经由环加成的双侧官能化抗体的制作方法

经由环加成的双侧官能化抗体
发明领域
本发明涉及生物缀合领域，特别涉及含有单个有效载荷(药物-抗体比为1)的抗体-缀合物。更具体地，本发明涉及适合于将有效载荷连接到天然igg型抗体上的缀合物、组合物和方法，即在这种缀合之前无需抗体的遗传再造(genetic reengineering)。作为化合物、组合物和方法的单官能化抗体缀合物可用于例如提供用于有效载荷的靶向递送的新药物，诸如高效细胞毒性剂(cytotoxic agent)或免疫调节剂。发明背景抗体-药物缀合物(adc)，被认为是治疗中的灵丹妙药，由附着有药剂的抗体组成。所述抗体(也称为配体)可以是小蛋白质形式(scfv's、fab片段、darpins、affibodies等)，但通常是单克隆抗体(mabs)，这些抗体是基于其对给定抗原的高选择性和亲和力、它们的长循环半衰期以及几乎没有免疫原性而选择的。因此，作为仔细选择的生物受体的蛋白质配体的mab为药物的选择性靶向提供了理想的递送平台。例如，已知与特定癌症相关抗原选择性结合的单克隆抗体可用于通过结合、内化、细胞内加工和最终释放活性分解代谢产物将化学缀合的细胞毒性剂递送至肿瘤。细胞毒性剂可以是小分子毒素、蛋白质毒素或其他形式，如寡核苷酸。结果，可以选择性地根除肿瘤细胞，同时保留未被抗体靶向的正常细胞。类似地，抗菌药(抗生素)与抗体的化学缀合可用于治疗细菌感染，而消炎药的缀合物正在研究用于治疗自身免疫性疾病，并且例如寡核苷酸与抗体的结合是一种潜在的有前途的治疗神经肌肉疾病的方法。因此，将活性药物靶向递送至所选特定细胞位置的概念是用于治疗多种疾病的有力方法，与相同药物的全身给药法相比，具有许多有益方面。使用单克隆抗体靶向递送特定蛋白质试剂的替代性策略是通过将后一种蛋白质与抗体末端的一个(或多个)遗传融合，所述末端可以是轻链或重链(或两者)上的n-末端或c-末端。在这种情况下，关注的生物活性蛋白，例如像假单胞菌外毒素a(pe38)或抗cd3单链可变片段(scfv)的蛋白质毒素，被遗传编码为与抗体的融合体，可能但不是必须通过肽间隔区，因此抗体被表达为融合蛋白。肽间隔区可以包含或不包含蛋白酶敏感的切割位点。单克隆抗体也可以在蛋白质序列本身中进行遗传修饰以改变其结构并由此引入(或去除)特定性质。例如，可以在抗体fc片段中进行突变以消除与fc-γ受体的结合，可以调节与fcrn受体的结合或与特定癌症靶标的结合，或者可以工程化抗体以降低pi并控制循环中的清除率。一种新兴的癌症治疗策略包括使用一种能够与上调的肿瘤相关抗原(taa或简单靶标)以及存在于破坏癌症的免疫细胞(例如t细胞或nk细胞)上的受体的抗体，也称为t细胞或nk细胞重定向抗体。尽管免疫细胞重定向的方法已经有超过30年，但新技术正在克服第一代免疫细胞重定向抗体的局限性，特别是延长半衰期以允许间歇给药，降低免疫原性并改善安全性。最常见的是，t细胞重定向双特异性抗体(trba)是通过将fab片段的臂之一中的补体依赖区(cdr)遗传交换为与在t细胞上的cd3或cd137(4-1bb)紧密结合的抗体片段来产生。然而，除了这些传统的与t细胞接合的双特异性抗体之外，还开发了多种其他分子结构，通常是igg型，例如yu和wang,j.cancer res.clin.oncol.2019,145,941
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956)。类似地，向肿瘤微环境的nk细胞募集也在广泛研究中。nk细胞接合(engagement)通常基于将
抗体(片段)插入igg支架，该抗体(片段)选择性地结合cd16、cd56、nkp46或其他nk细胞特异性受体。adc领域以及免疫细胞接合领域中的一种常见策略采用去除(nihilation)或消除抗体与fc-γ受体的结合能力，这具有多种药学意义。去除与fc-γ受体的结合的第一个后果是通过例如巨噬细胞或巨核细胞减少fc-γ受体介导的抗体摄取，这可能导致剂量限制性毒性，例如对(曲妥珠单抗-dm1)和lop628的报道。体内抗体的选择性去糖基化为治疗患有抗体介导的自身免疫的患者提供了机会。去除重组治疗性糖蛋白中的高甘露糖糖型可能是有益的，因为已知高甘露糖糖型会通过内源性甘露糖受体的非特异性摄取而损害治疗功效并导致快速清除，例如描述于gorovits和krinos-fiorotti,cancer immunol.immunother.2013,62,217-223和goetze等人,glycobiology 2011,21,949-959(均通过引用的方式并入)。此外，van de bovenkamp等人,j.immunol.2016,196,1435-1441(通过引用的方式并入)描述了高甘露糖聚糖如何影响免疫。reusch和tejada,glycobiology 2015,25,1325-1334(通过引用的方式并入)中描述了单克隆抗体中不适当的糖基化可能导致表达的ig基因的无效产生。在免疫治疗领域，糖基化抗体与免疫细胞上的fc-γ受体结合可在抗体与肿瘤相关抗原结合之前诱导免疫系统的全身性活化，从而导致细胞因子风暴(细胞因子释放综合征，crs)。因此，为了降低crs的风险，临床上绝大多数的免疫细胞接合物(engager)是基于缺乏与fc-γ受体结合的能力的fc沉默的抗体。此外，双特异性抗体领域的各种公司正在定制这样的分子结构，其在靶标结合与免疫细胞接合抗体结构域方面具有限定比率。例如，roche正在开发基于不对称单克隆抗体的t细胞接合物，所述抗体保留两个cdr与taa(例如cd20或cea)的二价结合能力，但仅伴随一个额外的抗cd3片段被工程化为两条重链之一(靶结合：cd3结合的比例为2:1)。类似的策略可用于t细胞与抗cd137(4-1bbb)的接合/活化或nk细胞与抗cd16、cd56、nkp46或其他nk细胞特异性受体的接合/活化。与fc-γ受体结合的消除可以通过多种方式实现，例如通过抗体(特别是fc片段)中的特异性突变或通过去除天然存在于fc片段(ch2结构域，在n297周围)中的聚糖。聚糖的去除可以通过fc结构域中的遗传修饰来实现，例如n297q突变或t299a突变，或通过在重组表达抗体后使用例如pngase f或糖苷内切酶酶促去除聚糖。例如，已知糖苷内切酶h可剪切高甘露糖和杂合糖型，但不能剪切复合聚糖，而糖苷内切酶s能够剪切复合聚糖和在某种程度上杂合聚糖，但不能剪切高甘露糖形式。糖苷内切酶f2能够剪切复合聚糖(但不能剪切杂合型)，而糖苷内切酶f3只能剪切也是1,6-岩藻糖基化的复合聚糖。另一种糖苷内切酶，糖苷内切酶d只能水解man5(m5)聚糖。将不同糖苷内切酶的比活性的综述公开于freeze等人，curr.prot.mol.biol.,2010,89:17.13a.1-17中，通过引用的方式并入本文。用于治疗用途的蛋白质去糖基化的另一个优点是促进了批次间的一致性和显著改善的均一性。在adc领域中，化学接头通常用于将药物连接至抗体。该接头需要具备许多关键属性，包括在给药后在延长的时间段在血浆中稳定的需要。稳定的接头使得adc能够定位到体内的预计位点或细胞，并防止在循环中有效载荷过早释放，这将无差别地诱导各种不期望的生物反应，从而降低adc的治疗指数。在内化后，adc应被处理使得有效载荷被有效释放，从而其可结合至其靶标。有两类接头，不可切割的和可切割的。不可切割的接头由抗体和有效载荷之间的
原子链组成，在生理条件下完全稳定，无论抗体-药物缀合物位于哪个器官或生物区室。因此，adc内化到细胞中后有效载荷从具有不可切割接头的adc的释放依赖于抗体的完全(溶酶体)降解。由于这种降解，有效载荷将被释放，仍然携带接头，以及来自接头最初连接的抗体的肽片段和/或氨基酸。可切割接头利用细胞或细胞区室的固有性质从adc选择性释放有效载荷，其通常在代谢加工后不留下接头痕迹。对于可切割的接头，有三种常用的机制：1)对特异性酶的敏感性、2)ph敏感性；和3)对细胞(或其微环境)的氧化还原状态的敏感性。基于酶的策略通常基于特异性蛋白酶、酯酶、糖苷酶或其他的内源性存在。例如，肿瘤学中使用的大多数adc利用在肿瘤细胞溶酶体中发现的显性蛋白酶来识别和切割接头中的特异性肽序列。dubowchik等人，bioconjug chem.2002,13,855
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69，通过引用的方式并入，率先发现特异性二肽作为组织蛋白酶的细胞内切割机制。已知在肿瘤溶菌酶或肿瘤微环境中上调的其他酶是纤溶酶、基质金属蛋白酶(mmp)、尿激酶和其他，所有这些酶可以识别adc中的特异性肽序列并通过肽键之一的水解裂解诱导有效载荷从接头释放。酯酶也可用于在酯键水解时在细胞内释放有效载荷，例如其可由barthel等人，j.med.chem.2012,55,6595
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6607，通过引用的方式并入，证明人羧酸酯酶2(ces2,hice)证明多柔比星前药对ces2阳性异种移植物的体内抗肿瘤功效优于或等于有效载荷本身的抗肿瘤功效。第三，各种糖苷酶可用于选择性切割特异性单糖，特别是半乳糖苷酶(用于去除半乳糖)或葡糖醛酸糖苷酶(用于去除葡萄糖醛酸)，如例如分别阐明于torgov等人，bioconj.chem.2005,16,717
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721和j.med.chem.2006,17,831
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840，通过引用的方式并入。可用于键的肿瘤特异性水解裂解的其他内源酶是例如磷酸酶或硫酸酯酶。除了使用内源性酶之外，任何选择的酶的局部浓度增强，其可能不是天然丰富的，可以通过如通过静脉内注射、通过瘤内注射或通过其他方法如adept(抗体导向酶促前药治疗)的全身施用的策略来实现。与人细胞的胞质溶胶(ph 7.4)相比，酸敏感性策略利用内体(ph 5-6)和溶酶体(ph 4.8)区室中较低的ph值来触发接头内的酸不稳定基团例如腙的水解，参见例如ritchie等人,mabs 2013,5,13
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21，通过引用的方式并入。也可以使用替代的酸敏感性接头，例如基于甲硅烷基醚，公开于us20180200273中。基于氧化还原机制的第三种释放策略利用比血浆中更高浓度的细胞内谷胱甘肽。因此，含有二硫键的接头在被谷胱甘肽还原时释放游离的硫醇基团，这可保留有效载荷的一部分或进一步自降解(self-immolate)以释放游离的有效载荷。释放游离的有效载荷的替代性还原机制可基于(芳香族)硝基或(芳香族)叠氮基至苯胺的转化，其可为有效载荷的一部分或自降解组装单元的一部分。抗体-药物缀合物中的自降解组装单元将药物单元连接至缀合物或其药物-接头中间体的其余部分。自降解组装单元的主要功能是在配体单元靶向的位点有条件地释放游离药物。可活化的自降解部分包含可活化基团和自降解的间隔基单元。在活化可活化基团时，例如通过将酰胺基酶转化为氨基或通过将二硫化物还原为游离硫醇基，引发自降解反应序列，导致通过一种或更多的各种机制释放游离药物，其可涉及(临时的)1,6-消除对氨基苄基成为对醌甲基化物，任选地伴随释放二氧化碳和/或随后的第二环化释放机制。自降解组装单元可为连接抗体和有效载荷的化学间隔基的一部分(通过官能团)。替代性地，自降解基团不是化学间隔基的固有部分，而是从连接抗体和有效载荷的化学间隔基分支。
已获上市许可或目前处于晚期临床试验的大多数抗体-药物缀合物采用上述释放活性药物的机制之一。例如，是一种用于治疗各种血液肿瘤的adc，由靶向cd30的抗体(配体)组成，其通过接头与高效微管蛋白抑制剂mmae(有效载荷)连接，所述接头由与自降解对氨基苄氧基羰基(pab)连接的组织蛋白酶敏感片段组成。相同的释放mmae的机制对泊洛妥珠单抗(polatuzumab-vedotin)起作用。在关键性试验(pivotal trial)中使用蛋白酶/肽酶敏感接头的其他adc是syd985、adct-402、asg-22ce和ds-8201a。蛋白酶介导的有效载荷释放也是rg7861(dsta4637s)设计的一部分，rg7861(dsta4637s)是肿瘤学以外领域开发的adc，具体来说用于治疗细菌感染。已批准两种adc(和)，其由通过酸敏感基团，特别是腙基团连接至损伤dna的有效载荷(卡奇霉素)的抗体组成。类似地，戈沙妥珠单抗(sacituzumab govetican)，iii期临床研究中的adc，通过碳酸基团的酸性水解释放有效载荷。谷胱甘肽敏感的二硫化物基团是索星-米妥昔单抗(mirvetuximab soravtansine)中的接头的一部分，用于将抗体连接到美登素类(maytansinoid)有效载荷dm4以及imgn853中。目前，超过75种adc处于临床试验的不同阶段，其中至少70％包含一种形式的可切割接头。如上所述，自降解单元是许多adc中接头的一部分，在大多数情况下至少存在与蛋白酶敏感性肽片段连接的(酰化)对氨基苄基单元，用于酶释放氨基。除了氨基苄基外，其他芳族部分也可用作自降解单元的一部分，例如杂芳族部分，例如吡啶或噻唑，参见例如us7,754,681和us2005/0256030。氨基苄基的取代可以在对位或邻位，在两种情况下都导致相同的1,6-消除机制。苄基位置可以被烷基或羰基衍生物取代，例如衍生自扁桃酸的酯或酰胺，如例如公开于wo2015/038426，通过引用的方式并入。自降解单元的苄基位置连接到杂原子离去基团，通常基于但不限于氧或氮。主要地，苄型官能团存在于氨基甲酸酯部分，其在触发1,6-消除机制时释放二氧化碳，以及伯氨基或仲氨基。伯氨基或仲氨基可以是毒性有效载荷本身的一部分，并且可以是芳族氨基或脂族氨基。在后一种情况下，释放的有效载荷的氨基将最可能具有比在生理条件(ph7-7.5)下更高的pka，并且因此主要处于质子化状态，并且特别是在肿瘤的酸性环境中(ph《7)。伯氨基或仲氨基也可是另一个自降解基团的一部分，例如n,n-二烷基乙二胺部分。在另一端的n,n-二烷基乙二胺部分可以连接到另一个氨基甲酸酯基团，以在环化时释放醇基团作为毒性有效载荷的一部分，例如elgersma等人，mol.pharm.2015,12,1813
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1835，通过引用的方式并入。氨基甲酸酯部分的伯氨基或仲氨基也可以形成n,o-缩醛的一部分，该方法已用于多种药物递送策略，例如释放5-氟尿嘧啶(madec-lougerstay等人，j.chem.soc.perkin trans i,1999,1369
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1375)和sn-38(santi等人,j.med.chem.2014,57,2303
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2314)。最近，kolakowski等人angew.chem.int.ed.2016,55,7948
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7951，通过引用的方式并入，采用相似的构型用于设计由于adc的长循环时间而具有延长的血清暴露的接头，结合β-葡糖醛酸糖苷酶促进释放机制，以释放脂肪醇。自降解芳族部分的苄基位置的官能团也可是酚氧，参见例如toki等人，j.org.chem.2002,67,1866
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1872和us7,553,816，通过引用的方式并入，但不是脂肪醇，因为脂肪醇不具有足够的离去基团容量(典型的pka 13-15)。苄基官能团的另一种选择是季铵基团，其在消除时会释放出三烷基氨基或杂芳基胺，如burke等人，mol.cancer ther.2016,15,938
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945和staben等人，nat.chem.2016,8,
res.2001，7，1490；labrijn等人，nat.biotechnol.2009 27，767，都通过引用的方式并入)的异质混合物。对于利妥昔单抗(t-dm1)和临床上的其他adc，具体多少药物被连接至任何给定的抗体仍是不可控制的，因此adc作为大部分dar为3-4的缀合物的统计学分布而获得。实现更高dar的一种方法是通过还原单克隆抗体中的所有(4)链间二硫键，从而释放总共8个半胱氨酸侧链作为游离硫醇，然后与马来酰亚胺官能化的有效载荷整体缀合，以达到在6-8之间的最终dar。该方法应用于各种临床阶段的adc，包括例如immu-132、immu-110、ds-8201a、u3-1402、sgn-cd48a和sgn-cd228a，并且可以应用于各种有效载荷，但由于在还原步骤期间的片段混杂(scrambling)，该方法不太适合于除igg1之外的抗体。用于生物缀合的许多技术是已知的，如g.t.hermanson,“bioconjugate techniques”,elsevier,3
rd ed.，通过引用的方式并入。可以认识到两种主要技术可用于通过随机缀合制备adc，基于赖氨酸侧链的酰化或基于半胱氨酸侧链的烷基化。赖氨酸侧链中的ε-氨基的酰化通常通过使蛋白质经受基于活化的酯或活化的碳酸酯衍生物的试剂来实现，例如smcc用于制备半胱氨酸侧链中硫醇基团烷基化的主要化学方法是基于马来酰亚胺试剂的使用，例如用于制造除了标准马来酰亚胺衍生物外，一系列马来酰亚胺变体也可适用于更稳定的半胱氨酸缀合，例如james christie等人，j.contr.rel.2015,220,660
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670和lyon等人，nat.biotechnol.2014,32,1059
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1062，都通过引用的方式并入。与半胱氨酸侧链缀合的另一项重要技术是通过二硫键，一种已经用于可逆地将蛋白质毒素、化疗药物和探针连接到载体分子的可生物活化的连接(参见例如pillow等人，chem.sci.2017,8,366
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370。半胱氨酸烷基化的其他方法涉及例如卤代乙酰胺(通常是溴乙酰胺或碘乙酰胺)的亲核取代，参见例如alley等人，bioconj.chem.2008,19,759
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765，通过引用的方式并入，或基于在不饱和键上的亲核加成的各种方法，例如与丙烯酸酯试剂的反应，参见例如bernardim等人，nat.commun.2016,7,doi:10.1038/ncomms13128和ariyasu等人，bioconj.chem.2017,28,897
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902，都通过引用的方式并入，与亚磷酰胺(phosphonamidates)反应，参见例如kasper等人，angew.chem.int.ed.2019,58,11625
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11630，通过引用的方式并入，与丙二酰胺反应，参加例如abbas等人，angew.chem.int.ed.2014,53,7491
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7494，通过引用的方式并入，与氰基乙炔基试剂反应，参见例如kolodych等人，bioconj.chem.2015,26,197
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200，通过引用的方式并入，与乙烯基砜反应，参见例如gil de montes等人，chem.sci.2019,10,4515
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4522，通过引用的方式并入，或与乙烯基吡啶反应，参见例如https://iksuda.com/science/permalink/(2020年1月7日访问)。toda等人，angew.chem.int.ed.2013,52,12592
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12596也已报道了与甲基磺酰基苯基噁二唑的反应用于半胱氨酸缀合，通过引用的方式并入。尽管大多数(～65％)的临床adc基于随机有效载荷连接，但基于对位点特异性adc具有改善的治疗指数的观察，明显的趋势倾向于位点特异性缀合的adc。为此，已经开发了许多方法，其通过与抗体中一个(或多个)预定位点的位点特异性缀合，能够产生具有限定的dar的抗体-药物缀合物。位点特异性缀合通常通过将特异性氨基酸(或序列)工程化到抗体中来实现，用作有效载荷连接的锚点，参见例如aggerwal和bertozzi，bioconj.chem.2014,53,176
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192，通过引用的方式并入，最典型地半胱氨酸工程化。此外，
在过去十年中已探索了一系列其他位点特异性缀合技术，最突出的是非天然氨基酸的遗传编码，例如适合于肟连接的对乙酰苯丙氨酸，或适合于点击化学缀合的对叠氮甲基苯丙氨酸。大多数基于抗体遗传再造的方法得到dar约为2的adc。无需抗体再造的抗体缀合的替代方法包括链间二硫键的还原，然后添加连接至半胱氨酸交联剂如双砜试剂的有效载荷，参见例如balan等人，bioconj.chem.2007,18,61
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76和bryant等人，mol.pharmaceutics 2015,12,1872
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1879，均通过引用的方式并入，单或双溴马来酰亚胺，参见例如smith等人，chem.soc.2010,132,1960
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1965和schumacher等人，org.biomol.chem.2014,37,7261
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7269，均通过引用的方式并入，双马来酰亚胺试剂，参见例如wo2014114207，双(苯硫基)马来酰亚胺，参见例如schumacher等人，org.biomol.chem.2014,37,7261
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7269和aubrey等人，bioconj.chem.2018,29,3516
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3521，均通过引用的方式并入，双溴哒嗪二醛，例如参见robinson等人，rsc advances 2017,7,9073
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9077，通过引用的方式并入，双(卤代甲基)苯，参见例如ramos-tomillero等人，bioconj.chem.2018,29,1199
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1208，通过引用的方式并入或其他双(卤代甲基)芳族化合物，参见例如wo2013173391。通常，通过半胱氨酸交联制备的adc的药物抗体载量约为4(dar4)。在wo2014065661中，van geel等人，bioconj.chem.2015,26,2233
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2242和verkade等人，antibodies 2018,7,12，均通过引用的方式并入，已显示可以制备同质adc并基于天然抗体聚糖在n297处的酶改造选择性地定制为dar2或dar4(通过糖苷内切酶进行剪切并在糖基转移酶的作用下引入叠氮基修饰的galnac衍生物)，然后使用点击化学连接细胞毒性有效载荷。发现通过该技术制备的adc与一系列其他缀合技术和目前临床上应用的聚糖改造缀合技术(例如adct-601(adc therapeutics))相比显示出显著扩大的治疗指数。将抗体转化为叠氮基修饰的抗体的类似酶促方法使用细菌酶转谷氨酰胺酶(btg或tgase)，所述方法由lhospice等人，mol.pharmaceut.2015,12,1863
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1871(通过引用的方式并入)报道。显示用pngasef去糖基化天然糖基化位点n297释放邻近的n295，成为tgase介导的引入的底物，其在tgase存在下经受带有叠氮化物(azide-bearing)的分子时将去糖基化的抗体转化为双叠氮基抗体。随后，双叠氮基抗体与dbco修饰的细胞毒素反应以产生具有dar2的adc。cheng等人，mol.cancer therap.2018,17,2665
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2675，通过引用的方式并入，报道了一种基于c末端tgase介导的叠氮化物引入，然后在adc中转化的使用无金属点击化学的遗传方法。已经报道了将叠氮化物引入抗体的其他方法，其基于抗体的预先遗传修饰，然后使用基于amber抑制密码子的遗传编码引入非天然氨基酸，例如由axup等人，proc.nat.acad.sci.2012,109,16101
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16106所证明的，通过引用的方式并入。类似的，zimmerman等人，bioconj.chem.2014,25,351
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361，通过引用的方式并入，已经采用无细胞蛋白质合成方法将叠氮甲基苯丙氨酸(azphe)引入单克隆抗体，通过无金属点击化学转化为adc。同样在这种情况下，制备dar2的adc，或在首先引入两个azphe氨基酸的情况下制备dar4。此外，nairn等人，bioconj.chem.2012,23,2087
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2097，通过引用的方式并入，也显示了甲硫氨酸类似物如叠氮高丙氨酸(aha)可以通过营养缺陷型细菌被引入蛋白质中，并通过(铜催化的)点击化学进一步转化为蛋白质缀合物。最后，nguyen等人，j.am.chem.soc.2009,131,8720
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8721，通过引用的方式并入，显示了使用吡咯赖氨酰-trna合成酶/trna
cua
对的重组蛋白中脂肪族叠氮化物的遗传编码，并且通过点击化学保护标记。
后一种方法也应适用于生产dar2 adc，类似于oller-salvia等人，angew.chem.int.ed.2018,57,2831
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2834报道的方法。还开发了用于抗体的位点特异性修饰而无需预先遗传修饰的化学方法，例如由yamada和ito，chembiochem.2019,20,2729
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2737强调的。用于位点特异性修饰的通过亲和肽进行的化学缀合(ccap)已由kishimoto等人，bioconj.chem.2019，通过使用与人igg-fc结合具有高亲和力的肽，从而能够用生物素部分或细胞毒性有效载荷选择性修饰fc片段中的单个赖氨酸。类似地，yamada等人，angew.chem.int.ed.2019,58,5592
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5597和matsuda等人,acs omega 2019,4,20564
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20570(均以通过引用的方式并入)已证明类似的方法(ajicap
tm
技术)可应用于位点特异性引入抗体重链中单个赖氨酸上的硫醇基团。ccap或ajicap
tm
技术也可用于引入叠氮基或其他官能团。虽然市场上和临床上的adc主流的载药量在2到8之间，如上所述，对于一些高细胞毒性有效载荷，例如大多数pbd二聚体相关的ign型有效载荷，以及基于烯二炔的有效载荷、鹅膏菌素和其他，较低的dar将是优选的。已经发现，对于极强效的有效载荷，人类的最大耐受剂量可能会降低至远低于1mg/kg的值，通常甚至低于《300μg/kg或甚至《100μg/kg。因此，给药后(通常是静脉内)没有达到体内受体饱和，导致肿瘤摄取未达最佳标准并增强了清除。对于这种情况，具有相同有效载荷的dar1格式可能是优选的，因为mtd与类似的dar2版本相比可能高两倍。ruddle等人，chemmedchem 2019,14,1185
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1195最近已表明，可从抗体fab片段(通过全抗体(full antibody)的木瓜蛋白酶消化或重组表达制备)通过选择性还原c
h1
和c
l
链间二硫链，随后通过用含有两个马来酰亚胺单元的对称pdb二聚体处理来重新桥接该片段制备dar1缀合物。所得dar1型fab片段显示高度均质、在血清中稳定并显示出优异的细胞毒性。在后续出版物white等人，mabs 2019,11,500
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515和wo2019034764(通过引用的方式并入)中，显示dar1缀合物也可以由全igg抗体制备，在抗体的预先工程化之后：或者使用在铰链区仅具有一个链内二硫键的抗体(flexmab技术，报道于dimasi等人，j.mol.biol.2009,393,672
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692，通过引用的方式并入)，或者使用具有另外的游离半胱氨酸的抗体，其可通过天然氨基酸的突变(例如hc-s239c)或通过插入序列中(例如hc-i239c，由dimasi等人报道，mol.pharmaceut.2017,14,1501
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1516)获得。任一工程化抗体显示能够通过所得的半胱氨酸工程化adc与双马来酰亚胺衍生的pbd二聚体反应产生dar1adc。显示flexmab衍生的dar1 adc对血清中的有效载荷损失具有高度抗性，并在her2阳性胃癌异种移植模型中表现出强效的抗肿瘤活性。此外，与使用单个含马来酰亚胺的pbd二聚体制备的位点特异性的dar2 adc相比，该adc在大鼠中的耐受剂量是其两倍。然而，没有注意到治疗窗的改善，因为dar1 adc的最小有效剂量(med)与dar2adc相比以相同的因子2增加。迄今为止，尚未报道与dar2 adc相比改善治疗指数的dar1技术。此外，还没有报道在无需再造单克隆抗体的情况下，即可从全抗体生成dar1 adc的技术。治疗指数的改善和/或对dar1 adc的非遗传方法都将代表为开发具有更快的临床时间的更好的adc作出显著贡献。


技术实现要素：

提出了一种将任何全长抗体转化为具有单个药物负载(dar1)的稳定和位点特异
性的adc的技术，而不需要预先抗体再造。该技术适用于任何igg同种型，并且能够连接从小分子细胞毒物到蛋白支架(细胞因子、scfvs)到寡核苷酸等的有效载荷。根据一个优选实施方案的方法，其涉及用糖苷内切酶预先剪切聚糖，伴随fc-γ受体结合的消除，从而去除效应物功能。根据本发明的抗体-有效载荷缀合物为根据结构(1)：其中：-a、b、c和d各自独立地为0或1；-e是0-10范围内的整数；-l1、l2和l3是接头；-d是有效载荷；-bm是分支部分；-su是单糖；-g是单糖部分；-glcnac是n-乙酰葡糖胺部分；-fuc是岩藻糖部分；-z是连接基团。本发明还提供了制备根据本发明的抗体-有效载荷缀合物的方法、该制备方法中的中间体化合物和根据本发明的抗体-有效载荷缀合物的医学用途。
附图说明
图1显示生物分子中的一组代表性(但不是全面的)官能团(f)，其是天然存在的或通过工程化引入的，其在与反应基团反应时导致连接基团z。官能团f可以在任何选择的位置人工引入(工程化)到生物分子中。哒嗪连接基团(最后一列)是四氮杂双环[2.2.2]辛烷连接基团重排的产物，在四嗪与炔反应时形成，同时失去n2。在本文中，x可为卤素并且x9可
为h、烷基或吡啶基。结构(10a)-(10j)的连接基团z是用于本发明的优选连接基团。图2显示半乳糖胺的udp糖衍生物的几种结构，其可以用例如3-巯基丙酰基(11a)、叠氮基乙酰基(11b)或叠氮基二氟乙酰基(11c)在2-位进行修饰，或用叠氮基在n-乙酰基半乳糖胺(11d)的6-位进行修饰或用硫醇基在n-乙酰基半乳糖胺(11e)的6-位进行修饰。单糖(即除去udp)是用于本发明的优选部分su。图3显示将单克隆抗体非遗传转化为包含两个叠氮基(一个在任一天然糖基化位点上)的聚糖重构(glycan-remodeled)抗体的一般过程。在与二价环辛炔构建体反应时，单个有效载荷(r)连接至双叠氮基抗体。这种夹接(clipping)也可以通过使用具有两个末端乙炔基团的二价构建体(未描绘)的铜催化点击反应来实现。图4显示将单克隆抗体非遗传转化为包含两个硫醇基团(一个在任一天然糖基化位点上)的聚糖重构的抗体的一般过程。在与二价马来酰亚胺构建体反应时，单个有效载荷(r)连接至双硫醇抗体。这种夹接也可以通过在二价构建体中安装两次的可供选择的硫醇反应性部分(例如，卤代乙酰胺、末端烯烃、亚磷酰胺或丙二烯，未描绘)来实现。图5显示适用于无金属点击化学的环辛炔。该列举不是全面的，例如炔可通过氟化、通过芳环的取代或通过在芳环中引入杂原子而进一步活化。图6显示反应基团q'的实例，优选存在于图3和4的二价构建体中的r基团，其被定义为抗体-药物缀合物中的有效载荷。r基团可通过可裂解部分，例如如顶部结构中所示的肽切割接头连接到二价构建体上。也可以使用酸切割接头或基于二硫化物的接头(未描绘)，或通过另一种机制被切割的接头。r基团也可以通过不可切割的接头(底部构建体)连接。r基团本身可以是例如细胞毒性分子(但不限于细胞毒性分子)。图7是适合于通过夹接在双叠氮基抗体上产生dar1 adc的二价环辛炔构建体的图示，其中两个环辛炔部分连接至具有二聚体构建体(例如pbd二聚体或多米卡星二聚体)有效载荷的两个位点。接头可具有可切割性质或不可切割性质，如对于pbd二聚体所说明的。如所说明的实例，二聚体细胞毒性有效载荷在性质上不一定是对称的，也可为例如多米卡星单体和pbd单体的组合。图8说明通过使用三价环辛炔构建体连接dar1形式中的有效载荷的间接方法，所述构建体与双叠氮基-mab反应，留下一个环辛炔游离用于随后的点击化学(用叠氮化物修饰的有效载荷说明，其他选项可以是用硝酮、腈氧化物、重氮化合物、四嗪等的点击化学)。图9显示用于与双聚糖修饰的mab反应的三价构建体的各种选择。三价构建体可为同三价(heterotrivalent)或异三价(heterotrivalent)(2 1形式)。同三价构建体(x＝y)可由3x环辛炔或3x乙炔或3x马来酰亚胺或3x其他硫醇反应基团组成。异三价构建体(x≠y)可例如由两个环辛炔基团和一个马来酰亚胺基团或两个马来酰亚胺基团和一个反式环辛烯基团组成。异三价构建体可存在x和y的任何组合，除非x和y彼此反应(例如马来酰亚胺 硫醇)。图10显示一系列已知用于通过(a)二硫键的还原，随后(b)所得硫醇官能团的交联与含有二硫化物的蛋白质缀合的试剂，对于f＝硫醇，其也可用作在本发明的上下文中的反应性部分q。图11显示一系列二价bcn试剂(105、107、118、125、129、134)、三价bcn试剂(143、145、150)、用于分选(sortagging)的单价bcn试剂(157、161、163、168)或用于分选的单价四
嗪试剂(154)。图12显示一系列二价或三价交联剂(xl01-xl13)。图13显示一系列作为随后转化为抗体缀合物的起始材料的抗体变体。图14显示一系列基于mmae或mmaf的双bcn修饰的细胞毒性药物，用于通过与双叠氮基修饰的抗体交联来产生dar1 adc。图15显示一系列基于mmae(303)、pbd二聚体(304)、卡奇霉素(305)或pnu159,682(306)的额外双bcn修饰的细胞毒性药物，用于通过与双叠氮基修饰的抗体交联产生dar1 adc。图16显示一系列基于mmae或mmaf的具有各种环辛炔(bcn、dibo、dbco，具有各种间环辛炔接头变体)或叠氮化物或马来酰亚胺的二价细胞毒性药物，用于通过与双叠氮基修饰的抗体、双炔修饰的抗体或双硫醇修饰的抗体交联产生dar1 adc。图17显示了基于bcn-mmae(312)或叠氮化物-mmaf(313)的两种单价、直链的接头-药物的构建体。图18显示sds-page分析：泳道1-利妥昔单抗；泳道2-rit-v1a；泳道3-rit-v1a-145；泳道4-rit-v1a-(201)2；泳道5-rit-v1a-145-204；泳道6-rit-v1a-145-pf01；泳道7-rit-v1a-145-pf02。将凝胶用考马斯染色以显现总蛋白。在非还原条件下的6％sds-page上(左)和还原条件下的12％sds-page上(右)分析样品。图19显示b12-v1a(上部轨迹)和b12-v1a-145(下部轨迹)的rp-hplc轨迹。在rp-hplc分析之前，样品已用ides消化。图20显示在还原条件下曲妥珠单抗galnprosh trast-v5b与双马来酰亚胺-bcn xl01交联并随后用叠氮基-mmaf ld12(＝313)标记的rp-hplc轨迹。图21显示在还原条件下曲妥珠单抗galnprosh trast-v5b与双马来酰亚胺-叠氮化物xl02交联并随后用bcn-mmae ld11(＝312)和bcn-il15rα-il15 pf15标记的rp-hplc轨迹。图22显示在还原条件下trast-v8与双羟胺-bcn xl06交联并随后用抗4-1bb-叠氮化物pf09或hokt3-四嗪pf02标记的sds-page分析。图23显示sds-page分析：泳道1-trast-v1a；泳道2-trast-v1a-xl11；泳道3和4-trast-v1a-xl11-pf01；泳道5-rit-v1a；泳道6-rit-v1a-xl11；泳道7和8-rit-v1a-xl11-pf01。将凝胶用考马斯染色以显现总蛋白。在非还原条件下的6％sds-page上(左)和还原条件下的12％sds-page上(右)分析样品。图24显示在还原条件下曲妥珠单抗galnprosh trast-v5b与双马来酰亚胺-叠氮化物xl02交联并随后用bcn-mmae ld11(＝312)和bcn-il15rα-il15 pf15标记的sds-page分析。图25显示在还原条件下曲妥珠单抗galnprosh trast-v5b与双马来酰亚胺-bcn xl01交联随后用叠氮基-mmaf ld12(＝313)、叠氮基-il15pf19、hokt3-四嗪pf02和抗4-1bb-叠氮化物pf09标记的rp-hplc轨迹和sds-page分析。图26显示在还原条件下曲妥珠单抗galnprosh trast-v5b与双马来酰亚胺-mmae ld09(＝309)的交联的rp-hplc轨迹。图27显示在非还原条件下在6％凝胶上的sds-page分析：泳道1-利妥昔单抗；泳道
2-rit-v1a-(201)2；泳道3-rit-v1a-145-pf08；泳道4-b12-v1a-145-pf01；泳道5-b12-v1a-145-pf08。将凝胶用考马斯染色以显现总蛋白。泳道1和2作为非缀合mab和2:2分子形式的参考被包括在内。图28显示在非还原条件下在6％凝胶上的sds-page分析：泳道1-rit-v1a-(201)2；泳道2-rit-v1a-145-pf01；泳道3-rit-v1a；泳道4-rit-v1a-pf22；泳道5-trast-v1a-pf22。将凝胶用考马斯染色以显现总蛋白。泳道1和2作为非缀合mab和2:2分子形式的参考被包括在内。图29显示在非还原条件下在6％凝胶上的sds-page分析：泳道1-trast-v1a；泳道2-trast-v1a-pf23。将凝胶用考马斯染色以显现总蛋白。泳道1作为非缀合mab的参考被包括在内。图30显示在非还原条件下在6％凝胶上的sds-page分析：泳道1-rit-v1a；泳道2-rit-v1a-(201)2；泳道3-rit-v1a-145-pf01；泳道4-rit-v1a-pf22；泳道5-rit-v1a-pf23。将凝胶用考马斯染色以显现总蛋白。泳道1至4作为非缀合mab、2:1和2:2分子形式的参考被包括在内。图31显示在非还原条件下在6％凝胶上的sds-page分析：泳道1-rit-v1a-145；泳道2-rit-v1a-145-pf09；泳道3-trast-v1a-145；泳道4-trast-v1a-145-pf09；泳道5-rit-v1a；泳道6-rit-v1a-(pf07)2；泳道7-trast-v1a；泳道8-trast-v1a-(pf07)2。将凝胶用考马斯染色以显现总蛋白。图32显示非还原性sds-page分析：泳道1-trast-v1a-(pf10)
1-2
；泳道2-trast-v1a-(209)
1-2
；泳道3-trast-v1a-(pf11)
1-2
；泳道4-trast-v1a；泳道5-trast-v1a-145-pf12；泳道6-trast-v1a-145。将凝胶用考马斯染色以显现总蛋白。图33显示在非还原条件下在6％凝胶上的sds-page分析：泳道1-rit-v1a-145；泳道2-rit-v1a-145-pf17；泳道3-trast-v1a-145；泳道4-trast-v1a-145-pf17。将凝胶用考马斯染色以显现总蛋白。图34显示在非还原条件下在6％凝胶上的sds-page分析：泳道1-trast-v1a；泳道2-trast-v1a-pf29；泳道3-rit-v1a；泳道4-rit-v1a-pf29。将凝胶用考马斯染色以显现总蛋白。图35显示基于hokt3 200的双特异性用人pbmc对rajib肿瘤细胞的杀伤作用。双特异性和计算的ec
50
值显示在图例中。b12-v1a-145-pf01作为阴性对照被包括在内。图36显示基于抗4-1bb pf31的双特异性用人pbmc对rajib肿瘤细胞的杀伤作用。双特异性和计算的ec
50
值显示在图例中。b12-v1a-145-pf31作为阴性对照被包括在内。图37显示在与基于hokt3 200的双特异性孵育后，rajib-pbmc共培养物的上清液中的细胞因子水平。鼠okt3 migg2a抗体(invitrogen16-0037-81)作为阳性对照被包括在内。图38显示在与基于抗4-1bb pf31的双特异性孵育后，rajib-pbmc共培养物的上清液中的细胞因子水平。鼠okt3 migg2a抗体(invitrogen16-0037-81)作为阳性对照被包括在内。本发明具体实施方式定义
在本说明书和权利要求书中使用动词“包含”及其变化形式的非限制性意义以意指包括该词之后的项，但不排除未具体提及的项。此外，用不定冠词“一(a)”或“一个(an)”提及要素时不排除存在超过一个所述要素的可能性，除非上下文明确要求有且只有一个元素。因此，不定冠词“一”或“一个”通常意指“至少一个”。本说明书和权利要求书中所公开的化合物可包含一个或多个不对称中心，并且可存在所述化合物的不同的非对映异构体和/或对映异构体。除非另有说明，对本说明书和权利要求书中的任何化合物的描述意指包括所有的非对映异构体及其混合物。此外，除非另有说明，对本说明书和权利要求书中的任何化合物的描述意指包括单独的对映异构体，以及对映异构体的任何混合物、外消旋体或其他形式。在描述一种化合物的结构为具体的对映异构体时，应理解为本技术的发明不限于该具体的对映异构体。所述化合物可以不同的互变异构的形式存在。除非另有说明，本发明的化合物意指包括所有的互变异构形式。在描述一种化合物的结构为具体的互变异构体时，应理解为本技术的发明不限于该具体的互变异构体。本说明书和权利要求书中所公开的化合物还可以外型(exo)和内型(endo)非对映异构体存在。除非另有说明，对本说明书和权利要求书中的任何化合物的描述意指包括化合物的单独的外型和单独的内型非对映异构体，及其混合物。当化合物的结构被描述为具体的内型或外型非对映异构体时，应理解，本技术的发明不限于该具体的内型或外型非对映异构体。此外，本说明书和权利要求书中所公开的化合物可以顺式和反式异构体存在。除非另有说明，对本说明书和权利要求书中的任何化合物的描述意指包括化合物的单独的顺式异构体和单独的反式异构体，及其混合物。例如，当化合物的结构被描述为顺式异构体时，应理解，相应的反式异构体或顺式和反式异构体的混合物未被排除在本技术的发明之外。当化合物的结构被描述为具体的顺式或反式异构体时，应理解，本技术的发明不限于该具体的顺式或反式异构体。根据本发明的化合物可以盐形式存在，其也包括在本发明内。所述盐通常为药学上可接受的盐，其含有药学上可接受的阴离子。术语“其盐”意指当酸性质子(通常是酸的质子)被阳离子(如金属阳离子或有机阳离子等)替代时形成的化合物。在适用的情况下，该盐是药学上可接受的盐——尽管对于不打算施用于患者的盐而言，这不是必需的。举例来说，在化合物的盐中，化合物可以被无机或有机酸质子化以形成阳离子，而无机或有机酸的共轭碱作为盐的阴离子成分。术语“药学上可接受的”盐意指对于诸如哺乳动物的患者给药是可接受的盐(对于给定的剂量方案，具有抗衡离子的盐具有可接受的哺乳动物安全性)。这样的盐可以衍生自药学上可接受的无机或有机碱以及药学上可接受的无机或有机酸。“药学上可接受的盐”是指化合物的药学上可接受的盐，所述盐衍生自本领域已知的各种有机和无机抗衡离子，并且包括例如钠、钾、钙、镁、铵、四烷基铵等，以及(当分子包含碱性官能团时)有机或无机酸的盐，诸如盐酸盐、氢溴酸盐、甲酸盐、酒石酸盐、苯磺酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、马来酸盐、草酸盐等。术语“蛋白质”在本文中以其通常的科学含义使用。在本文中，包含约10个或更多个氨基酸的多肽被认为是蛋白质。蛋白质可包含天然的和非天然的氨基酸。
术语“单糖”在本文中以其通常的科学含义使用，并且是指在5-9个(羟基化)碳原子的链环化时由分子内半缩醛形成产生的含氧杂环，最通常包含五个碳原子(戊糖)、六个碳原子(己糖)或九个碳原子(唾液酸)。典型的单糖是核糖(rib)、木糖(xyl)、阿拉伯糖(ara)、葡萄糖(glu)、半乳糖(gal)、甘露糖(man)、葡糖醛酸(glca)、n-乙酰葡萄糖胺(glcnac)、n-乙酰半乳糖胺(galnac)和n-乙酰神经氨酸(neuac)。本文中使用的术语“抗体”为其常规的科学含义。抗体是由免疫系统产生的蛋白质，其能够识别并且结合特异性抗原。抗体是糖蛋白的实例。在本文中使用术语抗体的最广泛的意义，并具体包括单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗体片段以及双链和单链抗体。术语“抗体”在本文也意指包括人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和特异性结合癌抗原的抗体。术语“抗体”意指包括全免疫球蛋白，以及抗体的抗原结合片段。此外，所述术语包括经遗传改造的抗体和抗体的衍生物。抗体、抗体片段和经遗传改造的抗体可通过本领域已知的方法获得。抗体的典型实例，尤其包括阿昔单抗(abciximab)、利妥昔单抗(rituximab)、巴利昔单抗(basiliximab)、帕利珠单抗(palivizumab)、英夫利昔单抗(infliximab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、阿仑珠单抗(alemtuzumab)、阿达木单抗(adalimumab)、托西莫单抗-i131(tositumomab-i131)、西妥昔单抗(cetuximab)、替伊莫单抗(ibrituximab tiuxetan)、奥马佐单抗(omalizumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、那他珠单抗(natalizumab)、雷珠单抗(ranibizumab)、帕木单抗(panitumumab)、依库珠单抗(eculizumab)、培化舍珠单抗(certolizumab pegol)、戈利木单抗(golimumab)、卡那奴单抗(canakinumab)、卡妥索单抗(catumaxomab)、乌司奴单抗(ustekinumab)、托珠单抗(tocilizumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、地舒单抗(denosumab)、贝利木单抗(belimumab)、伊匹木单抗(ipilimumab)和布妥昔单抗(brentuximab)。“抗体片段”在本文中定义为完整抗体的一部分，包括其抗原结合区或其可变区。抗体片段的实例包括fab、fab'、f(ab
′
)2和fv片段、双抗体、微型抗体(minibody)、三链抗体(triabod)、四链抗体、线性抗体、单链抗体分子、scfv、scfv-fc、由抗体形成的多特异性抗体片段、由fab表达文库产生的片段或免疫特异性结合靶抗原(例如癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原)的上述任一种的表位结合片段。“抗原”在本文中定义为抗体特异性结合的实体。术语“特异性结合(specific binding)”和“特异性结合(specifically binds)”在本文中被定义为一种或多种抗体与其对应的靶抗原表位结合而不与大量其他抗原结合的高度选择性方式。通常，抗体或抗体衍生物以至少约1
×
10-7
m，优选10-8
m至10-9
m、10-10
m、10-11
m或10-12
m的亲和力结合，并以比其结合预定抗原或密切相关抗原以外的非特异性抗原(例如bsa，酪蛋白)的亲和力至少两倍大的亲和力结合预定抗原。术语“基本”或“基本上”在本文中定义为混合物或样品的大多数，即》50％总体，优选超过总体的50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。“接头”在本文中定义为连接化合物的两个或更多个元素的部分。例如，在抗体缀合物中，抗体和有效载荷通过接头彼此共价连接。接头可包含一个或多个接头和连接接头内的各种部分的间隔基部分。“极性接头”在本文中定义为含有特定目的是增加接头的极性，从而提高水溶性的结构元件的接头。极性接头可以例如包含一个或多个单元或其组合，其选自乙二醇、羧酸部分、磺酸酯部分、砜部分、酰化磺酰胺部分、磷酸酯部分、次膦酸酯部分、氨基或铵基。“间隔基”或间隔基部分在本文中定义为间隔(即提供其间的距离)并将接头的两个(或更多个)部分共价连接在一起的部分。接头可以是例如如下定义的接头-构建体、接头-缀合物或生物缀合物的一部分。“自降解基团”在本文中定义为抗体-药物缀合物中接头的一部分，其功能是在配体单元靶向的位点有条件地释放游离药物。可活化的自降解部分包含可活化基团(ag)和自降解的间隔基单元。在活化可活化基团时，例如通过将酰胺基酶转化为氨基或通过将二硫化物还原为游离硫醇基，引发自降解反应序列，导致通过一种或更多的各种机制释放游离药物，其可涉及(临时的)1,6-消除对氨基苄基成为对醌甲基化物，任选地伴随释放二氧化碳和/或随后的第二环化释放机制。自降解组装单元可为连接抗体和有效载荷的化学间隔基的一部分(通过官能团)。替代性地，自降解基团不是化学间隔基的固有部分，而是从连接抗体和有效载荷的化学间隔基分支。“可活化基团”在本文中定义为连接到芳族基团上的官能团，其可以经历生物化学加工步骤，例如酰胺键的蛋白水解或二硫键的还原，经该生物化学加工步骤，将引发芳族基团的自降解过程。可活化基团也可称为“活化基团”。“生物缀合物”在本文中定义为其中生物分子经由接头共价连接至有效载荷的化合物。生物缀合物包含一种或多种生物分子和/或一种或多种有效载荷。抗体-缀合物，例如抗体-有效载荷缀合物和抗体-药物-缀合物是生物缀合物，其中生物分子是抗体。“生物分子”在本文中定义为可以从自然界分离的任何分子或由较小分子构建块组成的任何分子，所述较小分子构建块是来源于自然界的大分子结构的组分，特别是核酸、蛋白质、聚糖和脂质。生物分子的实例包括酶、(非催化)蛋白质、多肽、肽、氨基酸、寡核苷酸、单糖、寡糖、多糖、聚糖、脂质和激素。术语“有效载荷”是指共价连接至靶向部分(例如抗体)的部分，也指接头切割后从缀合物释放的分子。因此，有效载荷是指具有一个通过接头共价连接至靶向部分的开放末端的单价部分，其在本发明的上下文中被称为d，并且还指从其释放的分子。术语“2:1分子形式”是指由与单个功能性有效载荷缀合的二价单克隆抗体(igg型)组成的蛋白质缀合物。本发明的抗体-有效载荷缀合物本发明涉及具有结构(1)的抗体-有效载荷缀合物：
其中：-a、b、c和d各自独立地为0或1；-e是0至10范围内的整数；-l1、l2和l3是接头；-d是有效载荷；-bm是分支部分；-su是单糖；-g是单糖部分；-glcnac是n-乙酰葡萄糖胺部分；-fuc是岩藻糖部分；-z是连接基团。在抗体-有效载荷缀合物(1)中，有效载荷d通过连接基团z，任选的接头l1、l2和l3、分支部分bm和糖部分-[su-(g)
e-(glcnac(fuc)d)]-连接到抗体ab。在(1)中，a、b、c和d各自独立地选自0和1。n-乙酰葡萄糖胺部分glcnac可为岩藻糖基化的(d＝1)或非岩藻糖基化的(d＝0)。抗体-有效载荷缀合物(1)包含两个glcnac部分，其彼此独立地为岩藻糖基化或非岩藻糖基化。换言之，在抗体-有效载荷缀合物(1)中，一个glcnac可为岩藻糖基化的，而另一个glcnac可为非岩藻糖基化的，两个glcnac都可为岩藻糖基化的，或者两个glcnac都可为非岩藻糖基化的。根据本发明的优选抗体-有效载荷缀合物具有a＝b＝1，即l1和l2都存在，更优选l1和l2相同。特别优选的是对称的抗体-有效载荷缀合物，其中a/b、e、g、su、z和l1/l2的每次出现都相同。抗体(ab或ab)在(1)中，ab是抗体。优选ab是单克隆抗体，更优选选自iga、igd、ige、igg和igm抗体。甚至更优选ab是igg抗体。igg抗体可以是任何igg同种型。抗体可以是任何igg同种型，
例如igg1、igg2、igi3或igg4。优选ab是全长抗体，但ab也可以是fc片段。(1)中的两个glcnac部分中的每一个优选地存在于抗体ab的fc片段中的天然n-糖基化位点上。优选地，所述glcnac部分与ab的290-305区中的天冬酰胺氨基酸连接。在进一步优选的实施方案中，抗体是igg型抗体，并且取决于具体的igg型抗体，所述glcnac部分存在于ab的氨基酸天冬酰胺297(asn297或n297)上。糖部分(g)e(4)中的两个glcnac部分中的每一个优选存在于抗体ab的fc-片段中的天然n-糖基化位点上。优选地，所述glcnac部分与ab的290-305区中的天冬酰胺氨基酸连接。在进一步优选的实施方案中，抗体是igg型抗体，并且取决于具体的igg型抗体，所述glcnac部分存在于抗体的氨基酸天冬酰胺297(asn297或n297)上。g是单糖部分且e是0至10范围内的整数。g优选选自葡萄糖(glc)、半乳糖(gal)、甘露糖(man)、岩藻糖(fuc)，n-乙酰葡萄糖胺(glcnac)、n-乙酰半乳糖胺(galnac)、n-乙酰神经氨酸(neunac)和唾液酸和木糖(xyl)。更优选地，g选自葡萄糖(glc)、半乳糖(gal)、甘露糖(man)、岩藻糖(fuc)、n-乙酰葡萄糖胺(glcnac)和n-乙酰半乳糖胺(galnac)。在一个优选实施方案中，e为0且g不存在。当抗体的聚糖被剪切时，g通常不存在。剪切是指用糖苷内切酶处理，使得只保留聚糖的核心glcnac部分。在另一个优选实施方案中，e是1至10范围内的整数。在该实施方案中，进一步优选g选自葡萄糖(glc)、半乳糖(gal)、甘露糖(man)、岩藻糖(fuc)、n-乙酰葡萄糖胺(glcnac)、n-乙酰半乳糖胺(galnac)、n-乙酰神经氨酸(neunac)或唾液酸和木糖(xyl)，更优选选自葡萄糖(glc)、半乳糖(gal)、甘露糖(man)、岩藻糖(fuc)、n-乙酰葡萄糖胺(glcnac)和n-乙酰半乳糖胺(galnac)。当e为3至10时，(g)e可以是直链的或支链的。支链寡糖(g)e的优选实例是(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(h)和(h)，如下所示。
如果存在g，则优选其终止于glcnac。换句话说，与su直接连接的单糖残基是glcnac。glcnac部分的存在有助于官能化抗体的合成，因为单糖衍生物su可以通过糖基转移容易地引入到末端glcnac残基上。在上述具有结构(a)-(h)的(g)e的优选实施方案中，部分su可以与任何末端glcnac残基(即不是与波浪键连接的那一个)连接，其连接到抗体上的核心glcnac残基。特别优选不存在g，即e＝0。其中e＝0的抗体-有效载荷缀合物(1)的一个优点是，当临床使用这种缀合物时，与fcγ受体cd16、cd32和cd64的结合显著降低或完全消除。su是一种单糖衍生物，也称为糖衍生物。优选地，可以通过糖基转移将糖衍生物并入官能化抗体中。可以被引入的核苷酸-糖衍生物的一些优选实例参见图2。更优选地su是gal、glc、galnac或glcnac，更优选gal或galnac，最优选galnac。术语衍生物是指被适当官能化以连接至(g)e和f的单糖。连接基团z在抗体-有效载荷缀合物(1)中，z是连接基团。如以上更详细地描述的，术语“连接基团”是指连接化合物的一部分和相同化合物的另一部分的结构元素。在(1)中，z通过l1和/或l2(如果存在)连接两种su衍生物与分支部分bm。是否存在l1和/或l2取决于a和b的值。在一个优选的实施方案中，两个z的出现都是相同的。如本领域技术人员将理解的，连接基团的性质取决于获得所述化合物的各部分之间的连接的反应类型。作为实例，当r-c(o)-oh的羧基与h2n-r'的氨基反应形成r-c(o)-n(h)-r'时，r通过连接基团z连接至r'，且z由基团-c(o)-n(h)-代表。由于连接基团z源自q和
f之间的反应，因此可以采取任何形式。此外，对于本发明的工作，连接基团z的性质并不是关键性的。如本领域技术人员将理解，连接基团的性质取决于获得所述化合物的特异性部分之间的连接的有机反应的类型。大量有机反应可用于将反应基团q1连接至间隔基部分，以及将有效载荷连接到间隔基部分。因此，两个连接基团z的种类繁多。例如，z可以通过环加成或亲核反应获得，优选其中环加成是[4 2]环加成或1,3-偶极环加成，并且亲核反应是迈克尔加成或亲核取代。在本发明的上下文中，连接基团z将抗体连接至接头l，任选地经由间隔基连接。本领域已知许多用于将反应基团q连接至反应基团f的反应。因此，在根据本发明的缀合物中可以存在多种连接基团z。在一个实施方案中，连接基团z选自上述选项，优选如图1所示。例如，当f包含或为硫醇基时，互补基团q包括n-马来酰亚胺基和烯基，相应的连接基团z如图1所示。当f包含或为硫醇基时，互补基团基团q还包括丙二烯酰胺基团(allenamide)和亚磷酰胺(phosphonamidite)基团。例如，当f包含或为酮基时，互补基团q包括(o-烷基)羟基氨基和肼基，以及相应的连接基团z如图1所示。例如，当f包含或为炔基时，互补基团q包括叠氮基，以及相应的连接基团z如图1所示。例如，当f包含或为叠氮基时，互补基团q包含炔基，以及相应的连接基团z如图1所示。例如，当f包含或为环丙烯基、反式环辛烯基或环炔基时，互补基团q包括四嗪基，以及相应的连接基团z如图1所示。在具体情况下，z只是一种中间结构并将排出n2，从而生成二氢哒嗪(来自与烯烃的反应)或哒嗪(来自与炔烃的反应)。例如，当f包含或为四嗪基时，互补基团q包括环丙烯基、反式环辛烯基或环炔基，以及相应的连接基团z如图1所示。在具体情况下，z只是一种中间结构并将排出n2，从而生成二氢哒嗪(来自与烯烃的反应)或哒嗪(来自与炔烃的反应)。f和q的另外的合适组合以及所得连接基团z的性质是本领域技术人员已知的，例如描述于g.t.hermanson,“bioconjugate techniques”,elsevier,3rd ed.2013(isbn:978-0-12-382239-0)，特别是在第3章，第229-258页，通过引用的方式并入。适用于生物缀合过程的互补反应基团的列表公开于g.t.hermanson,“bioconjugate techniques”,elsevier,3rd ed.2013(isbn:978-0-12-382239-0)的第3章的表3.1，第230-232页中，并且该表的内容通过引用明确并入本文。在一个优选的实施方案中，连接基团z为根据如下定义的结构(za)至(zk)中的任一种。优选地，z根据结构(za)、(ze)或(zj)：
在本文中，-x8是o或nh。-x9选自h、c
1-12
烷基和吡啶基，其中c
1-12
烷基优选为c
1-4
烷基，最优选甲基。-r
23
是c
1-12
烷基，优选c
1-4
烷基，最优选乙基。-在结构(zg)和(zh)中，键代表单键或双键，并且可以通过该键的任一侧连接至接头l。-波浪线表示与接头l的连接。连接性取决于q和f的具体性质。尽管根据(za)至(zg)的连接基团的任一位点可以连接至l，但优选的是如所描绘的这些基团中的最左侧连接至(l1)a/(l2)b。连接基团(zh)通常随着n2的释放而重排成(zg)。在一个优选的实施方案中，每个z独立地选自以下基团：-o-、-s-、-s-s-、-nr
2-、-n＝n-、-c(o)-、-c(o)-nr
2-、-o-c(o)-、-o-c(o)-o-、-o-c(o)-nr2、-nr
2-c(o)-,-nr
2-c(o)-o-、-nr
2-c(o)-nr
2-、-s-c(o)-、-s-c(o)-o-、-s-c(o)-nr
2-、-s(o)-、-s(o)
2-、-o-s(o)
2-、-o-s(o)
2-o-、-o-s(o)
2-nr
2-、-o-s(o)-、-o-s(o)-o-、-o-s(o)-nr
2-、-o-nr
2-c(o)-、-o-nr
2-c(o)-o-、-o-nr
2-c(o)-nr
2-、-nr
2-o-c(o)-、-nr
2-o-c(o)-o-、-nr
2-o-c(o)-nr
2-、-o-nr
2-c(s)-、-o-nr
2-c(s)-o-、-o-nr
2-c(s)-nr
2-、-nr
2-o-c(s)-、-nr
2-o-c(s)-o-、-nr
2-o-c(s)-nr
2-、-o-c(s)-、-o-c(s)-o-、-o-c(s)-nr
2-、-nr
2-c(s)-、-nr
2-c(s)-o-、-nr
2-c(s)-nr
2-、-s-s(o)
2-、-s-s(o)
2-o-、-s-s(o)
2-nr
2-、-nr
2-o-s(o)-、-nr
2-o-s(o)-o-、-nr
2-o-s(o)-nr
2-、-nr
2-o-s(o)
2-、-nr
2-o-s(o)
2-o-、-nr
2-o-s(o)
2-nr
2-、-o-nr
2-s(o)-、-o-nr
2-s(o)-o-、-o-nr
2-s(o)-nr
2-、-o-nr
2-s(o)
2-o-、-o-nr
2-s(o)
2-nr
2-、-o-nr
2-s(o)
2-、-o-p(o)(r2)
2-、-s-p(o)(r2)
2-、-nr
2-p(o)(r2)
2-和由(za)-(zi)中任一项表示的部分。在本文中，r2独立地选自氢、c
1-c
24
烷基、c
2-c
24
烯基、c
2-c
24
炔基和c
3-c
24
环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。更优选地，每个z包含选自三唑、环己烯、环己二烯、异噁唑啉、异噁唑烷、吡唑啉、哌嗪、硫醚、酰胺或酰亚胺基团的部分。三唑部分特别优选存在于z中。在一个特别优选的实施方案中，连接基团z包含一个三唑部分并根据结构(zj)：
在本文中，r
15
、x
10
、u、u’和v如针对(q36)所定义的，并且其所有优选的实施方案同样适用于(zj)。波浪线表示与相邻部分(su和(l1)a或(l2)b)的连接，并且连接性取决于q和f的具体性质。尽管根据(zj)的连接基团的任一位点可连接至(l1)a/(l2)b，但是优选地所描绘的上部波浪键表示与su的连接。根据结构(zf)和(zk)的连接基团是根据(zj)的连接基团的优选实施方案。在一个特别优选的实施方案中，连接基团z包含一个三唑部分并是根据结构(zk)：在本文中，r
15
、r
18
、r
19
和l如针对(q37)所定义的，并且其所有优选的实施方案同样适用于(zj)。波浪线表示与相邻部分(su和(l1)a或(l2)b)的连接，并且连接性取决于q和f的具体性质。尽管根据(zj)的连接基团的任一位点可连接至(l1)a，但优选如图所示的左波浪键代表与su的连接。在一个优选的实施方案中，q包含或为炔烃部分并且f为叠氮基部分，使得连接基团z包含三唑部分。优选的包含三唑部分的连接基团是根据结构(ze)或(zj)的连接基团，其中根据结构(zj)的连接基团优选根据结构(zk)或(zf)。在一个优选的实施方案中，连接基团根据结构(zj)，更优选根据结构(zk)或(zf)。分支部分bm本发明上下文中的“分支部分”是指嵌入连接三个部分的接头中的部分。换言之，分支部分包含至少三个与其他部分的键，一个与反应基团f、连接基团z或有效载荷d的键，一个与反应基团q或连接基团z的键，以及一个与反应基团q或连接基团z的键。本发明上下文中，任何包含至少三个与其他部分的键的部分适合作为分支部分。合适的分支部分包括碳原子(bm-1)、氮原子(bm-3)、磷原子(膦(bm-5)和氧化膦(bm-6))、芳族环如苯环(例如bm-7)或吡啶环(例如bm-9)、(杂)环(例如bm-11和bm-12)和多环部分(例如bm-13、bm-14和bm-15)。优选的分支部分选自碳原子和苯环，最优选bm是碳原子。下文描述结构(bm-1)至(bm-15)，其中三个分支，即与如上定义的其他部分的键，用*表示(用*标记的键)。
在(bm-1)中，用*标记的分支之一可以是单键或双键，用表示。在(bm-11)至(bm-15)中，以下适用：-每个n、p、q和q分别地是0-5范围内的整数，优选0或1，最优选1；-每个w1、w2和w3独立地选自c(r
21
)w和n；-每个w4、w5和w6独立地选自c(r
21
)
w 1
、n(r
22
)w、o和s；-每个代表一个单键或双键；-w为0或1或2，优选0或1；-每个r
21
独立地选自氢、oh、c
1-c
24
烷基、c
1-c
24
烷氧基、c
3-c
24
环烷基、c
2-c
24
(杂)芳基、c
3-c
24
烷基(杂)芳基和c
3-c
24
(杂)芳基烷基，其中所述c
1-c
24
烷基、c
1-c
24
烷氧基、c
3-c
24
环烷基、c
2-c
24
(杂)芳基、c
3-c
24
烷基(杂)芳基和c
3-c
24
(杂)芳基烷基被一个或多个选自o、s和nr3的杂原子任选取代和任选中断，其中r3独立地选自氢和c
1-c4烷基；和-每个r
22
独立地选自氢、c
1-c
24
烷基、c
3-c
24
环烷基、c
2-c
24
(杂)芳基、c
3-c
24
烷基(杂)芳基和c
3-c
24
(杂)芳烷基，其中所述c
1-c
24
烷基、c
1-c
24
烷氧基、c
3-c
24
环烷基、c
2-c
24
(杂)芳基、c
3-c
24
烷基(杂)芳基和c
3-c
24
(杂)芳烷基被一个或多个选自o、s和nr3的杂原子任选取代和任选中断，其中r3独立地选自氢和c
1-c4烷基。本领域技术人员理解，w的值和由表示的键的键级是相互依赖的。因此，每当出现w与桥环双键键合时，对于w的出现，w＝1，而每当出现w与两个桥环单键键合时，对于w的出现，w＝0。对于bm-12、o和p中的至少一个不为0。根据结构(bm-11)和(bm-12)的分支部分的代表性实例包括环丙基、环丁基、环戊
基、环己基、环庚基、环辛基、环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基、环庚烯基、环辛烯基、氮丙啶、氮杂环丁烷、二氮杂环丁烷、氧杂环丁烷、硫杂环丁烷、吡咯烷、二氢吡咯基、四氢呋喃基、二氢呋喃基、硫杂环戊基(thiolanyl)、咪唑啉基、吡唑烷基、噁唑烷基、异噁唑烷基、噻唑烷基、异噻唑烷基、二氧戊环基(dioxolanyl)、二硫戊环基(dithiolanyl)、哌啶基、噁烷基(oxanyl)、噻烷基(thianyl)、哌嗪基、吗啉代(morpholino)、硫代吗啉代(thiomorpholino)、二噁烷基(dioxanyl)、三噁烷基(trioxanyl)、二噻烷基(dithyanyl)、三噻烷基(trithianyl)、氮杂环庚烷基(azepanyl)、氧杂环庚烷基(oxepanyl)和硫杂环庚烷基(thiepanyl)。用作分支部分的优选环状部分包括环丙烯基、环己基、噁烷基(四氢吡喃)和二噁烷基。三个分支的取代模式决定分支部分是结构(bm-11)还是结构(bm-12)。根据结构(bm-13)至(bm-15)的分支部分的代表性实例包括萘烷、四氢化萘、二氢化萘、萘、茚、1,2-二氢化茚(indane)、异茚、吲哚、异吲哚、二氢吲哚、异二氢吲哚等。在一个优选的实施方案中，bm是碳原子。如果碳原子为根据结构(bm-1)的并且所有四个键键合至不同部分，则碳原子是手性的。碳原子的立体化学对于本发明来说不是关键的，并且可以是s或r。这同样适用于膦(bm-6)。最优选地，碳原子根据结构(bm-1)。根据结构(bm-1)的碳原子中用*表示的支链之一可以是双键，在这种情况下，碳原子可以是烯烃或亚胺的一部分。在bm是碳原子的情况下，碳原子可以是较大官能团的一部分，例如缩醛、缩酮、半缩酮、原酸酯、原碳酸酯、氨基酸等。这也适用于bm是氮或磷原子的情况，在这种情况下，它可以是酰胺、酰亚胺、亚胺、氧化膦(如在bm-6中)或磷酸三酯的一部分。在一个优选的实施方案中，bm是苯环。最优选地，苯环根据结构(bm-7)。苯环的取代模式可以是任何立体化学(regiochemistry)，例如1,2,3-取代的苯环、1,2,4-取代的苯环或1,3,5-取代的苯环。为了获得最佳的柔性和构象自由度，优选苯环根据结构(bm-7)，最优选苯环是1,3,5-取代的。这同样适用于(bm-9)的吡啶环。在一个优选的实施方案中，分支部分bm选自碳原子、氮原子、磷原子、(杂)芳环、(杂)环或多环部分。接头l1、l2和l3中的每一个可以不存在或存在，但优选地所有三个连接单元都存在。在一个优选的实施方案中，l1、l2和l3中的每一个，如果存在的话，独立地是至少2个，优选5至100个选自c、n、o、s和p原子的链。在本文中，原子链是指从连接单元的末端开始的原子的最短链。链内的原子也可以称为主链原子(backbone atom)。如本领域技术人员将理解的，具有多于两个化合价的原子，例如c、n和p，可以被适当地官能化以完成这些原子的化合价。换言之，主链原子任选地被官能化。在一个优选的实施方案中，l1、l2和l3中的每一个，如果存在的话，独立地是至少5至50，优选6至25个选自c、n、o、s和p原子的链。主链原子优选选自c、n和o。接头l1和l2将bm与反应性部分q连接。优选l1和l2都存在，即a＝b＝1，更优选它们是相同的。在一个特别优选的实施方案中，(l1)a–
z与(l2)b–
z相同。l1和l2可以独立地选自直链或支链c
1-c
200
亚烷基、c
2-c
200
亚烯基、c
2-c
200
亚炔基、c
3-c
200
亚环烷基、c5-c
200
亚环烯基、c
8-c
200
亚环炔基、c
7-c
200
烷基亚芳基、c
7-c
200
芳基亚烷基、c
8-c
200
芳基亚烯基和c9-c
200
芳基亚炔基，所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基被一个或多个选自o、s
和nr3的杂原子任选取代和任选中断，其中r3独立地选自氢、c
1-c
24
烷基、c
2-c
24
烯基、c
2-c
24
炔基和c
3-c
24
环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基是任选地被取代。当亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基被一个或多个如上定义的杂原子中断时，优选所述基团通过一个或多个o原子，和/或通过一个或多个s-s基团被中断。更优选地，l1和l2，如果存在的话，独立地选自直链或支链c
1-c
100
亚烷基、c
2-c
100
亚烯基、c
2-c
100
亚炔基、c
3-c
100
亚环烷基、c5-c
100
亚环烯基、c
8-c
100
亚环炔基、c
7-c
100
烷基亚芳基、c
7-c
100
芳基亚烷基、c
8-c
100
芳基亚烯基和c9-c
100
芳基亚炔基，所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基，被一个或多个选自o、s和nr3的杂原子任选取代和任选中断，其中r3独立地选自氢、c
1-c
24
烷基、c
2-c
24
烯基、c
2-c
24
炔基和c
3-c
24
环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。甚至更优选地，l1和l2，如果存在的话，独立地选自直链或支链c
1-c
50
亚烷基、c
2-c
50
亚烯基、c
2-c
50
亚炔基、c
3-c
50
亚环烷基、c
5-c
50
亚环烯基、c
8-c
50
亚环炔基、c
7-c
50
烷基亚芳基、c
7-c
50
芳基亚烷基、c
8-c
50
芳基亚烯基和c
9-c
50
芳基亚炔基，所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基被一个或多个选自o、s和nr3的杂原子任选取代和任选中断，其中r3独立地选自氢、c
1-c
24
烷基、c
2-c
24
烯基、c
2-c
24
炔基和c
3-c
24
环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。还甚至更优选地，l1和l2，如果存在的话，独立地选自直链或支链c
1-c
20
亚烷基、c
2-c
20
亚烯基、c
2-c
20
亚炔基、c
3-c
20
亚环烷基，c5-c
20
亚环烯基、c
8-c
20
亚环炔基、c
7-c
20
烷基亚芳基、c
7-c
20
芳基亚烷基、c
8-c
20
芳基亚烯基和c9-c
20
芳基亚炔基，所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基被一个或多个选自o、s和nr3的杂原子任选取代和任选中断，其中r3独立地选自氢、c
1-c
24
烷基、c
2-c
24
烯基、c
2-c
24
炔基和c
3-c
24
环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。在这些优选的实施方案中，进一步优选亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基是未取代的并且任选地被一个或多个选自o、s和nr3，优选o的杂原子中断，其中r3独立地选自氢和c
1-c4烷基，优选氢或甲基。最优选地，l1和l2，如果存在的话，独立地选自直链或支链c
1-c
20
亚烷基，所述亚烷基被一个或多个选自o、s和nr3的杂原子任选取代和任选中断，其中r3独立地选自氢、c
1-c
24
烷基、c
2-c
24
烯基、c
2-c
24
炔基和c
3-c
24
环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。在该实施方案中，进一步优选亚烷基未被取代并且任选被一个或多个选自o、s和nr3，优选o和/或s-s的杂原子中断，其中r3独立地选自氢和c
1-c4烷基，优选氢或甲基。优选的接头l1和l2包括-(ch2)
n1-、-(ch2ch2)
n1-、-(ch2ch2o)
n1-、-(och2ch2)
n1-、-(ch2ch2o)
n1
ch2ch
2-、-ch2ch2(och2ch2)
n1-、-(ch2ch2ch2o)
n1-、-(och2ch2ch2)
n1-、-(ch2ch2ch2o)
n1
ch2ch2ch
2-和-ch2ch2ch2(och2ch2ch2)
n1-，其中n1是1至50范围内的整数，优选1至40范围内，更优选1至30范围内，甚至更优选1至20范围内，并且还甚至更优选1至15范围内。更优选n1为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，更优选为1、2、3，4、5、6、7或8，甚至更优选1、2、3、4、5或6，还甚至更优选1、2、3或4。在一个实施方案中，l3不存在且c＝0。在替代性和更优选的实施方案中，l3存在且c
＝1。如果l3存在，其可与l1和l2相同或不同，优选不同。在一个优选实施方案中，l3可以包含l4、l5、l6和l7中的一个或多个。因此，在一个实施方案中，l3是
–
(l4)n–
(l5)o–
(l6)
p
–
(l7)q–
，其中l4、l5、l6和l7是一起形成如下文进一步定义的接头l的接头；n、o、p和q各自为0或1。在一个优选实施方案中，至少存在接头l4和l5(即n＝1；o＝1；p＝0或1；q＝0或1)，更优选存在接头l4、l5和l6且l7存在或不存在(即n＝1；o＝1；p＝1；q＝0或1)。在一个实施方案中，存在接头l4、l5、l6和l7(即n＝1；o＝1；p＝1；q＝1)。在一个实施方案中，存在接头l4、l5和l6且l7不存在(即n＝1；o＝1；p＝1；q＝0)。在一个实施方案中，n o p q＝1、2、3或4，优选2、3或4，更优选3或4。在一个优选实施方案中，l5和l6都存在，即o p＝2。最优选地，n o p q＝4。接头l3可包含当有效载荷d连接到接头结构时形成的连接基团z3，该连接可在接头结构(特别是反应性部分q)与官能化抗体(特别是反应部分f)反应之前或之后。接头l3内的连接基团可在连接单元l4、l5、l6和l7中的任何一个连接处形成，或者可以单独存在于接头l3内。例如，l3可表示为z3–
(l4)n–
(l5)o–
(l6)
p
–
(l7)q–
或
–
(l4)n–
z3–
(l5)o–
(l6)
p
–
(l7)q–
。在本文中，z可以采取任何形式，并优选如下文对于通过q和f反应得到的获得的连接基团进一步定义的。接头l4接头l4不存在(n＝0)或存在(n＝1)。优选地，存在接头l4且n＝1。l1可以例如选自直链或支链的c
1-c
200
亚烷基、c
2-c
200
亚烯基、c
2-c
200
亚炔基、c
3-c
200
亚环烷基、c
5-c
200
亚环烯基、c
8-c
200
亚环炔基、c
7-c
200
烷基亚芳基、c
7-c
200
芳基亚烷基、c
8-c
200
芳基亚烯基、c
9-c
200
芳基亚炔基。任选地，该亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基可以被取代，并且任选地，所述基团均可以被一个或多个杂原子中断，优选地是1至100个杂原子，所述杂原子优选地选自o、s(o)y和nr
15
，其中y是0、1或2，优选y＝2，且r
15
独立地选自氢、卤素、c
1-c
24
烷基、c
6-c
24
(杂)芳基、c
7-c
24
烷基(杂)芳基和c
7-c
24
(杂)芳基烷基。l4可以含有(聚)乙二醇二胺链(例如，1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷或包括更长的乙二醇链的等同物)、聚乙二醇链或聚环氧乙烷链、聚丙二醇链或聚环氧丙烷链，以及1,z-二氨基烷烃，其中z是烷烃中的碳原子数(z可以例如是1-10范围内的整数)。在一个优选的实施方案中，接头l4包含乙二醇基团、羧酸部分、磺酸酯部分、砜部分、磷酸酯部分、次膦酸酯部分、氨基基团、铵基团或磺酰胺基团。在一个优选的实施方案中，接头l4包含磺酰胺基，优选地是根据结构(23)的磺酰胺基：波浪线表示与化合物的剩余部分的连接，通常是与bm和l5、l6、l7或d的连接，优选地是与bm和l5的连接。优选地，(o)ac(o)部分与bm连接，而nr
13
部分与l5、l6、l7或d连接，优选地与l5连接。在结构(23)中，a1＝0或1，优选地a1＝1，并且r
13
选自氢、c
1-c
24
烷基、c
3-c
24
环烷基、c2-c
24
(杂)芳基、c
3-c
24
烷基(杂)芳基和c
3-c
24
(杂)芳基烷基，该c
1-c
24
烷基、c
3-c
24
环烷基、c
2-c
24
(杂)芳基、c
3-c
24
烷基(杂)芳基和c
3-c
24
(杂)芳基烷基被一个或多个选自o、s和nr
14
的杂原子任选地取代和任选地中断，其中r
14
独立地选自氢和c
1-c4烷基。替代性地，r
13
是连接到n的d，可能经由间隔基部分。在一个实施方案中，r
13
还连接到有效载荷d，从而形成环状结构。例如，n是哌嗪部分的一部分，其通过碳原子或氮原子，优选通过哌嗪环的第二个氮原子与d连接。优选地，环状结构，例如哌嗪环通过
–
(b)
e1
–
(a)
f1
–
(b)
g1
–
c(o)
–
或
–
(b)
e1
–
(a)
f1
–
(b)
g1
–
c(o)
–
(l5)o–
(l6)
p
–
(l7)q–
连接至d，如下文进一步定义。在一个优选的实施方案中，r
13
是氢或c
1-c
20
烷基，更优选地r
13
是氢或c
1-c
16
烷基，甚至更优选地r
13
是氢或c
1-c
10
烷基，其中该烷基被一个或多个选自o、s和nr
14
(优选是o)的杂原子任选地取代和任选地中断，其中r
14
独立地选自氢和c
1-c4烷基。在优选的实施方案中，r
13
是氢。在另一个优选的实施方案中，r
13
是c
1-c
20
烷基，更优选地是c
1-c
16
烷基，甚至更优选地是c
1-c
10
烷基，其中该烷基任选地被一个或多个o原子间隔，并且其中该烷基任选地被-oh基团，优选地被末端-oh基团取代。在该实施方案中，进一步优选的是，r
13
是包含末端-oh基团的(聚)乙二醇链。在另一个优选的实施方案中，r
13
选自氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基和叔丁基，更优选地选自氢、甲基、乙基、正丙基和异丙基，并且甚至更优选地选自氢、甲基和乙基。再甚至更优选地，r
13
是氢或甲基，并且最优选地，r
13
是氢。在一个优选的实施方案中，l1根据结构(24)：在本文中，a和r
13
如上文定义，sp1和sp2独立地是间隔基部分，并且b1和c1独立地是0或1。优选地，b1＝0或1并且c1＝1，更优选地b1＝0并且c1＝1。在一个实施方案中，间隔基sp1和sp2独立地选自直链或支链的c
1-c
200
亚烷基、c
2-c
200
亚烯基、c
2-c
200
亚炔基、c
3-c
200
亚环烷基、c
5-c
200
亚环烯基、c
8-c
200
亚环炔基、c
7-c
200
烷基亚芳基、c
7-c
200
芳基亚烷基、c
8-c
200
芳基亚烯基和c
9-c
200
芳基亚炔基，该亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基被选自o、s和nr
16
的一个或多个杂原子任选地取代和任选地中断，其中r
16
独立地选自氢、c
1-c
24
烷基、c
2-c
24
烯基、c
2-c
24
炔基和c
3-c
24
环烷基，该烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。当该亚烷基、亚烯基、亚炔基、环亚烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基被如上定义的一个或多个杂原子间隔时，优选的是，所述基团被一个或多个o原子，和/或一个或多个s-s基团间隔。更优选地，间隔基部分sp1和sp2，如果存在的话，独立地选自直链或支链的c
1-c
100
亚烷基、c
2-c
100
亚烯基、c
2-c
100
亚炔基、c
3-c
100
亚环烷基、c
5-c
100
亚环烯基、c
8-c
100
亚环炔基、c
7-c
100
烷基亚芳基、c
7-c
100
芳基亚烷基、c
8-c
100
芳基亚烯基和c
9-c
100
芳基亚炔基，该亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基被选自o、s和nr
16
的一个或多个杂原子任选地取代和任选地中断，其中r
16
独立地选自氢、c
1-c
24
烷基、c
2-c
24
烯基、c
2-c
24
炔基和c
3-c
24
环烷基，该烷基、烯基、炔基烷基和环烷基是任选取代的。
甚至更优选地，间隔基部分sp1和sp2，如果存在的话，独立地选自直链或支链的c
1-c
50
亚烷基、c
2-c
50
亚烯基、c
2-c
50
亚炔基、c
3-c
50
亚环烷基、c
5-c
50
亚环烯基、c
8-c
50
亚环炔基、c
7-c
50
烷基亚芳基、c
7-c
50
芳基亚烷基、c
8-c
50
芳基亚烯基和c
9-c
50
芳基亚炔基，该亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基被选自o、s和nr
16
的一个或多个杂原子任选地取代和任选地中断，其中r
16
独立地选自氢、c
1-c
24
烷基、c
2-c
24
烯基、c
2-c
24
炔基和c
3-c
24
环烷基，该烷基、烯基、炔基和环烷基是任选取代的。再甚至更优选地，间隔基部分sp1和sp2，如果存在的话，独立地选自直链或支链的c
1-c
20
亚烷基、c
2-c
20
亚烯基、c
2-c
20
亚炔基、c
3-c
20
亚环烷基、c
5-c
20
亚环烯基、c
8-c
20
亚环炔基、c
7-c
20
烷基亚芳基、c
7-c
20
芳基亚烷基、c
8-c
20
芳基亚烯基和c
9-c
20
芳基亚炔基，该亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基被选自o、s和nr
16
的一个或多个杂原子任选地取代和任选地中断，其中r
16
独立地选自氢、c
1-c
24
烷基、c
2-c
24
烯基、c
2-c
24
炔基和c
3-c
24
环烷基，该烷基、烯基、炔基和环烷基是任选取代的。在这些优选的实施方案中，进一步优选的是，亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基是未被取代的并且任选地被选自o、s和nr
16
(优选地是o)的一个或多个杂原子中断，其中r
16
独立地选自氢和c
1-c4烷基，优选地是氢或甲基。最优选地，间隔基部分sp1和sp2，如果存在的话，独立地选自直链或支链的c
1-c
20
亚烷基，该亚烷基被选自o、s和nr
16
的一个或多个杂原子任选地取代和任选地中断，其中r
16
独立地选自氢、c
1-c
24
烷基、c
2-c
24
烯基、c
2-c
24
炔基和c
3-c
24
环烷基，该烷基、烯基、炔基和环烷基是任选取代的。在该实施方案中，进一步优选的是，亚烷基是未取代的并且任选地被选自o、s和nr
16
，优选o和/或s-s的一个或多个杂原子中断，其中r3独立地选自氢和c
1-c4烷基，优选地是氢或甲基。因此，优选的间隔基部分sp1和sp2包括-(ch2)
r-、-(ch2ch2)
r-、-(ch2ch2o)
r-、-(och2ch2)
r-、-(ch2ch2o)rch2ch
2-、-ch2ch2(och2ch2)
r-、-(ch2ch2ch2o)
r-、-(och2ch2ch2)
r-、-(ch2ch2ch2o)rch2ch2ch
2-和-ch2ch2ch2(och2ch2ch2)
r-，其中r是1至50范围内的整数，优选地是1至40范围内的整数，更优选地是1至30范围内的整数，甚至更优选地是1至20范围内的整数并且再甚至更优选地是1至15范围内的整数。更优选地，n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，更优选地是1、2、3、4、5、6、7或8，甚至更优选地是1、2、3、4、5或6，再甚至更优选地是1、2、3或4。替代性地，优选的接头l4可以由
–
(w)
k1
–
(a)
d1
–
(b)
e1
–
(a)
f1
–
(c(o))
g1
–
表示，其中：-d1＝0或1，优选地d1＝1；-e1＝0-10范围内的整数，优选地e1＝0、1、2、3、4、5或6，优选地是1-10范围内的整数，最优选地e1＝1、2、3或4；-f1＝0或1，优选地f1＝0；-其中d1 e1 f1至少是1，优选地是在1-5范围内；并且优选地，其中d1 f1至少是1，优选地d1 f1＝1。-g1＝0或1，优选地g1＝1；-k1＝0或1，优选地k1＝1；-a是根据结构(23)的磺酰胺基；-b是
–
ch2–
ch2–o–
或
–o–
ch2–
ch2–
部分，或(b)
e1
是
–
(ch2–
ch2–
o)
e3
–
ch2–
ch2–
部分，其中e3以与e1相同的方式定义；-w是
–
oc(o)
–
、
–
c(o)o
–
、
–
c(o)nh
–
、
–
nhc(o)
–
、
–
oc(o)nh
–
、
–
nhc(o)o
–
、
–
c(o)(ch2)mc(o)
–
、
–
c(o)(ch2)mc(o)nh
–
或
–
(4-ph)ch2nhc(o)(ch2)mc(o)nh
–
，优选地其中w是
–
oc(o)nh
–
、
–
c(o)(ch2)mc(o)nh
–
或
–
c(o)nh
–
，并且其中m是0至10范围内的整数，优选地m＝0、1、2、3、4、5或6，最优选地m＝2或3；-优选地，其中l4通过(a)
d1-(b)
e1
与bm连接，并且通过(c(o))
g1
，优选地通过c(o)与(l5)o连接。在本实施方案的上下文中，结构(23)中的波浪线表示与相邻基团如(w)
k1
、(b)
e1
和(c(o))
g1
的连接。优选的是，a根据结构(23)，其中a1＝1且r
13
＝h或c
1-c
20
烷基，更优选地r
13
＝h或甲基，最优选地r
13
＝h。优选的接头l4如下：(a)k1＝0；d1＝1；g1＝1；f1＝0；b＝
–
ch
2-ch
2-o
–
；e1＝1、2、3或4，优选地e1＝2。(b)k1＝1；w＝
–
c(o)(ch2)mc(o)nh
–
；m＝2；d1＝0；(b)
e1
＝
–
(ch2–
ch2–
o)
e3
–
ch2–
ch2–
；f1＝0；g1＝1；e3＝1、2、3或4，优选地e1＝1。(c)k1＝1；w＝
–
oc(o)nh
–
；d1＝0；b＝
–
ch
2-ch
2-o
–
；g1＝1；f1＝0；e1＝1、2、3或4，优选地e1＝2。(d)k1＝1；w＝
–
c(o)(ch2)mc(o)nh
–
；m＝2；d1＝0；(b)
e1
＝
–
(ch2–
ch2–
o)
e3
–
ch2–
ch2–
；f1＝0；g1＝1；e3＝1、2、3或4，优选地e3＝4。(e)k1＝1；w＝
–
oc(o)nh
–
；d1＝0；(b)
e1
＝
–
(ch2–
ch2–
o)
e3
–
ch2–
ch2–
；g1＝1；f1＝0；e3＝1、2、3或4，优选地e3＝4。(f)k1＝1；w＝
–
(4-ph)ch2nhc(o)(ch2)mc(o)nh
–
，m＝3；d1＝0；(b)
e1
＝
–
(ch2–
ch2–
o)
e3
–
ch2–
ch2–
；g1＝1；f1＝0；e3＝1、2、3或4，优选地e3＝4。(g)k1＝0；d1＝0；g1＝1；f1＝0；b＝
–
ch
2-ch
2-o
–
；e1＝1、2、3或4，优选地e1＝2。(h)k1＝1；w＝
–
c(o)nh
–
；d1＝0；g1＝1；f1＝0；b＝
–
ch
2-ch
2-o
–
；e1＝1、2、3或4，优选地e1＝2。在一个实施方案中，接头l4包含分支(branching)氮原子，其位于bm和(l5)o之间的主链中，并且其含有另外的部分d作为取代基，该部分d优选地经由接头与分支氮原子连接。分支氮原子的一个实例是结构(23)中的氮原子nr
13
，其中r
13
经由间隔基部分与第二个存在的d连接。替代性地，根据结构
–
(w)
k1
–
(a)
d1
–
(b)
e1
–
(a)
f1
–
(c(o))
g1
–
，分支氮原子可位于l4内。在一个实施方案中，l4由(w)
k1
–
(a)
d1
–
(b)
e1
–
(a)
f1
–
(c(o))
g1
–
n*[
–
(a)
d1
–
(b)
e1
–
(a)
f1
–
(c(o))
g1
–
]2表示，其中a、b、w、d1、e1、f1、g1和k1如上文定义并针对每次出现独立地选择，n*是分支氮原子，其与
–
(a)
d1
–
(b)
e1
–
(a)
f1
–
(c(o))
g1
–
的两个实例连接。在本文中，两个(c(o))
g1
部分均与
–
(l5)o–
(l6)
p
–
(l7)q–
d连接，其中l5、l6、l7、o、p、q和d如上文定义并且各自独立地被选择。在最优选的实施方案中，这样的分支原子不存在，并且接头l4不包含与另一部分d的连接。接头l5接头l5不存在(o＝0)或存在(o＝1)。优选地，接头l5存在且o＝1。接头l5是本领域
已知的肽间隔基，优选地包含2-5个氨基酸，更优选是二肽或三肽间隔基，最优选地是二肽间隔基。尽管可以使用任何肽间隔基，但是优选地接头l5选自val-cit、val-ala、val-lys、val-arg、phe-cit、phe-ala、phe-lys、phe-arg、ala-lys、leu-cit、ile-cit、trp-cit、ala-ala-asn、ala-asn，更优选val-cit、val-ala、val-lys、phe-cit、phe-ala、phe-lys、ala-ala-asn，更优选val-cit、val-ala、ala-ala-asn。在一个实施方案中，l5＝val-cit。在一个实施方案中，l5＝val-ala。在优选的实施方案中，l5由通用结构(27)表示：在本文中，r
17
＝ch3或ch2ch2ch2nhc(o)nh2。波浪线表示与(l4)n和(l6)
p
的连接,优选根据结构(27)的l5经由nh连接至(l4)n和经由c(o)连接至(l6)
p
。接头l6接头l6不存在(p＝0)或存在(p＝1)。优选地，接头l6存在且p＝1。接头l6是可自切割(self-cleavable)的间隔基，也称为可自降解(self-immolative)间隔基。优选地，l6是对氨基苄氧基羰基(pabc)衍生物，更优选是根据结构(25)的pabc衍生物。在本文中，波浪线表示与(l5)n和与(l7)
p
的连接。通常，pabc衍生物通过nh与(l5)n连接，并且通过o与(l7)
p
连接。r3是h、r4或c(o)r4，其中r4是c
1-c
24
(杂)烷基、c
3-c
10
(杂)环烷基、c
2-c
10
(杂)芳基、c
3-c
10
烷基(杂)芳基和c
3-c
10
(杂)芳基烷基，这些基团被选自o、s和nr5的一个或多个杂原子任选地取代和任选地中断，其中r5独立地选自氢和c
1-c4烷基。优选地，r4是c
3-c
10
(杂)环烷基或聚亚烷基二醇。聚亚烷基二醇优选地是聚乙二醇或聚丙二醇，更优选地是
–
(ch2ch2o)sh或
–
(ch2ch2ch2o)sh。聚亚烷基二醇最优选地是聚乙二醇，优选地是
–
(ch2ch2o)sh，其中s是1-10范围内，优选1-5范围内的整数，最优选地s＝1、2、3或4。更优选地，r3是h或c(o)r4，其中r4＝4-甲基哌嗪或吗啉。最优选地，r3是h。接头l7接头l7不存在(q＝0)或存在(q＝1)。优选地，接头l7存在且q＝1。接头l7是氨基链烷酸(aminoalkanoic acid)间隔基，即
–n–
(c
h-亚烷基)
–
c(o)
–
，其中h是1-20，优选1-10，最优选1-6范围内的整数。在本文中，氨基链烷酸间隔基通常通过氮原子与l6连接，并通过羰基部分与d连接。优选的接头l7选自6-氨基己酸(ahx，h＝6)、β-丙氨酸(h＝2)和甘氨酸(gly，h＝1)，甚至更优选地是6-氨基己酸或甘氨酸。在一个实施方案中，l7＝6-氨基己酸。在一个实施方案中，l7＝甘氨酸。或者接头l7是根据结构
–n–
(ch2–
ch2–
o)
e6
–
(ch2)
e7
–
(c(o)
–
的乙二醇间隔基，其中e6是1-10范围内的整数，且e7是1-3范围内的整数。有效载荷d在根据本发明的接头-缀合物的一个优选的实施方案中，有效载荷选自活性物质、报告分子、聚合物、固体表面、水凝胶、纳米颗粒、微粒和生物分子。特别优选的有效载荷是活性物质和报告分子，特别是活性物质。本文中的术语“活性物质”涉及药理学和/或生物学物质，即具有生物学和/或药学活性的物质，例如药物、前药、诊断剂、蛋白质、肽、多肽、肽标签、氨基酸、聚糖、脂质、维生素、类固醇、核苷酸、核苷、多核苷酸、rna或dna。肽标签的实例包括细胞穿透肽如人乳铁蛋白或聚精氨酸。聚糖的实例为低聚甘露糖。氨基酸的实例为赖氨酸。当有效载荷为活性物质，所述活性物质优选选自药物和前药。更优选地，所述活性物质选自药学活性化合物，特别是低至中分子量的化合物(例如约200至约2500da，优选约300至约1750da)。在进一步优选的实施方案中，活性物质选自细胞毒素类、抗病毒剂、抗菌剂、肽和寡核苷酸。细胞毒素类的实例包括秋水仙碱(colchicine)、长春花生物碱(vinca alkaloids)、蒽环类药物(anthracyclines)、喜树碱类(camptothecin)、阿霉素(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、紫杉烷类(taxanes)、刺孢霉素类(calicheamycins)、tubulysins、伊立替康(irinotecans)、抑制肽、鹅膏蕈碱(amanitin)、debouganin、多米卡星、美登木素类(maytansines)、阿里他汀类(auristatin)、烯二炔类(enediynes)、吡咯并苯并二氮杂类(pbds)或吲哚并苯并二氮杂卓二聚体(indolinobenzodiazepine dimers)(ign)或pnu159,682。本文中的术语“报告分子”是指一种容易检测其存在的分子，例如诊断剂、染料、荧光团、放射性同位素标记、造影剂、磁共振成像剂或质量标记。本领域技术人员已知多种荧光团，也称为荧光探针。几种荧光团更详细地描述于例如g.t.hermanson,“bioconjugate techniques”,elsevier,3
rd ed.2013,chapter 10:“fluorescent probes”,p.395-463，通过引用的方式并入。荧光团的实例包括alexa fluor(例如alexa fluor 555)、花青染料(例如cy3或cy5)和花青染料衍生物、香豆素衍生物、荧光素和荧光素衍生物、罗丹明和罗丹明衍生物、硼二吡咯亚甲基衍生物、芘衍生物、萘二甲酰亚胺(naphthalimide)衍生物、藻胆蛋白衍生物(例如别藻蓝素)、色霉素、镧系元素螯合物和量子点纳米晶体(quantum dot nanocrystals)的所有种类。放射性同位素标记的实例包括
99m
tc、
111
in、
114m
in、
115
in、
18
f、
14
c、
64
cu、
131
i、
125
i、
123
i、
212
bi、
88
y、
90
y、
67
cu、
186
rh、
188
rh、
66
ga、
67
ga和
10
b,，其可选地任选地通过螯合部分，例如dtpa(二亚乙基三胺五乙酸酐)，dota(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-n,n',n”,n”'-四乙酸)，nota(1,4,7-三氮杂环壬烷n,n',n
”‑
三乙酸)，teta(1,4,8,11-四氮杂环十四烷-n,n',n”,n”'-四乙酸)，dtta(n
1-(对异硫氰酸基苄基)-二乙烯三胺-n1,n2,n3,n
3-四乙酸)，去铁胺或dfa(n'-[5-[[4-[[5-(乙酰羟基氨基)戊基]氨基]-1,4-二氧代丁基]-羟基氨基]戊基]-n-(5-氨基戊基)-n-羟基丁二酰胺)或hynic(肼基烟酰胺)连接。同位素标记技术是本领域技术人员已知的，并且在例如g.t.hermanson，“生物缀合物技术”，elsevier，第三版，2013年，第12章：“同位素标记技术”，第507-534页中更详细描述，其通过引用的方式并入。适合用作本发明化合物中的有效载荷d的聚合物是本领域技术人员已知的，并且几个实例在例如g.t.hermanson，“生物缀合物技术”，elsevier，第三版，2013年，第18章：“聚乙二醇化和合成聚合物改性”，第787-848页中更详细描述，其通过引用的方式并入。当有效载荷d是聚合物时，有效载荷d优选独立地选自聚(乙二醇)(peg)、聚环氧乙烷(peo)、聚丙二醇(ppg)、聚环氧丙烷(ppo)、1,x-二氨基烷烃聚合物(其中x是烷烃中的碳原子数，优选x是2至200范围内的整数，优选2至10)、(聚)乙二醇二胺(例如1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷和包含较长乙二醇链的等同物)、多糖(例如葡聚糖)、聚(氨基酸)(例如聚(l-赖氨酸))和聚(乙烯醇)。适合用作有效载荷d的固体表面是本领域技术人员已知的。固体表面是例如功能表面(例如纳米材料、碳纳米管、富勒烯或病毒衣壳的表面)，金属表面(例如钛、金、银、铜、镍、锡、铑或锌表面)，金属合金表面(其中合金来自例如铝、铋、铬、钴、铜、镓、金、铟、铁、铅、镁、汞、镍、钾、钚、铑、钪、银、钠、钛、锡、铀、锌和/或锆)，聚合物表面(其中聚合物是例如聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚(二甲基硅氧烷)或聚甲基丙烯酸甲酯，聚丙烯酰胺)，玻璃表面，有机硅表面，色谱载体表面(其中色谱载体是例如二氧化硅载体、琼脂糖载体、纤维素载体或氧化铝载体)等。当有效载荷d是固体表面时，优选d独立地选自功能表面或聚合物表面。水凝胶是本领域技术人员已知的。水凝胶是水溶胀的网络，由聚合物成分之间的交联形成。参见例如a.s.hoffman，adv.drug delivery rev.2012,64,18，其通过引用的方式并入。当有效载荷是水凝胶时，优选水凝胶由聚(乙烯)乙二醇(peg)作为聚合物基础组成。适合用作有效载荷d的微米和纳米颗粒是本领域技术人员已知的。多种合适的微米和纳米颗粒描述于例如g.t.hermanson，“生物缀合物技术”，elsevier，第三版，2013年，第14章：“微粒子和纳米颗粒”，第549-587页，其通过引用的方式并入。微米或纳米颗粒可以是任何形状，例如球体、棒、管、立方体、三角形和锥体。优选地，微米或纳米颗粒为球形。微米和纳米颗粒的化学组成可以变化。当有效载荷d是微米或纳米颗粒时，微米或纳米颗粒是例如聚合物微米或纳米颗粒、二氧化硅微米或纳米颗粒、或金微米或纳米颗粒。当颗粒是聚合物微米或纳米颗粒时，聚合物优选是聚苯乙烯或苯乙烯的共聚物(例如苯乙烯和二乙烯基苯、丁二烯、丙烯酸酯和/或乙烯基甲苯的共聚物)、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚乙烯基甲苯、聚(甲基丙烯酸羟基乙酯(phema)或聚(乙二醇二甲基丙烯酸酯/甲基丙烯酸2-羟基乙酯)[聚(edgma/hema)]。任选地，微米或纳米颗粒的表面被例如洗涤剂改性，通过二级聚合物的接枝聚合或通过另一种聚合物或间隔子部分的共价连接等。有效载荷d也可以是生物分子。以下更详细地描述生物分子及其优选实施方式。当有效载荷d是生物分子时，优选生物分子选自蛋白质(包括糖蛋白和抗体)、多肽、肽、聚糖、脂质、核酸、寡核苷酸、多糖、寡糖、酶、激素、氨基酸和单糖。根据本发明的darl抗体-有效载荷缀合物特别适合与高效细胞毒素一起使用，例如pbd二聚体、吲哚并苯并二氮杂卓二聚体(ign)、烯二炔、pnu159,682、多米卡星二聚体、鹅膏蕈碱和阿里他汀类，优选pbd二聚体、吲哚并苯并二氮杂卓二聚体(ign)、烯二炔或pnu159,682。在一个特别优选的实施方案中，有效载荷选自pbd二聚体、吲哚并苯二氮卓二聚体(ign)、烯二炔、pnu159,682、多米卡星二聚体、鹅膏蕈碱和阿里他汀类，优选pbd二聚体、吲哚并苯二氮卓二聚体(ign)、烯二炔或pnu159,682。在进一步优选的实施方案中，有效载荷不是对称的或二聚的有效载荷。
制备方法本发明还涉及一种制备假定有效载荷抗体比为1的抗体-有效载荷缀合物的方法，其包括以下步骤：(a)使具有结构(2)的包含至少两个反应基团q的化合物与具有结构(3)的抗体反应，所述抗体用两个反应基团f官能化：其中：-ab是抗体；-a、b、c和d各自分别为0或1；-e是0至10范围内的整数；-l1、l2和l3是接头；-v是反应基团q'或有效载荷d；-bm是分支部分；-su是单糖；-g是单糖部分；-glcnac是n-乙酰葡糖胺部分；-fuc是岩藻糖部分；-q和f是能够进行缀合反应的反应基团，其中它们连接在连接基团z中；来获得根据结构(1)的官能化抗体：其中z是通过q与f的反应得到的连接基团；其中如果v是有效载荷d，根据结构(1)的官能化抗体是抗体-有效载荷缀合物；或者如果v是反应基团q'，根据结构(1)的官能化抗体根据步骤(b)进一步反应；(b)如果v＝q'，使反应基团q'与含有反应基团f'的有效载荷反应以获得抗体-有效载荷缀合物，其中v是有效载荷d。根据本发明的方法可以采取两种主要形式，一种是不进行步骤(b)，另一种是进行
步骤(b)。在一个实施方案中，不进行步骤(b)且存在于具有结构(2)的化合物上的v是有效载荷d。在这种情况下，步骤(a)直接提供最终的缀合物(结构(1))。根据该优选实施方案的方法可以根据方案1表示。方案1在本文中，lb代表根据结构(9)的三价接头，其在上文进一步定义。因此，在一个优选的实施方案中，在步骤(a)中获得根据结构(1)的官能化抗体，其中d是有效载荷，并且不进行步骤(b)。在一个实施方案中，进行步骤(b)且存在于具有结构(2)的化合物上的v是反应基团q'。在这种情况下，步骤(a)提供具有结构(1)的中间官能化抗体，其中v＝q'(以下描述为(1b))。该中间官能化抗体含有另一个反应基团q'，其与具有反应基团f的适当官能化的有效载荷反应，以获得具有其中v＝d的结构(1)的最终缀合物。根据该优选实施方案的方法可以根据方案2表示。方案2在本文中，q1和f1正像q和f是反应性部分，q和f的定义和优选实施方案同样适用于q1和f1。接头化合物(2)中q'的存在不应干扰反应，这可以通过q'在q1和f1之间的反应中的惰性来实现。发明人已经发现其中q1和q'都是相同的反应性部分的三价接头化合物，与ab(f1)2的反应仅发生在两个结合q1/q'，并且第三反应性部分保持未反应。通过在稀释条件下进行反应来实现在接头化合物处发生的第三反应的进一步还原。因此，在一个优选的实施方案中，在步骤(a)中获得根据结构(1)的官能化抗体，其中d是反应基团q'，并且进行步骤(b)。“有效载荷与抗体的比”，也称为药物抗体比(dar)，是指缀合物中有效载荷分子与抗体分子的比率。本发明提供获得dar为1的缀合物，即一个有效载荷分子与一个抗体分子
缀合的有效途径。产物的有效载荷与抗体的比可略低于假定的有效载荷与抗体的比，因为并非所有官能化抗体都可以与结构(2)的接头化合物反应，使得实际的有效载荷与抗体的比可能与假定的有效载荷与抗体的比率有所偏离(即可能会有所降低)。根据本发明的方法提供有效载荷与抗体的比接近假定比率为1的产物混合物。与常规方法相比，本发明提供一种用于制备有效载荷与抗体的比为1的抗体缀合物的很大改进的方法。常规方法很难在抗体中仅引入单个附着点。抗体包含许多氨基酸，使得随机缀合，例如马来酰亚胺-半胱氨酸缀合，通常会产生含最高达8个甚至更多的有效载荷的缀合物的广泛的分布。其他缀合方法的缺点是抗体是对称的，因此提供至少两个可使用的任何附着点。因此，可以依靠遗传工程来设计仅包含一个附着点的重组抗体。替代性的现有技术方法涉及使用对称功能化的有效载荷，其中对称有效载荷(二聚体)通过接头用两个相同的反应性部分对称地官能化。然后这两个反应性部分与抗体中提供的两个附着点反应。本发明的方法通过将双官能团的接头化合物夹接在两个聚糖上，将对称抗体的两个聚糖附着点巧妙地转化为单个附着点。如实施例中所证明的，这样可以巧妙地获得有效载荷与抗体的比为1的缀合物。此外，由于分支部分，任何有效载荷可缀合至抗体，使得本方法不限于对称有效载荷。如果v＝d，步骤(a)的反应是缀合反应。否则，如果v＝q'，步骤(b)的反应是缀合反应。根据本发明的方法与任何缀合技术兼容，并且如果进行的话，任何这样的技术可以用于步骤(a)和步骤(b)。在一个优选的实施方案中，步骤(a)的反应是环加成或环加成或亲核反应，优选地其中环加成是[4 2]环加成或1,3-偶极环加成，并且亲核反应是迈克尔加成或亲核取代。反应性部分q和f在本发明的上下文中，术语“反应性部分”可指包含官能团的化学部分，也可以指官能团本身。例如，环辛炔基是包含官能团即c-c三键的反应基团。类似地，n-马来酰亚胺基是包含c-c双键作为官能团的反应基团。然而，官能团例如叠氮基官能团、硫醇官能团或炔基官能团在本文中也可称为反应基团。为了在根据本发明的方法中是反应性的，反应性部分q应能与官能化抗体上存在的反应性部分f反应。换言之，反应性部分q对官能化抗体上存在的反应性部分f具有反应性。在本文中，反应性部分被定义为当所述第一反应性部分与所述第二反应性部分选择性地反应时，任选地在其他官能团的存在下，“对”另一反应性部分“具有反应性”。互补的反应性部分是本领域技术人员已知的，并且在下文中更详细地描述以及在图1中举例说明。因此，缀合反应是q和f之间的化学反应，形成包含抗体和有效载荷之间的共价连接的缀合物。此处提供的反应性部分q的定义同样适用于f、q1、f1和q'。在一个优选的实施方案中，反应性部分选自任选取代的n-马来酰亚胺基、酯基、碳酸酯基、受保护的硫醇基、烯基、炔基、四嗪基、叠氮基、膦基、氧化腈基(nitrile oxide group)、氮羰基、腈亚胺基、重氮基、酮基、(o-烷基)羟基氨基、肼基、丙二烯酰胺基、三嗪基、亚磷酰胺基团。在一个特别优选的实施方案中，反应性部分q是n-马来酰亚胺基、亚磷酰胺基团、叠氮基或炔基，最优选反应性部分q是炔基。如果q是炔基，优选q选自末端炔基、(杂)环炔基和双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基]基团。
在一个优选实施方案中，q包含n-马来酰亚胺基或为n-马来酰亚胺基，优选q为n-马来酰亚胺基。如果q是n-马来酰亚胺基，q优选是未取代的。q因此优选地根据结构(q1)，如下所示。在另一个优选的实施方案中，q包含烯基(包括环烯基)或为烯基(包括环烯基)，优选地q为烯基。烯基可为直链或支链的，并且为任选地被取代的。烯基可以是末端烯基或内部烯基。烯基可包含多于一个c-c双键，并且优选地包含一个或两个c-c双键。当烯基为二烯基时，进一步优选两个c-c双键被一个c-c单键隔开(即，优选二烯基为共轭二烯基)。优选地，所述烯基为c
2-c
24
烯基，更优选c
2-c
12
烯基，甚至更优选c
2-c6烯基。进一步优选烯基为末端烯基。更优选地，烯基根据如下所示的结构(q8)，其中l为0至10范围内的整数，优选在0至6范围内；并且p为0至10范围内的整数，优选0至6。更优选l为0、1、2、3或4，更优选l为0、1或2，最优选l为0或1。更优选p为0、1、2、3或4，更优选p为0、1或2，最优选p为0或1。特别优选p为0且l为0或1，或p为1且l为0或1。特别优选的烯基为环烯基(包括杂环烯基)，其中所述环烯基为任选地被取代的。优选地，所述环烯基为c
3-c
24
环烯基，更优选为c
3-c
12
环烯基，甚至更优选为c
3-c8环烯基。在一个优选的实施方案中，环烯基为反式环烯基，更优选反式环辛烯基(也称为tco基)，且最优选反式环辛烯基为如下文所示的结构(q9)或(q10)。在另一个优选的实施方案中，环烯基是环丙烯基，其中环丙烯基为任选地被取代的。在另一个优选的实施方案中，环烯基为降冰片烯基、氧杂降冰片烯基、降冰片二烯基或氧杂降冰片二烯基，其中所述降冰片烯基、氧杂降冰片烯基、降冰片二烯基或氧杂降冰片二烯基任选地被取代。在进一步优选的实施方案中，环烯基为如下文所示的结构(q11)、(q12)、(q13)或(q14)，其中x4为ch2或o，r
27
独立地选自氢、直链或支链的c
1-c
12
烷基或c
4-c
12
(杂)芳基，且r
14
选自氢和氟化烃。优选地，r
27
独立地为氢或c
1-c6烷基，更优选地，r
27
独立地为氢或c
1-c4烷基。甚至更优选地r
27
独立地为氢或甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基或叔丁基。甚至更优选地r
27
独立地为氢或甲基。在另一个优选的实施方案中，r
14
选自氢和-cf3、-c2f5、-c3f7以及-c4f9，更优选氢和-cf3。在另一个优选的实施方案中，环烯基为结构(q11)，其中一个r
27
是氢，另一个r
27
为甲基。在另一个进一步优选的实施方案中，环烯基为结构(q12)，其中两个r
27
为氢。在这些实施方案中，进一步优选l为0或1。在另一个进一步优选的实施方案中，环烯基为结构(q13)的降冰片烯基(x4为ch2)或氧杂降冰片烯基(x4为o)；或结构(q14)的降冰片二烯基(x4为ch2)或氧杂降冰片二烯基(x4为o)，其中r
27
为氢且r
14
为氢或-cf3，优选-cf3。在另一个优选的实施方案中，q包含炔基(包括环炔基)或为炔基(包括环炔基)，优选q包含炔基。炔基可以是直链或支链的，并且任选地被取代。炔基可以是末端炔基或内部炔基。优选地，所述炔基为c
2-c
24
炔基，更优选为c
2-c
12
炔基，甚至更优选为c
2-c6炔基。进一步优选的是，炔基为末端炔基。更优选地，炔基根据如下所示的结构(q15)，其中l为0至10范围内的整数，优选0至6范围内的整数。更优选l为0、1、2、3或4，更优选l为0、1或2，最优选l为0或1。特别优选的炔基为环炔基(包括杂环炔基)，环烯基为任选地被取代的。优选地，(杂)环炔基为(杂)环辛炔基——即杂环辛炔基或环辛炔基，其中(杂)环辛炔基为任选地被取代的。在另一个优选的实施方案中，(杂)环辛炔基根据结构(q36)，并且在下文进一步定义。(杂)环辛炔基的优选实例包括结构(q16)，也称为dibo基团；(q17)，也称为dibac基团；
或(q18)，也称为barac基团；(q19)，也称为combo基团；和(q20)，也称为bcn基团，全部如下文所示，其中x5为o或nr
27
，r
27
的优选实施方案如上文所定义。(q16)中的芳环任选地在一个或多个位置被o-磺酰化，优选在两个位置，最优选如在(q37)(磺酰化二苯并环辛炔(s-dibo))中,而(q17)和(q18)的环可在一个或多个位置被卤化。特别优选的环炔基为任选地被取代的双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基]基团(bcn基团)。优选地，双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基]基团根据如下所示的结构(q20)。在另一个优选的实施方案中，q包含共轭(杂)二烯基或为共轭(杂)二烯基，优选q为能够在diels-alder反应中反应的共轭(杂)二烯基。优选(杂)二烯基包括任选地被取代的四嗪基、任选地被取代的1,2-醌基和任选地被取代的三嗪基。更优选地，所述四嗪基根据如下所示的结构(q21)，其中r
27
选自氢、直链或支链的c
1-c
12
烷基或c
4-c
12
(杂)芳基。优选地，r
27
为氢、c
1-c6烷基或c
4-c
10
(杂)芳基；更优选地，r
27
为氢、c
1-c4烷基或c
4-c6(杂)芳基。甚至更优选地，r
27
为氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基或吡啶基。甚至更优选地，r
27
是氢、甲基或吡啶基。更优选地，所述1,2-醌基根据结构(q22)或(q23)。所述三嗪基可为任何位置异构体(regioisomer)。更优选地，所述三嗪基为1,2,3-三嗪基或1,2,4-三嗪基，其可以经由任何可能的位置连接，例如结构(q24)中所示。最优选1,2,4-三嗪作为三嗪基。在另一个优选的实施方案中，q包含或为叠氮基，优选q为叠氮基。优选地，叠氮基根据如下所示的结构(q25)。在另一个优选的实施方案中，q包含或为氧化腈基，优选地q为氧化腈基。优选地，氧化腈基根据如下所示的结构(q27)。在另一个优选的实施方案中，q包含或为硝酮基，优选地q为硝酮基。优选地，硝酮基根据如下所示的结构(q28)，其中r
29
选自直链或支链的c
1-c
12
烷基和c
6-c
12
芳基。优选地，r
29
为c
1-c6烷基，更优选地，r
29
为c
1-c4烷基。甚至更优选地，r
29
为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基或叔丁基。甚至更优选地，r
29
为甲基。在另一个优选的实施方案中，q包含或为腈亚胺基，优选地q为腈亚胺基。优选地，腈亚胺基根据如下所示的结构(q29)或(q30)，其中r
30
选自直链或支链的c
1-c
12
烷基和c
6-c
12
芳基。优选地，r
30
为c
1-c6烷基，更优选地，r
30
为c
1-c4烷基。甚至更优选地，r
30
为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基或叔丁基。甚至更优选r
30
为甲基。在另一个优选的实施方案中，q包含或为重氮基，优选q为重氮基。优选地，重氮基根据如下所示的结构(q31)，其中r
33
选自氢或羰基衍生物。更优选地，r
33
为氢。在另一个优选的实施方案中，q包含或为酮基，优选q为酮基。优选地，酮基根据如下所示的结构(q32)，其中r
34
选自直链或支链的c
1-c
12
烷基和c
6-c
12
芳基。优选地，r34为c
1-c6烷基，更优选地，r
34
是c
1-c4烷基。甚至更优选地，r
34
为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基或叔丁基。甚至更优选地r
34
为甲基。在另一个优选的实施方案中，q包含或为(o-烷基)羟基氨基，优选地q为(o-烷基)羟基氨基。优选地，(o-烷基)羟基氨基根据如下所示的结构(q33)。在另一个优选的实施方案中，q包含或为肼基，优选q为肼基。优选地，肼基根据如下所示的结构(q34)。在另一个优选的实施方案中，q包含或为丙二烯酰胺基，优选q为丙二烯酰胺基。优
选地，丙二烯酰胺基根据结构(q35)。在另一个优选的实施方案中，q包含或为亚磷酰胺基团，优选q为亚磷酰胺基团。优选地，亚磷酰胺基团根据结构(q36)。
在本文中，(q6)中的芳环任选地在一个或多个位置被o-磺酰化，而(q7)和(q8)的环可以在一个或多个位置被卤化。如果q是(杂)环炔基，优选q选自(q52)-(q70)：
在本文中，与分子的其余部分的连接(描绘成波浪键)可为与q的任何可利用的碳或氮原子的连接。(q60)、(q63)、(q64)和(q65)的氮原子可含连接，或者可以包含氢原子或任选地被官能化。b
(-)
是阴离子，优选选自
(-)
otf、cl
(-)
、br
(-)
或i
(-)
，最优选b
(-)
是
(-)
otf。在缀合反应中，b
(-)
不需要是药学上可接受的阴离子，因为b
(-)
无论如何会与反应混合物中存在的阴离子交换。如果(q69)用于q，带负电荷的反荷离子优选在分离根据本发明的抗体-缀合物时是药学上可接受的，使得抗体-缀合物易于用作药物。q能够与存在于抗体上的反应部分f反应。反应基团q的互补反应基团f为本领域技术人员已知的，且在下文更详细地描述。f和q之间的反应及其对应产物(连接基团z)的一些代表性实例在图1中描述。在一个优选的实施方案中，缀合通过环加成或亲核反应实现，优选其中环加成是[4 2]环加成或1,3-偶极环加成并且亲核反应是迈克尔加成或亲核取代.因此，在根据本发明的缀合方法的优选实施方案中，通过亲核反应，例如亲核取代或迈克尔反应实现缀合。优选的迈克尔反应是马来酰亚胺-硫醇反应，其广泛用于生物缀合。因此，在一个优选的实施方案中，q在亲核反应中，优选在亲核取代或迈克尔反应中是反应性的。在本文中，优选q包含马来酰亚胺部分、卤代乙酰胺部分、丙二烯酰胺部分、亚磷酰胺部分、氰基乙炔基部分、乙烯基砜、乙烯基吡啶部分或甲基磺酰基苯基噁二唑部分，最优选马来酰亚胺部分。如果亲核反应用于缀合，优选构建体部分q
–
(l1)a–
bm
–
(l2)b–
q选自溴马来酰亚胺、双溴马来酰亚胺、双(苯基硫醇)马来酰亚胺、双溴哒嗪二酮(bis-bromopyridazinedione)、双(卤甲基)苯、双(卤甲基)哒嗪、双(卤甲基)吡啶或双(卤甲基)三唑。替代性地，q可由以下描述的结构(q41)-(q48)中的任何一个来表示。反应性部分与作为反应性部分f的硫醇基团通过亲核取代反应。另参见图10。
其中：-x7是cl、br、i、phs、mes；-r
24
是h或c
1-12
烷基，优选h或c
1-6
烷基；-其中(q45)和(q47)的苯环可以是杂芳环，例如吡啶环。因此，在根据本发明的缀合方法的优选实施方案中，缀合通过环加成，例如[4 2]环加成或1,3-偶极环加成，优选1,3-偶极环加成完成。根据该实施方案，反应基团q选自在环加成反应中具有反应性的基团。在此，反应基团q和f为互补的，即它们能够在环加成反应中彼此反应。典型的[4 2]环加成为diels-adler反应，其中q为二烯或亲双烯体。如技术人员所理解的，在diels-alder反应的上下文中，术语“二烯”是指1,3-(杂)二烯，并且包括共轭二烯(r2c＝cr-cr＝cr2)；亚胺(r2c＝cr-n＝cr2或r2c＝cr-cr＝nr、r2c＝n-n＝cr2)和羰基(例如r2c＝cr-cr＝o或o＝cr-cr＝o)。与含n和o的二烯的异相diels-alder反应在本领域中是已知的。本领域已知的适合于[4 2]环加成的任何二烯都可用作反应基团q。优选的二烯包括如上所述的四嗪、如上所述的1,2-醌和如上所述的三嗪。尽管本领域已知适合[4 2]环加成的任何亲双烯体都可用作反应基团q，但是亲双烯体优选如上所述的是烯基或炔基，最优选炔基。对于通过[4 2]环加成的缀合，优选q为亲双烯体(且f为二烯)，更优选q为炔基或包含炔基。对于1,3-偶极环加成，q为1,3-偶极子或亲偶极体。本领域已知的适合于1,3-偶极环加成的任何1,3-偶极子都可用作反应基团q。优选的1,3-偶极子包括叠氮基、硝酮基、氧化腈基、腈亚胺基和重氮基。尽管本领域已知的适合于1,3-偶极环加成的任何亲偶极体都可用作反应基团q，但亲偶极体优选为烯基或炔基，最优选炔基。对于通过1,3-偶极环加成的缀合，优选q为亲偶极体(且f为1,3-偶极子)，更优选q为炔基或包含炔基。因此，在一个优选的实施方案中，q选自亲偶极体和亲双烯体。优选地，q为烯基或炔基。在一个特别优选的实施方案中，q包含炔基，优选选自如上所述的炔基、如上所述的环烯基、如上所述的(杂)环炔基和双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基]基团，更优选地q包含末端炔烃或环辛炔部分，优选双环壬炔(bcn)、氮杂二苯并环辛炔(dibac/dbco)或二苯并环辛炔
(dibo)，更优选bcn或dibac/dbco，最优选bcn。在替代性的优选实施方案中，q选自式(q5)、(q6)、(q7)、(q8)、(q20)和(q9)，更优选地选自式(q6)、(q7)、(q8)、(q20)和(q9)。最优选地，q为双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基]，优选式(q20)。已知这些基团在与叠氮基官能化的抗体的缀合中为高度有效的。在一个特别优选的实施方案中，反应基团q包含炔基且为结构(q36)：其中：-r
15
独立地选自氢、卤素、-or
16
、-no2、-cn、-s(o)2r
16
、c
1-c
24
烷基、c
6-c
24
(杂)芳基、c
7-c
24
烷基(杂)芳基和c
7-c
24
(杂)芳基烷基，其中烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基为任选地被取代的，其中两个取代基r
15
可以连接在一起形成环状(annelated)环烷基或环状(杂)芳烃取代基，其中r
16
独立地选自氢、卤素、c
1-c
24
烷基、c
6-c
24
(杂)芳基、c
7-c
24
烷基(杂)芳基和c
7-c
24
(杂)芳基烷基；-x
10
为c(r
17
)2、o、s或nr
17
，其中r
17
为r
15
；-u为0、1、2、3、4或5；-u’为0、1、2、3、4或5；-其中u u’＝5；-v＝9或10。结构(q36)的反应基团的优选实施方案为根据结构(q37)、(q6)、(q7)、(q8)、(q9)和(q20)的反应基团。在一个特别优选的实施方案中，反应基团q包含炔基且根据结构(q37)：
[0100]
其中：-r
15
独立地选自氢、卤素、-or
16
、-no2、-cn、-s(o)2r
16
、c
1-c
24
烷基、c
5-c
24
(杂)芳基、c
7-c
24
烷基(杂)芳基和c
7-c
24
(杂)芳基烷基，其中烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基为任选地被取代的，其中两个r
15
取代基可连接在一起以形成环状环烷基或环状(杂)芳烃取代基，其中r
16
独立地选自氢、卤素、c
1-c
24
烷基、c
6-c
24
(杂)芳基、c
7-c
24
烷基(杂)芳基和c
7-c
24
(杂)芳基烷基；-r
18
独立地选自氢、卤素、c
1-c
24
烷基、c
6-c
24
(杂)芳基、c
7-c
24
烷基(杂)芳基和c
7-c
24
(杂)芳基烷基；-r
19
选自氢、卤素、c
1-c
24
烷基、c
6-c
24
(杂)芳基、c
7-c
24
烷基(杂)芳基和c
7-c
24
(杂)芳
基烷基，所述烷基任选地被选自o、n和s的多个杂原子之一间隔，其中烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基独立地任选地被取代；和-l为0到10范围内的整数。-在根据结构(q37)的反应基团的优选实施方案中，r
15
独立地选自氢、卤素、-or
16
、c
1-c6烷基、c
5-c6(杂)芳基，其中r
16
为氢或c
1-c6烷基，更优选r
15
独立地选自氢和c
1-c6烷基，最优选所有r
15
为h。在根据结构(q37)的反应基团的优选实施方案中，r
18
独立地选自氢、c
1-c6烷基，最优选两个r
18
均为h。在根据结构(q37)的反应基团的优选实施方案中，r
19
为h。在根据结构(q37)的反应基团的优选实施方案中，l为0或1，更优选l为1。在根据结构(q37)的反应基团的特别优选的实施方案中，反应基团为根据结构(q20)。化合物在另一方面，本发明涉及结构(2)的化合物：其中：-a、b和c各自单独地为0或1；-l1、l2和l3是接头；-d是有效载荷；-bm是分支部分；-q包含(杂)环辛炔部分。上文进一步定义部分a、b、c、l1、l2、l3、d、bm和q，其同样适用于本方面，包括上文定义的优选实施方案。在一个优选的实施方案中，d是上文进一步定义的细胞毒素。优选的结构(2)的化合物是对称的，即a/b、l1/l2和q的每次出现都是相同的。优选地，a＝b＝1，另外更优选地c＝1。在本方面的上下文中，q包含(杂)环辛炔部分，其任选地被取代并且可为杂环辛炔基或环辛炔基，优选环辛炔基。在进一步优选的实施方案中，(杂)环辛炔基是根据结构(q36)。(杂)环辛炔基的优选实例包括结构(q16)，也称为dibo基团；(q17)，也称为dibac基团；或(q18)，也称为barac基团；(q19))，也称为combo基团；和(q20)，也称为bcn基团，其中x5是o或nr
27
，并且r
27
的优选实施方案如上所定义。(q16)中的芳环任选在一个或多个位置被o-磺酰化，优选在两个位置，最优选根据(q37)，而(q17)和(q18)的环可在一个或多个位置被卤化。特别优选的环辛炔基是双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基]基团(bcn基团)，其任选地被取代。优选地，双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基]基团按照如下所示的结构(q20)。在一个实施方案中，q是双环壬炔(bcn)、氮杂二苯并环辛炔(dibac/dbco)、二苯并环辛炔(dibo)或磺酰化二苯并环辛炔(s-dibo)，更优选bcn或dibac/dbco，最优选bcn。根据该方面的化合物理想地适合作为制备根据本发明的抗体-有效载荷缀合物的中间体。应用
根据本发明的缀合物特别适用于治疗癌症。因此，本发明进一步涉及根据本发明的缀合物在医药中的用途。在另一方面，本发明还涉及治疗有需要的受试者的方法，其包括向受试者给药根据本发明的缀合物。根据该方面的方法还可表述为用于治疗的根据本发明的缀合物。根据该方面的方法还可表述为根据本发明的缀合物用于制备药物的用途。在本文中，给药通常与治疗有效量的根据本发明缀合物一起发生。本发明还涉及一种在有需要的受试者中治疗特定疾病的方法，包括给药如上定义的根据本发明的缀合物。所述特定疾病可选自癌症、病毒感染、细菌感染、神经系统疾病、自身免疫性疾病、眼病、高胆固醇血症和淀粉样变，更优选癌症和病毒感染，最优选所述疾病是癌症。有需要的受试者通常是癌症患者。根据本发明的缀合物在此类治疗中的用途是众所周知的，特别是在癌症治疗领域中，并且根据本发明的缀合物特别适用于这方面。在根据该方面的方法中，缀合物通常以治疗有效量给药。本发明的本方面还可表述为用于治疗有需要的受试者的特定疾病，优选用于治疗癌症的根据本发明的缀合物。换言之，该方面涉及根据本发明的缀合物用于制备药物或药物组合物的用途，所述药物或药物组合物用于在有需要的受试者中治疗特定疾病，优选用于治疗癌症。优选地，根据本发明的缀合物是fc沉默的，即当临床上使用时不显著结合fcγ受体cd16。这是当g不存在时的情况，即e＝0。优选地，对cd32和cd64的结合也显著降低。本发明上下文中的给药是指全身给药。因此，在一个实施方案中，本文定义的方法用于缀合物的全身给药。鉴于缀合物的特异性，它们可以全身给药，但在目标组织(例如肿瘤)中或附近发挥它们的活性。全身给药与局部给药相比具有很大的优势，因为该药物也可到达成像技术无法检测到的肿瘤转移，并且它可适用于血液肿瘤。本发明进一步涉及包含根据本发明的抗体-有效载荷缀合物和药学上可接受的载体的药物组合物。
实施例
通过以下实施例说明本发明。通用方法化学品购自常用供应商(sigma-aldrich、acros、alfa aesar、fluorochem、apollo scientific ltd和tci)，且其无需进一步纯化即可使用。用于化学转化、后处理和色谱法的溶剂(包括干溶剂)以hplc级购自aldrich(dorset，uk)，且其无需进一步蒸馏即可使用。硅胶60f254分析薄层色谱(tlc)板购自merck(darmstadt,germany)，在紫外光下用高锰酸钾染色剂或茴香醛染色剂进行可视化。使用acros硅胶(0.06-0.200,60a)或预装柱(silicycle)结合buchi sepacore c660级分收集器(flawil,switzerland)进行色谱纯化。使用配备waters xbridge c18色谱柱(5μm obd，30x100mm，pn186002982)的agilent 1200系统进行反相hplc纯化。用于nmr光谱法的氘代溶剂购自cambridge isotope laboratories。h-val-ala-pabc-mmaf.tfa获自levena biopharm，双-mal-lys-peg
4-tfp酯(177)获自quanta biodesign，o-(2-氨基乙基)-o'-(2-叠氮乙基)二甘醇(xl07)和化合物344和179获自broadpharm，2,3-双(溴甲基)-6-喹喔啉羧酸(178)获自chemscene，以及32-叠氮基-5-氧代-3,9,12,15,18,21,24,27,30-九氧杂-6-氮杂三十二烷酸(azadotriacontanoic)(348)获自carbosynth。
用于单克隆抗体和adc的质谱分析的一般方法在质谱分析之前，用ides(fabricator
tm
)处理igg以分析fc/2片段。将20μg(修饰的)igg溶液在37℃下与在磷酸盐缓冲盐水(pbs)ph 6.6中的0.5μl ides(50u/μl)以10μl的总体积孵育1小时。将样品稀释至40μl，然后在jeol accutof上进行电喷雾电离飞行时间(esi-tof)分析。使用magtran软件获得解卷积光谱(deconvoluted spectra)。分析型rp-hplc的一般方法在rp-hplc分析之前，将igg用ides处理，其允许分析fc/2片段。将(修饰的)igg(100μl，1mg/ml于pbs ph 7.4中)溶液与1.5μl在磷酸盐缓冲盐水(pbs)ph 6.6中的ides/fabricator
tm
(50u/μl)在37℃下孵育1小时。通过加入49％乙腈、49％水、2％甲酸(100μl)淬灭反应。rp-hplc分析在agilent 1100系列(hewlett packard)上进行。将样品(10μl)以0.5ml/min进样到柱温为70℃的zorbax poroshell300sb-c8柱(1x75 mm，5μm，agilent)上。在25分钟内应用线性梯度，从30至54％乙腈和水于0.1％tfa中。分析型hplc-sec的一般方法在agilent 1100系列(hewlett packard)上进行hplc-sec分析。将样品(4μl，1mg/ml)以0.86ml/min进样到xbridge beh200a(3.5μm,7.8x300 mm,pn186007640 waters)柱上。使用0.1m磷酸钠缓冲液ph 6.9(nah2po4/na2hpo4)进行等度洗脱16分钟。实施例1化合物102的合成向4-硝基苯氯甲酸酯(30.5g，151mmol)在dcm(500ml)中的冷却(0℃)溶液中加入吡啶(24.2ml，23.7g，299mmol)。将bcn-oh(101，18.0g，120mmol)在dcm(200ml)中的溶液逐滴加入到反应混合物中。加入完成后，加入饱和nh4cl水溶液(500ml)和水(200ml)。分离后，将水相用dcm(2
×
500ml)萃取。将合并的有机相干燥(na2so4)并浓缩。将粗物质通过硅胶色谱法纯化，并得到期望产物102，为灰白色固体(18.7g，59mmol，39％)。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)8.32
–
8.23(m,2h),7.45
–
7.34(m,2h),4.40(d,j＝8.3hz,2h),2.40
–
2.18(m,6h),1.69
–
1.54(m,2h),1.51(五重峰,j＝9.0hz,1h),1.12
–
1.00(m,2h)实施例2化合物104的合成向叠氮基-peg
11-胺(103)(182mg，0.319mmol)在thf(3ml)中的冷却溶液(-5℃)中加入10％nahco3水溶液(1.5ml)和溶解于thf(2ml)中的9-芴甲氧羰酰氯(99mg，0.34mmol)。2h后，加入etoac(20ml)并将混合物用盐水(2
×
6ml)洗涤，经mgso4干燥并浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化(0
→
11％meoh于dcm中)，得到104，为澄清油状物，收率为98％(251mg，
0.316mmol)。c
39h60
n4o
13
(m na

)的lcms(esi )计算值815.42，实测值815.53。实施例3化合物105的合成制备104(48mg，0.060mmol)在thf(3ml)和水(0.2ml)中的溶液并冷却至0℃。加入三甲基膦(1m于甲苯中，0.24ml，0.24mmol)，将混合物保持搅拌23小时。通过用dcm(6ml)萃取除去水。向该溶液中加入(1r,8s,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基(4-硝基苯)碳酸酯(102)(25mg，0.079mmol)和三乙胺(10μl，0.070mmol)。27h后，浓缩混合物，并将残余物溶解于dmf(3ml)中，然后加入哌啶(400μl)。1h后，将混合物浓缩并将残余物通过硅胶柱色谱法(0
→
21％meoh于dcm中)纯化，得到105，为无色油状物(8.3mg，0.0092mmol)。c
46
h-76
n2o
15
(m nh
4
)的lcms(esi )计算值914.52，实测值914.73。实施例4.化合物107的合成将(1r,8s,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基(4-硝基苯)碳酸酯(102)(4.1mg，0.013mmol)在干燥dcm(500μl)中的溶液缓慢加入到氨基-peg
23-胺(106)(12.3mg，0.0114mmol)在干燥dcm(500μl)中的溶液中。20h后，将混合物浓缩并将残余物通过硅胶柱色谱法(0
→
25％meoh于dcm中)纯化，得到期望化合物107，收率为73％(12mg，0.0080mmol)。c
70h124
n2o
27
(m nh
4
)的lcms(esi )计算值1443.73，实测值1444.08。实施例5.化合物108的合成向bcn-oh(101，21.0g，0.14mol)在mecn(450ml)中的溶液中加入二琥珀酰亚胺基碳酸酯(53.8g，0.21mol)和三乙胺(58.5ml，0.42mol)。将混合物搅拌140分钟后，将其真空浓缩并将残余物与mecn(400ml)共蒸发一次。将残余物溶解于etoac(600ml)中并用h2o(3
×
200ml)洗涤。将有机层经na2so4干燥并真空浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(0
→
4％etoac于dcm中)纯化并产生呈白色固体的108(11.2g，38.4mmol，27％收率)。1h nmr(400mhz,cdcl3):δ(ppm)4.45(d,2h,j＝8.4hz),2.85(s,4h),2.38
–
2.18(m,6h),1.65
–
1.44(m,3h),1.12
–
1.00(m,2h).实施例6.化合物110的合成向(1r,8s,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基n-琥珀酰亚胺基碳酸酯(108)(500mg，1.71mmol)在dcm(15ml)中的溶液中加入三乙胺(718ul，5.14mmol)和n-芴甲氧羰基(mono-fmoc)乙二胺盐酸盐(109)(657mg，2.06mmol)。将混合物搅拌45min，用etoac(150ml)稀释并用50％饱和nh4cl水溶液(50ml)洗涤。将水层用etoac(50ml)萃取，并将合并的有机
层用h2o(10ml)洗涤。将合并的有机萃取物在真空中浓缩并将一半残余物通过硅胶柱色谱法(0
→
3％meoh于dcm中)进行纯化，以42％收率产生期望的化合物110(332mg，0.72mmol)。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)7.77(d,j＝7.5hz,2h),7.59(d,j＝7.4hz,2h),7.44
–
7.37(m,2h),7.36
–
7.28(m,2h),5.12(br s,1h),4.97(br s,1h),44.41(d,j＝6.8hz,2h),4.21(t,j＝6.7hz,1h),4.13(d,j＝8.0hz,2h),3.33(br s,4h),2.36
–
2.09(m,6h),1.67
–
1.45(m,2h),1.33(五重峰,j＝8.6hz,1h),1.01
–
0.85(m,2h).c
28h31
n2o
4
(m h

)的lcms(esi )计算值459.23，实测值459.52。实施例7.化合物111的合成将化合物110(327mg，0.713mmol)溶解于dmf(6ml)中并加入哌啶(0.5ml)。2h后，将混合物浓缩并将残余物通过硅胶柱色谱法(0
→
32％0.7n nh3 meoh于dcm中)纯化，得到呈黄色油状物的期望化合物111(128mg，0.542mmol，76％)。1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm,rotamers)5.2(bs,1h),4.15(d,j＝8.0hz,2h),3.48
–
3.40(m,2/3h),3.33
–
3.27(m,2/3h),3.27
–
3.19(m,1 1/3h),2.85
–
2.80(m,1 1/3h),2.36
–
2.17(m,6h),1.67
–
1.50(m,2h),1.36(五重峰,j＝8.5hz,1h),1.01
–
0.89(m,2h).实施例8.化合物114的合成向二乙醇胺(112)(208mg，1.98mmol)在水(20ml)中的溶液中加入mecn(20ml)、nahco3(250mg，2.97mmol)和fmoc-osu(113)(601mg，1.78mmol)在mecn(20ml)中的溶液。将混合物搅拌2h并加入dcm(50ml)。分离后，将有机相用水(20ml)洗涤，干燥(na2so4)并浓缩。得到期望产物114，为无色粘稠油状物(573mg，1.75mmol，98％)。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)7.79
–
7.74(m,2h),7.60
–
7.54(m,2h),7.44
–
7.37(m,2h),7.36
–
7.30(m,2h),4.58(d,j＝5.4hz,2h),4.23(t,j＝5.3hz,1h),3.82
–
3.72(m,2h),3.48
–
3.33(m,4h),3.25
–
3.11(m,2h).实施例9.化合物116的合成向114(567mg，1.73mmol)在dcm(50ml)中的溶液中加入4-硝基苯氯甲酸酯(115)(768mg，3.81mmol)和et3n(1.2ml，875mg)。将混合物搅拌18小时并浓缩。将残余物通过硅胶色谱法(0％
→
10％meoh于dcm中，然后20％
→
70％etoac于庚烷中)纯化，得到32mg(49μmol，2.8％)期望产物116。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)8.31
–
8.20(m,4h),7.80
–
7.74(m,2h),7.59
–
7.54(m,2h),7.44
–
7.37(m,2h),7.37
–
7.29(m,6h),4.61(d,j＝5.4hz,2h),4.39(t,j＝5.1hz,2h),4.25(t,j＝5.5hz,1h),4.02(t,j＝5.0hz,2h),3.67(t,j＝4.8hz,2h),3.45(t,j＝5.2hz,2h).实施例10.化合物117的合成向116(34mg，0.050mmol)在dcm(2ml)中的溶液中加入111(49mg，0.21mmol)和三乙
胺(20μl，0.14mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜。23h后，浓缩混合物。通过硅胶柱色谱法纯化(0
→
40％meoh于dcm中)，得到117，为白色固体，收率为61％(27mg，0.031mmol)。c
47h57
n5o
10
(m h

)的lcms(esi )计算值851.41，实测值852.49。实施例11.化合物118的合成在117的制备期间获得化合物118(3.8mg，0.0060mmol)。c
32
h-47
n5o
8
(m h

)的lcms(esi )计算值629.34，实测值630.54。实施例12.化合物121的合成将二亚乙基三胺(119)(73μl，0.67mmol)和三乙胺(283μl，2.03mmol)在thf(6ml)中的溶液冷却至-5℃并置于氮气氛下。将2-(boc-肟基)-2-苯乙腈(120)(334mg，1.35mmol)溶解在thf(4ml)中并缓慢加入到冷却的溶液中。2.5h后，除去冰浴，并将混合物在室温下再搅拌2.5小时，并真空浓缩。将残余物再溶解于dcm(15ml)中并用5％氢氧化钠水溶液(2
×
5ml)、盐水(2
×
5ml)洗涤并经mgso4干燥。通过硅胶柱色谱法纯化(0
→
14％meoh于dcm中)，得到121，为无色油状物，91％收率(185mg，0.610mmol)。1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)5.08(s,2h),3.30
–
3.12(m,4h),2.74(t,j＝5.9hz,4h),1.45(s,18h).实施例13.化合物123的合成向121(33.5mg，0.110mmol)在thf(2ml)中的冷却溶液(-10℃)中加入10％nahco3水溶液(500μl)和溶解于thf(1ml)中的9-芴甲氧基碳酰氯(122)(34mg，0.13mmol)。1h后，将混合物浓缩并将残余物再溶解于etoac(10ml)中，用盐水(2
×
5ml)洗涤，经na2so4干燥并浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化(0
→
50％meoh于dcm中)，得到123，86％收率(50mg，0.090mmol)。1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)7.77(d,j＝7.4hz,2h),7.57(d,j＝7.4hz,2h),7.43
–
7.38(m,2h),7.36
–
7.31(m,2h),5.57(d,j＝5.2hz,2h),4.23(t,j＝5.1hz,1h),3.40
–
2.83(m,8h),1.41(s,18h).实施例14.化合物124的合成向123(50mg，0.095mmol)的dcm(3ml)溶液中加入4m hcl的二噁烷溶液(200μl)。将混合物搅拌19小时，浓缩，并得到白色固体(35mg)。不经纯化，将去保护的中间体和(1r,8s,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基(4-硝基苯)碳酸酯(102)(70mg，0.22mmol)溶解于dmf(3ml)中并加入三乙胺(34μl，0.24mmol)。2h后，将混合物浓缩并将残余物通过硅胶柱色谱法(0
→
25％meoh于dcm中)纯化，得到124，48％收率(31mg，0.045mmol)。c
41h47
n3o
6
(m h

)的lcms(esi- )计算值677.35，实测值678.57。实施例15.化合物125的合成
hplc(c18，30％
→
90％mecn(1％acoh)于水(1％acoh)中)纯化。获得期望的产物131，为无色膜状物(1.5mg，0.78μmol，21％)。c
96h148n15o25
(m h

)的lcms(esi )计算值1911.08，实测值1912.08。实施例18.化合物132的合成向121(168mg，0.554mmol)在dcm(2ml)中的溶液中加入128(240mg，0.89mmol)在dcm(1ml)中的溶液、dcm(1ml)和et3n(169mg，233μl)。将混合物搅拌17h，浓缩并通过硅胶色谱法(etoac于庚烷中的梯度)纯化。得到期望产物132，为浅黄色油状物(85mg，0.20mmol，35％)。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)5.24
–
5.02(m,2h),4.36
–
4.20(m,3h),3.84
–
3.67(m,4h),3.65
–
3.58(m,2h),3.47
–
3.34(m,4h),3.34
–
3.18(m,4h),1.44(bs,18h).实施例19.化合物134的合成向132(81mg，0.19mmol)的dcm(3ml)溶液中加入4n hcl的二噁烷溶液(700μl)。将混合物搅拌19小时，浓缩并将残余物溶解于dmf(0.5ml)中。加入et3n(132μl，96mg，0.95mmol)、dmf(0.5ml)和(1r,8s,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基(4-硝基苯)碳酸酯(102)(132mg，0.42mmol)，并将得到的混合物搅拌2h。浓缩混合物并将残余物通过硅胶色谱法(0％
→
3％meoh于dcm中)纯化。得到期望产物134，为无色膜状物(64mg，0.11mmol，57％)。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)4.31
–
4.23(m,2h),4.22
–
4.08(m,4h),3.80
–
3.68(m,4h),3.66
–
3.58(m,2h),3.50
–
3.28(m,8h),2.80
–
2.65(m,1h),2.40
–
2.10(m,12h),1.68
–
1.48(m,4h),1.35(五重峰,j＝8.1hz,1h),1.02
–
0.87(m,2h).c
31h46
n3o
8
(m h

)的lcms(esi )计算值588.33，实测值588.43。实施例20.化合物137的合成
nmr(400mhz,cdcl3):δ(ppm)5.01(br s,1h),4.17(d,2h,j＝12.0hz),3.79
–
3.68(m,2h),3.64
–
3.50(m,4h),3.47
–
3.30(m,2h),2.36
–
2.14(m,6h),1.93(br s,1h),1.68
–
1.49(m,2h),1.37(五重峰,1h,j＝8.0hz),1.01
–
0.89(m,2h).实施例23.化合物142的合成向141(663mg，2.36mmol)在dcm(15ml)中的溶液中加入三乙胺(986ul，7.07mmol)和4-硝基苯氯甲酸酯(115)(712mg，3.53mmol)。将混合物搅拌4小时并真空浓缩。通过硅胶柱色谱法(0
→
20％etoac于庚烷中)纯化，得到142(400mg，0.9mmol，38％收率)，为淡黄色油状物。1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)8.29(d,j＝9.4hz,2h),7.40(d,j＝9.3hz,2h),5.05(br s,1h),4.48
–
4.41(m,2h),4.16(d,j＝8.0hz,2h),3.81
–
3.75(m,2h),3.61(t,j＝5.0hz,2h),3.42(q,j＝5.4hz,2h),2.35
–
2.16(m,6h),1.66
–
1.50(m,2h),1.35(五重峰,j＝8.6hz,1h),1.02
–
0.88(m,2h).c
22h26
n2nao
8
(m na

)的lcms(esi )计算值469.16，实测值469.36。实施例24.化合物143的合成将142(2.7mg，6.0μmol)在dmf(48μl)中的溶液和et3n(2.1μl，1.5mg，15μmol)加入到125(2.3mg，5.0μmol)在dmf(0.32ml)中的溶液中。将混合物静置4天，用dmf(100μl)稀释并通过rp hplc(c18，30％
→
100％mecn(1％acoh)于水(1％acoh)中)纯化。获得产物143，为无色膜状物(2.8mg，3.7μmol，74％)。c
42h59
n4o
9
(m h

)的lcms(esi )计算值763.43，实测值763.53。实施例25.化合物145的合成向128(200mg，0.45mmol)在dcm(1ml)中的溶液中加入三乙胺(41.6ul，0.30mmol)和三(2-氨基乙基)胺144(14.9ul，0.10mmol)。将混合物搅拌150分钟后，将其真空浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化残余物(25％
→
100％etoac于dcm中，然后0％
→
10％meoh于dcm中)，得到145，43％收率(45.4mg，42.5umol)，为黄色油状物。1h nmr(400mhz,cdcl3):δ(ppm)5.68
–
5.18(m,6h),4.32
–
4.18(m,6h),4.18
–
4.11(d,j＝7.9hz,6h),3.74
–
3.61(m,6h),3.61
–
3.51
(m,6h),3.43
–
3.29(m,6h),3.29
–
3.15(m,6h),2.65
–
2.47(m,6h),2.37
–
2.16(m,18h),1.69
–
1.49(m,6h),1.35(五重峰,j＝8.9hz,3h),1.03
–
0.87(m,6h).实施例26.化合物148的合成向bcn-oh(101)(3.0g，20mmol)在dcm(300ml)中的溶液中加入csi(146)(1.74ml，2.83g，20mmol)。将混合物搅拌15分钟后，加入et3n(5.6ml，4.0g，40mmol)。将混合物搅拌5min并加入2-(2-氨基乙氧基)乙醇(147)(2.2ml，2.3g，22mmol)。将所得混合物搅拌15分钟并加入饱和nh4cl水溶液(300ml)。分离各层，并用dcm(200ml)萃取水相。将合并的有机层干燥(na2so4)并浓缩。将残余物通过硅胶色谱法(0％至10％meoh于dcm中)纯化。浓缩含有期望产物的级分。将残余物溶解在etoac(100ml)中并浓缩。得到期望产物148，为浅黄色油状物(4.24g，11.8mmol，59％)。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)5.99
–
5.79(bs,1h),4.29(d,j＝8.3hz,2h),3.78
–
3.74(m,2h),3.66
–
3.56(m,4h),3.37
–
3.30(m,2h),2.36
–
2.16(m,6h),1.63
–
1.49(m,2h),1.40(五重峰,j＝8.7hz,1h),1.05
–
0.94(m,2h).实施例27.化合物149的合成向148(3.62g，10.0mmol)在dcm(200ml)中的溶液中加入4-硝基苯氯甲酸酯(15)(2.02g，10.0mmol)和et3n(4.2ml，3.04g，30.0mmol)。将混合物搅拌1.5小时并浓缩。将残余物通过硅胶色谱法(20％
→
70％etoac(1％acoh)于庚烷(1％acoh)中)纯化。获得产物149，为白色泡沫(4.07g，7.74mmol，74％)。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)8.32
–
8.26(m,2h),7.45
–
7.40(m,2h),5.62
–
5.52(m,1h),4.48
–
4.42(m,2h),4.28(d,j＝8.2hz,2h),3.81
–
3.76(m,2h),3.70
–
3.65(m,2h),3.38
–
3.30(m,2h),2.35
–
2.16(m,6h),1.62
–
1.46(m,2h),1.38(五重峰,j＝8.7hz,1h),1.04
–
0.93(m,2h).实施例28.化合物150的合成
向149(200mg，0.38mmol)在dcm(1ml)中的溶液中加入三乙胺(35.4ul，0.24mmol)和三(2-氨基乙基)胺(144)(12.6ul，84.6umol)。将混合物搅拌120分钟并真空浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(25％
→
100％etoac于dcm中，然后0％
→
10％meoh于dcm中)纯化并产生150，36％收率(40.0mg，30.6umol)，为白色泡沫。1hnmr(400mhz,cdcl3):δ(ppm)6.34
–
5.72(m,6h),4.34
–
4.18(m,12h),3.76
–
3.58(m,12h),3.43
–
3.30(m,6h),3.30
–
3.18(m,6h),2.64
–
2.49(m,6h),2.38
–
2.14(m,18h),1.65
–
1.47(m,6h),1.39(五重峰,j＝9.1hz,3h),1.06
–
0.90(m,6h).实施例29.化合物153的合成向fmoc-gly-gly-gly-oh(151)(31.2mg，75.8μmol)在无水dmf(1ml)中的混合物中加入n,n-二异丙基乙胺(40μl，29mg，0.23mmol)和hatu(30.3mg，79.6μmol)。10分钟后，加入四嗪-peg3-乙胺(152)(30.3mg，75.8μmol)并将混合物涡旋。2小时后，将混合物通过rp hplc(c18，30％
→
90％mecn(1％acoh)于水(1％acoh)中)纯化。得到期望产物，为粉红色膜状物(24.1mg，31.8μmol，42％)。c
38h45
n8o
9
(m h

)的lcms(esi )计算值757.33，实测值757.46。实施例30.化合物154的合成向153(24.1mg，31.8μmol)在dmf(500μl)中的溶液中加入二乙胺(20μl，14mg，191μmol)。将混合物静置2小时并通过rp hplc(c18，5％
→
90％mecn(1％acoh)于水(1％acoh)中)纯化。得到期望产物154，为粉红色膜状物(17.5mg，32.7μmol，定量)。c
23h35
n8o
7
(m h

)的lcms(esi )计算值535.26，实测值535.37。实施例31.化合物156的合成将n-[(1r,8s,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲氧基羰基]-1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷(155)(68mg，0.21mmol)在干燥dmf(2ml)中的溶液转移至fmoc-gly-gly-gly-oh(151)(86mg，0.21mmol)在干燥dmf(2ml)中的溶液。加入dipea(100μl，0.630mmol)和hatu(79mg，0.21mmol)。1.5h后，将混合物浓缩并将残余物通过硅胶柱色谱法(0
→
11％meoh于dcm中)纯化，得到期望化合物156,34％收率(52mg，0.072mmol)。c
35h47
n5o
9
(m h )的lcms(esi )计算值717.34，实测值718.39。实施例32.化合物157的合成将化合物156(21mg，0.029mmol)溶解于dmf(2.4ml)中并加入哌啶(600μl)。20分钟后，浓缩混合物并通过制备型hplc纯化残余物，得到呈白色固体状的期望化合物157(9.3mg，0.018mmol，64％)。c
23h37
n5o
7
(m h

)的lcms(esi )计算值495.27，实测值496.56。
实施例33.化合物159的合成向氨基-peg
11-胺(158)(143mg，0.260mmol)在dcm(5ml)中的溶液中缓慢加入溶解在dcm(5ml)中的(1r,8s,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基(4-硝基苯)碳酸酯(102)(41mg，0.13mmol)。1.5h后，将混合物浓缩并将残余物通过硅胶柱色谱法(0
→
20％0.7n nh
3 meoh于dcm中)纯化，得到呈澄清油状物的期望化合物159(62mg，0.086mmol，66％)。c
35h46
n2o
13
(m h

)的lcms(esi )计算值720.44，实测值721.56。实施例34.化合物160的合成将159(62mg，0.086mmol)在干燥dmf(2ml)中的溶液转移到fmoc-gly-gly-gly-oh(151)(36mg，0.086mmol)在干燥dmf(2ml)中的溶液中。加入dipea(43μl，0.25mmol)和hatu(33mg，0.086mmol)。18h后，将混合物浓缩并将残余物通过硅胶柱色谱法(0
→
20％meoh于dcm中)纯化，得到期望化合物160，62％收率(60mg，0.054mmol)。c
56h83
n5o
18
(m h

)的lcms(esi )计算值1113.57，实测值1114.93。实施例35.化合物161的合成将化合物160(36mg，0.032mmol)溶解于dmf(2ml)中并加入哌啶(200μl)。2h后，将混合物浓缩并将残余物通过硅胶柱色谱法(0
→
40％0.7n nh
3 meoh于dcm中)纯化，得到呈黄色油状物的期望化合物161(16.7mg，0.0187mmol，58％)。c
41h73
n5o
16
(m h

)的lcms(esi )计算值891.51，实测值892.82。实施例36.化合物162的合成向氨基-peg
23-胺(106)(60mg，0.056mmol)在dcm(3ml)中的溶液中缓慢加入溶解在dcm(5ml)中的(1r,8s,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基(4-硝基苯)碳酸酯(102)(12mg，0.037mmol)。4h后，将混合物浓缩并再溶解于dmf(2ml)中，然后加入fmoc-gly-gly-gly-oh(51)(23mg，0.056mmol)、hatu(21mg，0.056mmol)和dipea(27μl，0.16mmol)。20h后，将混合物浓缩并将残余物通过硅胶柱色谱法(0
→
27％meoh于dcm中)纯化，得到93％的期望化合物162(57mg，0.043mmol)。c
80h131
n5o
30
(m nh
4
)的lcms(esi )计算值1641.89，实测值1659.92。实施例37.化合物163的合成将化合物162(57mg，0.034mmol)溶解于dmf(1ml)中并加入哌啶(120μl)。2小时后，将混合物浓缩，再溶解于水中，用乙醚(3
×
10ml)萃取除去fmoc-哌啶副产物。冷冻干燥后，得到163，为黄色油状物(46.1mg，0.032mmol，95％)。c
65h121
n5o
28
(m h

)的lcms(esi )计算值1419.82，实测值1420.91。
实施例38.化合物165的合成向(1r,8s,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基(4-硝基苯)碳酸酯(102)(204mg，0.650mmol)的溶液中加入氨基-peg12-醇(164)(496mg，0.908mmol)和三乙胺(350μl，2.27mmol)。19h后，将混合物浓缩并将残余物通过硅胶柱色谱法(2
→
20％meoh于dcm中)纯化，得到165，为澄清黄色油状物(410mg，0.560mmol，87％)。c
35h63
no
14
(m na

)的lcms(esi )计算值721.42，实测值744.43。实施例39.化合物166的合成向165(410mg，0.560mmol)在dcm(6ml)中的溶液中加入4-硝基苯氯甲酸酯(171μl，0.848mmol)和三乙胺(260μl，1.89mmol)。18h后，将混合物浓缩并将残余物通过硅胶柱色谱法(0
→
7％meoh于dcm中)纯化，得到期望化合物166，为澄清油状物(350mg，0.394mmol，70％)。c
42h66
n2o
18
(m na

)的lcms(esi )计算值886.43，实测值909.61。实施例40.化合物168的合成向166(15mg，0.017mmol)在dmf(2ml)中的溶液中加入肽h-lpetgg-oh(167)(9.7mg，0.017mmol)和三乙胺(7μl，0.05mmol)。46小时后，将混合物浓缩并将残余物通过制备型hplc纯化，以63％得到期望化合物168(14mg，0.010mmol)。c
60h101
n7o
25
(m h

)的lcms(esi )计算值1319.68，实测值1320.92。实施例41.xl01的合成向155(9.7mg，0.03mmol)在无水dmf(170μl)中的溶液中加入177(双马来酰亚胺-赖氨酸-peg
4-tfp，broadpharm)(20mg，0.024mmol)和et3n(9.9μl，0.071mmol)。在室温下搅
拌42h后，将混合物用dcm(0.4ml)稀释，并通过硅胶快速柱色谱法(0％
→
18％meoh于dcm中)纯化，得到xl01，为澄清油状物(10.2mg，0.010mmol，43％)。c
49h72
n7o
16
(m h

)的lcms(esi )计算值1003.12，实测值1003.62。实施例42.双马来酰亚胺叠氮化物xl02的合成向含有177(32.9mg，39.0μmol，1.0当量)于干燥dmf(400μl)中的小瓶中加入xl07(9.2mg，42.1μmol，1.08当量)并将溶液混合并在室温下放置约50分钟。接着，加入dipea，将所得溶液混合并在室温下放置约2小时。然后将反应混合物直接通过硅胶色谱法(dcm
→
14％meoh于dcm中)纯化。获得期望的产物xl02，为无色油状物(28.9mg，32.2μmol，83％收率)。c
39h62
n9o
15
(m h

)的lcms(esi )计算值896.97，实测值896.52。实施例43.xl03的合成向含有2,3-双(溴甲基)-6-喹喔啉羧酸178(51.4mg，142.8μmol，1.00当量)于干燥dcm(7.5ml)中的小瓶中加入dic(9.0mg，71.4μmol，0.5当量)。将所得混合物在室温下放置30分钟，随后加入xl07(17.7mg，78.5μmol，0.55当量)于干燥dcm(0.5ml)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌约35分钟，然后直接通过硅胶色谱法(dcm
→
10％meoh于dcm中)纯化，得到不纯的产物(72mg)，为白色固体。将不纯的产物溶解于1.0ml dmf中并将该溶液的50％与甲苯共蒸发(2
×
)。通过硅胶色谱法(12
→
30％丙酮于甲苯中)纯化残余物。得到期望产物xl03，为无色油状物(20.1mg，35.9μmol)。c
19h25
br2n6o
4
(m h

)的lcms(esi )计算值561.03，实测值561.12实施例44.xl05的合成向178(30mg，0.09mmol)于dcm(0.3ml)中的溶液中加入3-马来酰亚胺基丙酸nhs酯(27mg，0.10mmol)和et3n(38μl，0.27mmol)。在室温下搅拌28h后，将粗混合物真空浓缩并通过硅胶快速柱色谱法(0％
→
15％meoh于dcm中)纯化，得到xl05，为澄清油状物(27mg，0.056mmol，62％)。c
24h34
n3o
7
(m h

)的lcms(esi )计算值476.54，实测值476.46。实施例45.xl06的合成向根据verkade等人，antibodies 2018,7,doi:10.3390/antib7010012(通过引用的方式并入)制备的含有24(17.2mg，通过
1-h-qnmr为88重量％，18.4μmol，1.00当量)的小瓶中加入179于干燥dmf(60μl)中的溶液。向所得无色溶液中加入三乙胺(40.6μl，15.8当量，291μmol)，立即产生黄色溶液。将反应混合物在室温下放置约28小时，然后真空浓缩直到大部分et3n已经蒸发。然后将残余物用dcm(1ml)稀释并直接通过硅胶色谱法纯化(第1柱：dcm
→
20％meoh于dcm中，第2柱：dcm
→
20％meoh于dcm中)。获得期望的产物(xl06)，为无色油状物(4.3mg，18.4μmol，26％收率)。c
34h62
n7o
19s
(m h

)的lcms(esi )计算值904.38，实测值904.52。实施例46.182的合成向180(甲基四嗪-nhs酯，19mg，0.058mmol)在dcm(0.8ml)中的溶液中加入181(33.6mg，0.061mmol)和et3n(24μl，0.17mmol)。在室温下搅拌2.5h后，将混合物真空浓缩并通过硅胶快速柱色谱法(0
→
15％meoh于dcm中)纯化，得到期望化合物182，93％收率(41mg，0.054mmol)。c
35h60
n5o
13
(m h

)的lcms(esi )计算值758.88，实测值758.64。实施例47.183的合成向182(41mg，0.054mmol)在dcm(3ml)中的溶液中加入4-硝基苯氯甲酸酯(16mg，0.081mmol)和et3n(23μl，0.16mmol)。在室温下搅拌21h后，将混合物真空浓缩并通过硅胶快速柱色谱法(梯度：a.0％
→
20％etoac于dcm中(直到洗脱对硝基苯酚)，随后梯度b.0％
→
13％meoh于dcm中)纯化，得到期望化合物183，76％收率(37.9mg，0.041mmol)。c
42h63
n6o
17
(m h

)的lcms(esi )计算值923.98，实测值923.61。实施例48.xl10的合成向184(5.6mg，0.023mmol)在无水dmf(0.1ml)中的溶液中加入溶解于无水dmf(0.3ml)中的183(14.3mg，0.015mmol)和et3n(7μl，0.046mmol)，所述184根据macdonald等人，nat.chem.biol.2015,11,326
–
334(通过引用的方式并入)制备。在室温下搅拌2h后，将混合物真空浓缩并通过硅胶快速柱色谱法(0
→
15％meoh于dcm中)纯化，得到期望化合物xl10，50％收率(7.5mg，0.0076mmol)。c
47h73
n8o
15
(m h

)的lcms(esi )计算值990.13，实测值990.66。实施例49.186的合成向八乙二醇185的dcm(10ml)溶液中加入三乙胺(1.0ml，7.24mmol，2.5当量)，然后在28分钟内逐滴加入4-硝基苯氯甲酸酯(0.58g，2.90mmol，1当量)的dcm(5ml)溶液。将混合物搅拌90分钟后，将其真空浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化(75％
→
0％etoac于dcm中，随后0％
→
7％meoh于dcm中)。得到收率为38％的产物186，为无色油状物(584.6mg，
1.09mmol)。c
23h38
no
13
(m h

)的lcms(esi )计算值536.23，实测值536.93。1h-nmr(400mhz,cdcl3):δ(ppm)8.28(d,j＝12.0hz,2h),7.40(d,j＝12.0hz,2h),4.47
–
4.42(m,2h),3.84
–
3.79(m,2h),3.75
–
3.63(m,26h),3.63
–
3.59(m,2h),2.70
–
2.55(bs,1h).实施例50.188的合成向187(bocnh-peg2)2nh，202mg，0.42mmol)在dcm(1ml)中的溶液中加入部分(0.5ml，0.54mmol，1.3当量)制备的186储备液(584mg在dcm(1ml)中)，然后加入三乙胺(176μl，1.26mmol，3当量)和hobt(57mg，0.42mmol，1当量)。将混合物搅拌8天后，将其真空浓缩。将残余物溶解于乙腈(4.2ml)和0.1n naoh
(aq)
(4.2ml，1当量)的混合物和额外量的固体氢氧化钠(91.5mg)中。将混合物再搅拌21.5小时后，将混合物用dcm(3
×
40ml)萃取。将合并的有机层在真空中浓缩并将残余物通过硅胶柱色谱法(0％
→
15％meoh于dcm中)纯化。获得产物188，87％收率，为浅黄色油状物(320.4mg，0.37mmol)。c
39h78
n3o
18
(m h

)的lcms(esi )计算值876.53，实测值876.54。1h-nmr(400mhz,cdcl3):δ(ppm)5.15
–
5.02(bs,2h),4.25
–
4.19(m,2h),3.76
–
3.46(m,50h),3.35
–
3.26(m,4h),2.79
–
2.69(br.s,1h),1.44(s,18h).实施例51-1.189的合成将188(320mg，0.37mmol)溶解于dcm(1ml)中。然后加入4m hcl于二噁烷中(456μl，1.83mmol，5当量)。将混合物搅拌3.5小时后，再加入4m hcl于二噁烷中(450μl，1.80mmol，4.9当量)。将混合物再搅拌3.5小时后，额外加入4m hcl于二噁烷中(450μl，1.80mmol，4.9当量)。将混合物搅拌16.5小时后，将混合物真空浓缩。以定量收率获得产物189，为白色粘性固体。将其直接用于下一步骤。1h-nmr(400mhz,dmso-d6):δ(ppm)8.07
–
7.81(bs,6h),4.15
–
4.06(m,2h),3.75
–
3.66(m,2h),3.65
–
3.48(m,48h),3.03
–
2.92(m,4h).实施例51-2.190的合成向bcn-oh(164mg，1.10mmol，3当量)于dcm(3ml)中的溶液中加入csi(76μl，0.88mmol，2.4当量)。搅拌15分钟后，加入三乙胺(255μl，5.50mmol，5当量)。通过加入dcm(3ml)和三乙胺(508μl，11.0mmol，10当量)制备189的溶液。6分钟后将该储备液加入到最初的反应混合物中。将混合物搅拌21.5小时后，将其真空浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(0％
→
10％meoh于dcm中)纯化。获得产物190，39％收率，为浅黄色油状物(165.0mg，139μmol)。c
43h72
n5o
18s2
(m h

)的lcms(esi )计算值1186.54，实测值1186.65。1h-nmr(400mhz,cdcl3):δ(ppm)6.09
–
5.87(m,2h),4.31
–
4.19(m,6h),3.76
–
3.50(m,50h),3.40
–
3.29(m,4h),2.38
–
2.16(m,12h),1.66
–
1.47(m,4h),1.40(五重峰,j＝8.0hz,2h),1.04
–
0.94(m,4h).实施例52.191的合成
向190(101mg，0.085mmol)在dcm(2.0ml)中的溶液中加入双(4-硝基苯)碳酸酯(39mg，0.127mmol)和et3n(36ul，0.25mmol)。在室温下搅拌42h后，将粗混合物真空浓缩并通过硅胶快速柱色谱法纯化(a.0％
→
25％etoac于dcm中(直到洗脱对硝基苯酚)，随后梯度b.0％
→
12％meoh于dcm中)，得到191，为澄清油状物(49mg，0.036mmol，42％)。c
58h91
n6o
26s2
(m h

)的lcms(esi )计算值1352.50，实测值1352.78。实施例53.xl11的合成向191(7mg，0.0059mmol)在无水dmf(130μl)中的溶液中加入et3n(2.2ul，0.015mmol)和tco-胺盐酸盐(broadpharm)(1.8mg，0.0068mmol)。在室温下搅拌19小时后，通过硅胶快速柱色谱法(0％
→
15％meoh于dcm中)纯化粗混合物，得到xl11，为澄清油状物(1.5mg，0.001mmol，17％)。c
64h111
n8o
25s2
(m nh
4
)的lcms(esi )计算值1456.73，实测值1456.81。实施例54.194的合成向可利用的187(638mg，1.33mmol)在dcm(8.0ml)中的溶液中加入128(470mg，1.73mmol)、et3n(556.0μl，4.0mmol)和1-羟基苯并三唑(179.0mg，1.33mmol)。在环境温度下搅拌41小时后，将混合物真空浓缩并再溶解在mecn(10ml)中，然后加入0.1m氢氧化钠水溶液(10ml)和固体氢氧化钠颗粒(100.0mg)。1.5h后，加入dcm(20ml)并将期望化合物萃取四次。将有机层在真空中浓缩并将残余物通过硅胶快速柱色谱法(0％
→
12％meoh于dcm中)纯化，得到194，为澄清黄色油状物(733mg，1.19mmol，90％)。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)4.29
–
4.23(m,2h),3.77
–
3.68(m,4h),3.65
–
3.56(m,14h),3.56
–
3.49(m,8h),3.37
–
3.24(m,4h),1.45(s,18h).c
27h54
n3o
12
(m h

)的lcms(esi )计算值612.73，实测值612.55。实施例55.195的合成向194(31.8mg，0.052mmol)于dcm(1.0ml)中的溶液中加入4.0m hcl于二噁烷中(0.4ml)。在环境温度下搅拌2.5小时后，将反应混合物真空浓缩并在中间再溶解于dcm(2ml)中并浓缩。以定量收率获得化合物195，为澄清油状物。c
17h38
n3o
8
(m h

)的lcms(esi )计算值412.50，实测值412.45实施例56.196的合成向195(21.4mg，0.052mmol)在dcm(1.0ml)中的冷溶液(0℃)中加入et3n(36μl，0.26mmol)和2-溴乙酰溴(10.5μl，0.12mmol)。在冰上搅拌10分钟后，除去冰浴并加入0.1m氢氧化钠水溶液(0.8ml)。在室温下搅拌20分钟后，用dcm(2
×
5ml)萃取水层。合并有机层并真空浓缩。将粗棕色油状物通过硅胶快速柱色谱法(0％
→
18％meoh于dcm中)纯化，得到196，为澄清油状物(6.9mg，0.011mmol，20％)。c
21h40
br2n3o
10
(m h

)的lcms(esi )计算值654.36，实测值654.29。实施例57.xl12的合成
向196(6.9mg，0.011mmol)的dcm(0.8ml)溶液中加入双(4-硝基苯)碳酸酯(3.8mg，0.012mmol)和et3n(5μl，0.03mmol)。在室温下搅拌18小时后，加入溶解在dcm(0.5ml)中的155(bcn-peg
2-nh2，3.3mg，0.01mmol)。再搅拌2小时后，将混合物真空浓缩并通过硅胶快速柱色谱法纯化(梯度：a.0％
→
30％etoac于dcm中(直到洗脱对硝基苯酚)，随后梯度b.0％
→
20％meoh于dcm中)纯化，得到xl12，为透明油状物(1.0mg，0.001mmol，9％)。c
39h66
br2n5o
15
(m h

)的lcms(esi )计算值1004.77，实测值1004.51。实施例58-1.197的合成向102(204mg，0.647mmol)在dcm(20ml)中的溶液中加入181(496mg，0.909mmol)和et3n(350μl，2.27mmol)。在室温下搅拌19小时后，在真空中蒸发溶剂并通过硅胶快速柱色谱法(2
→
20％meoh于dcm中)纯化残余物，得到期望化合物197，为黄色油状物，87％收率(410mg，0.567mmol)。c
35h63
no
14
na

(m na

)的lcms(esi )计算值744.86，实测值744.43。实施例58-2.198的合成向197(410mg，0.567mmol)和4-硝基苯氯甲酸酯(172mg，0.853mmol)在dcm(6ml)中的溶液中加入et3n(260μl，1.88mmol)。在室温下搅拌18h后，在真空中蒸发溶剂，并将残余物通过硅胶快速柱色谱法(0
→
7％meoh于dcm中)纯化，得到期望化合物198，为澄清油状物，70％收率(350mg，0.394mmol)。c
42h66
n2o
18
na

(m na

)的lcms(esi )计算值909.96，实测值909.61。实施例59.xl13的合成向198(44.2mg，0.05mmol)于dcm(5ml)中的溶液中加入199(双-氨基氧基-peg2，33.3mg，0.18mmol)和et3n(11μl，0.07mmol)。在室温下搅拌67小时后，将混合物真空浓缩并通过rp hplc(柱xbridge prep c18 5um obd，30x100mm，5％
→
90％meoh于h2o中(均含有1％乙酸))纯化。获得产物xl13，为澄清油状物(8.1mg，0.0087μmol，17％)。c
42h78
n3o
19
(m h

)的lcms(esi )计算值929.08，实测值928.79。
实施例60.314的合成将3-巯基丙酸(200mg，1.9mmol)在水(6ml)中的溶液冷却至0℃，然后加入在乙醇(3ml)中的甲基硫代磺酸甲酯(methyl methanethiosulfonate)(263mg，2.1mmol)。将反应搅拌过夜并温热至室温。随后，通过饱和nacl水溶液(10ml)和et2o(20ml)淬灭反应。将水层用et2o(3
×
20ml)萃取，并将合并的有机层经na2so4干燥，过滤并浓缩，得到粗二硫化物产物(266mg，1.7mmol，93％)。1h-nmr(400mhz,cdcl3):δ7.00(bs,1h),2.96-2.92(m,2h),2.94-2.80(m,2h),2.43(s,3h).将衍生自3-巯基丙酸的粗二硫化物(266mg，1.7mmol)溶解于ch2cl2(20ml)中，然后加入edc.hcl(480mg，2.2mmol)和n-羟基琥珀酰亚胺(270mg，2.1mmol)。将反应搅拌90分钟并用水(20ml)淬灭。将有机层用饱和nahco3水溶液(2
×
20ml)洗涤。将有机层经na2so4干燥，过滤并浓缩，得到粗制314(346mg，1.4mmol，81％)。1h-nmr(400mhz,cdcl3):δ3.12-3.07(m,2h),3.02-2.99(m,2h),2.87(bs,4h),2.44(s,3h).实施例61.316的合成向315(根据wo2015057063实施例40制备，通过引用的方式并入)(420mg，1.14mmol)在ch2cl2/dmf(各5ml)中的溶液中加入粗制314(425mg，1.71mmol)和et3n(236μl，1.71mmol)。将反应混合物搅拌过夜，然后在减压下浓缩。快速色谱法(1:0-6:4mecn:meoh)得到316(358mg，0.7mmol，60％)。1h-nmr(400mhz,cd3od):δ5.46-5.45(m,1h),5.33-5.27(m,1h),5.15-5.11(m,1h),4.43-4.41(m,1h),4.17-4.06(m,2h),3.97-3.88(m,1h),2.89-2.83(m,2h),2.69-2.53(m,2h),2.32(s,3h),2.04(s,3h),1.91(s,3h),1.86(s,3h).实施例62.udp galnprossme(318)的合成向ump.nbu3(632mg，1.12mmol)在dmf(5ml)中的溶液中加入cdi(234mg，1.4mmol)并搅拌30分钟。加入甲醇(25μl，0.6mmol)，并在15分钟后，将反应置于高真空下保持15分
钟。随后，将316(358mg，0.7mmol)和nmi.hcl(333mg，2.8mmol)溶解于dmf(2ml)中并加入至反应混合物中。搅拌过夜后，减压浓缩反应混合物，得到粗产物317。将粗产物317溶解在meoh:h2o:et3n(7:3:3,10ml)中并搅拌过夜，然后加入另外的meoh:h2o:et3n(7:3:3,5ml)。48小时总反应时间后，在减压下浓缩反应混合物。通过阴离子交换柱(q hitrap,3x 5ml,1x20ml柱)分两部分纯化粗产物。通过装载缓冲液a(10mm nahco3)实现在柱上首次结合，并用50ml缓冲液a冲洗柱。接着进行梯度至70％b(250mm nahco3)以洗脱udp galnprossme 318(355mg，0.5mmol，72％)。1h-nmr(400mhz,d2o):δ7.86-7.84(m,1h),5.86-5.85(m,1h),5.44(bs,1h),4.26-4.22(m,2h),4.17-4.08(m,6h),3.92(m,1h),3.84-3.83(m,1h),3.66-3.64(m,2h),2.88(t,j＝7.2hz,2h),2.68(t,j＝7.2hz,2h),2.31(s,3h).实施例63.319的合成向化合物121(442mg，1.46mmol)在dcm(1ml)和dmf(200μl)中的溶液中加入化合物128在dcm(1ml)中的溶液和三乙胺(609μl，4.37mmol)。将混合物搅拌16小时后，将其真空浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(50％
‑‑
》100％etoac于庚烷中)纯化并得到319(316mg)。将其通过rp hplc(柱xbridge prep c18 5μm obd，30x100mm，5％
→
90％mecn(1％acoh)于水(1％acoh)中进一步纯化。获得产物319，为无色油状物，17％收率(110mg，0.25mmol)。c
19h37
n3nao
8
((m na

)的lcms(esi )计算值458.25，实测值458.33。1h-nmr(400mhz,cdcl3):δ(ppm)5.41
–
4.89(m,2h),4.31
–
4.24(m,2h),3.78
–
3.68(m,4h),3.65
–
3.59(m,2h),3.44
–
3.34(m,4h),3.34
–
3.19(m,4h),1.43(s,18h).实施例64.320的合成将化合物319(107mg，0.25mmol)溶解于dcm(1ml)中。然后加入4m hcl的二噁烷溶液(300μl，1.2mmol，4.8当量)。将混合物搅拌15小时后，将其从沉淀物中倒出，并将沉淀物用dcm(2ml)洗涤一次。以定量收率获得产物320，为白色粘性固体(89.9mg，0.29mmol)。将其直接用于下一步骤。实施例65.321的合成向101(75mg，0.50mmol，2当量)在dcm(1ml)中的溶液中加入csi(41μl，0.48mmol，1.9当量)。搅拌6分钟后，加入三乙胺(139μl，1.0mmol，4当量)。通过加入dmf(200μl)和dcm(2ml)，随后加入三乙胺(139μl，0.75mmol，3当量)来制备320的储备液。将320的该储备液的部分(32μl，0.25mmol)加入至含有csi的原始反应混合物中。将混合物搅拌16小时后，将其真空浓缩。通过硅胶柱色谱法(0％
→
10％meoh于dcm中)纯化残余物。获得产物321，3％收率，为无色油状物(11mg，14.2μmol)。c
31h48
n5o
12s2
((m h

)的lcms(esi )计算值746.27，实测值746.96。1h-nmr(400mhz,cdcl3):δ(ppm)6.36
–
5.94(m,2h),4.38
–
4.17(m,6h),3.84
–
3.79(m,2h),3.77
–
3.72(m,2h),3.68
–
3.63(m,2h),3.54
–
3.45(m,4h),3.39
–
3.27(m,4h),
2.38
–
2.16(m,12h),1.67
–
1.47(m,5h),1.40(五重峰,j＝8.0hz,2h),1.05
–
0.93(m,4h).实施例66.301(ld01)的合成向321(10.6mg，14.2μmol)在dcm(100μl)中的溶液中加入双(4-硝基苯)碳酸酯(4.3mg，14.2μmol，1.0当量)和三乙胺(5.9μl，42.6μmol，3.0当量)。搅拌66小时后，将该混合物的部分用vc-pabc-mmae.tfa在dmf中的储备液(200μl，50mg/ml)和额外量的三乙胺(5.9μl，42.6μmol，3.0当量)处理。24小时后，将其部分真空浓缩。将残余物通过rp hplc(柱xbridge prep c18 5μm obd，30x100 mm，5％
→
90％mecn(1％acoh)于水(1％acoh)中)纯化。获得化合物301，28％收率，为膜状物(3.4mg，1.9μmol)。c
90h140n15o25s2
((m h

)的lcms(esi )计算值1894.96，实测值1895.00。实施例67.322的合成向185(八乙二醇)在dcm(10ml)中的溶液中加入三乙胺(1.0ml，7.24mmol；2.5当量)，然后在28分钟内逐滴加入4-硝基苯氯甲酸酯(0.58g；2.90mmol；1当量)的dcm(5ml)溶液。将混合物搅拌90分钟后，将其真空浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化(75％
‑‑
》0％etoac于dcm中，然后0％
‑‑
》7％meoh于dcm中)。以38％收率获得产物322，为无色油状物(584.6mg；1.09mmol)。c
23h38
no
13
(m h

)的lcms(esi )计算值536.23，实测值536.93。1h-nmr(400mhz,cdcl3):δ(ppm)8.28(d,j＝12.0hz,2h),7.40(d,j＝12.0hz,2h),4.47
–
4.42(m,2h),3.84
–
3.79(m,2h),3.75
–
3.63(m,26h),3.63
–
3.59(m,2h),2.70
–
2.55(br.s,1h).实施例68.323的合成向化合物121(127mg，0.42mmol)在dcm(1ml)中的溶液中加入部分(0.5ml；0.54mmol；1.3当量)322的制备储备液(584mg于dcm(1ml)中)，随后加入三乙胺(176μl，1.26mmol；3当量)和hobt(57mg；0.42mmol；1当量)。将混合物搅拌4.5天后，将其真空浓缩。将残余物溶解在乙腈(4.2ml)和0.1n naoh(4.2ml，1当量)的混合物中。将混合物搅拌24小时后，加入额外的固体氢氧化钠(104.5mg)。将混合物再搅拌5小时后，将混合物用dcm(2x10ml)萃取。将合并的有机层在真空中浓缩并将残余物通过硅胶柱色谱法(0％
→
15％meoh于dcm中)纯化。得到产物323，收率54％，为淡黄色油状物(164.5mg，0.23mmol)。c
26h54
n3o
12
(m-boc

)的lcms(esi )计算值600.36，实测值600.49。1h-nmr(400mhz,cdcl3):δ(ppm)5.27
–
5.05(m,2h),4.26
–
4.21(m,2h),3.76
–
3.59(m,30h),3.43
–
3.33(m,4h),3.33
–
3.22(m,4h),1.43(s,18h).实施例69.324的合成
将化合物323(164mg，0.23mmol)溶解于dcm(1ml)中。然后加入4m hcl的二噁烷溶液(293μl，1.17mmol，5当量)。将混合物搅拌18小时后，另外加入4m hcl的二噁烷溶液(293μl，1.17mmol，5当量)。再搅拌混合物5小时后，真空浓缩混合物。以定量收率获得产物324，为白色粘性固体(132mg，0.23mmol)。将其直接用于下一步骤。实施例70.325的合成向101(81mg，0.54mmol，2.3当量)于dcm(2ml)中的溶液中加入csi(43μl，0.49mmol，2.1当量)。搅拌15分钟后，加入三乙胺(164μl，1.17mmol，5当量)。通过加入dcm(2ml)和三乙胺(164μl，1.17mmol，5当量)制备324的溶液。6分钟后将该储备液加入到最初的反应混合物中。将混合物搅拌23小时后，将其真空浓缩。通过硅胶柱色谱法(0％
→
12％meoh于dcm中)纯化残余物。以31％收率获得产物325，为浅黄色油状物(73.0mg，72.2μmol)。c
43h72
n5o
18s2
(m h

)的lcms(esi )计算值1010.43，实测值1010.50。1h-nmr(400mhz,cdcl3):δ(ppm)6.21
–
5.85(m,2h),4.38
–
4.17(m,6h),3.80
–
3.57(m,30h),3.57
–
3.44(m,4h),3.44
–
3.30(m,4h),2.38
–
2.16(m,12h),1.64
–
1.48(m,4h),1.40(五重峰,j＝8.0hz,2h),1.05
–
0.91(m,4h).实施例71.302(ldo2)的合成向325(19.5mg，19.7μmol)在dcm(100μl)中的溶液中加入双(4-硝基苯)碳酸酯(6.0mg，19.7μmol，1.0当量)和三乙胺(8.2μl，59.1μmol，3.0当量)。搅拌66小时后，将该混合物的部分用vc-pabc-mmae.tfa在dmf中的储备液(200μl，50mg/ml)和额外量的三乙胺(8.2μl，59.1μmol，3.0当量)处理。95小时后，将其部分真空浓缩。通过rp hplc(柱xbridge prep c18 5μm obd，30x100mm，5％
→
90％mecn(1％acoh于水(1％acoh)中)纯化残余物。以9％收率获得化合物302，为膜状物(3.7mg，1.71μmol)。c
102h165n15o31s22
(m 2h

)的lcms(esi )计算值1080.56，实测值1080.74。实施例72.329的合成向101(18mg，0.12mmol)在dcm(1ml)中的溶液中加入氯磺酰异氰酸酯(csi)。30分钟后，加入et3n(37μl，27mg，0.27mmol)。向195(26mg，0.054mmol)在dcm(1ml)中的溶液中加入et3n(37μl，27mg，0.27mmol)。将该混合物加入到反应混合物中。45分钟后，浓缩反应混合物并通过硅胶色谱法(dcm至7％meoh于dcm中)纯化残余物。获得产物329，为无色膜状物(27mg，0.029mmol，54％)。c
39h64
n5o
16s2
(m h

)的lcms(esi )计算值922.38，实测值922.50。实施例73.330的合成向329在dcm(1ml)中的溶液中加入双(4-硝基苯)碳酸酯(8.9mg，29.3μmol)和et3n(12.2μl，8.9mg，87.9μmol)。1天后，0.28ml用于制备化合物303。2天后，向主反应混合物中加入额外的双(4-硝基苯)碳酸酯(7.0mg，23μmol)。1天后，浓缩反应混合物并通过硅胶柱色
谱法纯化残余物。获得产物330，为无色膜状物(17.5mg，0.016mmol，55％(76％校正))。c
46h67
n6o
20s2
(m h

)的lcms(esi )计算值1087.38，实测值1087.47。实施例74.303(ld03)的合成向330(0.28ml，理论上含有8.8mg，8.1μmol)的反应混合物中加入et3n(3.4μl，2.5mg，24.3μmol)和vc-pabc-mmae.tfa(10mg，8.1μmol)于dmf(200μl)中的溶液。21小时后，加入2,2
′‑
(亚乙二氧基)双(乙胺)(4.7μl，4.8mg，32μmol)。45分钟后，将反应混合物在氮气流下浓缩。将残余物通过rp-hplc纯化(柱xbridge prep c18 5μmobd，30x100 mm，30％至90％mecn(1％acoh)于水(1％acoh)中。获得产物303，为无色膜状物(5.6mg，2.7μmol)。c
98h157n15o29s22
((m 2h

)/2)的lcms(esi )计算值1036.53，实测值1036.70。实施例75.332的合成向alloc
2-va-pabc-pbd 331(10.0mg，0.009mmol)于脱气dcm(400μl，通过将n2吹扫通过dcm 5分钟获得)中的溶液中加入吡咯烷(1.9μl，0.027mmol)和pd(pph3)4(1.6mg，0.0014mmol)。在环境温度下搅拌15分钟后，将反应混合物用dcm(10ml)稀释并加入饱和nh4cl水溶液(10ml)。将粗混合物用dcm(3
×
10ml)萃取。将有机层合并，经na2so4干燥，过滤，并真空浓缩。将黄色残余物再溶解于dmf(450μl)和mecn(450μl)中并通过rp hplc(柱xbridge prep c18 5μm obd，30x100 mm，5％
→
90％mecn的h2o溶液(均含有0.1％甲酸))纯化。将纯级分经spe柱(pl-hco
3 mp，500mg/6ml)中和，浓缩并与mecn(2
×
5ml)共蒸发，得到332，为白色固体(4.8mg，0.005mmol，58％)。c
49h60
n7o
11
(m h

)的lcms(esi )计算值923.04，实测值923.61。实施例76.304(ld04)的合成向332(4.8mg，0.005mmol)于无水脱气dmf(60μl，通过将n2吹扫通过dcm 5分钟获得)中的溶液中加入330(10mg，0.009mmol，溶解于48μl无水脱气dmf中)、et3n(3.6μl，0.026mmol)和hobt(存于无水脱气dmf中，5.1μl，0.35mg，0.0026mmol，0.5当量)。在环境温度下在黑暗中搅拌41h后，将粗反应混合物用dcm(300μl)稀释并通过硅胶快速柱色谱法(0％
→
12％meoh于dcm中)纯化，得到304，为澄清黄色油状物(4.0mg，0.0021mmol，41％)。c
89h121n12o28s2
(m h

)的lcms(esi )计算值1871.11，实测值1871.09。
实施例77.305(ld05)的合成向根据wo2019110725a1实施例5-5(通过引用的方式并入)制备的333(2.9mg，0.0013mmol)在无水dmf(60μl)中的溶液中加入330(1.45mg，0.0013mmol)和et3n(1.2μl，0.023mmol)。在室温下搅拌48小时后，将反应混合物用dmf(500μl)稀释并通过rp hplc(柱xbridge prep c18 5μm obd，30x100 mm，30％
→
100％mecn于h2o中(均含有1％乙酸))纯化。获得产物305，为无色膜状物(0.6mg，0.207μmol，16％)。c
124h182
in
14o46s5
(m/2 h

)的lcms(esi )计算值1447.03，实测值1447.19。实施例78.306(ld06)的合成向330(7mg，0.006mmol)在无水dmf(150μl)中的溶液中加入vc-pabc-dmea-pnu(334)在无水dmf(125μl，5.7mg，0.005mmol)和et3n(2μl，0.015mmol)中的储备物。在室温下搅拌25h后，将反应混合物用dcm(0.3ml)稀释，并通过硅胶快速柱色谱法(0％
→
20％meoh于dcm中)纯化，得到306，为红色膜状物(5mg，0.0024mmol，47％)。c
96h133n13o36s3
(m/2 h

)的lcms(esi )计算值1055.64，实测值1055.50。
实施例79.337的合成将化合物336(dibo，95mg，0.43mmol)溶解于dcm(1.0ml)中并在室温下加入氯磺酰异氰酸酯(33.0μl，0.37mmol)，并在2分钟后形成不溶物质。在室温下再搅拌15分钟后，加入et3n(120.0μl，0.85mmol)，所有不溶物质消失，并加入溶解于dcm(1.0ml)中的195(71mg，0.0171)与et3n(120.0μl，0.85mmol)的混合物。在室温下搅拌16h后，将粗混合物真空浓缩并通过硅胶快速柱色谱法(0％
→
15％meoh于dcm中)纯化，然后将其与etoac(2x)共蒸发以完全除去meoh。获得产物337，为蜡状白色固体(136.0mg，0.12mmol，75％)。c
51h63
n6o
16s2
(m nh
4
)的lcms(esi )计算值1080.21，实测值1080.59。实施例80.338的合成向337(136.0mg，0.12mmol)在dcm(2.0ml)中的溶液中加入双-(4-硝基苯)碳酸酯(47.0mg，0.15mmol)和et3n(54.0μl，0.38mmol)。在室温下搅拌18h后，将粗混合物在真空中浓缩并通过硅胶快速柱色谱法(梯度：a.0％
→
35％etoac于dcm中(直到洗脱对硝基苯酚)，随后梯度b.0％
→
13％meoh于dcm中)得到338，其为淡黄色油状物(89.0mg，0.07mmol，60％)。c
48h66
n7o
20s2
(m nh
4
)的lcms(esi )计算值1245.31，实测值1245.64。实施例81.307(ld07)的合成向338(6.95mg，0.005mmol)在无水dmf(93.0μl)中的溶液中加入et3n(2.4μl，0.017mmol)和vc-pabc-mmae.tfa(levena bioscience)在无水dmf(70μl，7.0mg，0.005mmol)中的储备液。在室温下搅拌18小时后，加入dmf(450μl)并通过rp hplc(柱xbridge prep c18 5μm obd，30x100 mm，30％
→
100％mecn于h2o中(均含有1％乙酸))纯化粗混合物。获得产物307，为无色膜状物(4.5mg，0.002mmol，36％)。c
110h152n15o29s2
(m/2 h

)的lcms(esi )计算值1106.30，实测值1106.79。实施例82.341的合成在室温下将化合物101(16.3mg，0.10mmol)溶解于dcm(0.8ml)中并加入氯磺酰异氰酸酯(8.6μl，0.099mmol)。在室温下搅拌15分钟后，加入et3n(69.0μl，0.49mmol)，然后加
入溶解在dcm(1.0ml)中的335(40mg，0.099mmol)和et3n(69.0μl，0.49mmol)的混合物。将该混合物在室温下搅拌1.5h(混合物1)，得到粗制339。在另一小瓶中，在室温下将340(dbco-c
2-oh，broadpharm)(34.0mg，0.099mmol)溶解于dcm(0.8ml)中并加入氯磺酰异氰酸酯(7.75μl，0.089mmol)。在室温下搅拌15分钟后，加入et3n(69.0μl，0.49mmol)，随后加入粗制339。在室温下再搅拌2h后，将反应混合物真空浓缩并通过硅胶快速柱色谱法(0％
→
15％meoh于dcm中)纯化，然后将其与etoac(2x)共蒸发以完全除去meoh。获得产物341，为澄清黄色油状物(20.0mg，0.017mmol，17％)。c
50h70
n7o
18s2
(m h

)的lcms(esi )计算值1121.26，实测值1121.59。实施例83.342的合成向341(20.0mg，0.17mmol)在dcm(1.0ml)中的溶液中加入双(4-硝基苯)碳酸酯(5.6mg，0.019mmol)和et3n(7.5μl，0.053mmol)。在室温下搅拌40h后，将粗混合物在真空中浓缩并通过硅胶快速柱色谱法(梯度：a.0％
→
30％etoac于dcm中(直到洗脱对硝基苯酚)，随后梯度b.0％
→
20％meoh于dcm中)纯化，得到342，为澄清浅黄色油状物(6.9mg，0.005mmol，30％)。c
57h73
n8o
22s2
(m h

)的lcms(esi )计算值1286.36，实测值1286.57。实施例84.308(ld08)的合成向342(3.6mg，0.0028mmol)在无水dmf(35.0μl)中的溶液中加入et3n(1.2μl，0.008mmol)和vc-pabc-mmae.tfa(levena bioscience)在无水dmf(34μl，3.4mg，0.0028mmol)中的储备液。在室温下搅拌27h后，加入dcm(400μl)，并通过硅胶快速柱色谱法(0％
→
30％meoh于dcm中)纯化粗混合物，得到308，为无色膜状物(3.7mg，0.0016mmol，58％)。c
109h161n17o31s2
(m/2 h

)的lcms(esi )计算值1135.84，实测值1135.73。实施例85.309(ld09)的合成向vc-pabc-mmae.tfa(levena bioscience)在无水dmf(91μl，9.1mg，0.0073mmol)中的储备液中加入et3n(5.1μl，0.037mmol)和343(双-马来酰亚胺-赖氨酸-peg
4-tfp，broadpharm)(6.2mg，0.0073mmol)。在室温下搅拌3h后，将混合物用dcm(0.4ml)稀释并通过硅胶快速柱色谱法(0％
→
30％meoh于dcm中)纯化，得到309，为澄清油状物(9.1mg，0.0051mmol，69％)。c
89h138n15o24
(m h

)的lcms(esi )计算值1802.13，实测值1802.11。实施例86.310(ld10)的合成向含有344(4.3mg，6.0μmol，1.7当量)的eppendorf小瓶中加入vc-pabc-mmaf.tfa盐的dmf溶液(4.00mg，100μl，34.31mmol，3.43μmol，1.0当量)，然后加入三乙胺(1.43μl，
prep c18 5μm obd，30x100mm，5％
→
90％mecn于h2o中(均含有1％acoh))纯化。获得产物311，为澄清油状物(0.6mg，0.28μmol，5％)。c
102h156n19o27
(m/2 h

)的lcms(esi )计算值1040.71，实测值1040.85。实施例90.化合物312的合成化合物312(ld11)根据verkade等人，antibodies 2018,7,doi:10.3390/antib7010012(通过引用的方式并入)所述的方法制备。实施例91.313(ld311)的合成向含有348(2.7mg，1.1eq，4.9μmol)的小瓶中加入dmf(60μl)和纯三乙胺(1.9μl，3eq，13μmol)。接着，加入hbtu在干燥dmf中的溶液(2.0mg，11μl，472mmol，1.2当量，5.3μmol)并将混合物混合。将反应混合物在室温下放置30分钟，然后加入va-pabc-mmaf.tfa盐(5.2mg，0.13ml，34.31mmol，1当量，4.4μmol)。将所得混合物混合并在室温下放置110分钟，然后直接通过rp hplc纯化(柱xbridge prep c18 5μm obd，30x100 mm，30％
→
90％mecn(1％acoh)于水(1％acoh)中。获得期望的产物313，为无色油状物(1.8mg，1.1μmol，26％收率)。c
77h127n12o23
(m h

)的lcms(esi )计算值1587.91，实测值1588.05。实施例92.350的合成向甲基四嗪-nhs酯349(19mg，0.057mmol)在dcm(400μl)中的溶液中加入溶解在dcm(800μl)中的氨基-peg
11-胺(47mg，0.086mmol)。在室温下搅拌20分钟后，将混合物真空浓缩并通过硅胶快速柱色谱法(0
→
50％meoh(0.7m nh3)的dcm溶液)纯化，得到期望化合物350，为粉红色油状物(17mg，0.022mmol，39％)。c
35h61
n6o
12
(m h

)的lcms(esi )计算值757.89，实测值757.46。实施例93.351的合成向151(fmoc-gly-gly-gly-oh，10mg，0.022mmol)在无水dmf(500μl)中的搅拌溶液中加入dipea(11μl，0.067mmol)和hatu(8.5mg，0.022mmol)。10分钟后，加入溶解于无水dmf(500μl)中的350(17mg，0.022mmol)。在室温下搅拌18.5h后，将混合物真空浓缩并通过硅胶快速柱色谱法(0
→
17％meoh于dcm中)纯化，得到期望化合物351，为粉色油状物(26mg，0.022mmol，定量)。c
56h83n10o17
(m nh
4
)的lcms(esi )计算值1168.32，实测值1168.67实施例94.169的合成向351(26mg，0.022mmol)在无水dmf(500μl)中的溶液中加入二乙胺(12μl，
0.11mmol)。在室温下搅拌1.5小时后，通过rp hplc(柱xbridge prep c18 5μm obd，30x100mm，5％
→
90％mecn于h2o中(均含有1％乙酸))纯化粗混合物。得到产物169，为澄清粉红色油状物(10.9mg，0.011mmol，53％)。c
41h70
n9o
15
(m h

)的lcms(esi )计算值929.05，实测值929.61。实施例95.352的合成向349(甲基四嗪-nhs酯，10.3mg，0.031mmol)于dcm(200μl)中的溶液中加入溶解于dcm(200μl)中的氨基-peg
23-胺(50mg，0.046mmol)。在室温下搅拌50分钟后，将混合物真空浓缩并通过硅胶快速柱色谱法(0
→
60％meoh(0.7m nh3)于dcm中)纯化，得到期望化合物352，为粉红色油状物(17.7mg，0.013mmol，44％)。c
59h109
n6o
24
(m h

)的lcms(esi )计算值1286.52，实测值1286.72。实施例96.353的合成向151(5.7mg，0.013mmol)在无水dmf(500μl)中的搅拌溶液中加入dipea(7μl，0.04mmol)和hatu(5.3mg，0.013mmol)。10分钟后，加入溶解在无水dmf(500μl)中的352(17.7mg，0.013mmol)。在室温下搅拌6h后，将混合物真空浓缩并通过硅胶快速柱色谱法(0
→
18％meoh于dcm中)纯化，得到期望化合物353，为粉红色油状物(21mg，0.012mmol，91％)。c
80h131n10o29
(m/2 nh
4
)的lcms(esi )计算值857.45，实测值857.08实施例97.170的合成向353(21mg，0.012mmol)在无水dmf(500μl)中的溶液中加入二乙胺(6.7μl，0.06mmol)。在室温下搅拌4小时后，通过rp hplc(柱xbridge prep c18 5μm obd，30x100 mm，5％
→
90％mecn于h2o中(均含有1％乙酸))纯化粗混合物。得到产物170，为粉红色油状物(11.6mg，0.008mmol，66％)。c
65h118
n9o
27
(m h

)的lcms(esi )计算值1457.68，实测值1457.92。实施例98.356的合成
向354(四氟叠氮基苯-nhs酯，40mg，0.12mmol)于dcm(1ml)中的溶液中加入355(boc-nh-peg
2-nh2，33mg，0.13mmol)和et3n(50μl，0.36mmol)。在黑暗中在室温下搅拌30min之后，将混合物在真空中浓缩并通过硅胶快速柱色谱法(0％
→
7％meoh于dcm中)纯化，得到期望的化合物356，为澄清油状物(47mg，0.10mmol，84％)。c
18h24
f4n5o
5
(m h

)的lcms(esi )计算值466.41，实测值466.23。实施例99.357的合成向356(47mg，0.10mmol)在dcm(2ml)中的溶液中加入4.0mhcl的二噁烷溶液(300μl)。在室温下在黑暗中搅拌17.5小时后，将混合物浓缩并以定量收率得到357，为白色固体(36mg，0.10mmol)。c
13h16
f4n5o
3
(m h

)的lcms(esi )计算值366.29，实测值366.20。实施例100.358的合成向151(fmoc-gly-gly-gly-oh，42mg，0.10mmol)在无水dmf(600μl)中的搅拌溶液中加入dipea(50μl，0.30mmol)和hatu(39mg，0.10mmol)。在黑暗中15分钟后，加入溶解在无水dmf(500μl)中的357(36mg，0.10mmol)。在室温下在黑暗中搅拌41h后，将混合物真空浓缩并通过硅胶快速柱色谱法(0
→
20％meoh于dcm中)纯化，得到期望化合物358，为澄清油状物(36mg，0.047mmol，47％)。c
34h35
f4n8o
8
(m h

)的lcms(esi )计算值759.68，实测值759.38。实施例101.171的合成向358(36mg，0.047mmol)在无水dmf(750μl)中的溶液中加入二乙胺(24μl，0.24mmol)。在室温下在黑暗中搅拌55min后，通过rp hplc(柱xbridge prep c18 5μm obd，30x100mm，5％
→
90％mecn于h2o中(均含有1％乙酸))纯化粗混合物。获得产物171，为澄清油状物(18.7mg，0.034mmol，74％)。c
19h25
f4n8o
6
(m h

)的lcms(esi )计算值537.45，实测值537.29。实施例102.bcn-lpetgg(172)的合成向102(10mg，0.031mmol)于无水dmf(500μl)中的溶液中加入肽167(h-lpetgg-oh，18mg，0.031mmol)和et3n(13μl，0.095mmol)。在室温下搅拌93h后，将粗混合物通过rp hplc(柱xbridge prep c18 5μm obd，30x100mm，5％
→
90％mecn于h2o中(均含有1％乙酸))纯化。获得产物172，为澄清油状物(16.8mg，0.022mmol，72％)。c
35h53
n6o
12
(m h

)的lcms(esi )计算值749.83，实测值749.39。实施例103.359的合成向102(56mg，0.17mmol)在dcm(8ml)中的溶液中加入氨基-peg
24-醇(214mg，0.199mmol)和et3n(80μl，0.53mmol)。在室温下搅拌20h后，在真空中蒸发溶剂并通过快速硅胶柱色谱法(2
→
30％meoh于dcm中)纯化残余物，得到期望化合物359，为黄色油状物，95％收率(210mg，0.168mmol)。c
59h111
no
26
na

(m na

)的lcms(esi )计算值1273.50，实测值
1273.07。实施例104.360的合成向359(170mg，0.136mmol)和4-硝基苯氯甲酸酯(44mg，0.22mmol)在dcm(7ml)中的溶液中加入et3n(63μl，0.40mmol)。在室温下搅拌41小时后，蒸发溶剂并通过快速硅胶柱色谱法(0
→
10％meoh于dcm中)纯化残余物，得到期望化合物360，为澄清油状物，67％收率(129mg，0.091mmol)。c
66h114
n2o
30
na

(m na

)的lcms(esi )计算值1438.59，实测值1438.13。实施例105.173的合成向360(16mg，0.011mmol)在无水dmf(800μl)中的溶液中加入167(肽h-lpetgg-oh，6.5mg，0.011mmol)和et3n(5μl，0.04mmol)。在室温下搅拌95h后，通过rp hplc(柱xbridge prep c18 5μm obd，30x100mm，5％
→
90％mecn于h2o中(均含有1％乙酸))纯化粗混合物。获得产物173，为澄清油状物(12.6mg，0.0068mmol，62％)。mecn的lcms(esi )计算值942.55，实测值924.26。实施例106.174的合成向361(甲基四嗪-peg
5-nhs酯，6.1mg，0.011mmol)于无水dmf(230μl)中的溶液中加入肽h-lpetgg-oh(6.5mg，0.011mmol)和et3n(4μl，0.028mmol)。在室温下搅拌22小时后，通过rp hplc(柱xbridge prep c18 5μm obd，30x100mm，5％
→
90％mecn于h2o中(均含有1％乙酸))纯化粗混合物。得到产物174，为澄清粉红色油状物(9.9mg，0.01mmol，91％)。c
44h70n11o16
(m nh
4
)的lcms(esi )计算值1009.09，实测值1009.61。实施例107.362的合成向354(31mg，0.093mmol)在dcm(1ml)中的溶液中加入181(56mg，0.10mmol)和et3n(40μl，0.28mmol)。在黑暗中在室温下搅拌25min之后，将混合物在真空中浓缩并通过硅胶快速柱色谱法(0
→
15％meoh于dcm中)纯化，得到期望化合物362，为澄清油状物(55mg，0.072mmol，77％)。c
31h51
f4n4o
13
(m h

)的lcms(esi )计算值763.75，实测值763.08。实施例108.363的合成向362(55mg，0.072mmol)在dcm(2ml)中的溶液中加入4-硝基苯氯甲酸酯(13mg，0.064mmol)和et3n(30μl，0.21mmol)。在室温下在黑暗中搅拌21h后，将混合物真空浓缩并通过rp hplc(柱xbridge prep c18 5μm obd，30x100mm，5％
→
90％mecn(1％acoh)于水(1％acoh)中)纯化。获得产物363，为黄色油状物(13.3mg，0.014mmol，20％)。c
38h54
f4n5o
17
(m h

)的lcms(esi )计算值928.85，实测值928.57。
实施例109.175的合成向363(13.3mg，0.014mmol)于无水dmf(300μl)中的溶液中加入167(肽h-lpetgg-oh，8.2mg，0.014mmol)和et3n(6μl，0.043mmol)。在黑暗中保持26h后，将粗混合物通过rp hplc(柱xbridge prep c18 5μm obd，30x100mm，5％
→
90％mecn于h2o中(均含有1％乙酸))纯化。获得产物175，为澄清油状物(11.4mg，0.0084mmol，59％)。c
56h89
f4n
10o24
(m h

)的lcms(esi )计算值1362.35，实测值1362.81。实施例110.365的合成向151(fmoc-gly-gly-gly-oh，20mg，0.049mmol)在无水dmf(350μl)中的搅拌溶液中加入dipea(25μl，0.15mmol)和hatu(18mg，0.049mmol)。10分钟后，加入溶解于无水中的化合物364(n-boc-乙二胺，7.8mg，0.049mmol)。在室温下搅拌45min后，将混合物真空浓缩并通过硅胶快速柱色谱法(0
→
30％meoh于dcm中)纯化，得到期望化合物365，为澄清油状物(12.4mg，0.022mmol，46％)。c
28h36
n5o
7
(m h

)的lcms(esi )计算值554.61，实测值554.46。实施例111.366的合成向365(12.4mg，0.022mmol)于dcm(0.7ml)中的搅拌溶液中加入4.0m hcl的二噁烷(400μl)溶液。在室温下搅拌1小时后，将混合物浓缩并获得366，为白色固体(11mg，0.022mmol，定量)。c
23h28
n5o7

(m h

)的lcms(esi )计算值545.50，实测值454.33。实施例112.176的合成向191(8mg，0.0059mmol)于无水dmf(300μl)中的溶液中加入et3n(2.5μl，0.017mmol)和366于无水dmf中的储备液(110μl，3.0mg，0.0059mmol)。在室温下搅拌18小时后，加入二乙胺(2ul)。额外的2小时后，将混合物通过rp hplc纯化(柱xbridge prep c18 5μm obd，30x100mm，5％
→
90％mecn于h2o中(均含有1％乙酸))。得到产物176，为澄清油状物(1.3mg，0.0009mmol，15％)。c
60h103n10o26s2
(m h

)的lcms(esi )计算值1444.64，实测值1444.75。实施例113.抗-4-1bb pf31抗-4-1bb scfv被设计为具有c-末端分选酶a识别序列，随后是his标签(氨基酸序列由seq id no:4识别)。抗-4-1bb scfv在hek293细胞中瞬时表达，随后通过absolute antibody ltd(牛津，英国)imac纯化。质谱分析显示一种主要产物(观测质量28013da，预期质量28018da)。实施例114.将syr-(g4s)
3-il15(pf18)克隆到pet32a表达载体中syr-(g4s)
3-il15(pf18)(氨基酸序列由seq id no:5识别)被设计为具有n-末端
(m)syr序列，在此处甲硫氨酸将在表达后被切割，留下n-末端丝氨酸，以及在syr序列和il15之间的柔性(g4s)3间隔基。密码子优化的dna序列被插入pet32a表达载体的ndei和xhoi之间，从而除去编码硫氧还蛋白融合蛋白的序列，并从genscript，piscataway，usa获得。实施例115.syr-(4s)
3-il15(pf18)的大肠杆菌(e.coli)表达和包涵体分离syr-(g4s)
3-il15(pf18)的表达始于将质粒(pet32a-syr-(g4s)3-il15)转化到bl21细胞(novagen)中。将转化的细胞铺板在含有氨苄青霉素的lb-琼脂上并在37℃下孵育过夜。挑取单个菌落并用于接种50ml tb培养基 氨苄青霉素，然后在37℃下孵育过夜。接着，过夜培养物用于接种1000ml tb培养基 氨苄青霉素。将培养物在37℃下在160rpm下孵育，当od600达到1.5时，用1mm iptg(1ml的1m储备液)诱导。在37℃下在160rpm下诱导》16小时后，通过离心(5000xg-5min)使培养物沉淀。将从1000ml培养物获得的细胞沉淀在具有1500单位benzonase的60ml bugbuster
tm
中裂解，并在室温下在滚道(roller bank)上孵育30分钟。细胞裂解后，通过离心(15分钟，15000xg)将不溶级分与可溶级分分离。将不溶级分的一半溶解在具有溶菌酶的30ml bugbuster
tm
(最终浓度：200μg/ml)中，并在滚道上孵育10分钟。然后将溶液用6体积的1：10稀释的bugbuster
tm
稀释，并以15000xg离心15分钟。通过使用匀浆器将沉淀重悬于200ml 1：10稀释的bugbuster
tm
中，并以12000xg离心10分钟。最后一步重复3次。实施例116.从分离的包涵体中重折叠syr-(g4s)
3-il15(pf18)将含有syr-(g4s)
3-il15(pf18)的纯化的包涵体在30ml 5m胍中用40mm半胱胺和20mm tris ph 8.0溶解并变性。将悬浮液以16.000xg离心5分钟以沉淀剩余的细胞碎片。用5m胍用40mm半胱胺和20mm tris ph 8.0将上清液稀释至1mg/ml，并在滚道上在室温下孵育2小时。在4℃下的冷室中，将1mg/ml溶液逐滴加入至10倍体积的重折叠缓冲液(50mm tris，10.53mm nacl，0.44mm kcl，2.2mm mgcl2，2.2mm cacl2，0.055％peg-4000，0.55m l-精氨酸，4mm半胱胺，4mm胱胺，ph 8.0)中，需要搅拌。在4℃下放置溶液至少24小时。使用spectrum
tm spectra/por
tm 3rc dialysis membrane tubing 3500dalton mwco将溶液透析至10mm nacl和20mm tris ph 8.0，1x过夜和2x4小时。将再折叠的syr-(g4s)
3-il15(pf18)装载到akta purifier-10(ge healthcare)上的平衡q-trap阴离子交换柱(ge health care)上。首先用缓冲液a(20mm tris，10mm nacl，ph 8.0)洗涤柱子。用缓冲液b(20mm tris缓冲液，1m nacl，ph 8.0)以从缓冲液a到缓冲液b 30ml的梯度洗脱保留的蛋白质。质谱分析显示对应于pf18的重量为14122da(预期质量：14122da)。使用akta purifier-10(ge healthcare)上的hiprep
tm 26/10desalting柱(cytiva)将纯化的syr-(g4s)
3-il15(pf18)缓冲液交换至pbs。实施例117.将syr-(g4s)
3-il15ra-接头-il15(pf26)克隆到pet32a表达载体中syr-(g4s)
3-il15ra-接头-il15(pf26)(氨基酸序列由seq id no:6识别)被设计为具有n-末端(m)syr序列，在此处甲硫氨酸在表达后将被切割，留下n-末端丝氨酸，以及在syr序列和il15ra-接头-il15之间的柔性(g4s)3间隔基。密码子优化的dna序列被插入pet32a表达载体的ndei和xhoi之间，从而除去编码硫氧还蛋白融合蛋白的序列，并从genscript，piscataway，美国获得。实施例118.syr-(g4s)
3-il15ra-接头-il15(pf26)的大肠杆菌表达和包涵体分离
10 membrane,millipore)以获得hokt3-peg
2-bcn 201(60μl，169μg，101μm于pbs ph 7.4中)。实施例122.使用分选酶a pentamutant将化合物ggg-peg
2-bcn(157)c-末端分选至hokt3 200以获得hokt3-peg
2-bcn 201通过使用分选酶a pentamutant(bps bioscience，目录号71046)的c-末端分选制备本发明的生物缀合物。向hokt3 200(14.3μl，14μg，35μm于pbs ph 7.4中)的溶液中加入分选酶a pentamutant(0.5μl，1μg，92μm于40mm tris ph 8.0中，110mm nacl，2.2mm kcl，400mm咪唑和20％甘油中)、ggg-peg
2-bcn(157μl，20mm于dmso:mq＝2:3中)、cacl2(2μl，100mm于mq中)和tbs ph 7.5(1.2μl)。将反应物在37℃下孵育过夜。质谱分析显示一种主要产物(观测质量27829da)，对应于hokt3-peg
2-bcn201。实施例123.使用分选酶a将化合物ggg-peg
11-bcn(161)c-末端分选至hokt3 200以获得hokt3-peg
11-bcn202通过使用分选酶a(由seq id no:2识别)的c-末端分选制备本发明的生物缀合物。向hokt3 200(14.3μl，14μg，35μm于pbs ph7.4中)的溶液中加入分选酶a(0.9μl，12μg，582μm于tbs ph 7.5 10％甘油中)、ggg-peg
11-bcn(161，2μl，20mm于mq中)、cacl2(2μl，100mm于mq中)和tbs ph 7.5(0.9μl)。将反应物在37℃下孵育过夜。质谱分析显示一种主要产物(观测质量21951da，约85％)，对应于分选酶a，一种副产物(观测质量28227da，约5％)，对应于hokt3-peg
11-bcn202，和两种其他副产物(观测质量28051da和28325da，各约5％)。实施例124.使用分选酶a pentamutant将化合物ggg-peg
11-bcn(161)c-末端分选至hokt3 200以获得hokt3-peg
11-bcn202使用分选酶apentamutant(bps bioscience，目录号71046)通过c-末端分选制备本发明的生物缀合物。向hokt3 200(14.3μl，14μg，35μm于pbs ph 7.4中)的溶液中加入分选酶a pentamutant(0.5μl，1μg，92μm于40mm tris ph 8.0，110mm nacl，2.2mm kcl，400mm咪唑和20％甘油中)、ggg-peg
11-bcn(161，2μl，20mm于mq中)、cacl2(2μl，100mm于mq中)和tbs ph 7.5(1.2μl)。将反应物在37℃下孵育过夜。质谱分析显示一种主要产物(观测质量28225da，约60％)，对应于hokt3-peg
11-bcn202，和一种副产物(观测质量28326da，约40％)。实施例125.使用分选酶a将化合物ggg-peg
23-bcn(163)c-末端分选至hokt3 200以获得hokt3-peg
23-bcn203通过使用分选酶a(由seq id no:2识别)的c-末端分选制备本发明的生物缀合物。向hokt3 200(14.3μl，14μg，35μm于pbs ph7.4中)的溶液中加入分选酶a(0.9μl，12μg，582μm于tbs ph 7.5 10％甘油中)、ggg-peg
23-bcn(163μl，20mm于mq中)、cacl2(2μl，100mm于mq中)和tbs ph 7.5(0.9μl)。将反应物在37℃下孵育过夜。质谱分析显示一种主要产物(观测质量21951da，约70％)，对应于分选酶a，和一种副产物(观测质量28755da，约30％)，对应于hokt3-peg
23-bcn203。实施例126.使用分选酶a pentamutant将化合物ggg-peg
23-bcn(163)c-末端分选至hokt3 200以获得hokt3-peg
23-bcn203通过使用分选酶a pentamutant(bps bioscience，目录号71046)的c-末端分选制备本发明的生物缀合物。向hokt3 200(14.3μl，14μg，35μm于pbs ph 7.4中)的溶液中加入分选酶a pentamutant(0.5μl，1μg，92μm于40mm tris ph 8.0，110mm nacl，2.2mm kcl，
400mm咪唑和20％甘油中)、ggg-peg
23-bcn(163μl，20mm于mq中)、cacl2(2μl，100mm于mq中)和tbs ph 7.5(1.2μl)。将反应物在37℃下孵育过夜。质谱分析显示一种主要产物(观测质量28754da)，对应于hokt3-peg
23-bcn203。实施例127.使用分选酶a将化合物ggg-peg
4-四嗪(154)c-末端分选至hokt3 200以获得hokt3-peg
4-四嗪204通过使用分选酶a(由seq id no:2识别)的c-末端分选制备本发明的生物缀合物。向hokt3 200(500μl，500μg，35μm于pbs ph7.4中)的溶液中加入分选酶a(58μl，384μg，302μm于tbs ph7.5 10％甘油中)、ggg-peg
4-四嗪(154μl，35μl，40mm于mq中)、cacl2(69μl，100mm于mq中)和tbs ph 7.5(32μl)。将反应物在37℃下孵育过夜，随后在akta explorer-100(ge healthcare)上的his-trap excel 1ml柱(ge healthcare)上纯化。将柱用缓冲液a(20mm tris，200mm nacl，20mm咪唑，ph 7.5)平衡，并将样品以1ml/min上样。收集流出物，并且质谱分析显示一种主要产物(观测质量27868da)，对应于104。将样品用pbs ph 7.4透析并通过旋转过滤浓缩(amicon ultra-0.5,ultracel-10membrane,millipore)以获得hokt3-peg
4-四嗪204(70μl，277μg，143μm于pbs ph 7.4中)。实施例128.使用分选酶a pentamutant将化合物ggg-peg
4-四嗪(154)c-末端分选至hokt3 200以获得hokt3-peg
4-四嗪204通过使用分选酶a pentamutant(bps bioscience，目录号71046)c-末端分选制备本发明的生物缀合物。向hokt3 200(14.3μl，14μg，35μm于pbs ph 7.4中)的溶液中加入分选酶a pentamutant(0.5μl，1μg，92μm于40mm tris ph 8.0，110mm nacl，2.2mm kcl，400mm咪唑和20％甘油中)、ggg-peg
4-四嗪(154μl，20mm于mq中)、cacl2(2μl，100mm于mq中)和tbs ph 7.5(1.2μl)。将反应物在37℃下孵育过夜。质谱分析显示一种主要产物(观测质量27868da)，对应于hokt3-peg
4-四嗪204。实施例129.用分选酶a将ggg-peg
11-四嗪(169)c-末端分选至hokt3 200以获得hokt3-peg
11-四嗪pf01通过用分选酶a(由seq id no:2识别)的c-末端分选制备本发明的生物缀合物。向hokt3 200(1908μl，5mg，91μm于pbs ph 7.4中)的溶液中加入分选酶a(81μl，948μg，533μm于tbs ph 7.5 10％甘油中)、ggg-peg
11-四嗪(169μl，347μl，20mm于mq中)、cacl2(347μl，100mm于mq中)和tbs ph 7.5(789μl)。将反应物在37℃下孵育过夜。质谱分析显示一种主要产物(观测质量28258da)，对应于hokt3-peg
11-四嗪pf01。将反应物在akta explorer-100(ge healthcare)上的his-trap excel 1ml柱(ge healthcare)上纯化。将柱用缓冲液a(20mm tris，200mm nacl，20mm咪唑，ph 7.5)平衡，并将样品以1ml/min上样。收集流出物，并使用hiprep 26/10脱盐柱(ge healthcare)将缓冲液交换为pbs ph 6.5。在4℃下对pbs ph6.5进行3天另外的透析以除去残留的169。实施例130.用分选酶a将ggg-peg
23-四嗪(170)c-末端分选至hokt3 200以获得hokt3-peg
23-四嗪pf02通过用分选酶a(由seq id no:2识别)的c-末端分选制备本发明的生物缀合物。向hokt3 200(1908μl，5mg，91μm于pbs ph 7.4中)的溶液中加入分选酶a(81μl，948μg，533μm于tbs ph 7.5 10％甘油中)、ggg-peg
23-四嗪(170μl，347μl，20mm于mq中)、cacl2(347μl，100mm于mq中)和tbs ph 7.5(789μl)。将反应物在37℃下孵育过夜。质谱分析显示一种主要
产物(观测质量28787da)，对应于hokt3-peg
23-四嗪pf02。将反应物在akta explorer-100(ge healthcare)上的his-trap excel 1ml柱(ge healthcare)上纯化。将柱用缓冲液a(20mm tris，200mm nacl，20mm咪唑，ph 7.5)平衡，并将样品以1ml/min上样。将流出物透析至pbs ph 6.5，然后在akta purifier-10(ge healthcare)上的superdex75 10/300gl柱(ge healthcare)上纯化，使用pbs ph 6.5作为流动相。实施例131.用分选酶a将ggg-peg
2-芳基叠氮化物(171)c-末端分选至hokt3 200以获得hokt3-peg
2-芳基叠氮化物pf03通过用分选酶a(由seq id no:2识别)的c-末端分选制备本发明的生物缀合物。向hokt3 200(2092μl，5mg，83μm于pbs ph 7.4中)的溶液中加入分选酶a(95μl，950μg，456μm于tbs ph 7.5 10％甘油中)、ggg-peg
2-芳基叠氮化物(171μl，347μl，20mm于mq中)、cacl2(347μl，100mm于mq中)和tbs ph 7.5(591μl)。将反应物在37℃下孵育过夜。质谱分析显示一种主要产物(观测质量27865da)，对应于hokt3-peg
2-芳基叠氮化物pf03。在akta purifier-10(ge healthcare)上的his-trap excel 1ml柱(ge healthcare)上纯化反应。将柱用缓冲液a(20mm tris，200mm nacl，20mm咪唑，ph7.5)平衡，并将样品以1ml/min上样。使用pbs ph 7.4作为流动相在akta purifier-10(ge healthcare)上的superdex75 10/300gl柱(ge healthcare)上纯化流出物。实施例132.用分选酶a将抗-4-1bb pf31中的ggg-peg
11-四嗪(169)进行c-末端分选以获得抗4-1bb-peg
11-四嗪pf08向含有蛋白质pf31的溶液(1151μl，93μm在tbs ph 7.5中)中加入tbs ph 7.5(512μl)、cacl2(214μl，100mm)、ggg-peg
11-四嗪(169，220μl，20mm于mq中)和分选酶a(50μl，533μm在tbs ph 7.5中)。将反应物在37℃下孵育过夜，随后在akta explorer-100(ge healthcare)上的his-trap excel 1ml柱(ge healthcare)上纯化。将柱用缓冲液a(20mm tris，200mm nacl，20mm咪唑，ph 7.5)平衡，并将样品以1ml/min上样。收集流出物，质谱分析显示一种主要产物(观测质量27989da)对应于4-1bb-四嗪pf08。实施例133.用分选酶a将化合物ggg-peg
2-芳基叠氮化物(171)抗4-1bb-pf31进行c-末端分选以获得抗4-1bbpf09通过用分选酶a(由seq id no:2识别)的c-末端分选制备本发明的生物缀合物。向抗4-1bb-pf31溶液(665μl，2mg，107μm于pbs ph 7.4中)中加入分选酶a(100μl，1mg，357μm于tbs ph 7.5 10％甘油中)、ggg-peg
2-芳基叠氮化物(171μl，140μl，20mm于mq中)、cacl2(140μl，100mm于mq中)和tbs ph 7.5(355μl)。将反应物在37℃下孵育过夜，随后在akta explorer-100(ge healthcare)上的his-trap excel 1ml柱(ge healthcare)上纯化。将柱用缓冲液a(20mm tris，200mm nacl，20mm咪唑，ph 7.5)平衡，并将样品以1ml/min上样。收集流出物，质谱分析显示一种主要产物(观测质量27592da)对应于抗4-1bb-叠氮化物pf09。实施例134.用分选酶a将ggg-il15rα-il15(208)中的芳基叠氮化物-peg
11-lpetgg(175)进行n-末端分选以获得芳基叠氮化物-peg
11-ggg-il15rα-il15(pf13)向含有蛋白质208(2000μl，140μm于tbs ph 7.5中)的溶液中加入tbs ph 7.5(2686μl)、cacl2(559μl，100mm)、175(83μl，50mm于dmso中)和分选酶a(260μl，537μm于tbs ph 7.5中)并在37℃下孵育3小时(避光)。孵育后，使用ni-nta珠(beads)(500μl珠＝1ml悬浮液)从溶液中除去分选酶a。将溶液在4℃下用ni-nta珠在滚道上孵育过夜(on)，然后将溶
液离心(5分钟，7.000xg)。通过分离沉淀和上清液来收集含有产物pf13的上清液。将反应混合物装载到akta purifier-10(ge healthcare)上的superdex 7510/300gl柱(ge healthcare)上，使用pbs ph 7.4作为流动相且流速为0.5ml/min。质谱分析显示重量为24193da(预期质量：24193da)，对应于pf13。实施例135.bcn-peg12-氨氧基(xl13)至syr-(g4s)
3-il15rα-il15(pf26)的n-末端肟连接以获得bcn-peg
12-syr-(g4s)
3-il15rα-il15(pf14)在标记pf26之前，使用高碘酸钠氧化n-末端丝氨酸。向含有蛋白质pf26的溶液(700μl，70μm于pbs ph 7.4中)中加入pbs ph 7.4(286μl)、naio4(0.98μl，100mm于mq中)和l-甲硫氨酸(5μl，100mm于mq中)并在4℃下孵育5分钟。质谱分析显示24114和24130da的重量对应于24114(醛)和24132da(水合物)的预期质量。使用pd-10脱盐柱除去过量的naio4和l-甲硫氨酸。使用amicon离心过滤器0.5，mwco 10kda(merck-millipore)将氧化的pf26浓缩至50μm的浓度。向含有氧化的pf26(416μl，50μm于pbs ph 7.4中)的溶液中加入xl13(41.6μl，50mm于dmso中)。在37℃下孵育过夜后，使用填充有sephadexg-25树脂(cytiva)的pd-10脱盐柱纯化反应混合物，并使用pbs洗脱。质谱分析显示的重量为25024da(预期质量：25042da)，对应于pf14。实施例136.通过spanc的il15rα-il15 pf26的n-末端bcn官能化以获得bcn-il15rα-il15 pf15向il15rα-il15 pf26(2.9mg，50μm于pbs中)中加入2当量naio4(4.8μl的50mm储备液于pbs中)和10当量l-甲硫氨酸(12.5μl的100mm储备液于pbs中)。将反应物在4℃下孵育5分钟。质谱分析显示丝氨酸氧化成相应的醛和水合物(观测质量24114da和24132da)。使用填充有sephadexg-25树脂(cytiva)的pd-10脱盐柱纯化反应混合物并使用pbs洗脱。向洗脱液(2.6mg，50μm于pbs中)中加入160当量n-甲基羟胺.hcl(340μl的50mm储备液于pbs中)和160当量对甲氧基苯胺(340μl的50mm储备液于pbs中)。将反应混合物在25℃下孵育3小时。质谱分析显示一个单峰(观测质量24143da)，对应于n-甲基-亚胺-氧化物-il15。使用填充有sephadexg-25树脂(cytiva)的pd-10脱盐柱纯化反应混合物并使用pbs洗脱。向洗脱液(2.47mg，50μm于pbs中)中加入25当量双-bcn-peg
11
(105)(51μl，50mm于dmso中)和150μl dmf。将反应物在室温下孵育过夜。使用superdex75 10/300柱(cytiva)纯化反应物。质谱分析显示一个主峰，对应于bcn-il15rα-il15 pf15(观测质量25041da)。实施例137.il15 pf18的n-末端重氮转移反应以获得叠氮基-il15pf19向il15 pf18(5mg，50μm于0.1m tea缓冲液ph 8.0中)中加入咪唑-1-磺酰叠氮化物盐酸盐(708μl，50mm于50mm naoh中)并在37℃下孵育过夜。使用hiprep
tm 26/10脱盐柱(cytiva)纯化反应物。质谱分析显示一个主峰，对应于叠氮基-il15 pf19(观测质量14147da)。实施例138.使用2pca在syr-(g4s)
3-il15(pf18)中n-末端并入四嗪-peg
12-2pca(xl10)以获得四嗪-peg
12-syr-(g4s)
3-il15(pf21)向syr-(g4s)
3-il15(pf18)(1052μl，50μm于pbs中)中加入20当量四嗪-peg12-2pca(xl10)(112μl的50mm储备液于dmso中)和4359μl pbs。将反应物在37℃下孵育过夜。使用离心过滤(amicon ultra-0.5,ultracel-10membrane,millipore)将样品浓缩《1ml，并装载到akta purifier-10(ge healthcare)上的superdex 75 10/300gl柱(ge healthcare)上，使
用pbs ph 7.4作为流动相且流速为0.5ml/min。质谱分析显示重量为24121da，对应于起始材料syr-(g4s)
3-il15(pf18)(预期质量：14121da)，质量为15093da，对应于产物pf21(预期质量：15094da)。实施例139.三-bcn(150)至hokt3-peg
2-芳基叠氮化物pf03的缀合以获得双-bcn-hokt3 pf22向hokt3-peg
2-芳基叠氮化物pf03(87μl，1mg，411μm于pbs ph 7.4中)的溶液中加入pbs ph 7.4(559μl)、dmf(49μl)和化合物150(22μl，40mm溶液于dmf中，25当量)。将反应物在室温下孵育过夜。质谱分析显示一种主要产物(观测质量29171da)，对应于双-bcn-hokt3 pf22。在akta purifier-10(ge healthcare)上的superdex75 10/300gl柱(ge healthcare)上使用pbs ph 7.4作为流动相纯化反应物。实施例140.用分选酶a将ggg-双-bcn 176c-末端分选至hokt3 200以获得双-bcn-hokt3 pf23通过用分选酶a(由seq id no:2识别)的c-末端分选制备本发明的生物缀合物。向hokt3 200(272μl，0.7mg，83μm于pbs ph 7.4中)的溶液中加入分选酶a(25μl，250μg，456μm于tbs ph 7.5 10％甘油中)、ggg-双-bcn(176μl，45μl，20mm于dmso中)、cacl2(45μl，100mm于mq中)和tbs ph 7.5(64μl)。将反应物在37℃下孵育过夜。质谱分析显示一种主要产物(观测质量28772da)，对应于双-bcn-hokt3 pf23。在akta purifier-10(ge healthcare)上的superdex75 10/300gl柱(ge healthcare)上使用pbs ph 7.4作为流动相纯化反应物。实施例141.使用张力促进的(strain-promoted)炔烃-硝酮环加成在syr-(g4s)
3-il15rα-il15(pf26)中n-末端并入双马来酰亚胺-peg
6-bcn(xl01)以获得双马来酰亚胺-peg
6-syr-(g4s)
3-il15rα-il15(pf28)向syr-(g4s)
3-il15rα-il15 pf26(2560μl，50μm于pbs中)中加入2当量naio4(5.12μl的50mm储备液于pbs中)和10当量l-甲硫氨酸(12.8μl的100mm储备液于pbs中)。将反应物在4℃下孵育5分钟。质谱分析显示丝氨酸氧化成相应的醛和水合物(观测质量24114da和24132da)。使用填充有sephadexg-25树脂(cytiva)的pd-10脱盐柱纯化反应混合物并使用pbs洗脱。向浓缩的洗脱液(2450μl，50μm于pbs中)中加入160当量n-甲基羟胺.hcl(196μl的100mm储备液于pbs中)和160当量对甲氧基苯胺(196μl的100mm储备液于pbs中)。将反应混合物在25℃下孵育3小时。质谱分析显示一个单峰(观测质量24143da)，对应于n-甲基-亚胺-氧化物-il15rα-il15。使用填充有sephadexg-25树脂(cytiva)的pd-10脱盐柱纯化反应混合物并使用pbs洗脱。向浓缩的洗脱液(1134μl，50μm于pbs中)中加入25当量双马来酰亚胺-peg
6-bcn(xl01)(28.5μl，50mm于dmso中)和86.5μl dmf。将反应物在室温下孵育过夜(o/n)。使用填充有sephadexg-25树脂(cytiva)的pd-10脱盐柱纯化反应混合物并使用pbs洗脱。使用离心过滤(amicon ultra-0.5,ultracel-10 membrane,millipore)进行另外的洗涤，用400μl pbs洗涤6次，以除去剩余的双马来酰亚胺-peg
2-bcn(xl01)。质谱分析显示期望的双马来酰亚胺-bcn-syr-(g4s)
3-il15rα-il15(pf28)(观测质量25145da，预期质量25144da)。实施例142.使用张力促进的叠氮化物-炔烃环加成在n
3-syr-(g4s)
3-il15(pf19)中n-末端并入三-bcn(150)以获得双-bcn-syr-(g4s)
3-il15(pf29)向n
3-il15 pf19(706μl，50μm于pbs中)中加入4当量三-bcn(150)(3.5μl的40mm储
备液于dmf中)和67μl dmf。将反应物在室温下孵育过夜。质谱分析证实双-bcn-syr-(g4s)
3-il15 pf29的形成(观测质量15453da，预期质量15453da)。使用填充有sephadexg-25树脂(cytiva)的pd-10脱盐柱纯化反应混合物并使用pbs洗脱。使用离心过滤器(amicon ultra-0.5,ultracel-10 membrane,millipore)进行另外的洗涤，用400μl pbs洗涤6次，以除去剩余的三-bcn(150)。实施例143.曲妥珠单抗至曲妥珠单抗-(galnaz)2(trast-v1b)的酶改造将曲妥珠单抗(5mg,22.7mg/ml)与endosh(如pct/ep2017/052792中所述(1％w/w))在室温下孵育1小时，然后加入β(1,4)-gal-t1(y289l)(2％w/w)和udp-galnaz(相比于igg 15当量)于10mm mncl2和tbs中，在30℃下保持16小时。加入这些组分后曲妥珠单抗的最终浓度为19.6mg/ml。使用prota柱(5ml,mabselect sure,cytiva)纯化官能化igg。在装载反应混合物后，用tbs洗涤柱。用0.1m naoac ph 3.5洗脱igg，并用2.5m tris-hcl ph 7.2中和。在透析至pbs 3次后，使用vivaspin turbo 4超滤装置(sartorius)将官能化的曲妥珠单抗浓缩至17.2mg/ml。ides处理后样品的质谱分析显示一种主要的fc/2产物(观测质量24380da)对应于预期的产物trast-v1b。实施例144.曲妥珠单抗至曲妥珠单抗-(galnaz)2(trast-v2)的酶改造将曲妥珠单抗(5mg，22.7mg/ml)与β(1,4)-gal-t1(y289l)(2％w/w)和udp-galnaz(相比于igg 20当量)于10mm mncl2和tbs中在30℃下孵育16小时。加入各组分后，曲妥珠单抗的最终浓度为19mg/ml。将官能化的igg透析至pbs三次并使用vivaspin turbo 4超滤装置(sartorius)浓缩至19.45mg/ml。ides处理后样品的质谱分析显示两种主要的fc/2产物(观测质量25718da，约总fc/2的50％)，其对应于具有2
×
galnaz的g0f，以及副产物(观测质量25636da，约总fc/2的50％)，其对应于具有1
×
galnaz的g1f。实施例145.曲妥珠单抗至曲妥珠单抗-(galnprossme)2(trast-v5a)的酶改造将曲妥珠单抗(5mg，22.7mg/ml)与endosh(如pct/ep2017/052792中所述)(1％w/w)孵育1小时，随后加入tngalnact(以cho表示)(10％w/w)和udp-galnprossme(318，相比于igg 40当量)于10mm mncl2和tbs中在30℃下保持16小时。加入各组分后，曲妥珠单抗的最终浓度为12.5mg/ml。使用prota柱(5ml，mabselect sure，cytiva)纯化官能化的igg。在装载反应混合物后，用tbs洗涤柱。用0.1m naoac ph 3.5洗脱igg，并用2.5m tris-hcl ph 7.2中和。在透析至pbs三次后，使用vivaspin turbo 4超滤装置(sartorius)将官能化的曲妥珠单抗浓缩至17.4mg/ml。ides处理后样品的质谱分析显示一种主要的fc/2产物(观测质量24430da)对应于预期的产物(trast-v5a)。实施例146.曲妥珠单抗至曲妥珠单抗-(galnac-lev)2(trast-v8)的酶改造将曲妥珠单抗(5mg，22.7mg/ml)与endosh(如pct/ep2017/052792中所述)(1％w/w)孵育1小时，随后加入β(1,4)-gal-t1(y289l)(10％w/w)和根据wo2014/065661a1中的实施例9-17制备的udp-galnac-lev(11g，x＝1)(相比于igg 75当量)于10mm mncl2和tbs中在30℃下保持16小时。加入各组分后，曲妥珠单抗的最终浓度为14.4mg/ml。使用prota 柱(5ml，mabselect sure，cytiva)纯化官能化的igg。在装载反应混合物后，用tbs洗涤柱。用0.1m naoac ph 3.5洗脱igg，并用2.5m tris-hcl ph 7.2中和。在透析至pbs三次后，使用vivaspin turbo 4超滤装置(sartorius)将官能化的曲妥珠单抗浓缩至10.6mg/ml。ides处理后样品的质谱分析显示一种主要的fc/2产物(观测质量24393da)对应于预期的产物
(trast-v8)。实施例147.曲妥珠单抗至曲妥珠单抗-(galnac-alkyne)2(trast-v9)的酶改造将曲妥珠单抗(5mg，22.7mg/ml)与endosh(如pct/ep2017/052792中所述)(1％w/w)孵育1小时，随后加入β(1,4)-gal-t1(y289l)(2％w/w)和根据wo2014/065661a1中的实施例9-16制备的udp-galnac-alkyne(11f，x＝1)(相比于igg 15当量)于10mm mncl2和tbs中在30℃下保持16小时。加入各组分后，曲妥珠单抗的最终浓度为19.6mg/ml。使用prota柱(5ml，mabselect sure，cytiva)纯化官能化的igg。在装载反应混合物后，用tbs洗涤柱。用0.1m naoac ph 3.5洗脱igg，并用2.5m tris-hcl ph 7.2中和。在透析至pbs三次后，使用vivaspin turbo 4超滤装置(sartorius)将官能化的曲妥珠单抗浓缩至12.1mg/ml。ides处理后样品的质谱分析显示一种主要的fc/2产物(观测质量24379da)对应于预期的产物trast-v9。实施例148.曲妥珠单抗(6-n
3-galnac)
2 205与201的缀合以获得缀合物206通过bcn修饰的hokt3 201与叠氮化物修饰的曲妥珠单抗205的缀合制备本发明的生物缀合物。向根据wo2016170186制备的曲妥珠单抗-(6-n
3-galnac)2溶液(205，2μl，75μg，250μm于pbs ph 7.4中)中加入hokt3-peg
2-bcn 201(9.9μl，28μg，101μm于pbs ph 7.4中)。将反应物在室温下孵育过夜。fabricator
tm
消化的样品的质谱分析显示两种主要产物(观测质量24368da和52196da，各约50％)，分别对应于叠氮基修饰的fc/2-片段和缀合物206。实施例149.将his
6-ssgenlyfq-ggg-il15rα-il15克隆到pet32a表达载体中il15rα-il15融合蛋白207被设计为具有n-末端his-标签(hhhhhh)、tev蛋白酶识别序列(ssgenlyfq)和n-末端分选酶a识别序列(ggg)。从genscript获得pet32a-载体，其含有编码his
6-ssgenlyfq-ggg-il15rα-il15(seq id no:3)的位于碱基对158和692之间的dna序列，从而除去硫氧还蛋白编码序列。实施例150.his
6-ssgenlyfq-ggg-il15rα-il15(207)的大肠杆菌表达和包涵体分离his
6-ssgenlyfq-ggg-il15rα-il15 207的表达始于将质粒(pet32a-il15rα-il15)转化到bl21细胞(novagen)中。下一步骤是用bl21细胞接种500ml培养物(lb培养基 氨苄青霉素)。当od600达到0.7时，用1mm iptg(500μl的1m储备液)诱导培养物。在37℃下诱导4小时后，通过离心沉淀培养物。将从500ml培养物中获得的细胞沉淀溶解于25ml具有625单位核酸酶(benzonase)的bugbuster
tm
中，并在室温下在滚道上孵育20分钟。裂解后，通过离心(20分钟，12000xg，4℃)将不溶级分与可溶级分分离。将不溶部分溶解于具有溶菌酶的25ml bugbuster
tm
(最终浓度：200μg/ml)中，并在滚道上孵育5分钟。然后将溶液用6体积的1：10稀释的bugbuster
tm
稀释并在4℃下以9000xg离心15分钟。通过使用匀浆器将沉淀重悬于250ml 1：10稀释的bugbuster
tm
中，并在4℃下以9000xg离心15分钟。最后一步重复3次。实施例151.从分离的包涵体中重折叠his
6-ssgenlyfq-ggg-il15rα-il15 207将含有his
6-ssgenlyfq-ggg-il15rα-il15 207的纯化的包涵体在4℃下在25ml变性缓冲液(5m胍，0.3m亚硫酸钠)和2.5ml 50mm 2-硝基-5-磺基苯甲酸二钠中磺化过夜。用10倍体积的冷milli-q稀释溶液并离心(在8000xg下离心10分钟)。使用匀浆器将沉淀溶解在125ml冷milli-q中并离心(在80000x g下保持10分钟)。最后一步重复3次。纯化的his
6-ssgenlyfq-ggg-il15rα-il15 207在5m胍中变性并稀释至1mg/ml蛋白质浓度。使用直径为
7.4中)中加入化合物125(2.5μl，0.8mm溶液于dmf中，相比于igg 2当量)。将反应物在室温下孵育1天，然后使用离心过滤器(amicon ultra-0.5ml mwco 10kda，merck millipore)将缓冲液交换至pbs ph 7.4。ides消化的样品的质谱分析显示一种主要产物(计算质量49184da，观测质量49184da)，对应于分子内交联的曲妥珠单抗衍生物216。hplc-sec显示《4％聚集，因此排除分子间交联。实施例161.曲妥珠单抗-(叠氮化物)2与二价接头145的分子内交联以得到217向曲妥珠单抗-(6-叠氮基galnac)2的溶液(320μl，2mg，5.56mg/ml于pbs ph 7.4中)中加入化合物145(80μl，1.66mm溶液于dmf中，相比于igg 10当量)。将反应物在室温下孵育1天，然后使用离心过滤器(amicon ultra-0.5ml mwco 10kda，merck millipore)将缓冲液交换至pbs ph 7.4。ides消化的样品的质谱分析显示一种主要产物(计算质量49796da，观测质量49807da)，对应于分子内交联的曲妥珠单抗衍生物217。hplc-sec显示《4％聚集，因此排除分子间交联。实施例162.曲妥珠单抗-(叠氮化物)2与二价接头-有效载荷构建体137的分子内交联以得到dar1 adc 218向曲妥珠单抗-(6-叠氮基galnac)2的溶液(37.5μl，250μg，6.67mg/ml于pbs ph 7.4中)中加入化合物137(12.5μl，0.67mm溶液于dmf中，相比于igg 5当量)。将反应物在室温下孵育1天，然后使用离心过滤器(amicon ultra-0.5ml mwco 10kda，merck millipore)将缓冲液交换至pbs ph 7.4。ides消化的样品的质谱分析显示一种主要产物(计算质量50464da，观测质量50474da)，对应于通过分子内交联获得的缀合的adc 218。hplc-sec显示《4％聚集，因此排除分子间交联。rp-hplc显示fc/2(t
r 6.099)、fc-毒素(t
r 8.275，对应于总fc/2片段的82.4％)和fab(t
r 9.320)片段。实施例163.曲妥珠单抗-(叠氮化物)2与二价接头-有效载荷构建体131的分子内交联以得到dar1 adc 219向曲妥珠单抗-(6-叠氮基galnac)2的溶液(37.5μl，250μg，6.67mg/ml于pbs ph 7.4中)中加入化合物131(12.5μl，0.67mm溶液于dmf中，相比于igg 5当量)。将反应物在室温下孵育1天，然后使用离心过滤器(amicon ultra-0.5ml mwco 10kda，merck millipore)将缓冲液交换至pbs ph 7.4。经ides消化的样品的质谱分析显示一种主要产物(计算质量50638da，观测质量50649da)，对应于通过分子内交联获得的adc 219。hplc-sec显示《4％聚集，因此排除分子间交联。rp-hplc显示fc/2(t
r 6.082)、fc-毒素(t
r 9.327，对应于总fc/2片段的76.7％)和fab(t
r 9.347)片段。实施例164.曲妥珠单抗-(叠氮化物)2与二价接头-有效载荷构建体139的分子内交联以得到dar1 adc 220向曲妥珠单抗-(6-叠氮基galnac)2(37.5μl，250μg，6.67mg/ml于pbs ph 7.4中)中加入化合物139(12.5μl，0.67mm的溶液于dmf中，相比于igg 5当量)。将反应物在室温下孵育1天，然后使用离心过滤器(amicon ultra-0.5ml mwco 10kda，merck millipore)将缓冲液交换至pbs ph 7.4。ides消化的样品的质谱分析显示一种主要产物(计算质量50392da，观测质量50402da)，对应于通过分子内交联获得的adc 220。hplc-sec显示《4％聚集，因此排除分子间交联。rp-hplc显示fc/2(t
r 6.062)、fc-毒素(t
r 8.548，对应于总fc/2片段的89.5％)和fab(t
r 9.295)片段。
实施例164.曲妥珠单抗衍生物217(包含单个bcn)与四嗪修饰的抗cd3免疫细胞接合物204的分子内交联以得到具有2：1分子形式的t细胞接合物221向217的溶液(8μl，141μg，17.7mg/ml于pbs ph 7.4中)中加入hokt3-peg
4-四嗪(204，13.15μl，280μg，21.45mg/ml于pbs ph 7.4中，相比于igg 2当量)。ides的样品的质谱分析显示一种主要产物(计算质量77664da，观测质量77647da)，对应于缀合的fc-peg
4-hokt3(221)。实施例165.双-叠氮基-利妥昔单抗与三价接头145的分子内交联以得到bcn-利妥昔单抗rit-v1a-145向双-叠氮基-利妥昔单抗rit-v1a的溶液(494μl，30mg，60.7mg/ml于pbs ph 7.4中)中，根据wo2016170186制备，加入pbs ph 7.4(2506μl)、丙二醇(2980μl)和三价接头145(20μl，40mm溶液于dmf中，相比于igg 4.0当量)。将反应物在室温下孵育过夜，然后在akta purifier-10(ge healthcare)上的superdex200 10/300 gl柱(ge healthcare)上使用pbs ph 7.4作为流动相纯化。还原sds-page显示一种主要的hc产物，对应于交联的重链(参见图18，右板，泳道3)，表明rit-v1a-145的形成。此外，非还原sds-page在与rit-v1a相同的高度附近显示一种主要条带(参见图18，左板，泳道3)，表明仅发生分子内交联。实施例166.双-叠氮基-b12 b12-v1a与三价接头145的分子内交联以得到bcn-b12 b12-v1a-145向双-叠氮基-b12 b12-v1a的溶液(415μl，4mg，9.6mg/ml于pbs ph 7.4中)中，根据wo2016170186制备，加入丙二醇(412μl)和三价接头145(2.7μl，40mm溶液于dmf中，相比于igg 4.0当量)。将反应物在室温下孵育过夜，然后在akta purifier-10(ge healthcare)上的superdex200 10/300gl柱(ge healthcare)上使用pbs ph 7.4作为流动相纯化。ides消化的样品的rp-hplc分析显示b12-v1a-145的形成(参见图19)。实施例167.曲妥珠单抗-galnprossme trast-v5a与双马来酰亚胺-bcn xl01的分子内交联将曲妥珠单抗-galnprossme(trast-v5a)(1.2mg，10mg/ml于pbs 10mm edta中，trast-v5a)与tcep(7.8μl，10mm于mq中)在37℃下孵育2小时。将还原的抗体使用离心过滤器(amicon ultra-0.5mlmwco 10kda，merck millipore)用pbs 10mm edta离心过滤并稀释至100μl。随后加入dha(6.5μl，10mm于mq：dmso(9：1)中)并将反应物在室温下孵育3小时。向一部分反应混合物(82μl，0.8mg)中加入双马来酰亚胺-bcn xl01(8μl，2于dmf中)，然后在室温下孵育1小时。使用离心过滤器(amicon ultra-0.5ml mwco 10kda，merck millipore)将缀合物离心过滤至pbs。dtt处理的样品的rp-hplc分析显示转化为缀合物trast-v5b-xl01(参见图20)。实施例168.曲妥珠单抗galnprossme trast-v5a与双马来酰亚胺-叠氮化物xl02的分子内交联将曲妥珠单抗galnprossme(1.5mg，10mg/ml于pbs 10mm edta中，trast-v5a)与tcep(9.3μl，10mm于mq中)在37℃下孵育2小时。将还原的抗体使用离心过滤器(amicon ultra-0.5mlmwco 10kda，merck millipore)用pbs 10mm edta离心过滤并稀释至150μl。随后加入dha(9.3μl，10mm于dmso中)并将反应物在室温下孵育3小时。向一部分反应物(100μl，1mg抗体)中加入双-马来酰亚胺叠氮化物xlo2(10μl，4mm于dmf中)，然后在室温下孵育1
小时。使用离心过滤器(amicon ultra-0.5ml mwco 10kda，merck millipore)将缀合物离心过滤至pbs，并随后在rp-hplc和sds-page凝胶上分析(参见图21和22)。dtt处理的缀合物的rp-hplc分析显示转化为缀合物trast-v5b-xl02。实施例169.通过肟连接将双羟胺-bcn xl06缀合至trast-v8使用vivaspin turbo 4超滤装置(sartorius)将trast-v8旋转过滤至0.1m柠檬酸钠ph 4.5并浓缩至16.45mg/ml。将trast-v8(1mg，8.1mg/ml于0.1m柠檬酸钠ph 4.5中)与双羟胺-bcn xl06(50μl，200当量于dmf中)和对甲氧基苯胺(26.7μl，200当量于0.1m柠檬酸钠ph 4.5中)一起在室温下孵育过夜。sds-page凝胶分析显示形成trast-v8-xl06(参见图22)。将反应物旋转过滤至pbs，并使用vivaspin turbo 4超滤装置(sartorius)浓缩至16.85mg/ml。实施例170.双-叠氮基-曲妥珠单抗trast-v1a与双-bcn-tco xl11的分子内交联以得到tco-曲妥珠单抗trast-v1a-xl11向双-叠氮基-曲妥珠单抗trast-v1a的溶液(36μl，2mg，56.1mg/ml于pbs ph 7.4中)中，根据wo2016170186，加入pbs ph 7.4(164μl)、丙二醇(195μl)和双-bcn-tco xl11(5.3μl，10mm溶液于dmf中，相比于igg 4.0当量)。将反应物在室温下孵育过夜，然后使用离心过滤器(amicon ultra-0.5ml mwco 10kda，merck millipore)将缓冲液交换至pbs ph 7.4。还原sds-page显示两种主要的hc产物，对应于非缀合重链和交联重链(参见图23，右板，泳道2)，表明部分转化为trast-v1a-xl11。此外，非还原sds-page在trast-v1a的高度显示一个主条带(参见图23，左板，泳道2)，表明仅发生分子内交联。实施例171.双-叠氮基-利妥昔单抗rit-v1a与双-bcn-tco xl11的分子内交联以得到tco-利妥昔单抗rit-v1a-xl11向双-叠氮基-利妥昔单抗rit-v1a的溶液(37μl，2mg，54.5mg/ml于pbs ph 7.4中)中加入pbs ph 7.4(163μl)、丙二醇(195μl)和双-bcn-tco xl11(5.3μl，10mm溶液于dmf中，相比于igg 4.0当量)。将反应物在室温下孵育过夜，然后使用离心过滤器(amicon ultra-0.5ml mwco 10kda，merck millipore)将缓冲液交换至pbs ph7.4。还原sds-page显示两种主要的hc产物，对应于非缀合重链和交联重链(参见图23，右板，泳道6)，表明部分转化为rit-v1a-xl11。此外，非还原sds-page在rit-v1a的高度显示一个主条带(参见图23，左板，泳道2)，表明仅发生分子内交联。实施例172.trast-v1b与二价接头-有效载荷构建体双-bcn-mmae137的分子内交联以得到dar1 adc trast-v1b-137(a)向trast-v1b溶液(15μl，150μg，10mg/ml于pbs ph 7.4中)中加入双-bcn-mmae(137μl，0.13mm于pg中的溶液，相比于igg 2当量)。将反应物在室温下孵育16小时，然后使用离心过滤器(amicon ultra-0.5ml mwco 10kda，merck millipore)将缓冲液交换至pbs ph7.4。ides消化的样品的质谱分析显示一种主要产物(观测质量50498da)，对应于通过分子内交联获得的缀合的adc trast-v1b-137。实施例173.trast-v1a与双-bcn-mmae ld01的分子内交联以得到dar1 adc trast-v1a-ld01(a)向trast-v1a溶液(1.5ml，5mg，6.7mg/ml于pbs ph 7.4中)中加入双-bcn-mmae(ld01，0.5ml，0.53mm溶液于dmf中，相比于igg 4当量)。将反应物在室温下孵育16小时，然
v1a-ld05(a)向trast-v1a的溶液(15μl，150μg，10mg/ml于pbs ph 7.4中)中加入双-bcn-cal(ld05，15μl，0.67mm于pg中的溶液，相比于igg 10当量)。将反应物在室温下孵育16小时，然后使用离心过滤器(amicon ultra-0.5ml mwco 10kda，merck millipore)将缓冲液交换至pbs ph 7.4。经ides消化的样品的质谱分析显示一种主要产物(观测质量51617da)，对应于通过分子内交联获得的缀合的adc trast-v1a-ld05。实施例180.trast-v1a与双-bcn-pnu ld06的分子内交联以得到dar1 adc trast-v1a-ld06(a)向trast-v1a的溶液(1.44ml，12mg，8.3mg/ml于pbs ph 7.4中)中加入双-bcn-pnu(ldo6，0.96ml，0.25mm于pg中的溶液，相比于igg 3当量)。将反应物在室温下孵育16小时，然后使用离心过滤器(amicon ultra-0.5ml mwco 10kda，merck millipore)将缓冲液交换至pbs ph 7.4。ides消化的样品的质谱分析显示一种主要产物(观测质量50835da)，对应于通过分子内交联获得的缀合的adc trast-v1a-ld06。实施例181.trast-v1a与双-bcn-mmae ld07的分子内交联以得到dar1 adc trast-v1a-ld07(a)向trast-v1a的溶液(15μl，150μg，10mg/ml于pbs ph 7.4中)中加入双-bcn-mmae(ld07，15μl，0.27mm溶液于pg中，相比于igg 3当量)。将反应物在室温下孵育16小时，然后使用离心过滤器(amicon ultra-0.5ml mwco 10kda，merck millipore)将缓冲液交换至pbs ph 7.4。ides消化的样品的质谱分析显示一种主要产物(观测质量50940da)，对应于通过分子内交联获得的缀合的adc trast-v1a-ld07。实施例182trast-v1a与双-bcn-mmae ld08的分子内交联以得到dar1 adc trast-v1a-ld08(a)向trast-v1a的溶液(15μl，150μg，10mg/ml于pbs ph 7.4中)中加入双-bcn-mmae(ld08，15μl，0.13mm溶液于pg中，相比于igg 2当量)。将反应物在室温下孵育16小时，然后使用离心过滤器(amicon ultra-0.5ml mwco 10kda，merck millipore)将缓冲液交换至pbs ph 7.4。ides消化的样品的质谱分析显示一种主要产物(观测质量51001da)，对应于通过分子内交联获得的缀合的adc trast-v1a-ld08。实施例183.曲妥珠单抗-galnprossme trast-v5a与双马来酰亚胺-mmae ld09(a)的分子内交联将曲妥珠单抗-galnprossme(trast-v5a)(1.2mg，10mg/ml于pbs 10mm edta中，trast-v5a)与tcep(7.8μl，10mm于mq中)在37℃下孵育2小时。将还原的抗体使用离心过滤器(amicon ultra-0.5mlmwco 10kda，merck millipore)用pbs 10mm edta离心过滤并稀释至120μl。随后加入dha(7.8μl，10mm于mq：dmso(9：1)中)并将反应在室温下孵育3小时。向一部分反应混合物(0.1mg，10μl)中加入双马来酰亚胺-mmae ld09(2μl，2mm于dmf中)，随后在室温下孵育2小时。使用离心过滤器(amicon ultra-0.5ml mwco 10kda，merck millipore)将缀合物离心过滤至pbs。dtt处理的样品的rp-hplc分析显示以65％形成缀合物trast-v5b-ld09的(参见图26)，sds-page凝胶分析证实该结论(参见图27)。实施例184.双-叠氮基-mmaf ld10与trast-v9经由cuaac(a)的缀合用trast-v9(0.2mg，16.5μl 12.1mg/ml)、pbs(11μl)、双-叠氮基-mmaf(ld10，5.3μ
l 1mm于dmf中)和dmf(2.6μl)制备溶液。在单独的小瓶(vail)中制备含有硫酸铜(71μl，15mm)、thtpa配体(13μl，160mm)、氨基胍(53μl，100mm)和抗坏血酸钠(40μl，400mm)的预混物。将预混物封盖，涡旋并使其静置10分钟。将预混合物(4.2μl)加入到抗体溶液中并将反应物孵育2小时，然后加入pbs 1mm edta(300μl)。使用离心过滤器(amicon ultra-0.5mlmwco 10kda，merck millipore)将稀释的溶液用pbs离心过滤。ides处理后样品的质谱分析显示一种主要的fc/2产物(观测质量50413da)对应于预期的产物trast-v9-ld10。sds-page凝胶分析证实该结论。实施例185.bcn-mmae ld11与trast-v5b-xl02经由spaac(a)的缀合将trast-v5b-xl02(0.1mg，10mg/ml于pbs中)与bcn-mmae ld11(1.3μl，5mm于dmf中)在室温下孵育过夜。rp-hplc分析显示trast-v5b-xl02-ld11的形成，并且sds-page凝胶分析证实该结论。实施例186.叠氮基-mmaf ld12与trast-v5b-xl01经由spaac(a)的缀合将trast-v5b-xl01(0.1mg，10mg/ml于pbs中)与叠氮基-mmaf ld12(1.3μl，5mm于dmf中)在室温下孵育过夜。rp-hplc分析显示以45％形成trast-v5b-xl01-ld12(参见图20)，sds-page凝胶分析证实该结论(参见图25)。实施例187.叠氮基-mmaf ld12至trast-v8-xl06经由spaac(a)的缀合向trast-v8-xl06(8.9μl，150μg，16.85mg/ml于pbs ph 7.4中)的溶液中加入叠氮基-mmaf(ld12，1.57μl，25.5mm溶液于dmf中，相比于igg 40当量)。将反应物在室温下孵育16小时，然后使用离心过滤器(amicon ultra-0.5ml mwco 10kda，merck millipore)将缓冲液交换至pbs ph 7.4。ides消化的样品的质谱分析显示一种主要产物(观测质量51244da)，对应于通过分子内交联获得的缀合的adc trast-v8-xl06-ld12。实施例188.trast-v1a与双-bcn-mmae ld13的分子内交联以得到dar1 adc trast-v1a-ld13(a)向trast-v1a溶液(22.5μl，150μg，6.7mg/ml于pbs ph 7.4中)中加入双-bcn-mmae(ld13，7.5μl，1.33mm溶液于dmf中，相比于igg 10当量)。将反应物在室温下孵育16小时，然后使用离心过滤器(amicon ultra-0.5ml mwco 10kda，merck millipore)将缓冲液交换至pbs ph 7.4。ides消化的样品的质谱分析显示一种主要产物(观测质量50807da)，对应于通过分子内交联获得的缀合的adc trast-v1a-ld13。实施例189.bcn-il15rα-il15 pf15与trast-v5b-xl02经由spaac的缀合(p:a比率1：1)将trast-v5b-xl02(0.1mg，10mg/ml于pbs中)与bcn-il15rα-il15 pf15(12.4μl，6.7mg/ml，相比于igg 3当量bcn-标记的il15rα-il15)在室温下过夜。rp-hplc分析显示trast-v5b-xl02-pf15的形成(参见图21)，sds-page凝胶分析证实了这一结论(参见图24)。实施例190.叠氮基-il15 pf19与trast-v5b-xl01经由spaac的缀合(p:a比率1：1)将trast-v5b-xl01(0.1mg，12.9mg/ml于pbs中)与叠氮基-il15pf19(5.6μl，7.2mg/ml)在室温下孵育过夜。sds-page凝胶分析显示预期产物trast-v5b-xl01-pf19的形成(参见图25)。实施例191.hokt3-四嗪pf02与trast-v5b-xl01经由spaac的缀合(p:a比率1：1)将trast-v5b-xl01(0.1mg，12.9mg/ml于pbs中)与hokt3-四嗪pf02(8.6μl，7.7mg/
healthcare)上使用pbs ph 7.4作为流动相纯化。非还原sds-page分析显示一种由与单个hokt3缀合的抗体组成的主要产物(参见图27，泳道4)，从而证实b12-v1a-145-pf01的形成。实施例198.hokt3-peg
4-四嗪204与tco-曲妥珠单抗trast-v1a-xl11的缀合得到具有2：1分子形式的t细胞接合物trast-v1a-xl11-204向tco-曲妥珠单抗-v1a-xl11的溶液(5.7μl，100μg，117μm于pbs ph 7.4中)中加入hokt3-peg
4-四嗪204(5μl，38μg，269μm于pbs ph 6.5中，相比于igg 2.0当量)。将反应物在室温下孵育过夜。非还原sds-page分析显示对应于非缀合抗体和缀合至单个hokt3的抗体的两种主要产物(参见图23，左板，泳道3)，从而证实trast-v1a-xl11-204的形成。此外，还原sds-page证实okt3与含有tco反应性柄的交联重链缀合(参见图23，右板，泳道3)。实施例199.hokt3-peg
4-四嗪204与tco-利妥昔单抗rit-v1a-xl11的缀合得到具有2：1分子形式的t细胞接合物rit-v1a-xl11-204向tco-利妥昔单抗rit-v1a-xl11的溶液(56.3μl，100μg，106μm于pbs ph 7.4中)中加入hokt3-peg
4-四嗪204(5μl，38μg，269μm于pbs ph 6.5中，相比于igg 2.0当量)。将反应物在室温下孵育过夜。非还原sds-page分析显示对应于非缀合抗体和缀合至单个hokt3的抗体的两种主要产物(参见图23，左板，泳道7)，从而证实rit-v1a-xl11-204的形成。此外，还原sds-page证实okt3与含有tco反应性柄的交联重链缀合(参见图23，右板，泳道7)。实施例200.hokt3-peg
23-四嗪pf02与bcn-利妥昔单抗rit-v1a-145的缀合得到具有2：1分子形式的t细胞接合物rit-v1a-145-pf02向rit-v1a-145的溶液(247μl，6.3mg，171μm于pbs ph 7.4中)中加入hokt3-peg
23-四嗪pfo2(262μl，2.0mg，267μm于pbs ph6.5中，相比于igg 1.7当量)。将反应物在室温下孵育过夜，然后在akta purifier-10(ge healthcare)上的superdex200 10/300gl柱(ge healthcare)上使用pbs ph 7.4作为流动相纯化。非还原sds-page分析显示一种由与单个hokt3缀合的抗体组成的主要产物(参见图18，左板，泳道7)，从而证实rit-v1a-145-pf02的形成。此外，还原sds-page证实一种主要的hc产物，对应于与单个hokt3缀合的两条重链(参见图18，右板，泳道7)。实施例201.hokt3-peg
2-芳基叠氮化物pf03与bcn-曲妥珠单抗trast-v1a-145的缀合得到具有2：1分子形式的t细胞接合物trast-v1a-145-pf03向trast-v1a-145的溶液(2.9μl，150μg，347μm于pbs ph 7.4中)中加入hokt3-peg
2-芳基叠氮化物pf03(4.9μl，56μg，411μm于pbs ph 7.4中，相比于igg 2.0当量)。将反应物在室温下孵育过夜。还原样品的质谱分析显示一种主要的重链产物(观测质量128388da)，对应于trast-v1a-145-pf03。实施例202.hokt3-peg
2-芳基叠氮化物pf03与bcn-利妥昔单抗rit-v1a-145的缀合得到具有2：1分子形式的t细胞接合物rit-v1a-145-pf03向rit-v1a-145的溶液(30μl，1.5mg，337μm于pbs ph 7.4中)中加入hokt3-peg
2-芳基叠氮化物pf03(49μl，0.6mg，411μm于pbs ph 7.4中，相比于igg 2.0当量)。将反应物在室温下孵育过夜，然后在akta purifier-10(ge healthcare)上的superdex200 10/300gl柱(ge healthcare)上使用pbs ph 7.4作为流动相纯化。还原样品的质谱分析显示一种主要的重链产物(观测质量128211da)，对应于rit-v1a-145-pf03。实施例203.双-bcn-hokt3 pf22与双-叠氮基-曲妥珠单抗trast-v1a缀合得到具
有2：1分子形式的t细胞接合物trast-v1a-pf22向trast-v1a的溶液(1.8μl，100μg，374μm于pbs ph 7.4中)中加入pbs ph 7.4(4.5μl)和双-bcn-hokt3 pf22(13.7μl，78μg，194μm于pbs ph 7.4中，相比于igg 4.0当量)。将反应物在室温下孵育过夜。非还原sds-page分析显示一种由与单个hokt3缀合的抗体组成的主要产物(参见图28，泳道5)，从而证实trast-v1a-pf22的形成。实施例204.双-bcn-hokt3 pf22与双-叠氮基-利妥昔单抗rit-v1a的缀合得到具有2：1分子形式的t细胞接合物rit-v1a-145-pf22向rit-v1a的溶液(1.8μl，100μg，363μm于pbs ph 7.4中)中加入pbs ph 7.4(7.9μl)和双-bcn-hokt3 pf22(10.3μl，58μg，194μm于pbs ph 7.4中，相比于igg 3.0当量)。将反应物在室温下孵育过夜。非还原sds-page分析显示一种由与单个hokt3缀合的抗体组成的主要产物(参见图28，泳道4)，从而证实rit-v1a-pf22的形成。实施例205.双-bcn-hokt3 pf23与双-叠氮基-曲妥珠单抗trast-v1a的缀合得到具有2：1分子形式的t细胞接合物trast-v1a-pf23向trast-v1a溶液(1.8μl，100μg，374μm于pbs ph 7.4中)中加入pbs ph 7.4(9.9μl)和双-bcn-hokt3 pf23(8.4μl，58μg，239μm于pbs ph 7.4中，相比于igg 3.0当量)。将反应物在37℃下孵育过夜。非还原sds-page分析显示由非缀合的曲妥珠单抗和缀合至双-bcn-hokt3 pf23的曲妥珠单抗组成的两种主要产物(参见图29，泳道2)，从而证实trast-v1a-pf23的部分形成。实施例206.双-bcn-hokt3 pf23与双-叠氮基-利妥昔单抗rit-v1a的缀合得到具有2：1分子形式的t细胞接合物rit-v1a-pf23向rit-v1a的溶液(1.8μl，100μg，363μm于pbs ph 7.4中)中加入pbs ph 7.4(13.6μl)和双-bcn-hokt3 pf23(4.3μl，30μg，239μm于pbs ph 7.4中，相比于igg 1.5当量)。将反应物在37℃下孵育过夜。非还原sds-page分析显示由非缀合的利妥昔单抗和与双-bcn-hokt3 pf23缀合一次的利妥昔单抗组成的两种主要产物(参见图30，泳道5)，从而证实rit-v1a-pf23的部分形成。实施例207.4-1bb-peg
11-四嗪pf08与bcn-利妥昔单抗rit-v1a-145的缀合得到具有2：1分子形式的t细胞接合物rit-v1a-145-pf08向rit-v1a-145的溶液(35μl，0.9mg，170μm于pbs ph 7.4中)中加入4-1bb-peg
11-四嗪pf08(40μl，248μg，222μm于pbs ph 7.4中，相比于igg 1.5当量)。将反应物在室温下孵育过夜。非还原sds-page分析显示一种由与4-1bb-peg
23-bcn pf08缀合的利妥昔单抗组成的主要产物(参见图27，泳道3)，从而证实rit-v1a-145-pf08的部分形成。实施例208.4-1bb-peg
11-四嗪pf08与bcn-b12 b12-v1a-145的缀合得到具有2：1分子形式的t细胞接合物b12-v1a-145-pf08向b12-v1a-145溶液(34μl，0.9mg，178μm于pbs ph 7.4中)中加入4-1bb-peg
11-四嗪pf08(40μl，248μg，222μm于pbs ph 7.4中，相比于igg 1.5当量)。将反应物在室温下孵育过夜。非还原sds-page分析显示一种由与4-1bb-peg
23-bcn pf08缀合的b12组成的主要产物(参见图27，泳道5)，从而证实b12-v1a-145-pf08的部分形成。实施例209.4-1bb-peg
2-芳基叠氮化物pf09与bcn-曲妥珠单抗trast-v1a-145的缀合得到具有2：1分子形式的t细胞接合物trast-v1a-145-pf09
向trast-v1a-145溶液(1.9μl，100μg，347μm于pbs ph 7.4中)中加入4-1bb-peg
2-芳基叠氮化物pf09(5.9μl，37μg，225μm于pbs ph 7.4中，相比于igg 2.0当量)。将反应物在室温下孵育过夜。非还原sds-page分析显示一种由缀合至单个4-1bb-peg
2-4-1bb-peg
2-芳基叠氮化物pf09的曲妥珠单抗组成的主要产物(参见图31，泳道4)，从而证实trast-v1a-145-pf09的形成。实施例210.4-1bb-peg
2-芳基叠氮化物pf09与bcn-利妥昔单抗rit-v1a-145的缀合得到具有2：1分子形式的t细胞接合物rit-v1a-145-pf09向rit-v1a-145的溶液(2.0μl，100μg，337μm于pbs ph 7.4中)中加入4-1bb-peg
2-芳基叠氮化物pf09(5.9μl，37μg，225μm于pbs ph 7.4中，相比于igg 2.0当量)。将反应物在室温下孵育过夜。非还原sds-page分析显示一种由与单个4-1bb-peg
2-芳基叠氮化物pf09缀合的利妥昔单抗组成的主要产物(参见图31，泳道2)，从而证实rit-v1a-145-pf09的形成。实施例211.四嗪-peg
3-ggg-il15rα-il15(pf12)与bcn-曲妥珠单抗trast-v1a-145的缀合得到具有2：1分子形式的t细胞接合物trast-v1a-145-pf12将trast-v1a-145(75μl，1.575mg，21mg/ml于pbs中)与pf12(80μl，2当量，6.5mg/ml于pbs中)在37℃下孵育16小时。在非还原sds-page上的分析证实trast-v1a-145-pf12的形成(参见图32，泳道5)。实施例212.芳基叠氮化物-peg
11-ggg-il15rα-il15(pf13)与bcn-曲妥珠单抗trast-v1a-145的缀合得到具有2：1分子形式的t细胞接合物trast-v1a-145-pf13将trast-v1a-145(280μl，5.2mg，18.6mg/ml于pbs中)与pf13(477μl，1.5当量，2.6mg/ml于pbs中)在37℃下孵育16小时。ides处理后的样品的质谱分析显示73991da的一种主要产物，对应于缀合至pf13的交联的fc-片段(预期质量：73989da)，从而证实trast-v1a-145-pf13的形成。实施例213.芳基叠氮化物-peg
11-ggg-il15rα-il15(pf13)与bcn-利妥昔单抗rit-v1a-145的缀合得到具有2：1分子形式的t细胞接合物rit-v1a-145-pf13将rit-v1a-145(0.5μl，0.025mg，50.6mg/ml于pbs中)与pf13(6.6μl，4当量，2.6mg/ml于pbs中)在室温下孵育16小时。ides处理后的样品的质谱分析显示73927da的一种主要产物，对应于缀合至pf13的交联的fc-片段(预期质量：73925da)，从而证实rit-v1a-145-pf13的形成。实施例214.双-bcn-syr-(g4s)
3-il15rα-il15(pf27)与双-叠氮基-曲妥珠单抗trast-v1a的缀合得到具有2：1分子形式的t细胞接合物trast-v1a-145-pf27将trast-v1a(1.78μl，0.099mg，56.1mg/ml于pbs中)与pf27(18.4μl，4当量，7.62mg/ml于pbs中)和2.87μl pbs在37℃下孵育16小时。ides处理后样品的质谱分析显示74193da的一种主要产物，对应于缀合至pf27的交联的fc-片段(预期质量：74178da)，从而证实trast-v1a-145-pf27的形成。实施例215.双-bcn-syr-(g4s)
3-il15rα-il15(pf27)与双-叠氮基-利妥昔单抗rit-v1a的缀合得到具有2：1分子形式的t细胞接合物rit-v1a-145-pf27将rit-v1a(1μl，0.055mg，54.6mg/ml于pbs中)与pf27(8.9μl，4当量，6.2mg/ml于pbs中)和1.6μl pbs在37℃下孵育16小时。ides处理后的样品的质谱分析显示74118da的一
145的缀合得到具有2：1分子形式的t细胞接合物trast-v1a-145-pf21将trast-v1a(2μl，0.042mg，21mg/ml于pbs中)与pf21(10μl，6.7当量，2.9mg/ml于pbs中)在37℃下孵育16小时。ides处理后样品的质谱分析显示64865da的一种主要产物，对应于缀合至pf21的交联的fc-片段(预期质量：64863da)，从而证实形成了trast-v1a-145-pf21。实施例223.cd3结合分析使用在细胞表面上表达cd3的jurkat e6.1细胞和在细胞表面上不表达cd3的molt-4细胞评估与cd3的特异性结合。将两种细胞系在补充有1％pen/strep和10％胎牛血清的rpmi1640中以2x105至1x106细胞/ml的浓度进行培养。在实验前在新鲜培养基中洗涤细胞并将每孔100,000个细胞接种在96孔板(重复性孔)中。在磷酸盐缓冲盐水(pbs)中制备6种抗体的稀释系列。将抗体在细胞悬浮液中稀释10倍并在4℃下在黑暗中孵育30分钟。孵育后，将细胞在冷pbs/0.5％bsa中洗涤两次，并与抗-his-pe(仅对于200)或抗-igg1-pe(对于所有其他化合物)在4℃下在黑暗中孵育30分钟。在第二孵育步骤后，洗涤细胞两次。加入7aad作为活-死染色。用guava 5ht流式细胞仪检测yellow-b通道(抗-igg1-pe和抗-his-pe)和red-b通道(7aad)中的荧光。用kaluza软件测定活细胞中yellow-b通道(抗-igg1-pe和抗-his-pe)中的中值荧光强度。所有双特异性抗体(而不是阴性对照利妥昔单抗)显示与cd3阳性jurkat e6.1细胞系的浓度依赖性结合(表1)。相反，没有观察到与cd3阴性molt-4细胞系的结合(表2)。表1.通过facs分析与cd3阳性细胞(jurkat e6.1)结合的抗体。显示了每个测试浓度的重复的中值荧光强度。表2.通过facs分析与cd3阴性细胞(molt-4)结合的抗体。显示每个测试浓度的中值荧光强度。
实施例224.fcrn结合分析在ph 7.4和ph 6.0下使用biacore t200(序列号1909913)，使用单循环动力学和运行biacore t200 evaluation software v 2.0.1测定与fcrn受体的结合。使用标准胺化学将cm5芯片与fcrn在乙酸钠ph 5.5中偶联。在以下物质中测量双特异性抗体和对照的系列稀释：具有0.05％tween-20的pbs ph 7.4(9点；2倍稀释系列；8000nm top conc.)和具有0.05％tween-20的pbs ph 6.0(3点；2倍稀释系列；4000nm top conc.)。使用30μl/min的流速，40秒的缔合时间和75秒的解离时间。使用稳态分析来分析样品。在ph 6.0下观察到所有双特异性抗体的fcrn结合，在ph 7.4下未观察到结合(表3)。表3.通过biacore测定的不同双特异性抗体、中间体和对照抗体在ph 6.0或ph 7.4下与fcrn的结合。实施例225.双特异性抗体对人pbmc杀伤raji-b肿瘤细胞的作用。用raji-b细胞(5e4细胞)和人pbmc(5e5)(1：10细胞比)接种到96孔板重复孔中。将双特异性抗体的系列稀释(1：10稀释；8点；10nm top conc.)加入孔中并在组织培养箱中在
37℃下孵育24小时。将样品用cd19、cd20抗体染色，并在获得bd fortessa cell analyzer之前加入碘化丙啶。通过流式细胞仪分析基于pi-/cd19 /cd20 染色定量活的rajib细胞。相对于未处理的细胞计算活的rajib细胞的百分比。对基于hokt3 200的双特异性抗体(图35)和基于抗-4-1bb pf31的双特异性抗体(图36)均证明靶依赖性细胞杀伤。实施例226.双特异性抗体对raji-b肿瘤细胞和人pbmc共培养物中细胞因子分泌的影响。用raji-b细胞(5e4细胞)和人pbmc(5e5)(1：10细胞比)接种到96孔板重复孔中。将双特异性抗体的系列稀释(1：10稀释；8点；将10nm top conc.)加入孔中并在组织培养箱中在37℃下孵育24小时。对上清液进行tnf-α、ifn-γ和il-10的细胞因子分析(试剂盒：hcytomag-60k-05,merck millipore)。图37显示基于hokt3 200的双特异性抗体的细胞因子水平，图38显示基于抗-4-1bb pf31的双特异性抗体的细胞因子水平。序列表c-末端分选酶a识别序列的序列鉴定(seq.id no:1):ggggsggggslpetgghhhhhhhhhh分选酶a的序列鉴定(seq.id no:2):tgshhhhhhgskphidnylhdkdkdekieqydknvkeqaskdkkqqakpqipkdkskvagyieipdadikepvypgpatpeqlnrgvsfaeeneslddqnisiaghtfidrpnyqftnlkaakkgsmvyfkvgnetrkykmtsirdvkptdvgvldeqkgkdkqltlitcddynektgvwekrkifvatevkhis6-tevsite-ggg-il15rα-il15的序列鉴定(seq.id no:3):mgsshhhhhhssgenlyfqgggitcpppmsvehadiwvksyslysreryicnsgfkrkagtssltecvlnkatnvahwttpslkcirdpalvhqrpappsggsggggsgggsggggslqnwvnvisdlkkiedliqsmhidatlytesdvhpsckvtamkcfllelqvislesgdasihdtvenliilannslssngnvtesgckeceeleeknikeflqsfvhivqmfints抗-4-1bb pf31的序列鉴定(seq.id no:4):divmtqspptlslspgervtlscrasqsisdylhwyqqkpgqsprllikyasqsisgiparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqdghsfpptfgggtkveikggggsggggsggggsggggsqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytfssywmhwvrqapgqrlewmgeinpgnghtnysqkfqgrvtitvdksastaymelsslrsedtavyycarsfttarafaywgqgtlvtvssggggsggggslpetgghhhhhhsyr-(g4s)
3-il15(pf18)的序列鉴定(seq.id no:5):syrggggsggggsggggsnwvnvisdlkkiedliqsmhidatlytesdvhpsckvtamkcfllelqvislesgdasihdtvenliilannslssngnvtesgckeceeleeknikeflqsfvhivqmfintssyr-(g4s)
3-il15rα-接头-il15(pf26)的序列鉴定(seq.id no:6):syrggggsggggsggggsitcpppmsvehadiwvksyslysreryicnsgfkrkagtssltecvlnkatnvahwttpslkcirdpalvhqrpappsggsggggsgggsggggslqnwvnvisdlkkiedliqsmhidatlytesdvhpsckvtamkcfllelqvislesgdasihdtvenliilannslssngnvtesgckeceeleeknikeflqsfvhivqmfints