腹泻抑制剂的制作方法

1.本发明涉及以来源于碱预处理蔗渣的寡糖作为有效成分的腹泻抑制剂。


背景技术：

2.家畜、宠物等的饲料由于一般不进行加热处理等，因此具有消化吸收率变低，饲料效率差，引起腹泻等症状这样的问题。因此，可以考虑通过将抗生素添加于家畜饲料而防止家畜腹泻、感染感染症从而有助于有效率的畜产物生产，因而抗生素一直被使用。另一方面，也担心通过使用抗生素从而在家畜中耐药性菌出现而扩散到环境中，水平传播到人。因此，在欧洲，禁止以生长促进作为目的而对家畜饲料添加抗生素。由于这样的情况，寄期望于代替抗生素的有用物质。
3.木寡糖为木糖单元通过β-糖苷键而多个键合而成的寡糖的总称。木寡糖由于显示优异的整肠作用等因此也作为功能性食品用的原材料而使用(非专利文献1)。
4.木寡糖可以通过将纤维素系生物质所包含的木聚糖水解而获得，作为水解的方法，已知进行水热处理的方法(非专利文献2)、进行酸水解的方法(非专利文献3)、进行酶处理的方法(专利文献1)。
5.另一方面，作为成为木寡糖的原料的纤维素系生物质，使用了各种生物质，由浆粕、玉米的穗轴制造(专利文献2)。
6.现有技术文献
7.专利文献
8.专利文献1：日本特开2019-195303号公报
9.专利文献2：日本特开2000-333692号公报
10.非专利文献
11.非专利文献1：ayyappan aa等，compre.rev.food.sci.food saf.10，2-16(2011)
12.非专利文献2：patricia m等，ind.crops.prod.62，460-465(2014)
13.非专利文献3：ozlem a等，carbohydr.res.344，660-666(2009)


技术实现要素：

14.发明所要解决的课题
15.本发明以提供与现有的木寡糖相比具有优异的腹泻抑制作用的腹泻抑制剂作为目的。
16.用于解决课题的手段
17.本发明者们进行了深入研究，结果发现，来源于碱预处理蔗渣的寡糖与市售的来源于玉米穗轴的木寡糖相比腹泻抑制效果高。
18.即，本发明如以下(1)～(10)所述。
19.(1)一种腹泻抑制剂，以来源于碱预处理蔗渣的寡糖组合物作为有效成分。
20.(2)根据(1)所述的腹泻抑制剂，上述寡糖组合物来源于碱预处理蔗渣的水解酶处
理物。
21.(3)根据(1)或(2)所述的腹泻抑制剂，上述寡糖为木寡糖。
22.(4)根据(3)所述的腹泻抑制剂，上述木寡糖为选自木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖中的1种或2种以上的混合物。
23.(5)一种饲料，含有(1)～(4)中任一项所述的腹泻抑制剂。
24.(6)一种家畜饲料，含有(1)～(4)中任一项所述的腹泻抑制剂。
25.(7)一种动物的生长促进剂，以来源于碱预处理蔗渣的寡糖组合物作为有效成分。
26.(8)一种腹泻抑制方法，将来源于碱预处理蔗渣的寡糖组合物施与人或除人以外的动物。
27.(9)一种动物的生长促进方法，将来源于碱预处理蔗渣的寡糖组合物施与除人以外的动物。
28.(10)一种动物的饲料转化率改善方法，将来源于碱预处理蔗渣的寡糖组合物施与除人以外的动物。
29.发明的效果
30.根据本发明，来源于碱预处理的寡糖组合物的腹泻抑制效果优异，作为腹泻抑制剂的有效成分是有用的。
具体实施方式
31.作为本发明的腹泻抑制剂的有效成分的寡糖组合物通过将碱预处理蔗渣进行水解反应而获得。
32.在蔗渣的碱预处理中，对碱处理所使用的碱性溶液没有特别限定，但可以使用氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氨。从廉价且易于操作这样的观点考虑，优选为氢氧化钠。作为碱处理条件，蔗渣固体成分浓度在与碱水溶液混合了的状态下设定为0.1～50重量％，优选设定为1～20重量％，进一步优选设定为5～10重量％的范围。如果蔗渣固体成分浓度小于0.1重量％，则水的使用量极端变多，在经济上变得不利。另一方面，如果蔗渣固体成分浓度超过50重量％，则有时蔗渣不被碱溶液浸泡，不能充分获得预处理的效果。
33.作为碱预处理中的碱添加量，例如，在使用氢氧化钠水溶液的情况下，氢氧化钠的添加量相对于蔗渣固体成分以0.1～100重量％，优选为1～50重量％，进一步优选为5～15重量％的范围添加。如果所添加的碱量小于0.1重量％，则有时后期的水解不易进行，得不到充分的木寡糖收量。另一方面，如果添加量超过100重量％，则除了碱量增大以外，进行水解反应时的ph调整所使用的酸量增大，在经济上变得不利。
34.进行碱处理的温度优选为10～200℃，从水解中的糖收率的观点考虑，更优选为25～120℃，进一步优选为80～100℃，特别优选为85～100℃。
35.碱处理的时间可以根据碱量等来适当设定，通常为0.5小时～24小时左右。
36.碱预处理在常温下、加压下都可以进行，但优选为在常压下进行为好。
37.碱预处理后的预处理物可以直接供于水解反应，但优选在水解反应前固液分离，将所得的固体成分作为预处理物而供于水解。作为固液分离的方法，可以使用螺旋倾析器等的离心分离法、加压/抽滤等过滤法、或微滤等膜过滤法等公知的方法。此外，可以将预处理蔗渣的固体成分在固液分离的前后通过纯水进行洗涤。通过进行洗涤，从而可以进一步
减少木质素分解物等酶反应抑制物质，水解反应时的ph调整所需要的酸的量也可以减少因此是优选的。
38.上述寡糖组合物所包含的寡糖的种类没有特别限定，但优选为木寡糖。木寡糖优选为木糖单元以2～6个进行了共价键合而成的结构，但没有限定，可以包含侧链。木糖彼此以β-糖苷键连接。它们根据木糖单元的数而被称为木二糖(2糖)、木三糖(3糖)、木四糖(4糖)、木五糖(5糖)、木六糖(6糖)。作为腹泻抑制剂的有效成分，只要是它们之中的1种或2种以上的混合物即可，但更优选为3种以上的混合物，更优选为4种以上的混合物，特别优选包含木二糖、木三糖、木四糖和木五糖的混合物。
39.作为本发明的腹泻抑制剂的有效成分的寡糖组合物通过碱预处理蔗渣的预处理物的水解反应而获得，优选通过碱预处理蔗渣的预处理物的采用酶的水解而获得。
40.作为碱预处理蔗渣的预处理物的水解反应所使用的酶，没有特别限定，但优选使用纤维素酶组合物。纤维素酶组合物为将β-1,4-葡聚糖的糖苷键水解的各种水解酶的混合物。作为纤维素酶组合物所包含的水解酶，可举出例如，纤维二糖水解酶、木聚糖酶、内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、脱乙酰几丁质酶、几丁质酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶等。在水解反应中使用的纤维素酶组合物中，其中，从木寡糖生产的观点考虑，优选使用在对蔗渣进行水解时至少具有木聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶的活性，并且实质上不具有β-木糖苷酶的活性的纤维素酶组合物。此外，这些酶活性的来源没有特别限定。这样的纤维素酶组合物的制备例记载于wo2017/170919号或wo2017/170917号。此外，可以直接使用将微生物进行培养而获得的培养液作为纤维素酶组合物，也可以将从培养液纯化了的酶、其它市售的酶制品混合而用于本发明。
41.在使用来源于微生物的纤维素酶组合物的情况下，作为微生物，可以优选使用真菌。作为真菌的具体例，可以例示木霉属(trichoderma)、曲霉属(aspergillus)、纤维单胞菌属(cellulomonas)、梭菌属(chlostridium)、链霉菌属(streptomyces)、腐质霉属(humicola)、枝顶孢属(acremonium)、耙齿菌属(irpex)、毛霉属(mucor)、篮状菌属(talaromyces)等的微生物。这些真菌中优选为木霉属、曲霉属真菌。
42.作为木霉属真菌的具体例，可以例示里氏木霉qm9414(trichoderma reesei qm9414)、里氏木霉qm9123(trichoderma reesei qm9123)、里氏木霉rutc-30(trichoderma reesei rutc-30)、里氏木霉pc3-7(trichoderma reesei pc3-7)、里氏木霉cl-847(trichoderma reesei cl-847)、里氏木霉mcg77(trichoderma reesei mcg77)、里氏木霉mcg80(trichoderma reesei mcg80)、绿色木霉qm9123(trichoderma viride qm9123)。这些木霉属真菌中，优选为里氏木霉。此外，也可以优选使用向生产上述纤维素酶组合物的真菌通过诱变剂或紫外线照射等而实施诱变处理从而纤维素酶组合物的生产性提高了的突变株、β-木糖苷酶的活性降低了的突变株。
43.此外，作为曲霉属真菌的具体例，可以例示黑曲霉(aspergillus niger)、烟曲霉(aspergillus fumigatus)、棘孢曲霉(aspergillus aculeatus)、土曲霉(aspergillus terreus)。
44.作为纤维素酶组合物，可以使用来源于上述真菌之中的1种真菌的纤维素酶组合物，可以将来源于多种真菌的纤维素酶组合物混合而使用。在使用来源于多种真菌的纤维
素酶组合物的情况下，组合没有特别限定，例如可以将来源于木霉属真菌的纤维素酶组合物、与来源于曲霉属真菌的纤维素酶组合物混合使用。具体而言，作为来源于曲霉属真菌的β-葡糖苷酶，可以例示“novozyme188”(
ノボザイムズ
社)、“β-glucosidase from aspergillus niger”(megazyme社)、
“スミチーム
bga”(新日本化学工业株式会社)等。另外，β-葡糖苷酶活性成分优选包含上述曲霉属真菌的β-葡糖苷酶活性成分。
45.上述寡糖组合物通过碱预处理物的水解而作为包含寡糖的糖液获得，但优选从糖液中包含的葡萄糖、木糖等单糖类将寡糖在后续工序中选择性地分离或浓缩。作为分离或浓缩的方法，没有特别限定，优选使用膜分离。此外，膜分离所使用的膜的种类没有特别限定，但优选使用聚酰胺制分离膜。此外，聚酰胺制分离膜的截留分子量也没有特别限定，但优选使用截留分子量200～1000的范围的聚酰胺制分离膜。在通过截留分子量300～1,000的范围的聚酰胺制分离膜进行过滤时，木寡糖在非透过侧被选择性地浓缩。
46.作为使上述糖液通过截留分子量300～1,000的聚酰胺制分离膜进行过滤的前工序，可以通过截留分子量2,000～100,000的分离膜而进行过滤。在前工序中使用的截留分子量2,000～100,000的分离膜大于之后使用的聚酰胺制分离膜的截留分子量，此外，只要透过以木二糖为代表的木寡糖，不透过酶等高分子成分，就没有特别限制，但更优选为截留分子量5,000～50,000的范围，进一步优选为截留分子量10,000～30,000的范围。能够从通过截留分子量2,000～100,000的分离膜而获得的透过液，除去上述糖液的制备所使用的酶成分等，使寡糖浓缩液中的杂质减少，并且能够减少对在后续工序中使用的聚酰胺制分离膜的负荷。作为截留分子量2,000～100,000的分离膜的原材料，可以使用聚醚砜(pes)、聚砜(ps)、聚丙烯腈(pan)、聚1,1-二氟乙烯(pvdf)、再生纤维素、纤维素、纤维素酯、磺化聚砜、磺化聚醚砜、聚烯烃、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸甲酯、聚四氟乙烯等。然而，在将上述糖液通过生物质的酶处理而制备的情况下，有时酶剂包含与纤维素分解有关的酶群，再生纤维素、纤维素、纤维素酯受到分解，因此优选使用以pes、pvdf等合成高分子作为原材料的分离膜。
47.作为截留分子量2,000～100,000的分离膜的具体例，有ge w&pt社制desal商标的m系列、p系列、g系列的gh(g-10)型、gk(g-20)型、gm(g-50)型、“duratherm”(注册商标)系列的hws uf型、std uf型、synder社制的vt、mt、st、sm、mk、mw、ly、bn、by、旭化成株式会社制的
“マイクローザ”
(注册商标)uf系列、日东电工株式会社制的ntr-7410、ntr-7450等。
48.此外，优选在采用截留分子量2,000～100,000的分离膜的过滤前将糖液通过微滤膜进行过滤而除去微粒。微滤膜优选使用平均细孔径为0.01～10μm左右的分离膜。
49.上述寡糖组合物可以具有来源于碱预处理蔗渣的着色。着色的程度没有特别限定，但以总糖浓度成为5g/l的方式稀释而使用1cm的比色池测定的波长420nm的吸光度优选为0.1～1.0，更优选为0.15～0.8。
50.在上述寡糖组合物中，只要是不损害本发明的效果的范围就可以包含来源于碱预处理蔗渣的木质素分解物，作为具体例为hmf、糠醛等呋喃系化合物、香草醛等芳香族化合物，但为了可以通过将蔗渣预处理时的预处理物用纯水进行洗涤来减少，优选使其尽量减少。具体而言，寡糖组合物所包含的木质素分解物量相对于寡糖量优选为0.1重量％以下，进一步优选为0.08重量％以下，进一步优选为0.06重量％以下，进一步优选为0.05重量％以下，进一步优选为0.04重量％以下，进一步优选为0.03重量％以下，特别优选为0.02重
量％以下。
51.成为上述寡糖组合物的主成分的糖为寡糖，但可以包含来源于碱预处理蔗渣的葡萄糖、木糖等单糖类。此外，组合物中的总糖浓度没有特别限定，但从运输上的观点考虑优选为20重量％以上，进一步优选为25重量％以上，进一步优选为30重量％以上，进一步优选为35重量％以上，特别优选为40重量％以上。
52.上述寡糖组合物中的寡糖含量没有特别限定，但从保存上、运输上的观点考虑优选为10重量％以上，进一步优选为15重量％以上，进一步优选为20重量％以上，进一步优选为25重量％以上，特别优选为0重量％以上。
53.在上述寡糖组合物中，可以包含除上述物质以外的来源于碱预处理蔗渣的物质，其程度没有特别限定，但以总糖浓度成为5g/l的方式稀释而使用1cm的比色池测定的波长280nm的吸光度优选为0.2～1.0，更优选为0.3～0.8。
54.上述寡糖组合物可以根据需要进行减压浓缩、蒸发浓缩，此外，其形状可以为液状或粉末状。粉末状的寡糖可以使用液状的寡糖通过喷雾干燥法等公知的粉末化方法来制造。
55.本发明的腹泻抑制剂可以通过施与人或除人以外的动物来获得腹泻抑制效果，但优选施与除人以外的动物。关于施与的方法，没有特别限定，可以作为食品或饲料所包含的成分或添加物而使用。
56.在将本发明的腹泻抑制剂施与人或除人以外的动物的情况下，作为施与量，没有特别限定，但优选将寡糖对食品、饲料添加50～500ppm，进一步优选为100～400ppm，进一步优选为100～300ppm，进一步优选为100～200ppm。所谓混配饲料，是混配必要的营养成分(蛋白质、能量)而制作的饲料，对于成分，没有特别限定。
57.在将本发明的腹泻抑制剂施与除人以外的动物的情况下，施与的动物没有特别限定，但优选为家畜，更优选为猪、小鸡或产蛋鸡，进一步优选为猪或小鸡，特别优选为猪。
58.通过使用本发明的腹泻抑制剂从而腹泻的发生频率降低。腹泻的发生频率例如在家畜的情况下用以下式(1)表示。由本发明的腹泻抑制剂引起的腹泻的发生频率的降低程度没有特别限定，优选降低0.2％以上，更优选降低0.3％以上，进一步优选降低0.4％以上，更进一步优选降低0.5％以上，更进一步优选降低0.7％以上，更进一步优选降低0.8％以上，更进一步优选降低1％以上，更进一步优选降低2％以上，更进一步优选降低3％以上，更进一步优选降低4％以上，特别优选降低5％以上。
59.(具有腹泻症状的头数/天的合计)/(总头数
×
天数)
×
100
···
式(1)。
60.如果将来源于碱预处理的寡糖使用于除人以外的动物、优选为家畜，则获得饲料转化率的改善效果，因此作为生长促进剂而优选使用。所谓饲料转化率，表示使动物的体重增加1kg所需要的饲料量kg。所谓饲料转化率的改善，是指饲料转化率降低。如果使用本发明的腹泻抑制剂，则与不添加本发明的腹泻抑制剂的对照、此外添加了市售的来源于玉米穗轴的木寡糖组合物的情况相比，饲料转化率降低。饲料转化率的降低的程度只要降低就没有特别限定，但优选降低0.01以上，更优选降低0.015以上，进一步优选降低0.02以上，更进一步优选降低0.025以上，特别优选降低0.03以上。
61.实施例
62.以下，举出实施例具体地说明本发明。但是，本发明不限定于它们。
63.(参考例1)蛋白质浓度测定方法
64.使用了市售的蛋白质浓度测定试剂(quick start bradford蛋白质测定法，bio-rad制)。在恢复到室温的蛋白质浓度测定试剂250μl中添加稀释了的来源于丝状菌的纤维素酶溶液5μl，用酶标仪测定了在室温下静置5分钟后的595nm下的吸光度。使用bsa作为标准品，对照标准曲线算出了蛋白质浓度。
65.(参考例2)β-木糖苷酶活性测定方法
66.β-木糖苷酶活性测定方法具体而言在含有1mm对硝基苯基-β-吡喃木糖苷(
シグマアルドリッチジャパン
社制)的50mm乙酸缓冲液90μl中使用酶稀释液10μl在30℃下进行反应，在30分钟后加入2m碳酸钠10μl充分地混合而停止反应，测定了405nm的吸光度的增加。将每1分钟游离1μmol对硝基苯酚的活性定义为1u。空白在含有1mm对硝基苯基-β-吡喃木糖苷的50mm乙酸缓冲液90μl中加入2m碳酸钠10μl而充分地混合，然后添加酶稀释液10μl在30℃下使其反应30分钟。然后，测定了405nm的吸光度的增加。
67.(参考例3)β-葡糖苷酶活性测定方法
68.β-葡糖苷酶活性测定方法具体而言在含有1mm对硝基苯基-β-吡喃葡萄糖苷(
シグマアルドリッチジャパン
社制)的50mm乙酸缓冲液90μl中使用酶稀释液10μl在30℃下进行反应，在10分钟后加入2m碳酸钠10μl充分地混合而停止反应，测定了405nm的吸光度的增加。将每1分钟游离1μmol对硝基苯酚的活性定义为1u。空白在含有1mm对硝基苯基-β-吡喃葡萄糖苷的50mm乙酸缓冲液90μl中加入2m碳酸钠10μl而充分地混合，然后添加酶稀释液10μl在30℃下使其反应30分钟。然后，测定了405nm的吸光度的增加。
69.(参考例4)纤维二糖水解酶活性测定方法
70.纤维二糖水解酶活性测定方法具体而言在含有1mm对硝基苯基-β-半乳吡喃糖苷(
シグマアルドリッチジャパン
社制)的50mm乙酸缓冲液90μl中使用酶稀释液10μl在30℃下进行反应，在60分钟后加入2m碳酸钠10μl充分地混合而停止反应，测定了405nm的吸光度的增加。将每1分钟游离1μmol对硝基苯酚的活性定义为1u。空白在含有1mm对硝基苯基-β-半乳吡喃糖苷的50mm乙酸缓冲液90μl中加入2m碳酸钠10μl而充分地混合，然后添加酶稀释液10μl在30℃下使其反应30分钟。然后，测定了405nm的吸光度的增加。
71.(参考例5)木聚糖分解活性
72.以在50mm乙酸钠缓冲液(ph5.0)中，以成为1重量％的方式悬浮了木聚糖(xylan from birch wood，fluka社制)的溶液作为底物溶液。在分注后的500μl底物溶液中添加酶液5μl，在50℃下一边旋转混合一边使其反应。反应时间以30分钟作为基本，根据酶活性的高度而在10～60分钟适当变更。反应后，将管离心分离，将其上清液成分的还原糖浓度通过dns法进行了测定。将在上述反应体系中在1分钟生成1μmol还原糖的酶量定义为1u，按照下述式算出活性值(u/ml)。
73.木聚糖分解活性(u/ml)＝还原糖浓度(g/l)
×
1000
×
505(μl)/(150.13
×
反应时间(分钟)
×
5(μl))。
74.(参考例6)糖浓度的测定
75.木寡糖、葡萄糖、木糖使用高效液相色谱“lachrom eite”(株式会社日立制作所)，在以下条件下进行了定量分析。基于由作为木寡糖的木二糖、木三糖、木四糖、木五糖、木六糖、和葡萄糖、木糖的标准品制作的标准曲线，进行了定量分析。另外，在本实施例中记述的
所谓木寡糖，是指在本糖浓度测定方法中保留时间与作为标准品的木二糖、木三糖、木四糖、木五糖、木六糖一致的木寡糖。
76.柱：ks802、ks803(shodex)
77.流动相：水
78.检测方法：ri
79.流速：0.5ml/分钟
80.温度：75℃。
81.(参考例7)呋喃系/芳香族系化合物的浓度的测定方法
82.糖液所包含的呋喃系化合物(hmf、糠醛)和芳香族系化合物(香草醛等)的浓度在以下所示的条件下通过hplc进行分析，通过与标准品的比较进行了定量。
83.柱：synergi hidrorp 4.6mm
×
250mm(phenomenex制)
84.流动相：乙腈-0.1％h3po4(流速1.0ml/分钟)检测方法：uv(283nm)
85.温度：40℃。
86.(参考例8)碱预处理蔗渣的制作
87.量取蔗渣5g，加热直到变为105℃。基于此时的重量变化而算出蔗渣的固体成分率。将对含水状态的蔗渣乘以固体成分率的值作为固体成分重量。将蔗渣100g以固体成分重量在与氢氧化钠溶液混合了的状态下成为8重量％、相对于蔗渣固体成分的氢氧化钠添加量成为10重量％的方式，浸泡于氢氧化钠水溶液，在85℃下预处理了3小时。在预处理后，用笊篱将固体成分粗分离后，直到蔗渣固体成分重量变为5重量％为止用纯水实施了洗涤。然后，利用离心分离(3,000g，10分钟)进行固液分离，分离成溶液成分和固体成分。将固体成分用纯水进行了洗涤后作为预处理物而使用于以下实验。
88.(参考例9)纤维素酶组合物的制备
89.[预培养]
[0090]
以玉米浆5％(w/vol)、葡萄糖2％(w/vol)、酒石酸铵0.37％(w/vol)、硫酸铵0.14(w/vol)、磷酸二氢钾0.2％(w/vol)、氯化钙二水合物0.03％(w/vol)、硫酸镁七水合物0.03％(w/vol)、氯化锌0.02％(w/vol)、氯化铁(iii)六水合物0.01％(w/vol)、硫酸铜(ii)五水合物0.004％(w/vol)、氯化锰四水合物0.0008％(w/vol)、硼酸0.0006％(w/vol)、七钼酸六铵四水合物0.0026％(w/vol)的方式添加于蒸馏水，将100ml加入到500ml带有挡板的锥形烧瓶中，在121℃下进行了15分钟高压釜灭菌。在放冷后，将与其另外地分别在121℃下进行了15分钟高压釜灭菌的pe-m和tween80分别添加0.01％(w/vol)，作为预培养培养基。在该预培养培养基100ml中将里氏木霉atcc66589(由atcc出售)以成为1
×
105个/ml的方式接种，以28℃、72小时、180rpm振荡培养，作为预培养(振荡装置：taitec社制bio-shaker br-40lf)。
[0091]
[正式培养]
[0092]
以玉米浆5％(w/vol)、葡萄糖2％(w/vol)、纤维素(
アビセル
)10％(w/vol)、酒石酸铵0.37％(w/vol)、硫酸铵0.14％(w/vol)、磷酸二氢钾0.2％(w/vol)、氯化钙二水合物0.03％(w/vol)、硫酸镁七水合物0.03％(w/vol)、氯化锌0.02％(w/vol)、氯化铁(iii)六水合物0.01％(w/vol)、硫酸铜(ii)五水合物0.004％(w/vol)、氯化锰四水合物0.0008％(w/vol)、硼酸0.0006％(w/vol)、七钼酸六铵四水合物0.0026％(w/vol)的方式添加于蒸馏水，
将2.5l加入到5l容量的搅拌广口瓶(able社制dpc-2a)容器中，在121℃下进行了15分钟高压釜灭菌。在放冷后，将与其另外地分别在121℃下进行了15分钟高压釜灭菌的pe-m和tween80分别添加0.1％，作为正式培养培养基。在该正式培养培养基2.5l中接种预先用上述预培养培养基进行了预培养的里氏木霉pc3-7 250ml。然后，以28℃、87小时、300rpm、通气量1vvm进行培养，在离心分离后，将上清液进行了膜过滤(
ミリポア
社制
ステリカップ‑
gv材质：pvdf)。相对于该制备出的培养液，将β-葡糖苷酶(novozyme188)以蛋白质重量比为1/100量添加，获得了纤维素酶组合物。
[0093]
(参考例10)选择性地减少了β-木糖苷酶活性的纤维素酶组合物的制备
[0094]
将在参考例9中获得的纤维素酶组合物的ph通过1n氢氧化钠水溶液而调整为ph7.5～8.0，用水进行稀释直到蛋白质浓度4g/l后，在40～50℃的温度范围保温。根据通过参考例2、3、4、5所记载的方法而测定了纤维二糖水解酶的活性、β-葡糖苷酶的活性、木聚糖分解活性、β-木糖苷酶的活性的结果，酶活性的最佳ph下的β-木糖苷酶的活性在对生物质的水解时被减少直到实质上不具有活性的值(200u/-蛋白质以下)，纤维二糖水解酶的活性、β-葡糖苷酶的活性、木聚糖分解活性残存60％以上，因此β-木糖苷酶活性选择性地失活了。
[0095]
(参考例11)木寡糖液的制造
[0096]
将参考例8的碱预处理蔗渣以成为干燥重量5重量％的方式加入，加入稀盐酸而调制为ph7.0。在调制了ph的预处理蔗渣中将参考例9的β-木糖苷酶活性选择性地减少了的纤维素酶组合物以成为8mg蛋白质/g-生物质的方式添加，使用杂交转子以ph7.0、40℃旋转混合8小时。然后，反应液通过离心分离而获得了上清液后，使用平均细孔径0.04μm的微滤膜(ge w&pt社制desal e系列，材质：聚砜)，在操作温度25℃、膜面线速度20cm/秒的条件下进行了过滤。
[0097]
接下来，使用截留分子量10,000的耐热性超滤膜(ge w&pt社制“duratherm”(注册商标)hws uf型，材质：聚醚砜)，在操作温度25℃、膜面线速度20cm/秒的条件下一边以通量在0.1m/d成为一定的方式控制操作压力一边进行了过滤。然后，为了将木寡糖与单糖类分离，作为分离膜，使用分离膜a：“desal g系列ge(g-5)型”(膜材质：聚酰胺复合膜，截留分子量1,000，ge w&pt社制)，进行了过滤。膜分离装置使用“sepa”(注册商标)cf-ii(ge w&pt社制，有效膜面积140cm2)，操作温度设为25℃，膜面线速度设为20cm/秒，在过滤压力0.5mpa的条件下进行过滤处理，回收非透过液，将木寡糖选择性地浓缩了。然后，通过进行减压浓缩从而制造出木寡糖液。将按照参考例6而测定的木寡糖液所包含的糖的组成示于表1中。木寡糖液中的木寡糖含量为17重量％。
[0098]
此外，关于所得的木寡糖液，按照参考例7而测定了芳香族系化合物和呋喃系化合物的浓度，结果相对于木寡糖量为0.03重量％，未检测到呋喃系化合物。进一步，将所得的木寡糖液的总糖浓度以成为5g/l的方式调制，使用1cm的比色池测定的波长420nm和280nm的吸光度分别为0.15和0.391。
[0099]
表1
[0100][0101]
(参考例12)不使用寡糖的小猪饲养试验
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对于体重约8kg的小猪18头(雄9头、雌9头)，使用市售的混配饲料而实施了饲养试验。试验中，计数具有腹泻症状的小猪，此外对体重增加和饲料摄取量进行记录，算出腹泻的发生频率和28天后的饲料转化率。将饲养试验结果示于表2中。
[0103]
(比较例1)使用了市售木寡糖组合物(来源于玉米穗轴)的小猪饲养试验将作为木寡糖而被市售的来源于玉米穗轴的木寡糖组合物(物産
フードサイエンス
，木寡糖70l)添加于在参考例12中使用的市售的混配饲料，与参考例12同样地实施了小猪饲养试验。按照参考例6而测定的本木寡糖组合物的糖组成如表1所示那样，以相对于混配饲料的木寡糖添加量成为200ppm的方式添加了木寡糖组合物。将饲养试验结果示于表2中。
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(实施例1)使用了来源于碱预处理蔗渣的木寡糖组合物的小猪饲养试验
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使用在参考例11中制造的来源于碱预处理蔗渣的木寡糖组合物，除此以外，通过与比较例1同样的方法而实施了小猪饲养试验。将饲养试验结果示于表2中。由此表明了，在使用了来源于碱预处理蔗渣的木寡糖的情况下，与来源于玉米穗轴的市售木寡糖比较，腹泻的发生频率变低，腹泻抑制的效果优异。进一步表明了，关于饲料转化率，也与来源于玉米穗轴的木寡糖相比被改善了。
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表2
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