g ai/ha茎叶喷药
[0035]
3、(1倍)甲咪唑烟酸130g ai/ha茎叶喷药
[0036]
4、(3倍)甲咪唑烟酸389g ai/ha)茎叶喷药
[0037]
5、(9倍)甲咪唑烟酸1166g ai/ha茎叶喷药
[0038]
6、(18倍)甲咪唑烟酸2333g ai/ha茎叶喷药
[0039]
7、0倍
[0040]
8、人工除草
[0041]
9、甲咪唑烟酸130g ai/ha茎叶喷药 吡嘧.丙草胺5g
[0042]
10、甲咪唑烟酸130g ai/ha茎叶喷药 吡嘧.苯噻酰5g
[0043]
五、试验结果
[0044]
各处理的田块如图2所示。
[0045]
其中，没有喷施除草剂的处理(7)较人工除草的处理减产40％，其他喷施除草剂处理都较人工除草的处理增产(表2)。
[0046]
用仲丁灵进行封闭后再用1倍浓度甲咪唑烟酸进行叶面喷施，增产幅度最高，较人工除草增产24.48％。
[0047]
用甲咪唑烟酸行封闭后再用1倍浓度甲咪唑烟酸进行叶面喷施，较人工除草增产23.3％；茎叶喷施9倍，较人工除草增产22.46％；茎叶喷施3倍，较人工除草增产21％；茎叶喷施18倍，较人工除草增产20％。
[0048]
茎叶喷施1倍加丙草胺泡腾剂较人工除草增产19％；茎叶喷施9倍较人工除草增产
14％。
[0049]
1倍浓度甲咪唑烟酸茎叶喷施，茎叶喷施1倍加苯噻酰泡腾剂较人工除草增产12％。
[0050]
各处理产量经过方差分析，没有喷施除草剂的处理产量最低，与其他处理具有极显著的差异，其他处理产量没有显著差距(表3)。各处理株高和穗长方差分析显示株高和穗长没有显著的差异(表4-6)。
[0051]
表2各处理在不同地区小区产量
[0052][0053]
表3不同处理产量显著性比较
[0054][0055]
表4不同处理产量方差分析表
[0056][0057]
表5不同处理株高显著性比较
[0058][0059]
表6不同处理穗长显著性比较
[0060][0061]
甲咪唑烟酸可以有效杀死田间杂草，代替人工除草。甲咪唑烟酸可以用于封闭剂也可以用于茎叶处理。易稻1用甲咪唑烟酸1倍、3倍、9倍和18倍茎叶处理后对植株无影响，在草害严重地区浓度越高，产量越高。甲咪唑烟酸对易稻1主要农艺性状影响非常小，有助于提高产量。