玉米事件MIR162的制作方法

玉米事件mir162
1.本技术是申请日为2007年5月24日、申请号为201710814647.1、发明名称为“玉米事件mir162”的发明专利申请的分案申请。


背景技术：

2.本发明总体上涉及植物分子生物学、植物转化，以及植物育种的领域。更具体而言，本发明涉及包含新颖的转基因的基因型的抗昆虫的转基因玉米植物并涉及检测核酸的存在的方法，这些核酸对在样品中及其组合物中的转基因玉米植物是独特的。
3.植物害虫是在全世界重要农作物损失中的一个主要因素。由于非哺乳动物害虫(包含昆虫)的侵染，仅在美国每年就损失大约80亿美元。除了农作物中的损失之外，虫害对于菜农和果农，对于观赏性花卉的生产商，以及对于家庭花匠也是一种负担。
4.虫害主要是通过密集使用化学杀虫剂来控制，这些化学杀虫剂通过抑制昆虫成长，预防昆虫摄食或繁殖，或者导致死亡而有效。由此可以达到好的昆虫控制，但这些化学品有时也能影响其他益虫。由化学杀虫剂的广泛使用产生的另一个问题是出现了有抵抗力的昆虫品种。通过各种抵抗管理实践已部分地缓和了这一状况，但对可替代的虫害控制剂仍有不断增加的需求。生物性害虫控制剂，例如表达杀虫毒素(像δ
‑
内毒素)的苏云金芽胞杆菌(bt)株，也已经用于农作物而产生了令人满意的结果，为化学杀虫剂提供了一种替代或补充 (compliment)。对某些这种δ
‑
内毒素编码的基因已经被分离出，并且它们在异源宿主中的表达已被证明为控制经济上重要的虫害提供了另一种工具。尤其是，btδ
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内毒素的表达已针对选定的虫害提供了有效的保护，并且表达这些毒素的转基因植物已经商业化，这就允许农民减少化学昆虫控制剂的使用。
5.也已鉴定出在生长的营养阶段由杆菌种产生的另一个杀虫的蛋白质家族(植物性的杀虫蛋白质(vip))。美国专利5,877,012、6,107,279 以及6,137,033(通过引用而纳入本文)描述了被称为vip3的新类型的杀虫蛋白质。其他披露，包括wo 98/18932、wo 98/33991、wo98/00546，以及wo 99/57282，现也已鉴定出该vip3类蛋白质的同系物。vip3编码序列编码大约88kda的蛋白质，这些蛋白质具有针对广谱的鳞翅类害虫的杀虫活性，这些害虫包括但不限于，小地老虎(blackcutworm)(bcw，agrotis ipsilon)，秋夜蛾(fall armyworm)(faw， spodoptera frugiperda)，烟草夜蛾幼虫(tobacco budworm)(tbw， heliothis virescens)，甘蔗螟虫(sugarcane borer)(scb，diatraeasaccharalis)，小玉米钻心虫(lesser cornstalk borer)(lcb， elasmopalpus lignosellus)，以及棉铃虫(corn earworm)(cew， helicoverpa zea)，并且当在转基因植物(例如玉米(玉蜀黍))中表达时，对植物给予保护使其免受昆虫摄食损伤。
6.当前植物转化方法通常导致像vip3的转基因随机整合进入宿主植物基因组中。如果该外来dna碰巧插入一个非常重要的自然基因，并且因此突变，则被引入的dna的这种随机的插入植物基因组中可以是致命的。另外，即使随机插入事件(event)不损害宿主细胞基因的功能，插入的外源基因的表达可以受到由周围基因组dna引起的“位置效应”的影响。在一些情况下，该基因被插入至一些位点中，在这些位点的位置效应足够强以致阻止从该引
入基因合成有效量的产物。例如，在植物中已观察到，在单个挑选的事件中，被引入至植物的染色体中的异源基因的表达水平可能存在广泛的变化。在表达的空间模式或时间模式上也可能存在不同，例如，在不同植物组织中的转基因的相对表达的不同，这可能与预期来自在该引入基因构建体中存在的转录调节元件的模式不对应。在其他情况中，该基因产物的过度生产对细胞具有有害作用。由于这些潜在的问题，通常的做法是生产几百种不同的事件并且筛选这些事件得出一个单独事件，该单独事件具有对于商业目的所希望的转基因表达模式和水平。然而，一旦在该植物的基因组中确认了具有商业上可行的位点，有利的是将相关基因靶向至那个非有害的位点。
7.已描述了几种方法，这些方法用于将相关核苷酸序列靶向地插入植物细胞中的特异的染色体位点上。在几种原核和更低级的真核生物中已鉴定出多个位点特异的重组系统。这些系统通常包含一个或多个蛋白质，这些蛋白质识别特异核苷酸序列的两个拷贝，切割并连接这些核苷酸序列，并且由此提供遗传信息的一个精确的、位点特异的交换。几种位点特异的重组酶在本领域是已知的。这些包括，但不限于，例如，噬菌体(bacteriophage)pl cre/lox系统(austin等(1981) cell 25：729
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736)，来自酵母接合糖酵母菌(zygosaccharomycesrouxii)的psrl质粒的r/rs重组酶系统(araki等(1985)j.mol. biol.182：191
‑
203)，噬菌体(phage)mu的gin/gix系统(maeser 和kahlmann(1991)mol.gen.genet.230：170
‑
176)，来自酵母啤酒酵母(saccharomyces cerevisiae)的2.mu.m质粒的flp/frt 重组酶系统(broach等(1982)cell 29:：227
‑
234)，以及来自细菌噬菌体λ(lambda)的int重组酶(landy(1989)annu.rev.biochem. 58：912
‑
949；landy(1993)curr.opin.genet.dev.3：699
‑
707； lorbach等(2000)j.mol.biol.296：1175
‑
1181；以及wo 01/16345)。披露于美国专利申请公开文件号2006/0130179中(通过引用而纳入本文)的一种特别有用的位点特异的靶向方法使用了兰布达(lambda)整合酶介导的重组。该方法包括将目标核苷酸序列引入至植物细胞中，该核苷酸序列包含第一整合酶识别位点；将供体核苷酸序列引入至该植物细胞中，该核苷酸序列包含第二整合酶识别位点；并且将整合酶或整合酶复合物引入至该植物细胞中。另一种有用的位点特异的靶向方法披露于美国专利申请公开文件号2006/0253918中(通过引用而纳入本文)，它使用了同源重组在该基因组中的特定位置整合一个或多个基因(基因堆积)。
8.具有转基因表达的希望的水平或模式的事件(event)对于使用常规育种方法通过有性的异型杂交将该转基因渗入至其他遗传背景中是有用的。这样杂交的子代保持该原始转化体的转基因表达特性。使用这一策略来确保在许多已很好地适应了当地生长条件的品种中可靠的基因表达。它还有利地能够检测出特殊事件的存在，以便确定有性杂交的子代是否包含相关转基因。另外，检测特定的事件的方法有助于遵循条例，这些条例要求上市前批准以及标记出衍生自例如重组农作物植物的食品。这有可能通过任何熟知的核酸检测方法检测出转基因的存在，该检测方法包括但不限于使用多核苷酸引物的热扩增(聚合酶链式反应(pcr))或者使用核酸探针的dna杂交。典型地，为了用于检测特异dna构建体(该dna构建体已被用于转化不同的植物品种) 的试剂和方法学的简易性和一致性，这些检测方法一般集中于频繁使用的遗传元件上，例如，启动子、终止子以及标记基因，因为对于许多dna构建体而言，该编码序列区域是可互换的。结果，此类方法对区别仅在该编码序列上不同的构建体可能是无用的。此外，此类方法对区别不同事件可能是无用的，特别是用同样dna构
建体产生的那些，除非邻近该插入的异源dna的染色体dna的序列(“侧翼dna”)是已知的。
9.由于前述原因，对于包含新型核酸序列的抗昆虫的转基因玉米事件存在一种需要，所述核酸序列对该转基因的玉米事件是独特的，对于标识该转基因的玉米事件并且对于检测在生物样品中来自该转基因的玉米事件的核酸是有用的，以及需要包含在生物样品中检测这些核酸而必需使用的试剂的试剂盒。存在一种进一步的需要来提供在该玉蜀黍基因组中的特异靶位点，以允许靶向和控制待整合至该玉米基因组中的核苷酸序列的插入。
10.发明概述
11.本发明涉及转化的玉米(玉蜀黍)事件，被称为mir162，它包含新颖的转基因的基因型，该基因型包含vip3aa20编码序列，它对事件 mir162是独特的。该vip3aa20编码序列编码vip3aa20杀虫蛋白质，该蛋白质给予mir162玉米植物以昆虫抵抗性。该mir162事件还包含 pmi编码序列，该序列编码了pmi蛋白质，该蛋白质给予玉米细胞利用甘露糖作为碳源的能力。除该vip3a20编码序列之外，本发明还提供对mirl62独特的其他核酸。本发明还提供了包含对mir162独特的核酸的转基因的玉米植物，来自这些转基因的玉米植物的种子，以及生产包含本发明的独特的核酸的转基因的玉米植物的方法，该方法是通过将包含对mir162独特的核酸的玉米近交系自身杂交或将其与不同基因型的另一种玉米系杂交。种子的一个实例，以及因此从该种子长成的玉米植物(包含对mir162独特的核酸)，以登记号pta
‑
8166 保藏于美国典型培养物保藏中心(american type culturecollection)。除了通过本发明的新型基因型给予这些玉米植物的特征之外，本发明的转基因的玉米植物可基本上具有对应的等基因的非转基因的玉米植物的所有形态学及生理学的特征。本发明还提供了来自mir162玉米植物、组织和种子的生物样品以及提取物。本发明还提供了用于检测在生物样品中对mir162独特的核酸的存在的组合物以及方法，这是基于插入至该玉米基因组的产生该mir162事件的重组表达盒的dna序列，以及位于插入点侧翼的基因组序列的dna序列。本发明还提供了在玉蜀黍染色体上的非有害的插入靶位点，它有助于将相关基因插入至在该染色体的特定位置，以及在所披露的插入位点或所披露的插入位点附近通过插入异源核酸改变玉蜀黍基因组的方法。该mir162事件的进一步地通过如下进行表征：分析该vip3aa20 和pmi蛋白质的表达水平以及测试mirl62对抗鳞翅类虫害的效力。本发明还提供了通过堆积该vip3aa20抗昆虫的特性与不同于vip3aa20 的抗昆虫的特性而生产抵抗广谱害虫的转基因的玉米植物的方法。
12.本发明上述以及其他方面将从以下详细说明中变得更清楚。
13.序列表中序列的说明
14.seq id no：1是mir162中的vip3aa20编码序列。
15.seq id no：2是vip3aa20氨基酸序列。
16.seq id no：3是质粒pnov1300的序列。
17.seq id nos：4至12是在taqman测定中有用的引物和探针。
18.seq id no：13是vip3aa20探针的序列。
19.seq id no：14pmi探针的序列。
20.seq id nos：15至37是在本发明中有用的引物。
21.seq id no：38是vip3aa20扩增子的序列。
22.seq id nos：39至40是在本发明中有用的引物。
23.seq id no：41是该cj134/179 5'扩增子的序列。
24.seq id nos：42至43是在本发明中有用的引物。
25.seq id no：44是vip3aa20 3'扩增子。
26.seq id no：45是5'基因组插入接头。
27.seq id no：46是在插入的5'侧翼的玉米基因组序列。
28.seq id no：47是3'插入基因组接头。
29.seq id no：48是在插入的3'侧翼的玉米基因组序列。
30.seq id no：49是mir162插入序列和侧翼序列。
31.seq id nos：50至54是本发明中有用的引物。
32.seq id no：55是5'pcr扩增子。
33.seq id nos：56至58是本发明中有用的引物。
34.seq id no：59是3'pcr扩增子。
35.seq id nos：60至105是本发明中有用的引物。
36.seq id no：106是包含所披露的染色体靶位点的玉蜀黍染色体5 的区域的序列。
37.seq id no：107是通过在mir162中插入异源dna而替换的玉蜀黍基因组序列。
38.详细说明
39.提供下列定义和方法以更好地定义本发明并且指导本领域的普通技术人员实施本发明。除非另作说明，此处所使用的术语应根据相关领域的那些普通技术人员的常规用法来理解。分子生物学中的一般术语的定义也可在rieger等，遗传学词汇表(glossary of genetics)： (标准和分子)classical and molecular，(第5版)5
th
edition, springer
‑
verlag：纽约(new york)，1994中找到。在此使用了如在37c.f.r.
§
1.822中对于dna碱基和氨基酸给出的术语。
40.如此处所用的，术语“扩增的”是指使用至少一种核酸分子作为模板，构建核苷酸分子的多个拷贝或该核酸分子互补的多个拷贝。扩增系统包括但不限于聚合酶链式反应(pcr)系统、连接酶链式反应 (lcr)系统、基于核酸序列的扩增(nasba，cangene，mississauga，安大略(ontario))、q
‑
β复制酶系统、基于转录的扩增系统(tas)，以及链置换扩增(sda)。参见，例如，诊断分子微生物学(diagnosticmolecular microbiology)：原理和应用(principles andapplications),d.h.persing等，ed.，美国微生物学协会(americansociety for microbiology)，华盛顿(washington，d.c.)(1993)。扩增产物被称为扩增子。
[0041]“编码序列”是被转录成rna的核酸序列，例如mrna、rrna、trna、 snrna、正义rna或反义rna。优选地该rna然后在生物体中被翻译以产生蛋白质。
[0042]
如此处所用，术语“玉米”指玉蜀黍或玉米并且包括可以用玉米培育的所有植物品种，包含野生玉蜀黍种类。
[0043]
此处所用的“检测试剂盒”是指在样品中检测对mir162植物独特的dna是否存在中有用的多种部件的试剂盒，其中该试剂盒包含本发明的核酸探针和/或引物，它们在高严格条件下特异性地与靶dna序列杂交，以及使核酸杂交或者扩增方法能够完成所必要的其他材料。
[0044]
如此处所用，术语转基因的“事件(event)”是指通过用异源 dna(例如，包括相关
基因的表达盒)转化和再生植物细胞或组织而产生的重组植物。术语“事件”是指包含异源dna的原始转化体和/或该转化体的子代。术语“事件”也指在转化体与另一玉米系之间通过有性异型杂交而产生的子代。即使在重复与回归亲本回交后，来自该转化的亲本的插入dna和侧翼dna存在于在该杂交子代的同样的染色体位置。术语“事件”也指来自原始转化体的dna，包含该插入dna以及直接邻近该插入dna的侧翼基因组序列，其预期将被转移至子代中，该子代作为包含该插入dna(例如，该原始转化体及由自交产生的子代)的亲本品系与不含该插入dna的亲本品系的有性杂交的结果而接收了包含相关转基因的插入dna。通常，植物组织的转化产生多个事件，每个事件代表dna构建体插入至植物细胞的基因组的不同位置上。基于该转基因的表达或其他希望的特征，选择特殊的事件。因此，“事件mir162”、“mir162”或者“mir162事件”可以互换地使用。
[0045]
抗昆虫的mir162玉米植物可以通过第一亲本玉米植物与缺乏昆虫抵抗性的第二亲本玉米植物的第一次有性杂交而进行培育，该第一亲本玉米植物包括从转基因的mir162玉米植物生长出的玉米植物，例如从保藏于atcc以登记号为pta
‑
6188的种子长成的mir162玉米植物，及其用本发明的实施方式的表达盒转化而得的子代，该转化给予了昆虫抵抗力，由此产生多个第一子代植物；并且然后选择抵抗昆虫的第一子代植物；并将该第一子代植物自交，由此产生多个第二子代植物；并且然后从这些第二子代植物选择抗昆虫的植物。这些步骤可以进一步包括该第一抗昆虫的子代植物或该第二抗昆虫的子代植物与该第二亲本玉米植物或第三亲本玉米植物回交，由此产生抵抗昆虫的玉米植物。
[0046]
如此处所用的“表达盒”是指能够在适当的宿主细胞中指引特定核苷酸序列的表达的核酸分子，包含可操作地与相关核苷酸序列(其可操作地与终止信号相连接)相连接的启动子。它还典型地包含适当翻译该核苷酸序列所需的序列。该表达盒可能也包含这样的序列，所述序列在相关核苷酸序列的直接表达中不是必需的但因为用于从表达载体去除该表达盒的方便的限制位点而存在。包含该相关核苷酸序列的表达盒可为嵌合的，意味着它的至少一个组分对于它的至少一个其他组分是异源的。该表达盒也可能是自然发生的，但已经是以在对异源表达有用的重组形式而获得的。然而，典型地，该表达盒对于该宿主是异源的，即，该表达盒的特定核酸序列不是自然地发生在该宿主细胞内，且必须是通过本领域已知的转化方法被引入该宿主细胞或该宿主细胞的祖先中。在该表达盒中核苷酸序列的表达可能是在组成型启动子或由诱导型启动子的控制之下，该诱导型启动子只有当该宿主细胞暴露于一些特殊的外界刺激时才引发转录。在多细胞生物体的情况下，例如植物，该启动子还可以对特殊组织，或器官，或者发展阶段是特异的。当被转化进植物中时，表达盒或其片段也可被称为“插入的序列”或者“插入序列”。
[0047]“基因”是限定的区域，该区域位于基因组之内并且，除了前述的编码序列之外，它可能包含其他(主要是调控性的)负责该编码部分的表达控制(也就是转录和翻译)的核酸序列。基因也可包含其他5'和3'未被翻译序列以及终止序列。其他可存在的元件是，例如，内含子。
[0048]“相关基因”是指任何基因，当被转移至植物时，它给予该植物希望的特征，例如抗生素耐受性、病毒抵抗性、昆虫抵抗性、疾病抵抗性，或者其他害虫抵抗性，除草剂耐受性，改进的营养价值，在工业过程改进的性能或者改变的繁殖能力。
[0049]
如此处所用的“基因型”是由亲本玉米植物遗传的遗传物质，并不是所有遗传物质
elsevier:纽约(new york)；以及现代分子生物学技术(currentprotocols in molecular biology),第2章(chapter 2),ausubel 等,eds.,greene publishing and wiley
‑
interscience：new york (1995)，以及还有sambrook等(2001)分子克隆：实验室手册 (molecular cloning:a laboratory manual)(5
th
ed.cols springharbor laboratory，cold spring harbor，ny)中可找到核酸杂交的广泛指南。
[0058]
典型地，特异性是杂交后洗涤的函数(关键因素为最终洗涤溶液的离子强度和温度)。通常，在已确定的离子强度和ph值条件下，选择高严格杂交和洗涤条件以便针对该特异序列比该热熔点(t
m
)约低 5℃。t
m
是50％的靶序列与完全匹配的探针的温度杂交(在已确定的离子强度和ph值条件下)。典型地，在高严格条件下，探针将与它的靶序列杂交，而非至其他序列。
[0059]
对于互补核酸(这些互补核酸在dna印迹或rna印迹的滤纸上具有多于100个互补的残基)的杂交的高严格杂交条件的一个实例是 50％甲酰胺与1mg肝素，在42℃杂交过夜。严格性非常高的洗涤条件的一个实例是0.15m nacl，在72℃下约15分钟。高严格洗涤条件的一个实例是0.2x ssc洗涤，在65℃下进行15分钟(参见，sambrook, infra,对于ssc缓冲液的描述)。
[0060]
本发明的示例性杂交条件包括在7％sds，0.25m napo4，ph7.2， 67℃条件下杂交过夜，然后在5％sds，0.20m napo4，ph 7.2，65℃条件下洗涤两次，每次30分钟，并在1％sds，0.20m napo4，ph7.2， 65℃条件下洗涤两次，每次30分钟。对于双链体(例如，多于100 个核苷酸)的示例性中等严格洗涤是1x ssc，在45℃进行15分钟。对于双链体(例如，多于100个核苷酸)的示例性低严格洗涤是4
‑
6x ssc，在40℃进行15分钟。
[0061]
对于大约10至50个核苷酸的探针，高严格条件典型地包括低于约1.0m na离子的盐浓度，典型地为约0.01至1.0m na离子浓度(或其他盐)，ph7.0至8.3，并且温度典型地为至少约30℃。增加去稳定剂(例如甲酰胺)，也能达到高严格条件。一般而言，2倍或更高倍于在特定杂交测定中观察到的不相关的探针的信噪比，表明检测到特异的杂交。若它们编码的蛋白质基本相同，则在高严格条件下彼此不杂交的核酸仍基本相同。例如，当使用遗传密码允许的最大程度的密码简并而生成核酸的拷贝时，发生该情况。
[0062]
以下是杂交/洗涤条件的示例组，其可被用于杂交与本发明的参考核苷酸序列基本相同的核苷酸序列：参考核苷酸序列优选地在7％十二烷基硫酸钠(sds)，0.5m napo4，1mm edta，50℃条件下与该参考核苷酸序列杂交，并在2x ssc，0.1％sds，50℃条件下洗涤，更希望在7％十二烷基硫酸钠(sds)，0.5m napo4，1mm edta，50℃条件下杂交，并在1x ssc，0.1％sds，50℃条件下洗涤，仍更希望在7％十二烷基硫酸钠(sds)，0.5m napo4,1mm edta，50℃条件下杂交，并在0.5x ssc，0.1％sds，50℃条件下洗涤，优选地在7％十二烷基硫酸钠(sds)，0.5m napo4，1mm edta，50℃条件下杂交，并在0.1x ssc，0.1％sds，50℃条件下洗涤，更优选地在7％十二烷基硫酸钠(sds)， 0.5m napo4，1mm edta，50℃条件下杂交，并在0.1x ssc，0.1％sds， 65℃条件下洗涤。本发明的序列可以使用所有上面的条件检测到。为了定义本发明的目的，使用了高严格条件。
[0063]“转化”是将异源核酸引入至宿主细胞或生物体中的过程。具体地说，“转化”是指将dna分子稳定整合进相关生物体的基因组中。
[0064]“转化的/转基因的/重组”是指已经引入了异源核酸分子的宿主生物体，例如细菌
或植物。该核酸分子能够被稳定地整合进入该宿主的基因组中或者该核酸分子也能作为染色体外的分子而存在。这样的染色体外的分子能够自动复制。转化的细胞、组织或者植物应理解为不仅包含转化过程的最后产物，还包含其转基因的子代。“非转化的”、“非转基因的”，或“非重组”宿主是指野生型生物体，即，细菌或植物，它不包含异源核酸分子。如此处所用，“转基因的”是指植物，植物细胞，或多个结构化或没有结构化的植物细胞，这些细胞通过熟知的基因操作和基因插入技术已将代表相关基因的核酸序列整合进该植物基因组中，并典型地整合进细胞核的染色体、线粒体或其他包含染色体的细胞器中，这是在与天然植物或植物细胞中正常存在的位点不同的位点，或在多于在天然植物或植物细胞中正常存在的拷贝数中的位点发生的。转基因植物来自这种核酸序列的操作和插入(与自然发生的突变相反)，以产生非自然发生的植物或具有非自然发生的基因型的植物。植物和植物细胞的转化技术在本领域是熟知的，并可能包含例如电穿孔法、显微注射法、土壤杆菌属介导的转化法，以及生物射弹转化(ballistic transformation)。
[0065]
如此处所用，术语对mirl62“独特”是指mirl62特有的特征。因此，对事件mirl62独特的核酸在其他非mir162玉米植物中没有发现。
[0066]
该“vip3”类的蛋白质包括，例如，vip3aa、vip3ab、vip3ac、 vip3ad、vip3ae、vipaf、vip3ag、vip3ba以及vip3bb，以及它们的同系物。“同系物”是指所指的蛋白质或多肽与该“vip3”类的蛋白质的其他成员具有确定的关系。“vip3aa20”是对事件mirl62独特的 vip3同系物。它是在该植物转化过程中通过引入至该玉蜀黍最佳化的 vip3aal9基因(包含在pnov1300(seq id no：3)内)的自发突变而产生。
[0067]
本发明涉及一种遗传改善的玉米系，该玉米系产生一种昆虫控制蛋白质，vip3aa20，以及允许该植物利用甘露糖作为碳源的磷酸甘露糖异构酶(pmi)。本发明尤其指向被命名为mir162(包含新型基因型)的转基因玉米事件，以及指向在生物样品中检测对mir162独特的核酸的组合物以及方法。本发明进一步指向包含该mir162基因型的玉米植物，指向来自该玉米植物的转基因种子，以及指向通过将包含该 mir162基因型的玉米与自身近交或将其与另一种玉米系杂交而产生的包含该mir162基因型的玉米植物的方法。包含本发明的mir162基因型的玉米植物对控制鳞翅类虫害是有用的，该虫害包含但不限于，小地老虎(bcw，agrotis ipsilon)，秋夜蛾(faw，spodopterafrugiperda)，烟草夜蛾幼虫(tbw，heliothis virescens)，甘蔗螟虫(scb，diatraea saccharalis)，小玉米钻心虫(lcb，elasmopalpuslignosellus)，棉铃虫(cew，helicoverpa zea)，以及西部豆类夜盗虫(wbcw，striacosta albicosta)。本发明进一步指向保护转基因玉米免受摄食损伤的方法，它通过在相同的转基因植物结果中堆积 mir162的昆虫抵抗特征和不同的昆虫抵抗特征产生玉米植物，与单独的该昆虫抵抗特征相比该植物在更大程度免受到免于摄食损伤的保护。
[0068]
在一个实施方式中，本发明包括含有对事件mirl62独特的核苷酸序列的分离的核酸分子。
[0069]
在另一个实施方式中，本发明包含分离的核酸分子，该核酸分子将插入至mir162基因组的异源dna分子连接至mir162中的基因组dna 中，其包含该异源dna分子的至少10个或更多(例如15、20、25、 50或更多)连续的核苷酸，以及位于该异源dna分子插入位点侧翼的基因组dna的至少10个或更多(例如15、20、25、50，或更多)连续的核苷酸。同样包括如下
核苷酸序列，这些核苷酸系列含有来自事件mir162的连续插入序列的10个或更多个核苷酸以及来自邻近该插入序列的事件mir162的侧翼dna的至少一个核苷酸。这类核苷酸序列是对事件mirl62是独特的和诊断性的。来自mir162的基因组dna的核酸扩增或杂交产生扩增子，该扩增子包含这类独特的序列，并且对于事件mirl62是诊断性的。在这一实施方式的一个方面中，该核苷酸序列是选自下组，该组构成为：seq id no：1、seq id no：38、seq idno：41、seq id no：45、seq id no：47、seq id no：49、seq id no： 55、seq id no：59，以及其互补物。
[0070]
在另一个实施方式中，本发明包括含有核苷酸序列(该核苷酸序列包含事件mir162的至少一个连接序列)的分离的核酸分子，其中连接序列横跨插入至该玉米基因组的异源表达盒以及来自该玉米基因组位于该插入位点侧翼的dna之间的接头，并且其对该事件是诊断性的。在这个实施方式的一个方面中，该连接序列选自下组，该组构成为： seq id no：45、seq id no：47，以及其互补物。
[0071]
在另一个实施方式中，本发明包含分离的核酸分子，该核酸分子将异源dna分子连接至事件mir162中的玉米植物基因组中，该核酸分子包含从约11至约20个连续核苷酸的序列，该序列选自下组，该组构成为：seq id no：45、seq id no：47，以及其互补物。
[0072]
在另一个实施方式中，本发明包含分离的核酸分子，该核酸分子含有选自下组的核苷酸序列，该组构成为：seq id no：1，seq id no： 38、seq id no：41、seq id no：45、seq id no：47、seq id no： 49、seq id no：55、seq id no：59，以及其互补物。在这个实施方式的一个方面中，该分离的核酸分子包含在一种玉米种子中，该种子以登记号为pta
‑
8166保藏在美国典型培养物保藏中心，或包含在由该种子长成的植物中。
[0073]
在本发明的一个实施方式中，提供了包含对事件mirl62独特的核苷酸序列的扩增子。在这个实施方式的一个方面中，该核苷酸序列选自下组，该组构成为：seq id no：1、seq id no：38、seq id no： 41、seq id no：45、seq id no：47、seq id no：49、seq id no： 55、seq id no：59，以及其互补物。
[0074]
在另一个实施方式中，本发明包含用于检测事件mirl62的侧翼序列引物。这类侧翼序列引物包含来自5'或3'侧翼序列的至少10至 15个连续核苷酸的核苷酸序列。在这个实施方式的一个方面中，该连续核苷酸选自seq id no：49的核苷酸1
‑
1088(包含两端)(在此任意地指定作为5'侧翼序列)，或其互补物。在这个实施方式的另一个方面中，该5'侧翼序列引物选自下组，该组构成为seq id no：36、 seq id no：39、seq id no：53、seq id no：68至80，以及其互补物。在这个实施方式的另一个方面中，这些连续的核苷酸选自seq idno：49的核苷酸9391
‑
10579(包含两端)(在此任意地指定作为3' 端侧翼序列)，或其互补物。在这个实施方式的还有另一个方面中，这些3'侧翼序列引物选自下组，该组构成为：seq id no：58，seq idno：97至105，及其互补物。
[0075]
在还有另一个实施方式中，本发明包含多核苷酸引物对，该引物对包含第一多核苷酸引物和第二多核苷酸引物，它们在样品中在事件 mir162 dna模板存在时共同起作用，以产生对事件mir162诊断性的扩增子。在这个实施方式的一个方面中，该第一引物和/或该第二引物选自seq id no：1或其互补物。在这个实施方式的另一个方面中，该第一引物和/或该第二引物选自下组，该组构成为seq id no：15至 35、seq id no：37、seq id no：42，以及其互补物。在这个实施方式的再一个方面中，由引物对产生的扩增子包含seq id no：1、
seq idno：38、seq id no：44，或者其互补物。
[0076]
在另一个实施方式中，本发明包含多核苷酸引物对，所述引物对包含第一多核苷酸引物和第二多核苷酸引物，它们在样品中在事件 mir162 dna模板存在时共同起作用以产生对事件mir162诊断性的扩增子，其中该第一引物是玉米植物基因组序列或是与其互补，该玉米植物基因组序列位于插入至该事件mir162的基因组中的异源dna序列的插入点的侧翼，且该第二多核苷酸引物序列是插入该事件mir162 基因组中的该异源dna序列，或是与其互补。
[0077]
在这个实施方式的一个方面中，该第一多核苷酸引物包含来自下述核苷酸序列的至少10个连续核苷酸，该核苷酸序列选自下组，该组构成为：seq id no：49的核苷酸1
‑
1088、seq id no：49的核苷酸 9391
‑
10579，以及其互补物。在这个实施方式中的另一个方面，该第一引物选自下组，该组构成为：seq id no：36，seq id no：39、seqid no：53、seq id no：57、seq id no：68至72、seq id no：79、 seq id no：80、seq id no：97至105，以及其互补物。在这个实施方式的另一个方面中，该第二多核苷酸引物包含来自seq id no：49 的位置1089
‑
9390的至少10个连续核苷酸，或者其互补物。在这个实施方式的又一个其他方面中，该第二多核苷酸引物选自下组，该组构成为：seq id no：15至35、seq id no：37、seq id no：40、seq idno：50至52、seq id no：54、seq id no：56、seq id no：57、seqid no：63、seq id no：73、seq id no：82、seq id no：96，以及其互补物。
[0078]
在这个实施方式的另一个方面中，该第一多核苷酸引物(在seq idno：36中给出)，以及该第二多核苷酸引物(在seq id no：37中给出)，在样品中在事件mir162 dna模板存在时共同起作用，以产生如实施例4所描述的对事件mir162诊断性的扩增子。在这个方面的一个实施方式中，该扩增子包含在seq id no：38中给出的核苷酸序列。
[0079]
在这个实施方式的再另一方面中，该第一多核苷酸引物(在seq idno：39中给出)，以及该第二多核苷酸引物(在seq id no：40中给出)，在样品中在玉米事件mir162 dna模板存在时共同起作用，以产生如实施例4所描述的对该玉米事件mir162诊断性的扩增子。在这个方面的一个实施方式中，该扩增子包含在seq id no：41中给出的核苷酸序列。
[0080]
在这个实施方式的另一方面中，该第一多核苷酸引物(在seq idno：53中给出)，以及该第二多核苷酸引物(在seq id no：54中给出)，在样品中在玉米事件mir162 dna模板存在时共同起作用，以产生如实施例5所描述的对该玉米事件mir162诊断性的扩增子。在一个实施方式中，该扩增子包含在seq id no：55中给出的核苷酸序列。
[0081]
在这个实施方式中的又另一个方面中，该第一多核苷酸引物(在 seq id no：58中给出)，以及该第二多核苷酸引物(在seq id no： 56中给出)，在样品中在玉米事件mir162 dna模板存在时共同起作用，以产生如实施例5所描述的对该玉米事件mir162诊断性的扩增子。在一个实施方式中，该扩增子包含在seq id no：59中给出的核苷酸序列。
[0082]
当然，本领域的技术范围之内容易获得进一步向外进入位于该插入的异源dna序列的任何一端侧翼的基因组序列中的额外的序列，以此用作引物序列，该引物序列可用于这类引物配对以扩增对该mir162 事件诊断性的序列。为了本披露的目的，短语“进一步向外进入位于该插入的异源dna序列的任何一端侧翼的基因组序列中”具体指序列运动，该运动远离该插入的异源dna序列的末端(插入的dna序列邻近天然基因组dna序列的点)并且向外进入该特定染色体的基因组dna (该异源dna序列被插入该特殊染色体)。优选地，对应于
该插入序列的一部分的引物序列或与该插入序列的一部分互补的引物序列应该将dna或rna的新生链的转录延长部分引(prime)向最近的侧翼序列接头。因此，对应于该基因组侧翼序列的一部分或与该基因组侧翼序列的一部分互补的引物序列应该引导dna或rna的新生链转录延长至最近的侧翼序列接头。引物序列能够是插入至该植物的染色体中的异源dna序列或基因组侧翼序列，或者能够与其互补。本领域的普通技术人员将很容易识别如下益处：引物序列是否需要是(或者是否需要是互补于)在该插入的异源dna序列中给出的或在seq id no：38中给出的序列决于通过使用嵌套的引物组所希望获得的产物的性质，这些引物旨在用于扩增特定的侧翼序列，该侧翼序列包含在该基因组 dna序列与该插入的异源dna序列之间的接头。
[0083]
在另一个实施方式中，本发明包括含有seq id no：2的分离的杀虫蛋白质，以及编码seq id no：2的核酸分子。在这个实施方式的一个方面中，该核酸分子是seq id no：1。本发明也包括含有异源启动子的嵌合基因，该异源启动子可操作地连接至该核酸分子，以及包含该嵌合基因的重组载体和宿主细胞。
[0084]
在还有另一个实施方式中，本发明包含检测在包含玉米核酸的样品中对于事件mir162独特的核酸分子存在的方法，其中该方法包括： (a)用多核苷酸引物对接触该样品，当用来自事件mir162的基因组dna用于核酸扩增反应时，该引物对产生对事件mir162诊断性的扩增子；(b)进行核酸扩增反应，由此产生该扩增子；并且(c)检测该扩增子。在这个实施方式的一个方面中，该扩增子包含选自下组的核苷酸序列，该组的构成为：seq id no：1、seq id no：38、seq id no： 41、seq id no：45、seq id no：47、seq id no：49、seq id no： 55、seq id no：59，以及其互补物。
[0085]
在另一个实施方式中，本发明包含检测在包含玉米核酸的样品中对事件mir162独特的核酸分子存在的方法，其中该方法包括：(a) 用探针接触该样品，该探针在高严格条件下与来自事件mir162的基因组dna杂交，并且它在高严格条件下不与在来自对照玉米植物的dna 杂交；(b)将该样品以及探针置于高严格杂交条件中；并且(c)检测该探针对该dna的杂交。能够通过本领域熟知的任何手段进行检测，包括萤光的、化学发光的、放射性的，免疫学的手段，等等。在杂交旨在被用作扩增特定序列的手段以产生对该mir162事件诊断性的扩增子的情况下，通过本领域熟知的任何手段进行的该扩增子的生产并检测旨在表示该目标序列的预期杂交，其中使用了探针或引物，或者用来表示一些序列的杂交，其中使用了两个或更多个探针或引物。术语“生物样品”旨在包括样品，该样品含有或被怀疑含有核酸，所述核酸包含在如下点的任一侧的五和十个之间的核苷酸，在该点处插入的异源dna序列的两个终止端的一个或另一个接触在该染色体内的该基因组dna序列(该异源dna序列被插入该染色体)，此处也被称为接头序列。另外，该接头序列包含少至两个核苷酸：它们是在该侧翼基因组dna内的第一核苷酸，邻近并共价连接至在该插入的异源dna 序列内的第一核苷酸。在这个实施方式的一个方面中，该探针包含选自下组的核苷酸序列，该组的构成为：seq id no：1、seq id no：38、 seq id no：41、seq id no：45、seq id no：47、seq id no：49、 seq id no：55、seq id no：59，以及其互补物。
[0086]
在还有另一个实施方式中，本发明包含试剂盒，该试剂盒用来检测在生物样品中对于事件mir162独特的核酸。该试剂盒包含至少核酸分子，它具有足够长度的连续聚核苷酸以便在核酸检测方法中起引物或探针的作用，并且当在样品中扩增靶核酸或与靶核酸杂
交随后检测该扩增子或与该靶序列的杂交时，这些聚核苷酸对在该样品中对事件 mir162独特的核酸序列的存在是诊断性的。该试剂盒进一步包括使核酸杂交或者扩增方法能够完成必需的其他材料。在这个实施方式的一个方面中，包含在该试剂盒中的核酸分子包括来自seq id no：1或 seq id no：49的核苷酸序列。在这个实施方式的另一个方面中，该核酸分子是选自下组的引物，该组的构成为：seq id no：15至37、 seq id no：39、seq id no：40、seq id no：42、seq id no：43、 seq id no：50至54、seq id no：56至58、seq id no：60至105，以及其互补物。在这个实施方式的还有另一个方面中，该扩增子包含 seq id no：1、seq id no：38、seq id no：41、seq id no：45、 seq id no：47、seq id no：49、seq id no：55、seq id no：59，或者其互补物。能够使用多种检测方法，包括但不限于taqman(perkinelmer)、热扩增、连接酶链式反应、dna杂交、elisa方法，以及比色和萤光检测方法。特别是本发明提供了用于在包含来自mir162的基因组核酸的样品中检测该靶序列(即，至少该vip3aa20序列或连接序列)存在的试剂盒。该试剂盒包含至少一个多核苷酸，该多核苷酸能够结合至该靶位点或基本上邻近该靶位点，以及至少一种手段，该手段用于检测该多核苷酸至该靶位点的结合。这些检测手段可为萤光的、化学发光的、比色的或者同位素的手段，并且可以至少与免疫学方法相偶联以检测该结合。还考虑了一种试剂盒，它能够在样品中检测该靶位点的存在，即，至少mir162的vip3aa20序列或连接序列，其中利用了两个或更多个多核苷酸序列，这些多核苷酸序列在一起能结合至核苷酸序列，这些核苷酸序列邻近该靶序列或在该靶序列的约100 个碱基对之内，或在约200个碱基对之内，或在约500个碱基对之内或在约1000个碱基对之内，并且这些多核苷酸序列能向彼此延伸以形成包含至少该靶位点的扩增子。
[0087]
在另一个实施方式中，本发明包含在生物样品中检测vip3aa20 蛋白质的方法，该方法包含：(a)从事件mir162组织中提取蛋白质； (b)采用包含由mir162事件产生的对vip3aa20蛋白质特异的抗体的免疫学方法测定该提取的蛋白质；并且(c)检测所述抗体与该 vip3aa20蛋白质的结合。
[0088]
在还有另一个实施方式中，本发明包含衍生自事件mirl62玉米植物、组织或者种子的生物样品，其中该样品包含核苷酸序列，该核苷酸序列是对事件mir162独特的序列或与事件mir162独特的序列互补的序列，并且其中该序列使用核酸扩增或核酸杂交方法能够在该样品中检测到。在这个实施方式的一个方面中，该核苷酸序列是或互补于 seq id no：1、seq id no：38、seq id no：41、seq id no：45、 seq id no：47、seq id no：49、seq id no：55，或seq id no：59。在这个实施方式的另一个方面中，该样品选自下组，该组构成为：玉米面、玉米粉、玉米糖浆、玉米油、玉米淀粉，以及全部或部分包含玉米副产物的制造的谷类。
[0089]
在另一个实施方式中，本发明包含衍生自mirl62玉米植物、组织或者种子的生物样品的提取物，它包含核苷酸序列，该核苷酸序列是对mir162独特的序列或与对mir162独特的序列互补。在这个实施方式的一个方面中，该序列用核酸扩增或核酸杂交的方法能够在该提取物中检测到。在这个实施方式的另一个方面中，该序列是seq id no： 1、seq id no：38、seq id no：41、seq id no：45、seq id no： 47、seq id no：49、seq id no：55，或seq id no：59，或者与上面的序列互补。在这个实施方式的还有另一个方面中，该样品选自下组，该组构成为：玉米面、玉米粉、玉米糖浆、玉米油、玉米淀粉，以及包含玉米副产物的全部
或部分制造的谷类餐品。
[0090]
本发明的另一个实施方式包含玉米植物，或其部分，以及来自玉米植物的种子，该玉米植物包含该转基因事件mirl62的基因型，其中该基因型包括在seq id no：1、seq id no：38、seq id no：41、seqid no：45、seq id no：47、seq id no：49、seq id no：55、seq idno：59中给出的核苷酸序列，或其互补物。包括本发明的核酸分子的玉米种子的一个实例于2007年1月23日保藏，且分配的atcc登记号为pta
‑
8166。在这个实施方式的一个方面中，该玉米植物来自近交玉米系cg5na58、cg5na58a、cg3nd97、cg5na01、cg5nf22、cg4nu15、 cg00685、cg00526、cg00716、np904、np911、np948、np934、np982、 np991、np993、np2010、np2013、np2015、np2017、np2029、np2031、 np2034、np2045、np2052、np2138、np2151、np2166、np2161、np2171、 np2174、np2208、np2213、np2222、np2275、np2276、np2316、bctt609、 af031、nph8431、894、butt201、r327h、2044bt，以及2070bt。然而本领域的技术人员将认识到该mirl62基因型能够被基因渗入至任何能用玉米繁殖的植物品种(包括野生型玉蜀黍物种)中，并因此这个实施方式的近交系列表并不意味着有限制性。
[0091]
在另一个实施方式中，本发明包含一种玉米植物，该植物包含至少第一dna序列和第二dna序列，它们连接在一起形成连续核苷酸序列，其中该第一dna序列在连接序列内并且包含至少约11个连续核苷酸，所述核苷酸选自下组，该组构成为：seq id no：49的核苷酸 1079
‑
1098、核苷酸9381
‑
9400，以及上述核苷酸的互补物，其中该第二dna序列在seq id no：49所给出的异源插入dna序列之内，及其互补物；并且其中该第一和第二dna序列作为核苷酸引物或探针在生物样品中用于检测玉米事件mir162核酸序列的存在是有用的。在这个实施方式的一个方面中，该核苷酸引物被用在dna扩增方法中以扩增从该玉米植物中提取的模板dna的靶dna序列，并且该玉米植物通过对应于包含seq id no：45或seq id no：47的dna序列的扩增子的生产可从其他玉米植物中鉴定出来。
[0092]
本发明的玉米植物的进一步特征可以在于，在高严格条件下使用 vip3aa20探针同时用限制性内切核酸酶kpni、ecorv或ncoi酶解该植物的基因组dna，分别产生约8kb、13kb或4.6kb的vip3aa20 杂交带。此处举例证明的是包含seq id no：13中给出的核苷酸序列的vip3aa20探针。
[0093]
本发明的玉米植物的进一步特征可以在于：在高严格条件下使用 pmi探针同时用限制性内切核酸酶acc65i或bamhi酶解该植物的基因组dna，产生单一的pmi杂交带。此处举例证明的是包含seq id no： 14中给出的核苷酸序列的pmi探针。
[0094]
在一个实施方式中，本发明提供了一种玉米植物，其中该mirl62 基因型给予该玉米植物昆虫抵抗性或利用甘露糖作为碳源的能力，或昆虫抵抗性及利用甘露糖作为碳源的能力。在这个实施方式的一个方面中，给予本发明的玉米植物以昆虫抵抗性的转基因的基因型包括 vip3aa20基因，且给予本发明的玉蜀黍植物以利用甘露糖作为碳源的能力的转基因的基因型包括pmi基因。
[0095]
在还有另一个实施方式中，本发明提供了用于生产抵抗鳞翅类害虫的玉米植物的方法，该方法包括：(a)第一亲代玉米植物与第二亲代玉米植物有性杂交，其中所述第一或第二亲代玉米植物包含事件 mir162 dna，由此产生多个第一代子代植物；(b)选择抵抗一种或多种鳞翅类昆虫的第一代子代植物；(c)自交该第一代子代植物，从而产生多个第二代子代植物；并且(d)从该第二代子代植物中挑选出抵抗一种或多种鳞翅类害虫的植物；其中
该第二代子代植物包含选自下组的核苷酸序列，该组的构成为：seq id no：1、seq id no：45、seqid no：47、seq id no：49、seq id no：55，以及seq id no：59。
[0096]
在另一个实施方式中，本发明提供了产生杂种玉米种子的一种方法，该方法包括：(a)种植第一近交玉米系的种子，该玉米系包含选自下组的核苷酸序列，该组的构成为：seq id no：1、seq id no：45、 seq id no：47、seq id no：49、seq id no：55以及seq id no： 59，并且种植具有不同基因型的第二近交系的种子；(b)培育来自所述种植的玉米植物直到开花的时期；(c)将这些玉米近交系中的一种的植物的所述的花去雄；(d)将这两种不同的近交系彼此有性杂交；并且(e)收获由此生产的杂交种子。在这个实施方式的一个方面中，该第一近交玉米系提供了母本。在这个实施方式的另一个方面中，该第一近交玉米系提供了父本。本发明也包含通过实施的方法产生的种子以及由该种子长成的杂种植物。
[0097]
本领域的一个普通技术人员将认识到mir162的转基因基因型能通过育种渗入至包含不同转基因基因型的其他玉米系中。例如，mir162 玉米近交能与包含鳞翅类抗性的bt11事件的转基因基因型的玉米近交杂交(美国专利第6,114,608号和第6,342,660号，通过引用而纳入本文)。得到的种子和子代植物具有堆积的昆虫抵抗特征及组合的 cry1ab和vip3aa20的活性谱。本发明包含的另一个特征堆积包括结合该mir162昆虫抵抗特征和该mir604昆虫抵抗特征(美国专利申请公开文件第2005/0216970号，公开于2005年9月29日，通过引用而纳入本文)。在得到的种子和子代植物中的堆积特征给予这些植物增大的活性谱；即，这些植物对于抵抗鳞翅类和鞘翅类的虫害是有效的。
[0098]
因此，本发明包含保护转基因玉米植物免受一种或多种虫害摄食损伤的一种方法，其中该方法包括在同样的转基因玉米植物中堆积 vip3aa20昆虫抵抗特征及不同于vip3aa20的另一昆虫抵抗特征，藉此这些堆积的特征保护该玉米植物免受一种或多种虫害的摄食损伤的程度大于单独由所述抗昆虫的特征所预期的程度。在这个实施方式的一个方面中，包含在事件mir162中的vip3aa20昆虫抵抗特征与包含在事件mir604中的cry3a055昆虫抵抗特征，通过事件mir162与事件 mir604有性杂交或通过将这些特征共同转化至同样的植物中而堆积在同一转基因玉米植物中。
[0099]
能与mir162近交杂交的其他转基因事件的实例包括，耐受草甘膦的ga21事件、耐受草甘膦/抵抗鳞翅类昆虫的mon802事件、抵抗鳞翅类的dbt418事件、雄性不育事件ms3、耐受草丁膦的事件b16、抵抗鳞翅类昆虫的事件mon80100、耐受草丁膦的事件t14和t25、抵抗鳞翅类昆虫的事件176，以及抵抗鞘翅类的事件mon863，所有这些在本领域都已知。将进一步认识到可以用本发明的转基因的基因型进行其他组合或堆积，并因此这些实例不应被看作是限制的。
[0100]
本领域的普通技术人员也将认识到包含该mir162基因型的转基因玉米种子能用不同的种子处理化学品(包括杀虫剂)进行处理，以增强或协同该vip3aa20蛋白质的杀虫活性。
[0101]
本主题发明在此披露了在玉蜀黍基因组中染色体5上的特异位点，该位点对于异源核酸的插入是极好的。还披露了一个5'分子标记(opie2；seq id no:106的核苷酸1680
‑
3338)以及一个3'分子标记(gag；seq id no:106的核苷酸43,275
‑
45,086)，它们在鉴定染色体5上的靶位点的位置时有用。因此，本主题发明提供了将相关异源核酸引入至这个预先建立的靶位点中或在这个靶位点的附近的方法。本主题发明还包含包括插入在本披露的靶
位点或该位点的总体附近的任何异源核苷酸序列的玉米种子和/或玉米植物。完成这类靶整合的一个选择是取代在此示范的vip3aa20表达盒的适当位置的不同的插入。在这总体方面，根据本主题发明可`使用靶向的同源重组(例如没有限制地)。“同源重组”是指在具有对应的位点(这些位点含有相似的核苷酸序列(即，同源序列))的任何核苷酸序列对之间的反应，通过这种反应这两个分子能相互作用(重组)以形成新的重组 dna序列。这些相似核苷酸序列的位点在此各自被称为“同源性序列”。总体而言，同源重组的频率随同源性序列的长度的增加而增加。因此，当在并非完全相同的两个核苷酸之间能发生同源重组时，该重组频率(或效率)随这两个序列之间趋异的增加而降低。在每个供体和靶分子上使用同源性序列可实现重组，由此产生了“单交换型”重组产物。替代地，可将两个同源性序列放置在每个靶核苷酸序列以及供体核苷酸序列上。在该供体上的两个同源性序列与在该靶上的两个同源性序列之间的重组产生了“双交换型”重组产物。如果在该供体分子上的同源性序列位于将被操作的序列(例如，相关序列)的侧翼，用该靶分子的双交换型重组将产生重组产物，其中该相关序列替换了 dna序列，该dna序列最初是位于该靶分子上的同源性序列之间。通过双交换型重组事件在该靶和供体之间的dna序列的交换被称为“序列置换”。这种类型的技术是，例如，美国专利申请公开文件号 2006/0253918(通过引用而纳入本文)的主题。随着该披露的靶位点目前被鉴定出来，并且利用在被鉴定出的靶位点周围的序列，技术人员将认识到可能使用其他方法进行异源核酸的靶向整合。这类方法(例如没有限制地)披露在美国专利申请公开文件号2007/0039074和美国专利申请公开文件号2006/0130179中。
[0102]
在一个实施方式中，本发明包含玉蜀黍染色体靶位点，该位点位于染色体5上在opie2分子标记物(作为seq id no：106的核苷酸 1680
‑
3338给出)以及gag分子标记物(作为seq id no：106的核苷酸43,275
‑
45,086给出)之间，其中该靶位点包含异源核酸。在另一个实施方式中，该玉蜀黍染色体靶位点位于染色体5上在seq id no: 106的核苷酸25,454
‑
25,513之间。在还有另一个实施方式中，该染色体靶位点的5'侧翼的是seq id no：106的核苷酸5,454
‑
25,454且 3'侧翼的是seq id no：106的核苷酸25,513
‑
45,513。
[0103]
在一个实施方式中，本发明包含制作转基因的玉蜀黍植物的方法，该方法包括在染色体5上位于opie2分子标记物(作为seq id no： 106的核苷酸1680
‑
3338个给出)以及gag分子标记物(作为seq id no： 106的核苷酸43,275
‑
45,086给出)之间的位置插入异源核酸。在另一个实施方式中，该异源核酸在染色体5上被插入seq id no:106 的核苷酸25,454
‑
25,513之间。在还有另一个实施方式中，该插入的异源核酸的5'侧翼的是seq id no：106的核苷酸5,454
‑
25,454且 3'侧翼的是seq id no：106的核苷酸25,513
‑
45,513。
[0104]
本发明的转基因基因型能够采用本领域公认的育种技术渗入至任何玉米近交或杂种中。植物育种的目标是将不同的希望的特征结合在单一品种或杂交种中。对于大田作物而言，这些特征可能包括对昆虫和疾病的抵抗性、对除草剂的耐受、对热和旱的耐受、减少农作物成熟的时间、更大的产量，以及更好的农艺学质量。随着许多农作物的机械收获，植物特征(例如发芽和植物丛建立，生长速率、成熟，以及植物和耳穗的高度)的均一性是很重要的。
[0105]
大田作物是通过利用了植物授粉方法的技术来培育。如果来自一朵花的花粉被转移至同一植物的同一朵花或另一朵花，则该植物是自我授粉的。如果花粉来自不同植物的花，则该植物是异花授粉的。
[0106]
已经自花授粉及针对类型进行了许多代选择的植物在几乎所有基因位点变得纯合，并产生纯育子代的均一群体。在两种不同纯合系之间的杂交产生杂种植物(对很多基因位点可能是杂合的)的均一群体。两种植物(每个在很多基因位点上是杂合的)的杂交将产生遗传上不同的并且将是不均一的杂种植物的群体。
[0107]
玉米(玉蜀黍)能通过自花受粉和异花授粉两种技术培育。玉米在同一个植物上具有单独的雄花和雌花，分别位于雄花穗和耳穗上。当风将花粉从雄花穗吹到从耳穗顶突出的花丝时，发生玉米的自然授粉。
[0108]
在植物中控制雄性能育性的可靠方法为改善的植物育种提供了机会。这对依赖于某些雄性不育系统的玉米杂种的发展尤其是成立的。对培育者而言有几个可用的控制雄性能育性的选择，例如，手工或机械去雄(或去雄花穗)、细胞质的雄性不育性、遗传雄性不育性、杀配子药等等。
[0109]
杂种玉米种子通常通过结合手工或机械去雄花穗的雄性不育系统而典型地产生。两个玉米近交在交错的条中种植在一块地上，并且从一个近交(雌性)中去除带花粉的雄花穗。假如能足够隔离外来玉米花粉源，则该去雄花穗近交系的耳穗将只从另一个近交系(雄性)受精，并且因此得到的种子是杂种，并将形成杂交植物。
[0110]
通过使用本领域中给予遗传的雄性不育的许多方法(每种方法都有其自身的优点和缺点)中的一种方法能够避免这种费力的且有时不可靠的去雄花穗的方法。这些方法采用多种方式，例如在植物中传递一种基因，该基因编码一种细胞毒物质，该细胞毒物质与雄性组织特异性启动子或反义系统相关，其中对生育力至关重要的基因被鉴定出来，并且该基因的反义物被插入至该植物中(参见：fabinjanski等 epo 89/3010153.8公开文件号329,308和公开号为wo 90/08828的 pct公开文件pct/ca90/00037)。
[0111]
使用雄性不育近交只是玉米杂种生产中的一个因素。本领域已知的且在玉米植物育种计划中使用的植物育种技术包括但不限于，回归选择、回交、系谱育种、限制长度多态性增强的选择、遗传标记物增强的选择和转化。在玉米植物育种计划中玉米杂种的发展总体上需要纯合近交系的发展、这些系的杂交、并且这些杂交的评估。系谱育种和回归选择育种方法被用于开发来自繁殖群体的近交系。玉米植物育种计划结合了来自两个或多个近交系或各种其他种质源的遗传背景进入育种库中，从该库中通过自交和选择所希望的表型而发展新近交系。这些新近交与其他近交系杂交，并且评价来自这些杂交的杂种以确定它们当中哪些具有商业潜力。如在玉米植物育种计划中所实践的，植物育种和杂种开发是昂贵且耗时的过程。
[0112]
系谱育种开始于两个基因型的杂交，其中每个基因型可能具有一个或多个所希望的特征，该特征在另一个中缺乏或与补充另一个。如果这两种原始的亲本不能提供全部所期望的特征，则可将其他源包含在该繁殖群体中。在该系谱方法中，优良植物自交并在连续后代中进行选择。在这些后续代中，因为自我授粉和选择该杂合条件对均质系 (homogeneous lines)让步。典型地，在自我授粉及选择的培育五代或更多代的系谱方法中，实行如下：f1→
f2；f2→
f3；f3→
f4；f4→
f5；等。
[0113]
回归选择育种，例如回交，可用于改善近交系及用这些近交产生的杂种。回交可被用于将特异的希望的特性从一个近交系或来源转移至缺乏该特性的近交系。这可通过例如将优良的近交(回归亲本)与携带所考虑的特性的适宜的一个或多个基因的一个供体近交
(非回归亲本)杂交来完成。然后将这种杂交的子代与该优良的回归亲本配对，然后在得到的子代中选择将从该非回归亲本处转移的所希望的特性。选择了所希望特性的五代或更多代回交代之后，子代对控制被转移的特性的位点将是纯合的，但对基本上所有其他基因将与该优良的亲本相像。然后，最后回交的子代进行自交以便为被转移的一个或多个基因给出纯育种子代。从包含被转移的一个或多个基因的近交中发展的杂种与从没有该被转移的一个或多个基因的同样近交发展的杂种基本上是一样的。
[0114]
良种近交系，即，纯种繁育的、纯合近交系，还可作为起始材料被用于育种或种源群体，由此发展其他近交系。衍生自良种近交系的这些近交系能用以上描述的系谱培育和回归选择育种方法来发展。作为一个实例，当在玉米植物育种计划中使用回交育种以创造这些衍生品系时，良种近交能够被用作亲本系或起始材料或种源群体，并且能够作为供体或回归亲本。
[0115]
单交玉米杂种来自两个近交系的杂交，这两个近交系中的每个具有这样的基因型，该基因型补充另一个的基因型。该第一代的杂种子代被指定为f1。在玉米植物育种计划中的商品杂种的发展中，只寻找 f1杂种植物。优选的f1杂种比它们的近交亲本更有活力。这种杂种活力，或杂种优势，在许多的多基因特性中能够证明，包括增强的植物生长及增大的产率。
[0116]
在玉米植物育种计划中的玉米杂种的发展涉及三个步骤：(1)从不同种质库选择植物用于起始育种杂交；(2)从几代的育种杂交中选择的植物进行自交以产生一系列近交系，虽然这些近交系彼此不同，但是它们纯育传代且高度均一；并且(3)将被选择的近交系与不同的近交系杂交以产生杂种子代(f1)。在玉米的近系繁殖过程中，这些品系的活力下降。当两种不同近交系杂交以产生杂种子代(f1)时活力被恢复。这些近交系的纯合性和均一性的重要结果是在已限定的一对近交之间的杂种将总是一样的。一旦提供优良杂种的近交被鉴定出来，只要保持该近交亲本的均一性，就能无限地复制该杂种种子。
[0117]
当两个近交系进行杂交以生产该f1子代时就产生单杂交杂种。双杂交种是从成对杂交的四个近交系(a x b)x(c x d)中产生，并且接着该两个f1杂种再次进行(a x b)x(c x d)杂交。三系杂交杂种是从三个近交系产生，其中这三个近交系中的两个(a x b)杂交，并且接着将所得到的f1杂种与该第三个近交进行杂交(a x b)x c。通过f1杂种展示的多数杂种活力在下一代(f2)中消失。因此，来自杂种的种子不用于种植。
[0118]
杂种的种子生产需要将通过该母本产生的花粉消除或失活。花粉的不完全去除或失活为自花授粉提供了可能性。这个不注意地自我授粉的种子可能无意中与杂种种子一起收获并包装。
[0119]
一旦该种子被种植，有可能鉴定并选择这些自花授粉的植物。这些自花授粉的植物将与用于产生该杂种的雌性近交系在遗传上是相当的。
[0120]
典型地，这些自花授粉的植物因其下降的活力能被鉴定并选出。雌性自交后代通过它们生长的和/再生的特征方面的更少的活力表现 (包含更短的植物高度，小的耳穗大小、耳穗与内核形状、穗轴颜色，或其他特征)而被鉴定出来。
[0121]
这些自花授粉系的鉴定也可通过分子标记分析而实现。参见，"theidentification of female selfs in hybrid maize:a comparisonusing electrophoresis and morphology(在杂种玉蜀黍中雌性自交后代的鉴定：使用电泳和形
态学进行的比较)",smith,j.s.c.和 wych,r.d.,seed science and technology(种子科学和技术)14, pp.1
‑
8(1995)，其披露通过引用明确地纳入本文。通过这些技术，自花授粉系的纯合性能通过分析沿着该基因组在不同位置上的等位基因的组成而得到验证。这些方法允许快速鉴定在此披露的本发明。也参见，"identification of atypical plants in hybrid maize seedby postcontrol and electrophoresis(通过后控制和电泳鉴定杂种玉蜀黍中的不合型植物)"sarca,v.等,probleme de geneticateoritica si aplicata vol.20(1)p.29
‑
42。
[0122]
如本领域技术人员很清楚的是，前述只是多种方式中的一些方式，通过这些方式那些寻求将本发明的转基因的基因型渗入至其他玉米系的人们可获得本发明的近交。还有其他可供使用的手段，并且上述实施例仅用作说明。
[0123]
以下实施例仅旨在说明本发明的一个或多个优选的实施方案，并且不应被解释为限制本发明的范围。
实施例
[0124]
实施例1.mir162事件的转化和选择
[0125]
mir604事件由专有玉米(玉蜀黍)系的土壤杆菌属介导的转化而产生。未成熟胚的转化基本上如negrotto等所描述(plant cellreports 19:798
‑
803,2000)(通过引用而纳入本文)，使用了来自质粒pnov1300(seq id no：3)的dna片段。pnov1300包含含有串联表达盒的核苷酸序列。第一表达盒包含来自玉蜀黍多泛素基因的zmubiint启动子区，其包含可操作地连接至vip3aal9编码序列的第一内含子(登录号s94464)，所述编码序列进一步可操作地连接至来自玉蜀黍的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(登录号 x15239)的pepc内含子#9(matsuoka和minami,1989.european j. of biochem.181:593
‑
598)以及来自花椰菜花叶病毒基因组(与登录号af140604相似)的35s rna的35s终止序列。它的作用是提供多聚腺苷酸化序列(franck等,1980.cell 21:285
‑
294)。 pnov1300中的vip3aal9基因包含合成的玉蜀黍最佳化的vip3aa编码序列(estruch,等,1999.)，该序列被合成以适应玉米的优选密码子使用(murray等,1989)。在植物转化中使用的合成的vip3aal9编码序列如天然vip3aal编码序列(发现于土壤细菌苏云金芽胞杆菌菌株 ab88(美国专利第5,877,012号))一样对相同的氨基酸序列进行编码，除了在284位置上一个单一的氨基酸不同；天然vip3aal编码序列编码赖氨酸，而该合成的vip3aal9编码序列在这个位置编码谷氨酰胺。该vip3aal9编码序列编码一种昆虫防治蛋白质，vip3aal9，它提供对鳞翅类昆虫的抵抗性。第二表达盒由可操作地连接至编码磷酸甘露糖异构酶(登录号m15380)的pmi编码序列(也称为e.colimana)的zmubiint启动子组成，所述异构酶催化甘露糖
‑6‑
磷酸异构化成果糖
‑6‑
磷酸(negrotto等,2000)。该pmi编码序列进一步可操作地连接至胭脂碱合酶3'末端转录终止及多聚腺苷酸化序列。
[0126]
从8至12天的耳穗上切除未成熟胚并用新鲜的培养基冲洗以为转化作准备。将胚与包含转化载体pnov1300的土壤杆菌属细胞的悬浮液混合，涡旋30秒，并允许温育另外5分钟。抽吸包含土壤杆菌属的过量溶液，并接着将胚移至含有非选择性培养基的盘子。胚在22℃、黑暗条件下与剩余的土壤杆菌属共培养2至3天。将胚被转移至补充了替卡西林(100mg/
ml)和硝酸银(1.6mg/l)的培养基中，并在黑暗条件下温育10天。产生胚发生的愈合组织的胚被转移至含有甘露糖的细胞培养基中。
[0127]
用pcr分析(参见实施例2)测定再生的小植株，以测定pmi和vip3aal9这两种基因的存在，以及抗生素抗性大观霉素(spec) 基因的缺乏。后来发现(参见下面实施例4)，在转化过程中两个突变被引入至该vip3aal9编码序列中，其中之一在该vip3aal9蛋白质中产生一个氨基酸改变。因此，这个新的vip3aa编码序列(它对事件 mir162是独特的)被指定为vip3aa20。该vip3aa20编码序列在129 位置编码异亮氨酸，以代替由所述vip3aal9基因编码的甲硫氨酸残基。
[0128]
对两种转基因阳性并且对spec基因阴性的植物被转移至温室中进一步繁殖。通过使用抗秋夜蛾的昆虫生物测定鉴定并筛选出阳性事件。通过taqman分析就拷贝数表征杀虫事件。基于具有单一拷贝的该转基因、如用elisa鉴定出的良好的蛋白质表达，以及良好的抗秋夜蛾的杀虫活性选择mir162进行进一步分析。
[0129]
该mir162事件的育种系谱如下：t
0 mir162植物(x nph8431)
→→ꢀ
nph8431(mir162)f1(x np2161)
→
np2161(mir162)f1(x np2161)
→
np2161(mir162)bc1f1(x b9620)
→
f1(x b9620)
→
bc1f1(x b9620)
→
bc2f1(x b9620)
→
bc3f1(x b9620)
→
bc4f1(x b9620)。将来自bc4代的植物材料用于dna分析、插入dna的拷贝数确定和测序。这些实验的阴性对照由来自bc4代的10个阴性分离子植物组成。
[0130]
实施例2.通过taqman pcr检测mir162
[0131]
taqman分析基本如ingham等描述的(biotechniques, 31:132
‑
140,2001)(通过引用将其纳入本文)来进行。简言之，基本上根据生产者的说明(除了所有步骤在1.2ml的96
‑
孔板中进行以外) 使用genomic dna extraction试剂盒(gentra systems, minneapolis,mn)从转基因和非转基因玉米植物的叶子分离基因组 dna。干燥的dna沉淀在te缓冲液(10mm tris
‑
hcl,ph 8.0,1mm edta) 中重悬。
[0132]
taqman pcr反应在96
‑
孔板中进行。为内源的玉米基因对照，设计对玉蜀黍醇脱氢酶(adhi)编码序列特异的引物和探针(genbank登录号af044295)。技术人员将认识到其他玉米基因可用作内源对照。进行多重反应以同时扩增vip3aa和adhi或者pmi和adhi。对于每个样品而言，通过将20μl提取的基因组dna结合35μl 2x taqmanuniversal pcr master mix(applied biosystems)(补充引物至每个最终浓度为900nm、补充探针至每个最终浓度为100nm，以及补充水至最终体积为70μl)而产生一个主要混合物。将这个混合物分配至 96
‑
孔扩增板中，一式3份，每份20μl，并用光学上通透的热封膜密封(marsh bio products)。在abi prism 7700仪器中运行pcr，使用以下扩增参数：在50℃下2分钟，和在95℃10分钟，之后35个循环的在95℃下15秒和60℃下1分钟。
[0133]
taqman分析的结果显示事件mir162具有一个拷贝的vip3aa20基因以及一个拷贝的pmi基因。
[0134]
用于taqman pcr反应的引物和探针显示在表1中。
[0135]
表1.用于taqman测定的引物
[0136][0137]
实施例3.用dna印迹法检测mirl62
[0138]
用于dna分析的基因组dna基本上用thomas等的方法(theor. appl.genet.86:173
‑
180,1993)(通过引用纳入本文)，从代表mir162 的bc4代的10棵植物的汇集的叶组织中分离出来。用于dna分离的所有植物用taqman pcr(如实施例2所描述的)逐个进行分析以确认存在单个拷贝的vip3aa20基因和pmi基因。对于阴性分离子对照，dna 从bc4代的阴性分离子的汇集的叶组织中分离出来。这些阴性分离子植物用taqman pcr逐个进行分析以确认vip3aa20和pmi基因的缺失，但如所预期，它们对内源玉蜀黍adhi基因呈阳性。
[0139]
使用常规的分子生物学技术进行dna分析(参见chomczynski,p. 1992.analytical biochemistry 201:34
‑
139)。基因组dna(7.5μg) 用限制性内切酶进行酶解，这些限制性内切酶在事件mir162插入物内酶解，但在对应于本实验使用的特异探针的编码序列内不酶解。这个方式允许确定并入事件mir162中的每个基因的拷贝数目，对应于用于每个dna分析的特异探针。
[0140]
进行了另一个系列的限制性酶解，其中用限制性内切酶酶解该插入物，这将从该插入物中释放已知大小的片断。这个方法为在mir162 中存在单个拷贝的各编码序列提供了额外的证据，并允许检测可能被紧密地连接至mir162插入物的插入物的部分拷贝。在琼脂糖胶电泳以及碱转移至一个gt膜(bio
‑
rad,cat.no.162
‑
0195) 后，使用全长的pcr产生的元件探针进行杂交。这些探针使用 megaprime
tm
系统(amersham biosciences,cat.no.rpn1607)通过随机引物法用
32
p进行标记。在65℃进行杂交，随后在2x ssc,0.1％sds 中，并且接着在0.1x ssc和0.1％sds中多次冲洗。接着对这些膜进行放射自显影。
[0141]
在每个dna分析中包含了三个对照样品：(1)来自阴性(非转化的)分离子的dna，用于鉴定任何内源性的可能与元件特异性探针交叉杂交的玉蜀黍序列；(2)来自阴性分离子的dna，在该分离子中引入了一定量的酶解的pnov1300，该酶解的量与基于质粒大小被引入的一个拷贝数相等，用于表明本实验在检测玉蜀黍基因组内的单个基因拷贝中的敏感性；
以及(3)经酶解的pnov1300质粒，其等于基于质粒大小的一个拷贝数，用于作为杂交的阳性对照以及表明本实验的敏感性。
[0142]
dna分析的结果表明该mirl62插入物包含单个vip3aa20基因和 pmi基因，并且不包含pnov1300主链序列。vip3aal9探针(seq id no： 13)用于进行vip3aa20 dna分析。vip3aal9和vip3aa20的核苷酸序列由两个核苷酸相区别，且99.9％是相同的。因此，该vip3aal9探针在严格条件下与存在于mir162中的vip3aa20序列杂交。使用该 vip3aal9探针，kpni和ecorv酶解分别产生约8kb和13kb大小的单一杂交带。此外，ncoi双酶解产生与预期的4.6kb大小一致的单一杂交带。使用该pmi探针(seq id no：14)，acc65i和bamhi酶解分别产生约4kb和6kb大小的单一杂交带。此外，xmai hindiii双酶解产生与预期的8.1kb大小一致的单一杂交带。该8.1kb xmai hindiiipnov1300带(阳性对照)也如预期与该vip3aal9和pmi探针杂交。用 dna梯度探针在仅有质粒的道中检测出一些交叉杂交。典型的可商购的dna梯度可能含有一些载体序列，这些载体序列能如在这些实验中观察到的那样与质粒对照序列交叉杂交，但这不影响本研究的发现。最终，pnov1300主链探针没有杂交表明在转化过程中没有任何 pnov1300载体主链序列并入mir162中。
[0143]
实施例4.异源dna插入物测序
[0144]
确定了插入mir162的异源dna分子中的vip3aa和pmi编码序列的核苷酸序列，以表明该插入物的整体的完整性、功能元件的连续性，并检测任何单独的碱基对变化。从衍生自bc4代的dna扩增编码序列。采用expand high fidelity pcr系统(roche,cat.no.1732650)或 pfuultra
tm
hotstart high
‑
fidelity dna聚合酶(stratagene,cat.no. 600390)进行pcr扩增。每个pcr产物被单独地克隆至载体(invitrogen,cat.no.k4700
‑
20)或载体(invitrogen,cat.no.k2800
‑
20)中，并且对每个pcr产物的三个单独的克隆进行鉴定并测序。使用abi1.1或big dye 3.1 dgtp(用于gc丰富的模板)化学法使用abi3730xl分析仪进行测序。使用来自华盛顿大学(university of washington)的phred、phrap 和consed包进行序列分析，并且该序列分析进行的误差率少于10,000 个碱基中1个(ewing&green,1998.genome research 8:186
‑
194)。每个基因的最终一致序列通过结合来自三个单独的克隆的序列数据进行确定以针对每个基因产生一个一致序列。采用clustalw程序使用下列参数进行序列对比：记分矩阵(scoring matrix)blosum55、空位开放罚分(gap opening penalty)15、空位延伸罚分(gap extensionpenalty)6.66(thompson等,1994.nucleic acids research 22:4673
‑
4680)。
[0145]
完整的vip3aa20编码序列采用下列引物和pfuultra hotstart 酶进行pcr扩增：mov3aa
‑
01
‑
5'：5'atgaacaagaacaacaccaa3'(seq idno：15)以及mov3aa
‑
01
‑
3'：5'ctacttgatgctcacgtcgtag3'(seq idno：16)，产生一个2370bp产物。该pcr扩增子使用表2中所示的引物进行测序。
[0146]
表2
[0147][0148][0149]
两个其他的pcr反应重叠了完整的vip3aa20编码序列。vip3aa20 的5’末端使用下列引物和expand high fidelity酶用一个pcr扩增覆盖：162insert
‑
f2：5'acaccaatgatgcaaataggc3'(seq id no：36) 以及vip_r4 5'gaaggtgttcaggtagaactcgaag3'(seq id no：37)。第二个反应覆盖了vip3aa20的3’末端；该产物用下列引物和expandhigh fidelity酶扩增：vip
‑
f3:5'ggtgctgttcgagaagaggt3'(seq idno：42)以及pmi_rev1:5'cgatttatcactctcaatcacat3'(seq id no： 43)。由这些反应产生的扩增子分别包含2946bp的核苷酸序列(seq idno：38)和2577bp的核苷酸序列(seq id no：44)。
[0150]
一致序列数据揭示，与pnov1300中的vip3aa编码序列(被指定为 vip3aa19)(它被用于转化mir162)相比，mir162中的vip3aa编码序列(被指定为vip3aa20)中有两个核苷酸变化。第一个核苷酸变化，一个g至t的突变，发生在vip3aa19编码序列(seq id no：3)的 387位置。这一突变导致vip3aal9的129位置的甲硫氨酸变为 vip3aa20的异亮氨酸(m129i)。第二个核苷酸变化发生在编码序列的 1683位置，一个g至c的突变，但不产生氨基酸的变化。因此，该 vip3aa20编码序列和该vip3aa20蛋白质对mir162事件是独特的，并可用于鉴定包含该mirl62转基因的基因型的任何植物。该pmi编码序列mirl62与转化质粒pnov1300中的序列相同。vip3aa20和vip3aal9 杀虫蛋白质的比对显示在表3中。
[0151]
表3.vip3aa20和vip3aal9的氨基酸序列的比较。
[0152]
[0153][0154]
阴影框表示氨基酸变化。
[0155]
实施例5.侧翼dna序列的分析
[0156]
本领域的技术人员已知很多方法来扩增邻近已知序列的核心区的未知dna序列。那些方法包括但不限于，反向pcr(ipcr)[ochman 等,genetics 120:621
‑
623(1988)；triglia等,nucleic acidsres.16:8186(1988)]，锅柄pcr[jones和winistorfer,nucleicacids res.20:595
‑
600(1992)；jones和winistorfer， biotechniques 23:132
‑
138(1997)]，盒连接锚定pcr[mueller和 wold,science 246:780
‑
786(1989)]，小载体pcr[riley等,nucleicacids res.18:2887
‑
2890(1990)]，新型
‑
alu
‑
pcr[puskas等,核酸研究(nucleic acids res.)22:3251
‑
3252(1994)]，以及热不对称交错pcr(tail
‑
pcr)[liu和whittier,genomics 25:673
‑
681 (1995)]。
[0157]
用于扩增位于插入至事件mir162的异源dna侧翼的玉米基因组 dna序列的一个方法是小载体pcr，基本如riley等,nucleic acidsres.18:2887
‑
2890(1990)所描述(通过引用纳入本文)。
[0158]5’
侧翼序列和连接序列用标准pcr方法进行确认。使用下列引物对，或其互补序列来确认该序列：162insert
‑
f2：5'acaccaatgatgcaaataggc3'(seq id no：36)/vip_r4： 5'gaaggtgttcaggtagaactcgaag3'(seq id no：37)和cjb179： 5'atgcaaataggctgggaatagtc3'(seq id no：39)/cjb134 5'gtaccagcttgctgagtggct3'(seq id no：40)。所得到的扩增子具有如seq id no：41显示的序列，并包含seq id no：45的5'连接序列。应认识到，其他引物序列也可用于确定该侧翼序列和连接序列。使用这个方法，发现该mir162插入物5'侧翼于seq id no：46中显示的玉米基因组序列的核苷酸1040
‑
1088。
[0159]
来自事件mir162的5'侧翼序列的更大的区域用seegene dnawalking speedup
tm
premix试剂盒按照生产者的说明而生成。
[0160]
在四个单独的试管中用引物fe1002： 5'cgtgactcccttaattctccgct3'(seq id no：50)与由生产者提供的 dw
‑
acp 1、2、3或4引物中的一个独立地进行第一pcr反应。在冰上在pcr试管中混合下列试剂：100μg mir162基因组dna、4μl 2.5 μm dw
‑
acp(每个具有dw
‑
acp 1,2,3或4)、4μl 2.5μm fe1002、 19μl蒸馏水，以及25μl 2x seeamptm acptm master mix ii。将这些试管放置在一个预热的(94℃)热循环器中。用下列程序完成 pcr：一个循环的94℃下5分钟、42℃下1分钟及72℃下2分钟，30 个循环的94℃下40秒、55℃下40秒及72℃下90秒，和一个循环的 72℃下7分钟。该pcr产物用外切核酸酶i(exonuclease i)和shrimp 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)进行纯化。
[0161]
在四个单独的试管中用引物fe1003： 5'gatcagattgtcgtttcccgcctt3'(seq id no：51)与由试剂盒的生产者提供的dw
‑
acpn引物独立地进行第二pcr反应。在冰上在pcr试管中混合下列试剂：3μl纯化的pcr产物、1μl 10μm dw
‑
acpn、 1μl 10μm fe1003、5μl蒸馏水以及10μl 2x seeamptm acptmmaster mix ii。这些试管放置在一个预热的(94℃)热循环器中。用下列程序完成pcr：一个循环的94℃下5分钟，35个循环的94℃下40 秒、60℃下40秒及72℃下90秒，和一个循环的72℃下7分钟。
[0162]
在四个单独的试管中用引物fe1004： 5'gattgtcgtttcccgccttcagtt3'(seq id no：52)与由生产者提供的 universal引物独立地进行第三pcr反应。在冰上在pcr试管中混合下列试剂：2μl纯化的pcr产物、1μl 10μm universal引物、 1μl 10μm fe1004、6μl蒸馏水，以及10μl 2x seeamptm acptmmaster mix ii。这些试管放置在一个预热的(94℃)热循环器中。用下列程序完成pcr：一个循环的94℃下5分钟，35个循环的94℃下 40秒、60℃下40秒及72℃下90秒，和一个循环的72℃下7分钟。
[0163]
10μl的pcr产物在含有溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶上跑胶。从该琼脂糖凝胶取出适宜的条带，并根据生产者的说明用qiagen qiaquickgel extraction试剂盒进行纯化。将提取的dna根据生产者的说明克隆至invitrogen topo
‑
xl克隆载体中。将这个克隆转化至e.coli 中，并且根据生产者的说明用qiagen miniprep试剂盒从过夜生长后的这些细胞中提取该质粒dna。这个质粒被用于末端运行测序(end runsequencing)。
[0164]
在新的、先前未知的序列内设计一个新引物以与在该异源dna插入物中的一个引物用于扩增该基因组dna之外的完整的1kb的侧翼序列。使用了侧翼序列引物162dwconf3： 5'cctgtgttgttggaacagacttctgtc3'(seq id no：53)以及插入物dna 引物fe0900：5'ggctccttcaacgttgcggttctgtc3'(seq id no：54)来扩增包含5’侧翼序列的核酸分子以便进行确认。得到的扩增子序列在seq id no：55中给出。这个5’扩增子包含在seq id no：45中给出的5’连接序列。10μl的该pcr产物(扩增子)在包含溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶上跑胶。从该琼脂糖凝胶中取出适宜的条带，并根据生产者的说明用qiagen qiaquick gel extraction试剂盒进行纯化。将提取的dna根据生产者的说明克隆至invitrogen topo
‑
xl克隆载体中。将这个克隆转化至e.coli中。根据生产者的说明用qiagenminiprep试剂盒从在培养基中过夜生长后的这些细胞中提取质粒 dna。三个质粒用列于表4的引物进行完全测序。对这些质粒序列进行比对以产生完整的确认的5’侧翼序列。采用这一方法，确定出约1kb 的5’侧翼序列(seq id no：46)。
[0165]
表4.引物序列
[0166][0167]
来自事件mirl62的3’侧翼序列按照生产者的说明用clonetechgenomewalker
tm
universal试剂盒(clonetech laboratories,inc.) 产生。
[0168]
首先，构建未克隆的衔接子连接的基因组dna片断库，被称为 genomewalker“文库”。每个文库如下通过用一个限制性酶(drai、 ecorv、pvuii、stui和xmni)酶解该mir162基因组dna来构建：例如，将25μl mir162基因组dna(0.1μg/μl)、8μl限制性酶(10单位/μl)、10μl限制性酶缓冲液(10x)，以及57μl蒸馏水在试管中混合并在37℃温育过夜。
[0169]
然后用几轮苯酚/氯仿提取来纯化dna。最后，沉淀该dna，并用乙醇冲洗，干燥，并溶解于20μl的te缓冲液中。
[0170]
为将该genomewalker衔接子末端连接至该mir162基因组dna上，将4μl经酶解的纯化的基因组dna与1.9μl genomewalker衔接子(25 μm)、1.6μl 10x连接缓冲液，以及0.5μl t4 dna连接酶(6个单位 /μl)混合。这些反应在16℃下温育过夜。用70℃下温育五分钟来停止这些反应。该反应停止后，将72μl te加至每个试管中，并且将内容物彻底混合。
[0171]
用由生产者提供的引物ap1与在已知的异源插入dna序列内设计的不同引物(第1轮“基因特异性引物”或“gsp1”)进行第一pcr 反应。在冰上在pcr试管中混合下列试剂：1μl适宜的mir162 dna 文库、1μl 10μm ap1、1μl 10μm gsp1、1μl 10mm dntps、 5μl 10x advantage 2 pcr缓冲液、1μl bd advantage 2聚合酶，以及40μl蒸馏水。用下列程序完成
pcr：7个循环的94℃下25秒以及72℃下4分钟，32个循环的94℃下25秒以及67℃下4分钟，和一个循环的67℃下4分钟。每个原始pcr反应通过添加1μl原始pcr 产物及49μl蒸馏水稀释50倍。进行的反应是(1)drai和xmni文库用gsp1引物162gw3f1：5'tctcttgctaagctgggagctcgatccg3'(seq idno:56)和引物ap1。
[0172]
采用由生产者提供的引物ap2与在已知的异源插入dna序列内设计的不同引物(第2轮“基因特异性引物”或“gsp2”)独立地进行第二pcr反应。在冰上在pcr试管中混合下列试剂：1μl适宜的稀释的原始pcr产物、1μl 10μm ap2、1μl 10μm gsp2、1μl 10mm dntps、5μl 10x advantage 2 pcr缓冲液、1μl bd advantage 2聚合酶，以及40μl蒸馏水。用下列程序完成pcr：5个循环的94℃下25秒以及72℃下4分钟，20个循环的94℃下25秒以及67℃下4 分钟，和一个循环的67℃下4分钟。进行的反应是(1)drai和xmni 文库用gsp2引物162gw3f2：5'aagattgaatcctgttgccggtcttgcg3' (seq id no：57)和引物ap2。
[0173]
10μl的pcr产物在包含溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶上跑胶。从该琼脂糖凝胶取出适宜的条带，并根据生产者的说明用qiagen qiaquickgel extraction试剂盒进行纯化。将提取的dna根据生产者的说明克隆进invitrogen topo
‑
xl克隆载体中。将这个克隆转化至e.coli 中，并且根据生产者的说明用qiagen miniprep试剂盒从过夜生长后的细胞中提取该质粒dna。这个质粒用末端运行测序进行测序。
[0174]
在新的先前未知的序列中设计一个新引物，用于与在该插入dna 中的一个引物扩增基因组dna之外的约1kb的3'侧翼序列。该插入 dna引物162gw3f1：5'tctcttgctaagctgggagctcgatccg3'(seq id no： 56)和3'侧翼序列引物1623'gwr1：5ctggtgaaccgatttttacggagg3' (seq id no：58)用于扩增包含该3’侧翼序列的核酸分子以用于确认。所得到的扩增子的序列在seq id no：59中给出。这个3’扩增子包含在seq id no：47中给出的3’连接序列。10μl的pcr扩增子在包含溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶上跑胶。从该琼脂糖凝胶取出适宜的条带，并根据生产者的说明使用qiagen qiaquick gel extraction试剂盒进行纯化。根据生产者的说明将所提取的dna克隆至invitrogentopo
‑
xl克隆载体中。将这个克隆转化至e.coli中。根据生产者的说明用qiagen miniprep试剂盒从在培养基中过夜生长后的细胞中提取质粒dna。使用在表5中显示的引物对三个质粒进行完全测序。对这些质粒序列进行比对以产生完整的经确认的3’侧翼序列(seq idno：48)。
[0175]
表5.引物序列
[0176][0177][0178]
实施例6.用elisa检测mir162中的vip3aa20蛋白质
[0179]
从mirl62的叶、根、木髓、内核、穗丝、花粉以及整个植物中制备提取物。通过elisa使用免疫亲和纯化的山羊抗vip3a和蛋白质a 纯化的兔抗vip3a多克隆抗体采用本领域公认的elisa过程就 vip3aa20对这些提取物进行定量分析。横跨所有生长期在所分析的所有组织中均检测到vip3aa20。在整个植物中检测到的vip3aa20蛋白质的平均水平在开花期和种子成熟期分别为10μg/g鲜重和16μg/g 鲜重。叶子中的vip3aa20蛋白质在开花期的平均水平是22μg/g鲜重。
[0180]
实施例7.mir162的田间效力
[0181]
测定mirl62事件在田间抵抗秋夜蛾(faw,spodopterafrugiperda)，棉铃虫(cew,helicoverpa zea)，小地老虎(bcw, agrotis ipsilon)，以及欧洲玉米螟(european corn borer)(ecb, ostrinia nubilalis)的效力。将mir162事件的表现与 (syngenta，inc.)(一种常规的杀虫剂标准(以11.2g a.i./英亩的比率应用))、与转基因玉米事件bt11(包含cry1ab基因)，以及 bt11x mir162杂种(通过bt11近交系与mir162近交系杂交产生)进行比较。
[0182]
在代表美国大陆主要玉米生长地区的13个州种植了28个试验。试验在随机化完全区组设计中以每个区组一式四份重复的小块田地进行种植。每个重复每次处理的小块田地是17.5排英尺。种植密度定为约30,000棵植物/英亩。使用免疫诊断条来确认在不同处理组中是否存在vip3aa20及cry1ab蛋白质。
[0183]
在群体足够高的试验中使用自然害虫侵染；而在群体不高的试验中进行人工害虫侵染。在bcw试验中使用了在v1至v2的两次2龄至 3龄幼虫的人工侵染。在侵染后3、7及14天后对这些小块田地进行评级。将bcw损伤记录为部分受损植物和完全切割植物。在侵染后7 及14天或在对照植物中观察到3龄幼虫后对faw小块田地进行评级。
[0184]
使用以下等级评价faw和cew的叶子损伤：
[0185]
0.01
‑
没有可见的叶子损伤
[0186]1‑
在少数叶子上的针孔损伤
[0187]2‑
在少数叶子上的小量蛀孔损伤
[0188]3‑
在一些叶子上的蛀孔损伤
[0189]4‑
在少数叶子上的蛀孔损伤和病变(lesion)
[0190]5‑
在一些叶子上的病变
[0191]6‑
在一些叶子上的大型病变
[0192]7‑
在少数叶子上的大型病变和部分咬食
[0193]8‑
在一些叶子上的大型病变和部分咬食
[0194]9‑
在多数叶子上的大型病变和部分咬食
[0195]
对第一代和第二代ecb评估植物损伤。使用以下等级评定第一代损伤，典型地当幼虫处于3龄至4龄期时：
[0196]1‑
没有可见的叶子损伤
[0197]2‑
在少数叶子上的小量蛀孔伤害
[0198]3‑
一些叶子上普遍的蛀孔伤害
[0199]4‑
一些叶子有蛀孔和伸长病变
[0200]5‑
一些叶子有伸长病变
[0201]6‑
一些叶子有约2.5cm的伸长病变
[0202]7‑
约一半的叶子上普遍长形病变
[0203]8‑
约三分之二的叶子上普遍长形病变
[0204]9‑
多数叶子有长形病变
[0205]
在人工虫害侵染或在产卵高峰末期后的3至4周评估第二代ecb 损伤。采用下列测量：活幼虫的数目/茎、活幼虫的数目/柄、活幼虫的数目/耳穗、通道的数目/茎、累积的通道
长度(cm)/茎、累积的通道长度(cm)/柄、通道的数目/耳穗、累积的通道长度内核损伤(cm) /耳穗，以及被侵染的植物的％。
[0206]
cew试验一般种植晚以增加自然侵染的水平。当对照植物上的cew 幼虫处于l5至l6生长期时对耳穗的摄食损伤进行评价。耳穗评级包括记录每个耳穗上观察到的幼虫的数目以及从耳穗顶至被破坏的平均最低内核测量的可见的内核摄食的长度。
[0207]
bcw田间试验的结果列于表6。少于3％的mir162植物以及bt11x mir162植物被bcw幼虫切割。大量的bt11及对照植物被切割。包含 mir162基因型的植物比常规杀虫剂处理的植物具有更小的bcw摄食损伤。
[0208]
表6.在侵染后21天来自5个bcw试验的茎损伤评级。损伤测量为被切割的总植物的百分数。
[0209][0210]
faw田间试验的结果列于表7中。faw摄食损伤在0.01至9的等级内进行测量。在mir162杂种中的平均摄食损伤非常低(<1)，并且显著地低于在bt11和常规杀虫药处理中观察到的平均损伤。在这些试验中昆虫压力是沉重的，每棵植物约50至100个初生幼虫。bt11提供一些免受损伤的保护，然而常规杀虫药处理没有提供保护，维持与对照相同量的损伤。
[0211]
表7.来自五个faw试验的叶子摄食损伤评级。对于每种处理列出了侵染后14天的平均损伤评级。
[0212][0213]
用于评估第一代ecb损伤的试验结果列于表8中。ecb摄食损伤在1至9的等级内进行评级。在这些试验中，mir162给予抵抗ecb摄食损伤的最小保护。bt11完全保护这些植物免受ecb摄食损伤。bt11 x mir162植物具有与bt11植物一样的保护水平。常规杀虫剂处理比 mir162性状提供更好的保护，但比由bt11提供的保护显著更小。
[0214]
表8.叶子摄食损伤田间试验。侵染后14天的平均损伤评级。
[0215][0216]
第二代ecb损伤的结果列于表9中。摄食损伤测量为在每个玉米茎中累积的通道长度(如果发现一个以上的通道，将通道长度相加)。 bt11和bt11x mir162处理提供了抵抗茎钻孔的有力保护，然而单独的mir162或杀虫剂处理没有提供抵抗通道产生的保护。
[0217]
表9.针对第二代ecb幼虫以每个茎的通道长度(cm)测量的来自七个试验的茎损伤评级。人工侵染后三至四周进行测量。
[0218][0219]
评估cew损伤的试验结果列于表10中。摄食损伤作为从耳穗顶至被破坏的平均最低内核测量得到的每个耳穗的内核损伤长度进行评级。在bt11、杀虫剂和对照小块田地中观察到显著的耳穗损伤。与未处理的对照相比bt11提供了一定水平的保护，且与传统杀虫剂处理提供的保护相当。mir162和bt11 x mir162为耳穗提供了几乎完全的保护使其免受cew幼虫的摄食损伤。
[0220]
表10.来自六个cew试验的测量为摄食损伤的平均长度的耳穗损伤评级。当对照植物中cew幼虫处于l5至l6时进行测量。
[0221][0222]
实施例8.mir162抵抗西部豆类夜盗虫(western bean cutworm)的效力
[0223]
生产crylab蛋白质的当前商业转基因事件未提供可接受水平的抵抗西部豆类夜盗虫(wbcw,striacosta albicosta)的保护。因此，测试了单独的mir162以及与其他转基因的基因型堆积的mir162抵抗 wbcw的效力。
[0224]
从野生捕获的雌性蛾子收集wbcw卵。用半合成的小地老虎饲料喂养幼虫直至用于
25,513
‑
51,328)之间。
[0231]
事件mir162的转基因在田间条件下经过几代的一致农业表现说明这些在mir162插入位点周围的经鉴定的区域为其他目的转基因基因的靶整合提供了良好的基因组位置。这种靶整合克服了所谓的“位置效应”的问题以及在转基因整合进入宿主后在基因组中产生突变的风险。这种靶整合的其他的优点包括但不限于，在获得转基因植物(该植物展示所希望水平的转基因表达而不展示由该转基因不经意插入至宿主基因组中的一个重要基因座而导致的异常)之前减少必须筛选和测试的大量数目的转化事件。另外，这种靶整合允许堆积转基因使得具有两种基因的良种植物品系的育种更有效。
[0232]
使用以上公开的教导内容，普通技术人员能够使用本领域已知的方法将目的异源核酸靶向至染色体5上与mir162中的位点相同的插入位点，或靶向至与mir162中的插入位点密切邻近的位点。一种此类的方法公开于美国专利申请公开号20060253918中，其全部内容通过引用纳入本文。简言之，位于插入位点5’侧翼的高达20kb的基因组序列(seq id no：106的核苷酸5,454
‑
25,454)以及位于插入位点3’侧翼的高达20kb的基因组序列(seq id no：106的核苷酸 25,513
‑
45,513)被用在一个或多个相关基因的侧翼，这些相关基因意欲通过同源重组插入至染色体5上的基因组位置。这些序列可以进一步侧翼于t
‑
dna边界重复，例如左边界(lb)及右边界(rb)重复序列及其他用于增强t
‑
dna递送效率的加强序列。一个或多个相关基因能像在mir162插入位点中一样被精确地放置或能被放置在mir162插入位点周围20kb区域内的任何位置，以给予一致水平的转基因表达，而对植物没有害处。包含一个或多个相关基因及侧翼序列的dna载体能通过本领域技术人员已知的几个方法之一(包括但不限于土壤杆菌属介导的转化)递送入植物细胞中。将dna载体插入至mir162靶位点能通过几种方法之一(包括但不限于共表达或重组增强基因的上调或内源重组抑制基因的下调)而被进一步加强。此外，本领域中已知基因组中特异序列的切割能用于增加同源重组的频率，因此插入至mir162 插入位点及其侧翼区域中的插入能通过自然或设计的序列特异性内切核酸酶(用于切割这些序列)的表达而加强。因此，使用此处提供的教导内容，任何异源核酸能被插入至玉蜀黍染色体5上位于seq id no： 106的核苷酸25,454和45,513之间的靶位点或邻近这个位点的靶位点。
[0233]
实施例10.事件mir162插入位点及侧翼序列用于稳定基因表达的用途
[0234]
当其他相关基因在玉蜀黍和其他农作物的其他基因组位置中作为一个转基因被插入时，位于mir162插入位点侧翼的基因组序列也可用于稳定这个(些)相关基因的表达。具体而言，位于插入位点5’侧翼的高达20kb的基因组序列(seq id no：106的核苷酸5,454
‑
25,454) 和位于插入位点3’侧翼的高达20kb的基因组序列(seq id no：106 的核苷酸25,513
‑
45,513)用于侧翼于旨在插入植物基因组的一个或多个相关基因。这些序列可进一步侧翼于t
‑
dna边界重复，如左边界 (lb)及右边界(rb)的重复序列以及其他用于增强t
‑
dna递送效率的加强序列。一个或多个相关基因能像在mir162插入位点中一样精确地被放置或能被放置在mir162插入位点周围的20kb区域内的任何位置，以给予一致水平的转基因表达。包含一个或多个相关基因以及mir162 插入位点侧翼序列的dna载体能通过本领域技术人员已知的几个方法之一(包含但不限于原生质体转化、生物射弹轰击以及土壤杆菌属介导的转化)递送入植物细胞中。递送的dna能够随机整合入植物基因组中或也能作为独立分离的遗传单位(例如人工染色体或微型染色体) 的一部分存在。包含一个或多个相关基因
的dna载体及mir162插入位点侧翼序列也能递送入植物细胞中。因此，通过用位于mir162插入位点侧翼的基因组序列围绕一个或多个相关基因，这些基因在转基因宿主植物(例如双子叶植物或单子叶植物，如玉米)中的表达得到稳定。
[0235]
保藏
[0236]
申请人已经在2007年1月23日根据布达佩斯条约将以上公开的事件mir162的玉米种子保藏在美国典型培养物保藏中心(atcc)，地址为1801university boulevard,manassas,va 20110，atcc登记号为pta
‑
8166。此保藏将在该保藏机构保存30年，或在最后一次要求之后的5年，或本专利的有效期内，以更长的为准，且在此期间内如果需要将被替换。申请人对从atcc获得所保藏的材料没有限制；然而，申请人无权免除法律在转移生物材料或其在商业上的转运方面所施加的任何限制。申请人不放弃根据本专利或根据植物品种保护法案 (plant variety protection act)(7 usc 2321以及以下等等)赋予的他们的权利的任何侵权。
[0237]
在本说明书中所引用的所有公开文献和已公开的专利文件均通过引用纳入本文，其程度如同每个单独的公开文献或专利文件被确切地并单独地指明通过引用而纳入本文。
[0238]
本发明的一些实施方案如下：
[0239]
1.分离的核酸分子，包含对事件mir162独特的核苷酸序列。
[0240]
2.如实施方案1所述的分离的核酸分子，其中该核酸分子将插入事件mir162的基因组的异源dna分子连接至事件mir162中的基因组 dna，该事件mir162中的基因组dna包含该异源dna分子的至少10 个连续核苷酸以及位于该异源dna分子插入点侧翼的该基因组dna的至少10个连续核苷酸。
[0241]
3.如实施方案1所述的分离的核酸分子，其中该核酸分子将插入事件mir162的基因组的异源dna分子连接至事件mir162中的基因组 dna，该事件mir162中的基因组dna包含该异源dna分子的至少20 个连续核苷酸以及位于该异源dna分子插入点侧翼的基因组dna的至少20个连续核苷酸。
[0242]
4.如实施方案1所述的分离的核酸分子，其中该核酸分子将插入事件mir162的基因组的异源dna分子连接至事件mir162中的基因组 dna，该事件mir162中的基因组dna包含该异源dna分子的至少50 个连续核苷酸以及位于该异源dna分子插入点侧翼的基因组dna的至少50个连续核苷酸。
[0243]
5.根据实施方案1至4中任一项所述的分离的核酸分子，其中该核苷酸序列选自：seq id no：1、seq id no：38、seq id no：41、 seq id no：45、seq id no：47、seq id no：49，以及其互补物。
[0244]
6.如实施方案5所述的分离的核酸分子，其中该核苷酸序列编码包含氨基酸序列seq id no：2的蛋白质。
[0245]
7.根据实施方案1至6中任一项所述的分离的核酸分子，其中该核酸分子包含于玉米种子中，该玉米种子保藏在美国典型培养物保藏中心，登记号为pta
‑
8166。
[0246]
8.一种扩增子，其包含实施方案1至7中任一项所述的核酸分子。
[0247]
9.多核苷酸引物对，其包含第一多核苷酸引物以及第二多核苷酸引物，这些多核苷酸引物在样品中的事件mir162 dna模板存在时共同起作用，以产生对事件mir162有诊断性的扩增子。
[0248]
10.根据实施方案9所述的引物对，其中该第一引物序列和/或该第二引物序列是从seq id no：1中选择的。
[0249]
11.根据实施方案10所述的引物对，其中该扩增子包含seq idno：1、seq id no：38，或其互补物。
[0250]
12.根据实施方案9所述的多核苷酸引物对，其中该第一引物序列是玉米植物基因组序列或与其互补，该玉米植物基因组序列位于插入事件mir162的玉米植物基因组中的异源dna序列的插入点的侧翼，并且该第二多核苷酸引物序列是插入事件mir162的基因组的异源dna 序列或与其互补。
[0251]
13.根据实施方案12所述的多核苷酸引物对，其中该第一多核苷酸引物包含选自下组的核苷酸序列的至少10个连续核苷酸，该组的构成为：seq id no：49的核苷酸1
‑
1088、seq id no：49的核苷酸 9391
‑
10579，以及其互补物。
[0252]
14.根据实施方案13所述的多核苷酸引物对，其中该第一多核苷酸引物包含选自下组的核苷酸序列，该组的构成为：seq id no：36、 seq id no：39、seq id no：53、seq id no：57、seq id nos：68 至72、seq id no：79、seq id no：80、seq id nos：97至105，以及其互补物。
[0253]
15.根据实施方案12所述的多核苷酸引物对，其中该第二多核苷酸引物包含来自seq id no：49的核苷酸1089
‑
9390的至少10个连续核苷酸，或其互补物。
[0254]
16.根据实施方案15所述的多核苷酸引物对，其中该第二多核苷酸引物包含选自下组的核苷酸序列，该组的构成为：seq id no：15 至35、seq id no：37、seq id no：40、seq id nos：50至52、seqid no：54、seq id no：56、seq id no：57、seq id no：63、seq idno：73、seq id no：82、seq id no：96，以及其互补物。
[0255]
17.根据实施方案12所述的多核苷酸引物对，其中该第一多核苷酸引物由seq id no：36构成，并且该第二多核苷酸引物由seq id no：37构成。
[0256]
18.根据实施方案17所述的多核苷酸引物对，其中该扩增子由 seq id no：38构成。
[0257]
19.根据实施方案12所述的多核苷酸引物对，其中该第一多核苷酸引物由seq id no：39构成，并且该第二多核苷酸引物由seq id no： 40构成。
[0258]
20.根据实施方案19所述的多核苷酸引物对，其中该扩增子由seq id no：41构成。
[0259]
21.根据实施方案12所述的多核苷酸引物对，其中该第一多核苷酸引物由seq id no：53构成，并且该第二多核苷酸引物由seq id no： 54构成。
[0260]
22.根据实施方案21所述的多核苷酸引物对，其中该扩增子由 seq id no：55构成。
[0261]
23.根据实施方案12所述的多核苷酸引物对，其中该第一多核苷酸引物由seq id no：58构成，并且该第二多核苷酸引物由seq id no： 56构成。
[0262]
24.根据实施方案23所述的多核苷酸引物对，其中该扩增子由 seq id no：59构成。
[0263]
25.在包含玉米核酸的样品中检测对事件mir162独特的核酸分子存在的方法，该方法包括：
[0264]
(a)用引物对接触该样品，当该对引物被用于来自事件mir162 的基因组dna的核
酸扩增反应时产生对事件mir162有诊断性的扩增子；
[0265]
(b)进行核酸扩增反应，由此产生该扩增子；并且
[0266]
(c)检测该扩增子。
[0267]
26.如实施方案25所述的方法，其中该扩增子包含核苷酸序列 seq id no：1、seq id no：38、seq id no：41、seq id no：45、 seq id no：47、seq id no：49、seq id no：55、seq id no：59，或其互补物。
[0268]
27.在包含玉米核酸的样品中检测对事件mir162独特的核酸分子的存在的方法，该方法包括：
[0269]
(a)用探针接触该样品，该探针在高严格条件下与来自事件 mir162的基因组dna杂交，并且在高严格条件下不与对照玉米植物的 dna杂交；
[0270]
(b)将该样品以及探针置于高严格杂交条件中；和
[0271]
(c)检测该探针对该核酸分子的杂交。
[0272]
28.如实施方案27所述的方法，其中该探针包含选自下组的核苷酸序列，该组的构成为：seq id no：1、seq id no：38、seq id no： 41、seq id no：45、seq id no：47、seq id no：49、seq id no： 55、seq id no：59，以及其互补物。
[0273]
29.一种检测核酸的试剂盒，所述核酸对事件mir162是独特的，该试剂盒包含具有足够长度的连续多核苷酸的至少一个核酸分子，以便在核酸检测方法中作为引物或探针起作用，并且在对样品中的靶核酸序列的扩增或者杂交并随后检测针对该靶序列的扩增子或者杂交时，所述核酸对于在该样品中对事件mir162独特的核酸序列的存在是诊断性的。
[0274]
30.如实施方案29所述的试剂盒，其中该核酸分子包含来自seqid no：1或者seq id no：49的核苷酸序列。
[0275]
31.如实施方案30所述的试剂盒，其中该核酸分子是选自下组的引物，该组的构成为：seq id no：15至37、seq id no：39、seq idno：40、seq id no：42、seq id no：43、seq id no：50至54、seqid no：56至58、seq id no：60至105，以及其互补物。
[0276]
32.转基因玉米植物，或者其细胞或组织，其均包含根据实施方案1至7中任一项所述的核酸分子。
[0277]
33.根据实施方案32所述的玉米植物，其特征在于用限制性内切核酸酶kpni，ecorv或者ncoi酶解该植物的基因组dna，在高严格条件下使用vip3aa20探针产生单一的vip3aa20杂交带。
[0278]
34.如实施方案33所述的玉米植物，其中该探针包含seq id no：13的核苷酸序列，或其互补物。
[0279]
35.根据实施方案32所述的玉米植物，其中该玉米植物对昆虫有抵抗力。
[0280]
36.根据实施方案35所述的玉米植物，其中昆虫抵抗性是由于 vip3aa20基因的表达。
[0281]
37.玉米种子，包含根据实施方案1至6中任一项所述的核酸分子。
[0282]
38.玉米种子，保藏于美国典型培养物保藏中心，登记号为 pta
‑
8166。
[0283]
39.转基因玉米植物，该植物从根据实施方案37或38所述的种子产生。
[0284]
40.衍生自事件mirl62玉米植物、组织，或种子的生物样品，其中该样品包含核苷酸序列，该核苷酸序列是下列序列或与其互补：seqid no：1、seq id no：38、seq id no：
41、seq id no：45、seq idno：47、seq id no：49、seq id no：55，或者seq id no：59，并且其中该序列用核酸扩增或核酸杂交方法在该样品中是可检测的。
[0285]
41.如实施方案40所述的生物样品，其中该样品选自下组，该组的构成为：玉米面、玉米粉、玉米糖浆、玉米油、玉米淀粉，以及全部或部分包含玉米副产物的制造的谷类。
[0286]
42.衍生自事件mir162玉米植物、组织，或种子的生物样品的提取物，所述提取物包含核苷酸序列，该核苷酸序列是或互补于seq idno：1、seq id no：38、seq id no：41、seq id no：45、seq id no： 47、seq id no：49、seq id no：55或seq id no：59。
[0287]
43.如实施方案42所述的提取物，其中该序列用核酸扩增或核酸杂交方法在该提取物中是可检测的。
[0288]
44.如实施方案42或43所述的提取物，其中该样品选自下组，该组的构成为：玉米面、玉米粉、玉米糖浆、玉米油、玉米淀粉，以及全部或部分包含玉米副产物的制造的谷类。
[0289]
45.生产抵抗鳞翅类害虫的玉米植物的方法，包括：
[0290]
(a)将第一亲代玉米植物与第二亲代玉米植物有性杂交，其中所述第一或第二亲代玉米植物包含事件mir162 dna，由此产生多个第一代子代植物；
[0291]
(b)选择抵抗鳞翅类昆虫侵染的第一代子代植物；
[0292]
(c)将该第一代子代植物自交，由此产生多个第二代子代植物；
[0293]
(d)从这些第二代子代植物中挑选抵抗鳞翅类害虫的植物；
[0294]
其中这些第二代子代植物包含seq id no：1、seq id no：38、 seq id no：41、seq id no：45、seq id no：47、seq id no：49、 seq id no：55，或者seq id no：59。
[0295]
46.生产杂种玉米种子的一种方法，包括：
[0296]
(a)种植第一近交玉米系的种子，该近交玉米系包含选自下组的核苷酸序列，该组的构成为：seq id no：1、seq id no：38、seq id no：41、seq id no：45、seq id no：47、seq id no：49、seq id no： 55，或者seq id no：59，以及种植具有不同基因型的第二近交系的种子；
[0297]
(b)培育产生自所述种植的玉米植物直到开花的时期；
[0298]
(c)对该玉米近交系之一的植物的所述的花去雄；
[0299]
(d)将该两种不同近交系彼此有性杂交；并且
[0300]
(e)收获由此生产的杂种种子。
[0301]
47.根据实施方案46所述的方法，其中第一近交玉米系的植物是母本。
[0302]
48.根据实施方案46所述的方法，其中第一近交玉米系的植物是父本。
[0303]
49.用如实施方案46所述的方法生产的杂种种子。
[0304]
50.玉米植物，该植物是通过培育如实施方案44所述的杂种玉米种子产生。
[0305]
51.一种分离的杀虫蛋白质，其包含seq id no：2。
[0306]
52.一种分离的核酸分子，该核酸分子编码实施方案51所述的蛋白质。
[0307]
53.嵌合基因，其包含可操作地连接至实施方案52所述的核酸分子的异源启动子序列。
[0308]
54.一种重组载体，其包含实施方案53所述的嵌合基因。
[0309]
55.一种转基因宿主细胞，其包含实施方案53所述的嵌合基因。
[0310]
56.玉蜀黍染色体靶位点，位于染色体5上在如seq id no：106 的核苷酸1680
‑
3338所给出的opie2分子标记物与如seq id no：106 的核苷酸43,275
‑
45,086所给出的的gag分子标记物之间，其中该靶位点包含异源核酸。
[0311]
57.根据实施方案56所述的玉蜀黍染色体靶位点，其中所述靶位点位于seq id no：106的核苷酸25,454和25,513之间。
[0312]
58.根据实施方案56所述的玉蜀黍染色体靶位点，其中所述靶位点的5'侧翼是seq id no：106的核苷酸5,454至25,454，且3'侧翼是seq id no：106的核苷酸25,513至45,513。
[0313]
59.制造转基因玉蜀黍植物的方法，该方法包括在位于染色体5 上在seq id no：106的核苷酸1680
‑
3338所给出的opie2分子标记物与在seq id no：106的核苷酸43,275
‑
45,086所给出的gag分子标记物之间插入异源核酸。
[0314]
60.根据实施方案59所述的方法，其中所述异源核酸被插入染色体5上seq id no：106的核苷酸25,454与25,513之间。
[0315]
61.根据实施方案59所述的方法，其中所述插入的异源核酸的5' 侧翼是seq id no：106的核苷酸5,454至25,454，并且3'侧翼是seq idno：106的核苷酸25,513至45,513。