一种nk细胞的培养及冻存方法
技术领域
1.本发明涉及细胞培养及冻存技术领域，具体为一种nk细胞的培养及冻存方法。
背景技术：
2.肿瘤细胞免疫治疗技术作为一种新兴的肿瘤治疗手段，具有杀瘤识别谱广、抗癌杀伤力高、毒副作用小等特点。自然杀伤细胞(nk)通过自身表面活化性受体与肿瘤细胞表面配体之间的作用，可不受mhc分子的限制，进而识别mhc-i类分子表达下调或缺失的肿瘤细胞并发挥杀伤功能。由于nk细胞在外周血中占有较小的比例，占淋巴细胞的5％～15％，并且肿瘤患者体内nk细胞的功能存在不同程度的缺失，难以产生良好抗肿瘤效果，需要通过体外培养增加nk细胞的数量和改善nk细胞的功能。由于不能确保体外培养与临床使用时间节点的完全统一，为了避免长时间的培养而增加的成本、培养时间超过最佳对数生长期后细胞的生长状态及活性的下降而影响细胞的治疗质量，保存培养后的nk细胞也成了必要的方法之一。
3.目前，常使用程控降温的方法对nk细胞进行冻存，但是程控降温操作繁琐。虽然-80℃直接冻存更受欢迎，但是该方法对nk细胞的冻存损伤较大，复苏率和复苏后的杀伤活性都会明显降低，应用受到局限。
4.现有(公开号为：cn105211051a)的专利公开了一种培养后的nk细胞的冻存液及其制备方法，请求保护一种培养后的nk细胞的冻存液，所述冻存液由溶液a和自体血清配制而成，溶液a和自体血清的体积比为1：0.5～2，其中：溶液a由自体血清混合液与dmso配制而成，自体血清混合液与dmso的体积比为3～6：1；自体血清混合液包括茶多酚、葡萄籽提取物、维生素c和自体血清，该细胞的冻存液中茶多酚、葡萄籽提取物、维生素c的终浓度分别为0.5～5mg/ml、0.125～0.5mg/ml、0.5～5mg/ml。但是，该冻存液成分较为复杂，含有茶多酚、葡萄籽提取物和维生素c，而且葡萄籽提取物是一种植物提取物，成分受原料来源影响较大，无法保证不同批次冻存液的质量一致。
5.现有(公开号为：cn107699543a)一种莎草醌及类似物在nk细胞培养方面的应用，请求保护莎草醌及其衍生物在nk细胞冻存复苏和体外培养方面的应用。但是，该专利只研究了莎草醌及其衍生物可以提高nk细胞的复苏率，并未公开莎草醌及其衍生物对nk细胞杀伤活性的影响，而复苏率和杀伤活性对考察nk细胞冻存效果缺一不可。
6.根据上述两篇专利可见，现有技术均存在一定的不足，有必要开发更多的nk细胞冻存方法和冻存液，因此我们提出一种nk细胞的培养及冻存方法。
技术实现要素：
7.(一)解决的技术问题
8.针对现有技术的不足，本发明提供了一种nk细胞的培养及冻存方法，解决了现有nk细胞培养中细胞扩增慢，收获不高，且冻存时，所结冰晶对细胞伤害大的问题。
9.(二)技术方案
10.为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种nk细胞的培养方法，包括以下步骤：
11.s1.从脐带血中分离单个核细胞；
12.s2.将单个核细胞免疫去除cd3单克隆抗体；
13.s3.加入无血清培养基中，同时加入活化因子培养；
14.s4.培养2-5天；
15.s5.nk细胞收获。
16.优选的，所述步骤s1中脐带血的血浆浓度为1-5％。
17.优选的，所述步骤s2中cd3单克隆抗体浓度为80-240ng/ml。
18.优选的，所述步骤s3中培养为扩瓶培养。
19.优选的，所述步骤s3中活化因子为il-2，浓度为300-800iu/ml。
20.一种nk细胞的冻存方法，其特征在于：包括以下步骤：
21.1)配制含dmso、10-20％小牛血清的冻存培养液；
22.2)取对数生长期的nk细胞，去除旧培养液用pbs清洗，然后去除pbs加适量胰蛋白酶消化1-3分钟；
23.3)离心后去除胰蛋白酶加配制好的冻存培养液；
24.4)利用配置好的冻存培养液把nk细胞悬浮起来，分装到冻存管中；
25.5)分别在4℃冻存10min、-20℃冻存30min，-80℃过夜；
26.6)然后将冻存管放到液氮罐或冻存盒中，再放入到-80℃的冰箱
27.优选的，所述步骤2)中胰蛋白酶能够覆盖nk细胞。
28.优选的，所述步骤4)中每管容量为1-2ml。
29.(三)有益效果
30.本发明提供了一种nk细胞的培养及冻存方法。具备以下有益效果：
31.1、本发明提供的一种nk细胞的培养及冻存方法，在nk细胞培养过程中通过加入活化因子，可以有效提高nk细胞扩增，提高扩增倍数，具有非常好的扩增效果，同时操作简单、成本低廉。
32.2、本发明提供的一种nk细胞的培养及冻存方法，在细胞冻存过程中，所结的冰晶对细胞伤害较大，传统处理一般是十分小心的放慢速度操作，而本发明通过加入的dmso，可以起到减少冰晶伤害的效果。
33.3、本发明提供的一种nk细胞的培养及冻存方法，该方法培养获得的nk细胞效率高，且整体操作过程更加简单，对细胞伤害小，处理效果更好。
具体实施方式
34.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
35.实施例1：
36.本发明实施例提供一种nk细胞的培养方法，包括以下步骤：
37.s1.从脐带血中分离单个核细胞；
38.s2.将单个核细胞免疫去除cd3单克隆抗体；
39.s3.加入无血清培养基中，同时加入活化因子培养；
40.s4.培养2-5天；
41.s5.nk细胞收获。
42.步骤s1中脐带血的血浆浓度为1％。
43.步骤s2中cd3单克隆抗体浓度为80ng/ml。
44.步骤s3中培养为扩瓶培养，活化因子为il-2，浓度为300iu/ml。
45.实施例2：
46.本发明实施例提供一种nk细胞的培养方法，包括以下步骤：
47.s1.从脐带血中分离单个核细胞；
48.s2.将单个核细胞免疫去除cd3单克隆抗体；
49.s3.加入无血清培养基中，同时加入活化因子培养；
50.s4.培养2-5天；
51.s5.nk细胞收获。
52.步骤s1中脐带血的血浆浓度为5％。
53.步骤s2中cd3单克隆抗体浓度为240ng/ml。
54.步骤s3中培养为扩瓶培养，活化因子为il-2，浓度为300iu/ml.
55.实施例3：
56.本发明实施例提供一种nk细胞的培养方法，包括以下步骤：
57.s1.从脐带血中分离单个核细胞；
58.s2.将单个核细胞免疫去除cd3单克隆抗体；
59.s3.加入无血清培养基中，同时加入活化因子培养；
60.s4.培养2-5天；
61.s5.nk细胞收获。
62.步骤s1中脐带血的血浆浓度为5％。
63.步骤s2中cd3单克隆抗体浓度为240ng/ml。
64.步骤s3中培养为扩瓶培养，活化因子为il-2，浓度为800iu/ml。
65.实施例4：
66.本发明实施例提供一种nk细胞的培养方法，包括以下步骤：
67.s1.从脐带血中分离单个核细胞；
68.s2.将单个核细胞免疫去除cd3单克隆抗体；
69.s3.加入无血清培养基中，同时加入活化因子培养；
70.s4.培养2-5天；
71.s5.nk细胞收获。
72.步骤s1中脐带血的血浆浓度为1％。
73.步骤s2中cd3单克隆抗体浓度为80ng/ml。
74.步骤s3中培养为扩瓶培养，活化因子为il-2，浓度为800iu/ml。
75.实施例4：
76.本发明实施例提供一种nk细胞的培养方法，包括以下步骤：
77.s1.从脐带血中分离单个核细胞；
78.s2.将单个核细胞免疫去除cd3单克隆抗体；
79.s3.加入无血清培养基中，同时加入活化因子培养；
80.s4.培养2-5天；
81.s5.nk细胞收获。
82.步骤s1中脐带血的血浆浓度为5％。
83.步骤s2中cd3单克隆抗体浓度为240ng/ml。
84.步骤s3中培养为扩瓶培养，活化因子为il-2，浓度为800iu/ml。
85.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
技术领域
1.本发明涉及细胞培养及冻存技术领域，具体为一种nk细胞的培养及冻存方法。
背景技术：
2.肿瘤细胞免疫治疗技术作为一种新兴的肿瘤治疗手段，具有杀瘤识别谱广、抗癌杀伤力高、毒副作用小等特点。自然杀伤细胞(nk)通过自身表面活化性受体与肿瘤细胞表面配体之间的作用，可不受mhc分子的限制，进而识别mhc-i类分子表达下调或缺失的肿瘤细胞并发挥杀伤功能。由于nk细胞在外周血中占有较小的比例，占淋巴细胞的5％～15％，并且肿瘤患者体内nk细胞的功能存在不同程度的缺失，难以产生良好抗肿瘤效果，需要通过体外培养增加nk细胞的数量和改善nk细胞的功能。由于不能确保体外培养与临床使用时间节点的完全统一，为了避免长时间的培养而增加的成本、培养时间超过最佳对数生长期后细胞的生长状态及活性的下降而影响细胞的治疗质量，保存培养后的nk细胞也成了必要的方法之一。
3.目前，常使用程控降温的方法对nk细胞进行冻存，但是程控降温操作繁琐。虽然-80℃直接冻存更受欢迎，但是该方法对nk细胞的冻存损伤较大，复苏率和复苏后的杀伤活性都会明显降低，应用受到局限。
4.现有(公开号为：cn105211051a)的专利公开了一种培养后的nk细胞的冻存液及其制备方法，请求保护一种培养后的nk细胞的冻存液，所述冻存液由溶液a和自体血清配制而成，溶液a和自体血清的体积比为1：0.5～2，其中：溶液a由自体血清混合液与dmso配制而成，自体血清混合液与dmso的体积比为3～6：1；自体血清混合液包括茶多酚、葡萄籽提取物、维生素c和自体血清，该细胞的冻存液中茶多酚、葡萄籽提取物、维生素c的终浓度分别为0.5～5mg/ml、0.125～0.5mg/ml、0.5～5mg/ml。但是，该冻存液成分较为复杂，含有茶多酚、葡萄籽提取物和维生素c，而且葡萄籽提取物是一种植物提取物，成分受原料来源影响较大，无法保证不同批次冻存液的质量一致。
5.现有(公开号为：cn107699543a)一种莎草醌及类似物在nk细胞培养方面的应用，请求保护莎草醌及其衍生物在nk细胞冻存复苏和体外培养方面的应用。但是，该专利只研究了莎草醌及其衍生物可以提高nk细胞的复苏率，并未公开莎草醌及其衍生物对nk细胞杀伤活性的影响，而复苏率和杀伤活性对考察nk细胞冻存效果缺一不可。
6.根据上述两篇专利可见，现有技术均存在一定的不足，有必要开发更多的nk细胞冻存方法和冻存液，因此我们提出一种nk细胞的培养及冻存方法。
技术实现要素：
7.(一)解决的技术问题
8.针对现有技术的不足，本发明提供了一种nk细胞的培养及冻存方法，解决了现有nk细胞培养中细胞扩增慢，收获不高，且冻存时，所结冰晶对细胞伤害大的问题。
9.(二)技术方案
10.为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种nk细胞的培养方法，包括以下步骤：
11.s1.从脐带血中分离单个核细胞；
12.s2.将单个核细胞免疫去除cd3单克隆抗体；
13.s3.加入无血清培养基中，同时加入活化因子培养；
14.s4.培养2-5天；
15.s5.nk细胞收获。
16.优选的，所述步骤s1中脐带血的血浆浓度为1-5％。
17.优选的，所述步骤s2中cd3单克隆抗体浓度为80-240ng/ml。
18.优选的，所述步骤s3中培养为扩瓶培养。
19.优选的，所述步骤s3中活化因子为il-2，浓度为300-800iu/ml。
20.一种nk细胞的冻存方法，其特征在于：包括以下步骤：
21.1)配制含dmso、10-20％小牛血清的冻存培养液；
22.2)取对数生长期的nk细胞，去除旧培养液用pbs清洗，然后去除pbs加适量胰蛋白酶消化1-3分钟；
23.3)离心后去除胰蛋白酶加配制好的冻存培养液；
24.4)利用配置好的冻存培养液把nk细胞悬浮起来，分装到冻存管中；
25.5)分别在4℃冻存10min、-20℃冻存30min，-80℃过夜；
26.6)然后将冻存管放到液氮罐或冻存盒中，再放入到-80℃的冰箱
27.优选的，所述步骤2)中胰蛋白酶能够覆盖nk细胞。
28.优选的，所述步骤4)中每管容量为1-2ml。
29.(三)有益效果
30.本发明提供了一种nk细胞的培养及冻存方法。具备以下有益效果：
31.1、本发明提供的一种nk细胞的培养及冻存方法，在nk细胞培养过程中通过加入活化因子，可以有效提高nk细胞扩增，提高扩增倍数，具有非常好的扩增效果，同时操作简单、成本低廉。
32.2、本发明提供的一种nk细胞的培养及冻存方法，在细胞冻存过程中，所结的冰晶对细胞伤害较大，传统处理一般是十分小心的放慢速度操作，而本发明通过加入的dmso，可以起到减少冰晶伤害的效果。
33.3、本发明提供的一种nk细胞的培养及冻存方法，该方法培养获得的nk细胞效率高，且整体操作过程更加简单，对细胞伤害小，处理效果更好。
具体实施方式
34.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
35.实施例1：
36.本发明实施例提供一种nk细胞的培养方法，包括以下步骤：
37.s1.从脐带血中分离单个核细胞；
38.s2.将单个核细胞免疫去除cd3单克隆抗体；
39.s3.加入无血清培养基中，同时加入活化因子培养；
40.s4.培养2-5天；
41.s5.nk细胞收获。
42.步骤s1中脐带血的血浆浓度为1％。
43.步骤s2中cd3单克隆抗体浓度为80ng/ml。
44.步骤s3中培养为扩瓶培养，活化因子为il-2，浓度为300iu/ml。
45.实施例2：
46.本发明实施例提供一种nk细胞的培养方法，包括以下步骤：
47.s1.从脐带血中分离单个核细胞；
48.s2.将单个核细胞免疫去除cd3单克隆抗体；
49.s3.加入无血清培养基中，同时加入活化因子培养；
50.s4.培养2-5天；
51.s5.nk细胞收获。
52.步骤s1中脐带血的血浆浓度为5％。
53.步骤s2中cd3单克隆抗体浓度为240ng/ml。
54.步骤s3中培养为扩瓶培养，活化因子为il-2，浓度为300iu/ml.
55.实施例3：
56.本发明实施例提供一种nk细胞的培养方法，包括以下步骤：
57.s1.从脐带血中分离单个核细胞；
58.s2.将单个核细胞免疫去除cd3单克隆抗体；
59.s3.加入无血清培养基中，同时加入活化因子培养；
60.s4.培养2-5天；
61.s5.nk细胞收获。
62.步骤s1中脐带血的血浆浓度为5％。
63.步骤s2中cd3单克隆抗体浓度为240ng/ml。
64.步骤s3中培养为扩瓶培养，活化因子为il-2，浓度为800iu/ml。
65.实施例4：
66.本发明实施例提供一种nk细胞的培养方法，包括以下步骤：
67.s1.从脐带血中分离单个核细胞；
68.s2.将单个核细胞免疫去除cd3单克隆抗体；
69.s3.加入无血清培养基中，同时加入活化因子培养；
70.s4.培养2-5天；
71.s5.nk细胞收获。
72.步骤s1中脐带血的血浆浓度为1％。
73.步骤s2中cd3单克隆抗体浓度为80ng/ml。
74.步骤s3中培养为扩瓶培养，活化因子为il-2，浓度为800iu/ml。
75.实施例4：
76.本发明实施例提供一种nk细胞的培养方法，包括以下步骤：
77.s1.从脐带血中分离单个核细胞；
78.s2.将单个核细胞免疫去除cd3单克隆抗体；
79.s3.加入无血清培养基中，同时加入活化因子培养；
80.s4.培养2-5天；
81.s5.nk细胞收获。
82.步骤s1中脐带血的血浆浓度为5％。
83.步骤s2中cd3单克隆抗体浓度为240ng/ml。
84.步骤s3中培养为扩瓶培养，活化因子为il-2，浓度为800iu/ml。
85.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
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