靶向CD39和TGFBETA的新型缀合物分子的制作方法

2022-09-14 23:42:30 来源：中国专利 TAG：

靶向cd39和tgfbeta的新型缀合物分子
技术领域
1.本发明总体上涉及靶向cd39和tgfβ的新型缀合物分子。

背景技术：

2.cd39，也称为外核苷三磷酸二磷酸水解酶1(entpdase1)，是一种完整的膜蛋白，可将atp或adp转化为amp，然后cd73将amp脱磷酸化为腺苷，腺苷是有效的免疫抑制剂，并与位于cd4

、cd8

t细胞和自然杀伤(nk)细胞表面的腺苷受体(例如，a2a受体)结合，并抑制t细胞和nk细胞应答，从而抑制免疫系统。腺苷还与巨噬细胞和树突细胞上的a2a或a2b受体结合，抑制吞噬作用和抗原呈递，并增加促癌因子(例如vegf、tgfβ和il-6)的分泌。cd39和cd73的酶活性在校准分别通过adp和atp转化为amp和amp转化为腺苷而传递给免疫细胞的嘌呤能信号的持续时间、强度和化学性质方面具有战略性作用(luca antonioli et al.，trends mol med.2013jun；19(6):355-367)。由cd39和cd73介导的腺苷水平升高会产生免疫抑制环境，从而促进癌症的发生和发展。
3.转化生长因子β(tgfβ)是一种多效细胞因子，在晚期原发性和转移性肿瘤中高水平表达，并激活抗增殖和促肿瘤信号级联。肿瘤基质细胞和许多类型的肿瘤，包括乳腺、结肠、肺、胰腺、前列腺以及血液系统恶性肿瘤，产生高水平的tgfβ。除了促进肿瘤细胞的上皮至间质转化(emt)、侵袭和转移外，tgfβ还通过例如抑制干扰素-γ(ifn-γ)的表达、限制th1细胞的分化和减弱cd8

效应细胞的功能等机制使肿瘤逃避免疫监视。最重要的是，tgfβ诱导调节性t细胞(treg)分化。treg通过产生免疫抑制细胞因子(il-10、tgfβ和il-35)、表达抑制分子(ctla-4)以及通过cd39将atp水解为腺苷，进一步抑制炎症。
4.鉴于cd39和tgfβ在调节肿瘤免疫应答中的作用，仍然需要对抗cd39活性的治疗剂或对抗cd39和tgfβ活性的治疗剂来治疗疾病，例如癌症。

技术实现要素：

5.本发明全文中的冠词“一种”(a/an)、“一个”(a/an)和“所述”在此用于指代一种(个)或多于一种(个)(即，至少一种(个))该冠词的语法对象。举例来说，“一种抗体”指一种抗体或多于一种抗体。
6.在一个方面，本发明提供了一种缀合物分子，其包括能够干扰cd39和其底物之间相互作用的cd39抑制部分以及能够干扰tgfβ和其受体之间相互作用的tgfβ抑制部分。
7.在某些实施方式中，所述cd39抑制部分能够干扰cd39和atp/adp之间的相互作用，并且/或者所述tgfβ抑制部分能够干扰tgfβ和tgfβ受体之间的相互作用。在某些实施方式中，所述cd39抑制部分为选自下组的cd39拮抗剂：cd39结合剂、靶向cd39编码序列的rnai、靶向cd39编码序列的反义核苷酸以及与cd39竞争结合其底物的试剂。在某些实施方式中，所述tgfβ抑制部分为选自下组的tgfβ拮抗剂：tgfβ结合剂、靶向tgfβ编码序列的rnai、靶向tgfβ编码序列的反义核苷酸以及与tgfβ竞争结合其受体的试剂。在某些实施方式中，所述cd39结合剂选自下组：特异性识别cd39的抗体或其抗原结合片段，以及与cd39结合的小化
合物分子；并且/或者所述tgfβ结合剂选自下组：特异性识别tgfβ的抗体或其抗原结合片段，以及与tgfβ结合的小分子化合物。
8.在某些实施方式中，所述缀合物分子为融合蛋白，其包括与tgfβ结合域相连的cd39结合域。在某些实施方式中，所述tgfβ结合域与人类和/或小鼠tgfβ结合。在某些实施方式中，所述tgfβ结合域与人类tgfβ1、人类tgfβ2和/或人类tgfβ3结合。在某些实施方式中，所述tgfβ结合域包括tgfβ受体的细胞外结构域(ecd)。在某些实施方式中，所述tgfβ受体为tgfβ受体i(tgfβri)、tgfβ受体ii(tgfβrii)或tgfβ受体iii(tgfβriii)。在某些实施方式中，所述ecd包括如seq id no:163、seq id no:164或seq id no:165所示的氨基酸序列，或与其具有至少85％序列同一性但仍然保持与tgfβ结合特异性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述tgfβ结合域包括tgfβ受体的两个或更多个ecd。在某些实施方式中，所述两个或更多个ecd源自相同的tgfβ受体，或源自至少两个不同的tgfβ受体。在某些实施方式中，所述两个或更多个ecd包括源自tgfβri的第一ecd和源自tgfβrii的第二ecd。在某些实施方式中，所述两个或更多个ecd可操作地串联。在某些实施方式中，所述两个或更多个ecd通过第一连接子连接。在某些实施方式中，所述tgfβ结合域包括选自下组的氨基酸序列：seq id no:166、seq id no:167、seq id no:168、seq id no:169、seq id no:170、seq id no:171或其任何组合。
9.在某些实施方式中，所述cd39结合域与人类cd39结合。在某些实施方式中，所述tgfβ结合域通过第二连接子与抗cd39结合域连接。在某些实施方式中，所述cd39结合域包括抗cd39抗体部分。在某些实施方式中，所述抗cd39抗体部分包括重链可变区和轻链可变区。在某些实施方式中，所述抗cd39抗体部分进一步包括附加到所述重链可变区的羧基末端的重链恒定区。在某些实施方式中，所述抗cd39抗体部分进一步包括附加到所述轻链可变区的羧基末端的轻链恒定区。在某些实施方式中，所述tgfβ结合域在选自下组的位置结合到所述抗cd39抗体部分：所述抗cd39抗体部分的1)所述重链可变区的氨基末端；2)所述轻链可变区的氨基末端；3)所述重链可变区的羧基末端；4)所述轻链可变区的羧基末端；5)所述重链恒定区的羧基末端；以及6)所述轻链恒定区的羧基末端。
10.在某些实施方式中，所述融合蛋白包括两个或更多个tgfβ结合域，所述结合域(i)全部与所述抗cd39抗体部分的重链可变区连接或(ii)全部与所述抗cd39抗体部分的轻链可变区连接。在某些实施方式中，所述融合蛋白包括两个或更多个tgfβ结合域，其分别与所述抗cd39抗体部分的重链和轻链可变区连接。在某些实施方式中，所述融合蛋白包括两个或更多个tgfβ结合域，其全部与所述抗cd39抗体部分的重链恒定区连接。在某些实施方式中，所述融合蛋白包括两个或更多个tgfβ结合域，其全部与所述抗cd39抗体部分的轻链恒定区连接。在某些实施方式中，所述融合蛋白包括两个或更多个tgfβ结合域，其分别与所述抗cd39抗体部分的重链和轻链恒定区连接。
11.在某些实施方式中，所述融合蛋白包括两个、三个、四个、五个、六个或更多个tgfβ结合域。在某些实施方式中，所述第一和/或第二连接子选自下组：可切割连接子、不可切割连接子、肽连接子、柔性连接子、刚性连接子、螺旋连接子和非螺旋连接子。在某些实施方式中，所述第一和/或第二连接子包括肽连接子。在某些实施方式中，所述肽连接子包括gs连接子。在某些实施方式中，所述gs连接子包括如seq id no:177(gggs)或seq id no:173(ggggs)所示的一个或多个重复，或者包括如seq id no:182(ggggsggggsggggsg)所示的氨
基酸序列。
12.在另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包括本发明所述的缀合物分子以及一种或多种药学上可接受的运载体。在另一方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸，其编码本发明所述的缀合物分子。在另一方面，本发明提供了一种载体，其包括本发明所述的分离的多核苷酸。在另一方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包括本发明所述的载体。在另一方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括本发明所述的缀合物分子和/或本发明所述的药物组合物，以及第二治疗剂。
13.在另一方面，本发明提供了一种表达本发明所述的缀合物分子的方法，其包括在表达本发明所述的载体的条件下培养本发明所述的宿主细胞。在另一方面，本发明提供了一种在受试者中治疗、预防或减轻与cd39和/或tgfβ相关的疾病、病症或状况的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本发明所述的缀合物分子和/或本发明所述的药物组合物。在另一方面，本发明提供了一种在受试者中治疗、预防或减轻通过降低cd39的atp酶活性而可治疗的疾病的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明所述的缀合物分子和/或本发明所述的药物组合物。在另一方面，本发明提供了一种在受试者中治疗、预防或减轻与腺苷介导的t细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、抗原呈递细胞、nk和/或b细胞活性的抑制相关的疾病的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明所述的缀合物分子和/或本发明所述的药物组合物。在另一方面，本发明提供了一种调节cd39阳性细胞中cd39活性的方法，其包括将所述cd39阳性细胞暴露于本发明所述的缀合物分子和/或本发明所述的药物组合物。
14.在另一方面，本发明提供了一种在受试者中治疗、预防或减轻与增加的tgfβ水平和/或活性有关的疾病的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明所述的缀合物分子和/或本发明所述的药物组合物。在另一方面，本发明提供了本发明所述的缀合物分子和/或本发明所述的药物组合物在制备用于治疗、预防或减轻受试者中与cd39相关或与tgfβ相关的疾病、病症或状况的药物中的用途。
附图说明
15.图1显示了抗cd39单克隆抗体mab21和mab23对atp介导的t细胞增殖抑制的阻断。migg2a被用作同种型对照抗体。
16.图2显示了抗cd39嵌合抗体c14、c19、c21和c23对atp介导的t细胞增殖抑制的阻断。higg4是指人类igg4同种型对照抗体。
17.图3显示了树突细胞(dc)上的cd39表达水平。
18.图4a至图4c显示了抗cd39嵌合抗体c14、c19、c21和c23对atp介导的dc活化，通过使用facs检测的cd86(图4a)、cd83(图4b)和hla-dr(图4c)的表达来测定。
19.图5显示了在用molp-8细胞(人多发性骨髓瘤细胞系)接种的小鼠中，用抗cd39嵌合抗体c23-higg4和c23-higg1处理后的肿瘤生长。
20.图6a分别显示了人源化抗体hu23.h5l5与entpd1(即cd39)、entpd2(即cd39l1)、entpd3(即cd39l3)、entpd5(即cd39l4)和entpd6(即cd39l2)蛋白的结合特性。图6b分别显示了阴性对照higg4与entpd1(即cd39)、entpd2(即cd39l1)、entpd3(即cd39l3)、entpd5(即cd39l4)和entpd6(即cd39l2)蛋白的结合。
21.图7a和图7b显示了通过facs测定的c23人源化抗体与molp-8细胞的结合活性。
22.图8显示了c23人源化抗体(通过酵母展示获得)与molp-8细胞的结合活性。
23.图9a和图9b显示了通过facs测定的c23人源化抗体对sk-mel-28细胞的atp酶抑制。
24.图10a至图10c显示了通过facs测定的c14人源化抗体与molp-8细胞的结合活性。
25.图11a至图11d显示了人源化抗体hu23.h5l5在pbmc中对atp介导的t细胞的活化，通过il-2(图11a)、ifn-γ(图11b)、cd4

t细胞增殖(图11c)和cd8

t细胞增殖(图11d)测定。
26.图12a至图12e显示了通过facs检测的人源化抗体hu23.h5l5和hu14.h1l1与sk-mel-5细胞(图12a)、sk-mel-28细胞(图12b)、molp-8细胞(图12c)、chok1-cynocd39细胞(图12d)和chok1-mcd39细胞(图12e)的结合活性。
27.图13a至图13b显示了人源化抗体hu23.h5l5和hu14.h1l1对sk-mel-5细胞(图13a)和molp-8细胞(图13b)的atp酶抑制活性。
28.图14a至图14c显示了抗cd39人源化抗体hu23.h5l5对atp介导的单核细胞的活化，通过cd80(图14a)、cd86(图14b)和cd40(图14c)的表达来测定。
29.图15显示了人源化抗体hu23.h5l5增加atp介导的dc活化，通过测cd83表达(图15a)，增强的t细胞增殖(图15b)和t细胞活化(图15c)来测定。
30.图16显示了人源化抗体hu23.h5l5和hu14.h1l1在molp-8异种移植小鼠中对肿瘤生长的抑制。
31.图17显示了抗cd39人源化抗体hu23.h5l5在nk耗竭的molp-8异种移植小鼠中对肿瘤生长的抑制。
32.图18显示了抗cd39人源化抗体hu23.h5l5在巨噬细胞耗竭的molp-8异种移植小鼠中对肿瘤生长的抑制。
33.图19a显示了人源化抗体hu23.h5l5和hu14.h1l1与参考抗体的表位分组结果。图19b显示了所测试抗体的表位分组。
34.图20显示了人源化抗cd39抗体hu23.h5l5对由lps刺激诱导的人巨噬细胞il1β释放的影响。
35.图21显示了不同剂量(0.03mg/kg、0.3mg/kg、3mg/kg、10mg/kg、30mg/kg)的人源化抗体hu23.h5l5在pbmc移植小鼠中对肿瘤生长的抑制。
36.图22显示了人源化抗体hu23.h5l5、嵌合抗体c34和c35以及参考抗体t895、i394和9-8b的表位作图(epitope mapping)结果。
37.图23a至23c显示了人源化抗体hu23.h5l5逆转由细胞外atp抑制的cd8

t细胞增殖，通过t细胞增殖(图23a)、cd25

细胞(图23b)和活细胞数量(图23c)来测定。
38.图24a至24g显示了本发明所述的示例性抗cd39/tgfβ陷阱(anti-cd39/tgfβtrap)分子的示意图。
39.图25a至25d分别显示了示例性抗cd39/tgfβ陷阱分子对人类tgfβ1(图25a)、人类tgfβ2(图25b)、人类tgfβ3(图25c)和小鼠tgfβ1(图25d)的结合特性。
40.图26显示了示例性抗cd39/tgfβ陷阱分子对人类tgfβ1和tgfβrii的阻断分析结果。
41.图27a和27b分别显示了用molp-8细胞(图27a)和chok1细胞(图27b)通过facs测定
的示例性抗cd39/tgfβ陷阱分子对人类cd39的结合活性。
42.图28a和28b分别显示了通过elisa(图28a)和facs(图28b)测定的示例性抗cd39/tgfβ陷阱分子对人类cd39和tgfβ1同时结合的活性。
43.图29a显示了在转染hek293的细胞中示例性抗cd39/tgfβ陷阱分子的tgfβ报告分析结果。图29b显示了示例性抗cd39/tgfβ陷阱分子在不同cd39蛋白：抗cd39/tgfβ陷阱分子比率下预培养时的tgfβ中和活性。
44.图30a至30c分别显示了示例性抗cd39/tgfβ陷阱分子在molp-8细胞(图30a和30b)和cho细胞(图30c)上的atp酶抑制活性。
45.图31a显示了向同种异体dc诱导的自体t细胞中添加treg可抑制t细胞的ifn-γ分泌。图31b至31d显示了示例性抗cd39/tgfβ陷阱分子对treg介导的人类t细胞抑制的影响，通过cd4

t细胞增殖％(图31b)、cd8

t细胞增殖％(图31c)和ifn-γ分泌改变(图31d)测定。
46.图32提供了一个图表，所述图表描绘了用相同摩尔的抗cd39/tgfβ陷阱分子es014-1和es014-2、抗cd39抗体es014_v2、tgfβ陷阱es014_v1和对照抗体es014_v3处理的人类t细胞的凋亡抑制百分比，如图所示。图32a显示了总t细胞早期凋亡的百分比，其中x轴表示抗体和浓度，y轴表示早期t细胞凋亡的百分比(％)(膜联蛋白v pi-)。图32b显示了总t细胞晚期凋亡的百分比，其中x轴表示抗体和浓度，y轴表示晚期t细胞凋亡的百分比(％)(膜联蛋白v pi )。
47.图33提供了一个图表，所述图表描绘了用相同摩尔的抗cd39/tgfβ陷阱分子es014-1和es014-2、抗cd39抗体es014_v2、tgfβ陷阱es014_v1和对照抗体es014_v3处理的t细胞功能，如图所示。图33a显示了细胞活力和细胞活化的facs，图33b显示了上清液中il-2和ifn-γ的产生。
48.图34提供了一个图表，所述图表描绘了用抗cd39/tgfβ陷阱分子es014-1和es014-2、抗cd39抗体es014_v2、tgfβ陷阱es014_v1和对照抗体es014_v3处理的t细胞上的foxp3表达，如图所示。图34a显示了cd4

t细胞上的foxp3表达的百分比，图34b显示了cd8

t细胞上foxp3表达的百分比。
49.图35提供了一个图表，所述图表描绘了用抗cd39/tgfβ陷阱分子es014-1和es014-2、抗cd39抗体es014_v2、tgfβ陷阱es014_v1和对照抗体es014_v3处理的总t细胞的百分比(％)，如图所示。图35a显示了cd4

t细胞的百分比(％)，以及图35b显示了cd8

t细胞的百分比(％)。
具体实施方式
50.本发明的以下描述只为说明本发明的多种实施方式。因此，此处讨论的具体修改方式不应理解为对申请范围的限制。本领域的技术人员在不偏离本发明范围的情况下即可很容易地得出多种等同方式，变化和修改，应理解这样的等同实施方式包括在本发明范围内。在本发明中引用的所有文献，包括公开出版物、专利和专利申请都通过引用的方式全文并入。
51.定义
52.本发明中使用的术语“抗体”包括任何可结合某特定抗原的免疫球蛋白、单克隆抗体、多克隆抗体、多价抗体、双价抗体、单价抗体、多特异性抗体或双特异性抗体。一个天然
的完整抗体包含两条重(h)链和两条轻(l)链。哺乳动物的重链可分为α、δ、ε、γ和μ，每条重链由一个可变区(vh)以及第一、第二、第三和第四(可选地)恒定区(分别为ch1、ch2、ch3、ch4)组成；哺乳动物的轻链可分为λ或κ，而每条轻链由一个可变区(vl)以及一个恒定区组成。抗体呈“y”型，“y”型结构的茎部由通过二硫键结合的两条重链的第二和第三恒定区组成。“y”型结构的每条臂包括与单条轻链的可变区和恒定区结合的单条重链的可变区和第一恒定区。轻链和重链的可变区决定抗原的结合。每条链的可变区通常含有三个高变区，称互补决定区(cdr)(轻链cdr包含lcdr1、lcdr2、lcdr3，重链cdr包含hcdr1、hcdr2、hcdr3)。本发明中公开的抗体和抗原结合片段的cdr边界可通过kabat、imgt、chothia或al-lazikani命名法命名或识别(al-lazikani,b.,chothia,c.,lesk,a.m.,j.mol.biol.,273(4),927(1997)；chothia,c.et al.,j mol biol.dec 5；186(3):651-63(1985)；chothia,c.and lesk,a.m.,j.mol.biol.,196,901(1987)；chothia,c.et al.,nature.dec 21-28；342(6252):877-83(1989)；kabat e.a.et al.,sequences of proteins of immunological interest,5th ed.public health service,national institutes of health,bethesda,md.(1991)；marie-paule lefranc et al.,developmental and comparative immunology,27:55-77(2003)；marie-paule lefranc et al.,immunome research,1(3),(2005)；marie-paule lefranc,molecular biology of b cells(second edition),chapter26,481-514,(2015))。其中，三个cdr由被称为框架区(fr)(轻链fr包含lfr1、lfr2、lfr3和lfr4，重链fr包含hfr1、hfr2、hfr3和hfr4)的侧翼部分间隔开，框架区比cdr更加高度保守，并形成一个支架支撑高度可变环。重链和轻链的恒定区与抗原结合无关，但具有多种效应功能。抗体依据其重链恒定区的氨基酸序列可以分成几类。根据是否含有α、δ、ε、γ和μ重链，抗体可分别分为五个主要的分类或同种型：iga、igd、ige、igg和igm。几个主要的抗体分类还可分为亚类，如igg1(γ1重链)、igg2(γ2重链)、igg3(γ3重链)、igg4(γ4重链)、iga1(α1重链)或iga2(α2重链)等。
53.在某些实施方式中，本发明提供的抗体包括其任何抗原结合片段。本发明中使用的术语“抗原结合片段”是指由含有一个或多个cdr的抗体的一部分形成的抗体片段，或者与抗原结合但不具有完整的天然抗体结构的任何其他抗体片段。抗原结合片段的例子包括，但不限于，双功能抗体(diabody)、fab、fab’、f(ab’)2、fd、fv片段、二硫键稳定的fv片段(dsfv)、(dsfv)2、双特异性dsfv(dsfv-dsfv’)、二硫键稳定的双抗体(ds diabody)、单链抗体分子(scfv)、scfv二聚体(双价的双功能抗体)、双特异性抗体、多特异性抗体(multispecific antibody)、骆驼化单域抗体(camelized single domain antibody)、纳米抗体(nanobody)、域抗体(domain antibody)和双价域抗体。抗原结合片段能够与亲本抗体结合相同的抗原。
54.抗体的“fab”是指由单条轻链(包括可变区和恒定区)和单条重链的可变区和第一恒定区经二硫键结合起来组成的抗体的一部分。
[0055]“fab
’”
是指包含了部分铰链区的fab片段。
[0056]“f(ab’)
2”是指fab’的二聚体。
[0057]
抗体(例如igg、iga或igd同种型)的“fc”是指由第一重链的第二和第三恒定区经由二硫键与第二重链的第二和第三恒定区连接组成的抗体的一部分。igm和ige同种型抗体的fc还包含第四恒定区。抗体的fc部分负责多种不同的效应功能，例如，抗体依赖性细胞介
导的细胞毒性(adcc)和补体依赖性细胞毒性(cdc)，但在抗原结合中不起作用。
[0058]
抗体的“fv”是指含有完整抗原结合位点的最小抗体片段。fv片段由单条轻链的可变区与单条重链的可变区结合组成。
[0059]“单链fv抗体”或“scfv”是指由轻链可变区与重链可变区直接相互连接或通过肽接头序列连接而成的经改造的抗体(huston js et al.proc natl acad sci usa,85:5879(1988))。
[0060]“单链fv-fc抗体”或“scfv-fc”是指由与抗体fc部分连接的scfv组成的经改造的抗体。
[0061]“骆驼化单域抗体(camelized single domain antibody)”、“重链抗体”或“hcab(heavy-chain-only antibody)”都是指含有两个vh结构域而不含有轻链的抗体(riechmann l.and muyldermans s.,j immunol methods.dec 10；231(1-2):25-38(1999)；muyldermans s.,j biotechnol.jun；74(4):277-302(2001)；wo94/04678；wo94/25591；美国专利号6,005,079)。重链抗体最初来源于驼科(骆驼、单峰驼和美洲驼)。虽然缺失轻链，但是骆驼化抗体(camelized antibody)有确证的抗原结合全部功能(hamers-casterman c.et al.,nature.jun 3；363(6428):446-8(1993)；nguyen vk.et al.immunogenetics.apr；54(1):39-47(2002)；nguyen vk.et al.immunology.may；109(1):93-101(2003))。重链抗体的可变区(vhh结构域)是获得性免疫产生的已知最小的抗原结合单位(koch-nolte f.et al.,faseb j.nov；21(13):3490-8.epub 2007jun 15(2007))。
[0062]“纳米抗体(nanobody)”是指一种抗体片段，其由来自重链抗体的vhh结构域以及两个恒定区ch2和ch3组成。
[0063]“双功能抗体(diabody)”或“dab”包括带有两个抗原结合位点的小抗体片段，其中所述片段含有在同一条多肽链上相连的vh结构域和vl结构域(vh-vl或vl-vh)(请参见，例如，holliger p.et al.,proc natl acad sci usa.jul 1590(14):6444-8(1993)；ep404097；wo93/11161)。两个结构域之间的连接子很短，使同一条链上的两个结构域不能互相配对，从而迫使两个结构域与另一条链的互补结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。这两个抗原结合位点可靶向相同或不同的抗原(或表位)。在一些实施方式中，“双特异性ds双功能抗体”是靶向两种不同抗原(或表位)的双功能抗体。
[0064]“域抗体(domain antibody)”是指仅含有重链可变区或轻链可变区的抗体片段。在某些情况下，两个或更多个vh结构域由肽接头共价连接形成双价或多价域抗体。双价域抗体的两个vh结构域可靶向相同或不同的抗原。
[0065]
本发明中使用的术语“价”是指给定分子中存在特定数量的抗原结合位点。术语“单价”是指仅具有一个抗原结合位点的抗体或抗原结合片段。术语“多价”是指具有多个抗原结合位点的抗体或抗原结合片段。由此，术语“双价”、“四价”和“六价”分别表示抗原结合分子中存在两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段是双价的。在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段是四价的。
[0066]
在本发明中使用的“双特异性”抗体是指具有来源于两个不同的单克隆抗体的片段或者源于一个抗体和另一个蛋白质(例如，tgfβ受体)，并且能够与两个不同的表位结合的人工抗体。所述两个表位可以存在于同一个抗原，或者其可以存在于两个不同的抗原。
[0067]
在某些实施方式中，“scfv二聚体”是双价双功能抗体或双特异性scfv(bsfv)，包含二聚化的两个vh-vl(由肽连接子连接)部分，使得一个部分的vh与另一个部分的vl协作形成两个结合位点，这两个结合位点可靶向相同抗原(或表位)或不同抗原(或表位)。在另一些实施方式中，“scfv二聚体”是双特异性双功能抗体，包含相互连接的vh1-vl2(由肽连接子连接)和vl1-vh2(由肽连接子连接)，使得vh1和vl1协作，vh2和vl2协作，且每个协作的配对具有不同的抗原特异性。
[0068]“dsfv”是指二硫键稳定的fv片段，其单条轻链的可变区与单条重链的可变区之间的连接是二硫键。在一些实施方式中，“(dsfv)
2”或“(dsfv-dsfv’)”含有三条肽链：两个vh部分通过肽连接子(例如长的柔性连接子)相连，并通过二硫键分别与两个vl部分结合。在一些实施方式中，dsfv-dsfv’具有双特异性，其中每对通过二硫键配对的重链和轻链具有不同的抗原特异性。
[0069]
本发明中使用的术语“嵌合”是指具有来源于一种物种的重链和/或轻链的一部分，并且所述重链和/或轻链的其余部分来源于另一不同物种的抗体或抗原结合片段。在一个示例性的实例中，嵌合抗体可以包括来源于人的恒定区和来源于非人动物(例如小鼠)的可变区。在一些实施方式中，所述非人动物是哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、豚鼠或仓鼠。
[0070]
本发明中使用的术语“人源化”是指包括来源于非人动物的cdr、来源于人的fr区、以及来源于人的恒定区(当适用时)的抗体或抗原结合片段。
[0071]
本发明中使用的术语“亲和性”或“亲和力”是指免疫球蛋白分子(即，抗体)或其片段与抗原之间非共价相互作用的强度。
[0072]
本发明中使用的“特异性结合(specific binding)”或“特异性地结合(specifically binds)”是指两分子间的非随机结合反应，例如，抗体和抗原间的反应。特异性结合的特征可以在于结合亲和性，例如由kd值表示，即，当抗原和抗原结合分子之间的结合达到平衡时解离速度与结合速度的比值(koff/kon)。可通过使用本领域公知的任何传统方法测定kd，包括但不限于，表面等离子共振法、octet方法、微量热泳法、hplc-ms方法和facs检测法。≤10-6
m(例如≤5x10-7 m、≤2x10-7 m、≤10-7
m、≤5x10-8 m、≤2x10-8 m、≤10-8
m、≤5x10-9 m、≤4x10-9 m、≤3x10-9 m、≤2x10-9 m或≤10-9
m)的kd值可以表示抗体或其抗原结合片段与cd39(例如人类cd39)之间的特异性结合。
[0073]
本发明中使用的“竞争结合人类cd39”的能力是指第一抗体或其抗原结合片段抑制人类cd39与第二抗cd39抗体之间结合的相互作用到任何可检测的程度的能力。在一些实施方式中，竞争结合人类cd39的抗体或抗原结合片段可将人类cd39与第二抗cd39抗体之间结合的相互作用抑制至少85％或至少90％。在一些实施方式中，这样的抑制作用可以大于95％或大于99％。
[0074]
本发明中使用的术语“表位”是指抗原上与抗体结合的特定的原子基团或氨基酸。如果两种抗体表现出对抗原的竞争性结合，则可能结合抗原上相同或密切相关的表位。表位可以是线性或构象的(即包括间隔开的氨基酸残基)。例如，如果抗体或其抗原结合片段对参考抗体与抗原的结合阻断达到至少85％、或至少90％或至少95％，那么所述抗体或其抗原结合片段可以被认为与所述参考抗体结合相同/密切相关的表位。
[0075]
本发明中使用的术语“氨基酸”是指含有氨基(-nh2)和羧基(-cooh)官能团以及每
个氨基酸特有的侧链的有机化合物。氨基酸名称在本发明中也以标准的单字母或三字母代码表示，总结如下：
[0076][0077][0078]
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本发明中互换使用以指代氨基酸残基的聚合物。这些术语还适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然氨基酸聚合物和非天然氨基酸聚合物。
[0079]
在本发明中当“保守取代”用于氨基酸序列时，是指将一个氨基酸残基用另一个具有相似理化性质的侧链的氨基酸残基替代。例如，可以在具有疏水侧链的氨基酸残基之间(例如met、ala、val、leu和ile)、具有中性亲水侧链的氨基酸残基之间(例如cys、ser、thr、asn和gln)、具有酸性侧链的氨基酸残基之间(例如asp、glu)、具有碱性侧链的氨基酸残基之间(例如his、lys和arg)或具有芳香侧链的氨基酸残基之间(例如trp、tyr和phe)进行保守取代。本领域已知，保守取代通常不会引起蛋白构象结构的显著变化，因此能够保留蛋白质的生物活性。
[0080]
本发明中使用的术语“同源的”是指当最佳比对时核酸序列(或其互补链)或氨基酸序列与另一条序列具有至少60％(例如，至少65％、70％、75％、80％、85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)的序列同一性。
[0081]
当“百分比(％)序列同一性”用于氨基酸序列(或核酸序列)时，是指在进行序列比对，并且必要时引入间隔使相同氨基酸(或核酸)数目达到最多后，在候选序列中，与参比序
列相同的氨基酸(或核酸)残基占所述候选序列的氨基酸(或核酸)残基的百分比。换言之，可以通过用与其比较的参比序列相同的氨基酸残基(或碱基)数除以候选序列或参比序列(以较短者为准)中的氨基酸残基(或碱基)总数来计算氨基酸序列(或核酸序列)的百分比(％)序列同一性。所述氨基酸残基的保守取代可以认为或可以不认为是相同残基。可以通过本领域公开的工具，例如blastn、blastp(美国国家生物技术信息中心网站(ncbi)，也可参见altschul s.f.et al.,j.mol.biol.,215:403
–
410(1990)；stephen f.et al.,nucleic acids res.,25:3389
–
3402(1997))、clustalw2(欧洲生物信息研究所网站，可参见higgins d.g.et al.,methods in enzymology,266:383-402(1996)；larkin m.a.et al.,bioinformatics(oxford,england),23(21):2947-8(2007))和align或megalign(dnastar)软件，对序列进行比对以确定氨基酸(或核酸)序列的百分比序列同一性。本领域技术人员可以使用所述工具的默认参数或根据比对的需要适当调整参数，例如通过挑选合适的算法。
[0082]
本发明中使用的“效应功能”是指抗体的fc区与其效应子(例如，c1复合体和fc受体)结合的生物活性。示例性的效应功能包括抗体与c1复合体上的c1q相互作用介导的补体依赖性细胞毒性(cdc)、抗体的fc区与效应细胞上的fc受体结合介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)以及吞噬作用。可以使用各种检测法(例如fc受体结合测定、c1q结合测定和细胞裂解测定)评估效应功能。
[0083]“分离的”物质已经经人工由自然状态改变。如果自然界中出现某种“分离的”组合物或物质，那么其已经被改变或脱离其原始状态，或二者均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在的多核苷酸或多肽不是“分离的”，但如果这些多核苷酸或多肽与之在天然状态下共存的物质足够分离并以基本上纯的状态存在，则可以认为是“分离的”。“分离的核酸序列”是指分离的核酸分子的序列。在某些实施方式中，“分离的抗体或其抗原结合片段”是指纯度为至少60％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的抗体或其抗原结合片段，其中纯度由电泳方法(例如，sds-page、等电聚焦、毛细管电泳)，或色谱法(例如，离子交换色谱或反相hplc)确定。
[0084]
本发明中使用的术语“载体”是指可将遗传元件操作性地插入其中并使该遗传元件获得表达的一种运载工具，例如生产由该遗传元件编码的蛋白质、rna或dna，或者复制所述遗传元件。载体可用于转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传元件在宿主细胞内得以表达。举例来说，载体包括：质粒、噬菌粒、柯斯质粒(cosmid)、人工染色体如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1衍生的人工染色体(pac)、噬菌体如λ噬菌体或m13噬菌体，以及动物病毒等。载体可含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还可包括协助其进入细胞的成分，包括但不限于，病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳。载体可以是表达载体或克隆载体。本发明提供的载体(例如表达载体)含有本发明所述的编码抗体或其抗原结合片段的核酸序列、至少一个可操作地连接至所述核酸序列的启动子(例如，sv40、cmv、ef-1α)，以及至少一个选择标记。
[0085]
本发明中使用的术语“宿主细胞”是指可以或已经导入外源多核苷酸和/或载体的细胞。
[0086]
术语“受试者”包括人类和非人类动物。非人类动物包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物和非哺乳动物(例如，非人类灵长类、小鼠、大鼠、猫、兔子、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物和爬行动物)。除另有说明外，否则术语“患者”或“受试者”在本发明中可互换使用。
[0087]
术语“抗肿瘤活性”是指肿瘤细胞增殖、生存力或转移活性的降低。例如，抗肿瘤活性可以通过在治疗期间出现的异常细胞的生长速率的下降或肿瘤尺寸的稳定或减少、或者由于与没有治疗的对照相比由于治疗导致的更长的生存期来显示。可以使用可接受的体外或体内肿瘤模型(包括但不限于异种移植物模型、同种异体移植物模型、小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)模型和本领域已知的研究抗肿瘤活性的其他已知模型)来评估抗肿瘤活性。
[0088]
本发明中使用的对某种疾病、病症或状况的“治疗”或“疗法”包括预防或减轻某种疾病、病症或状况，降低某种疾病、病症或状况发生或发展的速度，降低发展出某种疾病、病症或状况的风险，预防或延迟与某种疾病、病症或状况相关的症状发展，减少或终止与某种疾病、病症或状况相关的症状，产生某种疾病、病症或状况的完全或部分的逆转，治愈某种疾病、病症或状况，或以上的组合。
[0089]
术语“诊断(diagnosis)”、“诊断(diagnose)”或“诊断(diagnosing)”是指病理状态、疾病或状况的鉴定，例如cd39相关疾病的鉴定，或指患有cd39相关疾病的可能会受益于特定的治疗方案的受试者的鉴定。在一些实施方式中，诊断包含鉴定cd39的异常含量或活性。在一些实施方式中，诊断是指在受试者中鉴定癌症或自身免疫性疾病。
[0090]
如本发明所用，术语“生物样品”或“样品”是指获自或源自目标受试者的生物组合物，其包含待表征和/或待鉴定的细胞和/或其他分子实体，例如基于物理、生化、化学和/或生理特征来表征和/或鉴定。生物样品包括但不限于通过本领域技术人员已知的任何方法获得的受试者的细胞、组织、器官和/或生物流体。在一些实施方式中，生物样品是流体样品。在一些实施方式中，流体样品是全血、血浆、血清、粘液(包括鼻腔排泄物和痰)、腹膜液、胸膜液、胸腔液、唾液、尿液、滑液、脑脊髓液(csf)、胸腔穿刺液、腹部流体、腹水或心包积液。在一些实施方式中，生物学样品是获自受试者的心脏、肝、脾、肺、肾、皮肤或血管的组织或细胞。
[0091]
术语“可操作地连接(operably link)”或“可操作连接的(operably linked)”是指两个或更多个感兴趣的生物序列的并置(有或没有间隔子或连接子)，其方式使它们处于允许它们以预期方式发挥功能的关系中。当用于多肽时，它意指多肽序列以允许连接产物具有预期生物功能的方式连接。例如，抗体可变区可操作地连接到恒定区以提供具有抗原结合活性的稳定产物。该术语也可用于多核苷酸。例如，当编码多肽的多核苷酸可操作地连接到调控序列(例如，启动子、增强子、沉默子序列等)时，意指多核苷酸序列以允许来自该多核苷酸的多肽的调控表达的方式连接。
[0092]
当用于氨基酸序列(例如肽、多肽或蛋白质)时，术语“融合(fusion)”或“融合的(fused)”是指两个或更多个氨基酸序列的组合，例如通过化学键或重组手段，组合成一个天然不存在的单一氨基酸序列。融合氨基酸序列可通过两个编码多核苷酸序列的遗传重组产生，并可通过将含有重组多核苷酸的构建体引入宿主细胞的方法表达。
[0093]
如本发明所用，“cd39”也被称为entpd1或entpd酶1，是指一种可将atp转化为amp的完整膜蛋白。在结构上，cd39的特征在于两个跨膜结构域、一个较小的胞质域和一个较大的胞外疏水结构域。在某些实施方式中，所述cd39是人类cd39。本发明所用的cd39可以来自
其他动物物种，例如小鼠和食蟹猴等。人类cd39蛋白的示例性序列公开于ncbi ref seq no.np_001767.3中。小鼠(mus musculus)cd39蛋白的示例性序列公开于ncbi ref seq no.np_033978.1中。食蟹猴(cynomolgus)cd39蛋白的示例性序列公开于ncbi ref seq no.xp_015311945.1中。
[0094]
除了cd39之外，entpd酶家族还包含其他几个成员，包括entpd酶2、3、4、5、6、7和8(也称为entpd2、3、4、5、6、7和8，在本发明中可互换使用)。四种entpd酶是典型的细胞表面定位酶，具有面向细胞外的催化位点(entpd酶1、2、3、8)。entpd酶5和6在异源表达后表现出细胞内定位并分泌。entpd酶4和7完全位于细胞内，面向细胞质细胞器内腔。在一些实施方式中，本发明提供的抗体或其抗原结合片段特异性结合cd39(即entpd酶1)，但不与其他家族成员结合，例如entpd酶2、3、5或6。
[0095]
术语“抗cd39抗体部分”是指能够与cd39(例如，人类或猴cd39)特异性结合并且形成靶向cd39和tgfβ的缀合物分子部分的抗体(包括其抗原结合片段)。术语“抗人类cd39抗体部分”是指能够与人类cd39特异性结合并且形成靶向cd39和tgfβ的缀合物分子部分的抗体(包括其抗原结合片段)。
[0096]
本发明中使用的“cd39相关”的疾病、病症或状况是指由cd39的表达或活性的增加或减少引起的、加剧的或与之相关的任何疾病或状况。在一些实施方式中，cd39相关的疾病、病症或状况是免疫相关病症，例如自身免疫性疾病。在一些实施方式中，cd39相关的疾病、病症或状况是与过度细胞增殖有关的病症，例如癌症。在某些实施方式中，cd39相关的疾病或状况的特征在于表达或过表达cd39和或cd39相关基因，例如entpd1、2、3、4、5、6、7或8基因。
[0097]
本发明中使用的术语“转化生长因子β”和“tgfβ”是指具有来自受试者(例如人类)的任何tgfβ的全长天然氨基酸序列的任何tgfβ家族蛋白质，包括前体和成熟tgfβ的潜在形式和相关或非相关复合物(“潜在tgfβ”)。本发明中对此类tgfβ的引用将理解为对当前识别形式中的任何一种的引用，包括tgfβ1、tgfβ2、tgfβ3同种型及其潜在形式，以及对未来识别的人类tgfβ类型的引用，包括从任何已知tgfβ序列衍生的多肽，所述多肽至少约75％，优选地至少约80％，更优选至地至少约85％，更优选地至少约90％，和甚至更优选地至少约95％与所述序列同源。特定术语“tgfβ1”、“tgfβ2”和“tgfβ3”是指文献中定义的tgfβ，例如，derynck et al.,nature,cancer res.,47:707(1987)；seyedin et al.,j.biol.chem.,261:5693-5695(1986)；demartin et al.,embo j.,6:3673(1987)；kuppner et al.,int.j.cancer,42:562(1988)。术语“转化生长因子β”、“tgfβ”、“tgfbeta”、“tgf-β”、“tgf-beta”、“tgfb”、“tgf-b”、“tgfb”和“tgf-b”在本发明中可以互换使用。
[0098]
如本发明所用，术语“人类tgfβ1”是指人类tgfb1基因(例如，野生型人类tgfb1基因)编码的tgfβ1蛋白。示例性野生型人类tgfβ1蛋白由genbank登录号np_000651.3提供。如本发明所用，术语“人类tgfβ2”是指人类tgfb2基因(例如，野生型人类tgfb2基因)编码的tgfβ2蛋白。示例性野生型人类tgfβ2蛋白由genbank登录号np_001129071.1和np_003229.1提供。如本发明所用，术语“人类tgfβ3”是指人类tgfb3基因(例如，野生型人类tgfb3基因)编码的tgfβ3蛋白。示例性野生型人类tgfβ3蛋白由genbank登录号np_003230.1、np_001316868.1和np_001316867.1提供。
[0099]
如本发明所用，术语“小鼠tgfβ1”、“小鼠tgfβ2”和“小鼠tgfβ3”分别是指小鼠
tgfb1基因(例如，野生型小鼠tgfb1基因)、小鼠tgfb2基因(例如，野生型小鼠tgfb2基因)和小鼠tgfb3基因(例如，野生型小鼠tgfb3基因)编码的tgfβ1蛋白、tgfβ2蛋白和tgfβ3蛋白。示例性野生型小鼠(mus musculus)tgfβ1蛋白由genbank登录号np_035707.1和caa08900.1提供。示例性野生型小鼠tgfβ2蛋白由genbank登录号np_033393.2提供。示例性野生型小鼠tgfβ3蛋白由genbank登录号aaa40422.1提供。
[0100]
本发明中使用的术语“tgfβ受体”是指与至少一个tgfβ同种型结合的任何受体。总体上，所述tgfβ受体包括tgfβ受体i(tgfβri)、tgfβ受体ii(tgfβrii)或tgfβ受体iii(tgfβriii)。
[0101]
对于人类，术语“tgfβ受体i”或“tgfβri”是指具有野生型人类tgfβ受体1同种型序列(例如，genbank登录号abd46753.1的氨基酸序列)或具有与genbank登录号abd46753.1的氨基酸序列基本相同的序列的多肽。所述tgfβri可能保留至少0.1％、至少0.5％、至少1％、至少5％、至少10％、至少25％、至少35％、至少50％、至少75％、至少90％、至少95％或至少99％野生型序列的tgfβ结合活性。表达的tgfβri的多肽缺少信号序列。
[0102]
对于人类，术语“tgfβ受体ii”或“tgfβrii”是指具有野生型人类tgfβ受体2同种型序列(例如，genbank登录号np_001020018.1的氨基酸序列)或具有野生型人类tgfβ受体2同种型序列(例如，genbank登录号np_003233.4的氨基酸序列)或具有与genbank登录号np_001020018.1或genbank登录号np_003233.4的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。所述tgfβrii可能保留至少0.1％、至少0.5％、至少1％、至少5％、至少10％、至少25％、至少35％、至少50％、至少75％、至少90％、至少95％或至少99％野生型序列的tgfβ结合活性。表达的tgfβrii的多肽缺少信号序列。
[0103]
对于人类，术语“tgfβ受体iii”或“tgfβriii”是指具有野生型人类tgfβ受体3同种型a序列(例如，genbank登录号np_003234.2的氨基酸序列)或具有野生型人类tgfβ受体3同种型b序列(例如，genbank登录号np_001182612.1的氨基酸序列)或具有与genbank登录号np_003234.2或genbank登录号np_001182612.1的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。所述tgfβrii可能保留至少0.1％、至少0.5％、至少1％、至少5％、至少10％、至少25％、至少35％、至少50％、至少75％、至少90％、至少95％或至少99％野生型序列的tgfβ结合活性。表达的tgfβriii的多肽缺少信号序列。
[0104]
本发明中使用的“tgfβ相关”的疾病、病症或状况是指由tgfβ的表达或活性的增加或减少引起的、加剧的或与之相关的任何疾病或状况。在一些实施方式中，tgfβ相关的疾病、病症或状况是免疫相关病症，例如自身免疫性疾病。在一些实施方式中，tgfβ相关的疾病、病症或状况是与过度细胞增殖有关的病症，例如癌症。在某些实施方式中，tgfβ相关的疾病或状况的特征在于表达或过表达tgfβ和或tgfβ相关基因，例如tgfb1、tgfb2、tgfb3基因。
[0105]
术语“抗tgfβ抗体部分”是指能够特异性结合tgfβ(例如，tgfβ1、tgfβ2、tgfβ3)并且形成靶向cd39和tgfβ的蛋白部分的抗体。术语“抗人类tgfβ抗体部分”是指能够特异性结合人类tgfβ并且形成靶向cd39和tgfβ的蛋白部分的抗体。
[0106]
术语“药学上可接受的”是指所指的运载体、溶媒、稀释剂、赋形剂和/或盐，总的来
说在化学上和/或在物理上与制剂中的其他配料相兼容，并在生理上与其接收者相兼容。
[0107]
本发明中使用的术语“cd39阳性细胞”是指在细胞表面上表达cd39的细胞(例如，吞噬细胞)。
[0108]
本发明中使用的术语“通路”是指一组生物化学反应，所述反应能够以逐步的过程将一种化合物转化为另一种化合物。通路中第一步的产物可能是第二步的底物，第二步的产物可能是第三步的底物，依此类推。该通路的成分包括通路中的所有底物、辅因子、副产物、中间产物、终产物和任何酶。因此，本发明中使用的术语“腺苷通路”是指生物化学通路的集合，其中任何一种都涉及腺苷，例如腺苷的产生或腺苷转化为其他物质。本发明中使用的术语“tgfβ信号通路”是指生物化学通路的集合，其中任何一个都涉及tgfβ，例如tgfβ的产生或tgfβ转化为其他物质。
[0109]
本发明中使用的术语“拮抗剂”是指抑制蛋白质、多肽或肽的表达水平或活性，从而减少蛋白质、多肽或肽的数量、形成、功能和/或下游信号的分子。例如，本发明所述的“cd39拮抗剂”是指抑制cd39表达水平或活性，从而减少cd39的数量、形成、功能和/或下游信号的分子。又例如，本发明所述的“tgfβ拮抗剂”是指抑制tgfβ表达水平或活性，从而减少tgfβ的数量、形成、功能和/或下游信号的分子。
[0110]
如本发明所用，术语“编码的(encoded)”或“编码(encoding)”是指能够转录成mrna和/或翻译成肽或蛋白质的方法。术语“编码序列”或“基因”是指编码肽或蛋白质的多核苷酸序列。这两个术语在本发明中可以互换使用。在一些实施方式中，编码序列是从信使rna(mrna)反向转录的互补dna(cdna)序列。在一些实施例中，编码序列为mrna。
[0111]
本发明中使用的术语“反义核苷酸”是指能够通过氢键与目标核酸杂交的寡聚化合物。例如，“靶向cd39编码序列的反义核苷酸”是指能够与cd39编码序列或其一部分杂交的核苷酸。
[0112]
靶向cd39和tgfβ的缀合物分子
[0113]
当前免疫检查点抑制剂(例如pd1和ctla-4)的一个潜在限制是富含腺苷和tgfβ的肿瘤微环境(“tme”)。肿瘤局部微环境中的腺苷和tgfβ信号在过滤t细胞中可能使其向treg倾斜，并减弱免疫效应细胞的激活。本技术的发明人意外地发现，通过一种同时靶向cd39和tgfβ的新的缀合物分子，由于同时阻断腺苷通路(通过抑制cd39)和tgfβ信号通路(通过tgfβ陷阱)，可能实现更免疫正常化的tme和协同抗肿瘤效应。事实上，本技术的发明人证明，与使用tgfβ受体或抗cd39抗体的单一疗法相比，同时靶向本发明所述的cd39和tgfβ的缀合物分子显示出协同抗肿瘤效应，特别是在t细胞存活、细胞因子产生和treg抑制方面。
[0114]
在一个方面，本发明提供了一种缀合物分子，所述缀合物分子包括能够干扰cd39和其底物之间相互作用的cd39抑制部分和能够干扰tgfβ和其受体之间相互作用的tgfβ抑制部分。所述缀合物分子可能是小分子、化合物(天然的或合成的)、肽、多肽、蛋白质、干扰rna、信使rna等。在某些实施方式中，所述缀合物分子不是两种或更多种不同物质的混合物(即，两种或更多种不同物质只是放在一起，没有化学结合)。在某些实施方式中，所述缀合物分子是双功能分子，能够干扰cd39与其底物之间的相互作用，并且能够干扰tgfβ与其受体之间的相互作用。
[0115]
腺苷通路通过调节免疫和炎症细胞(如巨噬细胞、树突状细胞、髓源性抑制细胞、t细胞和自然杀伤(nk)细胞)的功能，参与免疫耐受肿瘤微环境的创建。腺苷通路还通过分别
在癌细胞和内皮细胞上表达的腺苷受体干扰癌细胞增殖、凋亡和血管生成，调节癌症的生长和扩散。实体瘤表达高水平的cd39和cd73，以及低水平的核苷转运体(nts)、外周腺苷脱氨酶及其辅因子cd26，导致癌症环境中腺苷信号的增加。在某些实施方式中，本发明所述的cd39抑制部分能够干扰cd39和atp/adp之间的相互作用。在某些实施方式中，所述缀合物分子的cd39抑制部分在治疗、预防或减轻癌症中特别有用。
[0116]
在某些实施方式中，所述缀合物分子的cd39抑制部分为选自下组的cd39拮抗剂：cd39结合剂、靶向cd39编码序列的rnai、靶向cd39编码序列的反义核苷酸以及与cd39竞争结合其底物的试剂。
[0117]
如果分子导致cd39的表达水平(转录或翻译水平)或活性显著降低，则认为该分子抑制cd39的表达水平或活性。类似地，如果分子导致cd39与其底物之间的结合显著减少，从而导致cd39介导的下游信号和功能显著减少，则认为该分子抑制cd39与其底物(例如atp或adp)之间的结合。例如，如果减少至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，则认为减少显著。
[0118]
cd39结合剂(拮抗剂)能够通过两种方式发挥作用。在一些实施方式中，本发明所述的cd39结合剂能够与cd39竞争结合其底物，从而干扰、阻断或以其他方式阻止cd39结合其底物。这种类型的拮抗剂结合底物，但不会触发预期的信号转导，也称为“竞争性拮抗剂”。在其他实施方式中，本发明所述的cd39结合剂能够以足够的亲和性和特异性结合并隔离cd39，以基本上干扰、阻断或以其他方式阻止cd39结合其底物。这种类型的拮抗剂也称为“中和拮抗剂”，并且能够包括例如针对cd39的抗体或适体，所述抗体或适体特异性地结合cd39。
[0119]
在某些实施方式中，所述cd39结合剂选自下组：特异性识别cd39的抗体或其抗原结合片段，以及结合cd39的小分子化合物。
[0120]
本发明中使用的术语“小分子化合物”是指可作为生物过程的酶底物或调节剂的低分子量化合物。总体上，“小分子化合物”是一种尺寸小于5千道尔顿(kd)的分子。在一些实施方式中，小分子小于约4kd、3kd、约2kd或约1kd。在一些实施方式中，小分子小于约800道尔顿(d)、约600d、约500d、约400d、约300d、约200d或约100d。在一些实施方式中，小分子小于约2000g/mol、小于约1500g/mol、小于约1000g/mol、小于约800g/mol，或小于约500g/mol。在一些实施方式中，小分子为非聚合物。在一些实施方式中，根据本发明，小分子不是蛋白质、多肽、寡肽、肽、多核苷酸、寡核苷酸、多糖、糖蛋白、蛋白聚糖等。在一些实施方式中，小分子是治疗药物。在一些实施方式中，小分子是佐剂。在一些实施方式中，小分子是药物。
[0121]
在某些实施方式中，所述缀合物分子的tgfβ抑制部分能够干扰tgfβ和tgfβ受体之间的相互作用。在某些实施方式中，tgfβ和tgfβ受体之间的相互作用被一种药剂阻断，所述药剂可破坏tgfβ信号通路内的信号转导级联，并破坏或阻止tgfβ或tgfβ超家族配体与其内源性受体结合。能够用于确定tgfβ信号通路抑制剂抑制活性的示例性分析包括但不限于电泳迁移率转移分析、抗体超转移分析以及tgfβ诱导基因报告分析，例如，如wo 2006/012954中所述。
[0122]
在某些实施方式中，所述缀合物分子的tgfβ抑制部分为选自下组的tgfβ拮抗剂：tgfβ结合剂、靶向tgfβ编码序列的rnai、靶向tgfβ编码序列的反义核苷酸以及与tgfβ竞争
结合其受体(例如tgfβri、tgfβrii或tgfβriii)的试剂。
[0123]
如果分子导致tgfβ的表达水平(转录或翻译水平)或活性显著降低，则认为该分子抑制tgfβ的表达水平或活性。类似地，如果分子导致tgfβ与其受体之间的结合显著减少，从而导致tgfβ介导的下游信号和功能显著减少，则认为该分子抑制tgfβ与其受体(例如tgfβri、tgfβrii或tgfβriii)之间的结合。例如，如果减少至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，则认为减少显著。
[0124]
tgfβ结合剂(拮抗剂)能够通过两种方式发挥作用。在一些实施方式中，本发明所述的tgfβ结合剂能够与tgfβ竞争结合其受体，从而干扰、阻断或以其他方式阻止tgfβ结合其受体。这种类型的拮抗剂结合受体，但不会触发预期的信号转导，也称为“竞争性拮抗剂”。在其他实施方式中，本发明所述的tgfβ结合剂能够以足够的亲和性和特异性结合并隔离tgfβ，以基本上干扰、阻断或以其他方式阻止tgfβ结合其受体。这种类型的拮抗剂也称为“中和拮抗剂”，并且能够包括例如针对tgfβ的抗体或适体，所述抗体或适体特异性地结合tgfβ。
[0125]
在某些实施方式中，所述tgfβ结合剂选自下组：特异性识别tgfβ的抗体或其抗原结合片段，以及结合tgfβ的小分子化合物。
[0126]
在某些实施方式中，本发明所述的缀合物分子为融合蛋白，其包括与tgfβ结合域连接的cd39结合域。
[0127]
如本发明所用，术语“结合域”指能够特异性结合到目标分子或复合物的部分。所述结合域可能包含小分子、肽、修饰肽(例如，具有非天然氨基酸残基的肽)、多肽、蛋白质、抗体或其抗原结合片段、配体、核酸或其任何组合。例如，术语“cd39结合域”是指能够特异性结合cd39(例如，人和/或小鼠cd39)的部分；术语“tgfβ结合域”是指能够特异性结合tgfβ家族的一个或多个家族成员或亚型(例如tgfβ1、tgfβ2或tgfβ3)的部分。所述“tgfβ结合域”在本发明中也可称为“tgfβ陷阱(tgfβtrap)”。因此，包含与本发明所述的tgfβ结合域连接的cd39结合域的蛋白质在本发明中也可能称为“抗cd39/tgfβ陷阱”。
[0128]
在某些实施方式中，本发明所述的缀合物分子特异性结合人类tgfβ1、人类tgfβ2和/或人类tgfβ3。在某些实施方式中，本发明所述的缀合物分子以类似的亲和性特异性结合人类tgfβ1和小鼠tgfβ1。在某些实施方式中，本发明所述的缀合物分子以不超过3x10-11
m(例如，不超过2x10-11
m、不超过1x10-11
m、不超过0.9x10-11
m、不超过0.8x10-11
m、不超过0.7x10-11
m、不超过0.6x10-11
m、不超过0.5x10-11
m)的ec
50
值与人类tgfβ1特异性结合，所述ec
50
值通过elisa分析测定。在某些实施方式中，本发明所述的缀合物分子能够以不超过4x10-10
m(例如，不超过3x10-10
m、不超过2x10-10
m、不超过1x10-10
m、不超过0.5x10-10
m)的ic
50
值阻断tgfβ1和tgfβrii结合，所述ic
50
值通过阻断分析法测定。在某些实施方式中，本发明所述的缀合物分子能够以剂量依赖性方式与人类cd39结合，所述方式通过facs分析测定。在某些实施方式中，本发明所述的缀合物分子能够同时结合cd39和tgfβ，所述结合通过elisa分析或facs分析测定。在某些实施方式中，本发明所述的缀合物分子能够以不超过4x10-11
m的ic
50
值抑制tgfβ信号，所述ic
50
值通过tgf-βsmad报告分析测定。在某些实施方式中，本发明所述的缀合物分子能够以不超过7x10-10
m(例如，不超过6x10-10
m、不超过5x10-10
m、不超过4x10-10
m、不超过3x10-10
m、不超过2x10-10
m、不超过1x10-10
m、不超过0.5x10-10
m)的
ic
50
值抑制表达cd39细胞的atp酶活性，所述ic
50
值通过atp酶活性分析测定。在某些实施方式中，本发明所述的缀合物分子能够以不超过4x10-10
m(例如，不超过3x10-10
m、不超过2x10-10
m、不超过1x10-10
m、不超过0.5x10-10
m)的kd值与人类cd39特异性结合，所述kd值通过octet分析测定。在某些实施方式中，本发明所述的缀合物分子能够以不超过4x10-11
m(例如，不超过3x10-11
m、不超过2x10-11
m、不超过1x10-11
m、不超过0.5x10-11
m)的kd值与人类tgfβ1特异性结合，所述kd值通过octet分析测定。在某些实施方式中，本发明所述的缀合物分子能够恢复t细胞功能，所述过程通过treg抑制分析测定。在某些实施方式中，本发明所述的缀合物分子能够以剂量依赖性方式抑制人类t细胞凋亡。在某些实施方式中，本发明所述的缀合物分子能够以剂量依赖性方式通过刺激促进人类t细胞存活和活化。在某些实施方式中，本发明所述的缀合物分子能够阻断tgfβ诱导的foxp3在总t细胞上的表达。在某些实施方式中，本发明所述的缀合物分子能够恢复atp诱导的对人t细胞增殖的抑制。
[0129]
tgfβ结合域
[0130]
在某些实施方式中，所述tgfβ结合域与人类和/或小鼠tgfβ结合。在某些实施方式中，所述tgfβ结合域能够拮抗和/或抑制tgfβ信号通路。在某些实施方式中，所述tgfβ结合域能够拮抗和/或抑制tgfβ。在本发明中，所述tgfβ结合域可以是特异性结合到tgfβ家族的一个或多个家族成员或同种型的任何部分。在某些实施方式中，所述tgfβ结合域包括结合tgfβ1(例如，人类tgfβ1)、tgfβ2(例如，人类tgfβ2)和/或tgfβ3(例如，人类tgfβ3)的蛋白质，或具有类似或改善的tgfβ结合亲和性的其变体。在某些实施方式中，所述tgfβ结合域与tgfβ1(例如，人类tgfβ1)结合。在某些实施方式中，所述tgfβ结合域与tgfβ2(例如，人类tgfβ2)结合。在某些实施方式中，所述tgfβ结合域与tgfβ3(例如，人类tgfβ3)结合。在某些实施方式中，所述tgfβ结合域与tgfβ1(例如，人类tgfβ1)和tgfβ2(例如，人类tgfβ2)特异性结合。在某些实施方式中，所述tgfβ结合域与tgfβ1(例如，人类tgfβ1)和tgfβ3(例如，人类tgfβ3)特异性结合。在某些实施方式中，所述tgfβ结合域与tgfβ2(例如，人类tgfβ2)和tgfβ3(例如，人类tgfβ3)特异性结合。在某些实施方式中，所述tgfβ结合域与tgfβ1(例如，人类tgfβ1)、tgfβ2(例如，人类tgfβ2)和tgfβ3(例如，人类tgfβ3)特异性结合。本领域技术人员将理解，结合到tgfβ家族的一个家族成员或同种型的tgfβ结合域可能能够以类似或更高的亲和性结合到tgfβ家族的一个或多个其他家族成员或同种型。
[0131]
本发明所述的tgfβ结合域可能是抗tgfβ抗体部分或其抗原结合片段。示例性抗tgfβ抗体部分包括fresolimumab和metelimumab，以及在例如us7494651b2、us8383780b2、us8012482b2、wo2017141208a1中描述的抗tgfβ抗体部分或其抗原结合片段，其每一个都通过整体引用并入本发明中。
[0132]
本发明所述的tgfβ结合域也可能是tgfβ受体(例如，tgfβri、tgfβrii、tgfβriii)或其片段。在某些实施方式中，所述tgfβ结合域包括可溶性tgfβ受体(例如，可溶性人tgfβ受体)或其片段。在某些实施方式中，所述tgfβ结合域包括tgfβ受体(例如，人tgfβ受体)的胞外域(ecd)。在某些实施方式中，所述tgfβ受体选自下组：tgfβ受体i(tgfβri)、tgfβ受体ii(tgfβrii)、tgfβ受体iii(tgfβriii)及其任何组合。在某些实施方式中，所述tgfβ受体是tgfβri(例如，人tgfβri)。在某些实施方式中，所述tgfβ受体是tgfβrii(例如，人tgfβrii)。在某些实施方式中，所述tgfβ受体是tgfβriii(例如，人tgfβriii)。
[0133]
在某些实施方式中，所述tgfβ结合域包括tgfβri(例如人tgfβri)的ecd、tgfβrii
(例如人tgfβrii)的ecd、tgfβriii(例如人tgfβriii)的ecd或其任何组合。在某些实施方式中，所述tgfβ结合域包括tgfβri(例如人tgfβri)的ecd。在某些实施方式中，所述tgfβ结合域包括tgfβrii(例如人tgfβrii)的ecd。在某些实施方式中，所述tgfβ结合域包括tgfβriii(例如人tgfβriii)的ecd。在某些实施方式中，所述tgfβ结合域包括tgfβri(例如人tgfβri)的ecd和tgfβrii(例如人tgfβrii)的ecd。在某些实施方式中，所述tgfβ结合域包括tgfβri(例如人tgfβri)的ecd和tgfβriii(例如人tgfβriii)的ecd。在某些实施方式中，所述tgfβ结合域包括tgfβrii(例如人tgfβrii)的ecd和tgfβriii(例如人tgfβriii)的ecd。
[0134]
在某些实施方式中，所述tgfβ受体的ecd包括选自下组的氨基酸序列或者由选自下组的氨基酸序列组成：如seq id no:163、seq id no:164或seq id no:165所示的氨基酸序列，或与其具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性但仍然保持与tgfβ的结合特异性的氨基酸序列。
[0135]
在某些实施方式中，所述tgfβ结合域包括tgfβ受体的两个或更多个(例如，三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个等)ecd。在某些实施方式中，所述两个或更多个ecd源自相同的tgfβ受体。例如，所述两个或更多个ecd源自tgfβri(例如人tgfβri)，在本发明中也被成为“tgfβri ecd”或“tgfβri ecds”。又例如，所述两个或更多个ecd源自tgfβrii(例如人tgfβrii)，在本发明中也被成为“tgfβrii ecd”或“tgfβrii ecds”。又例如，所述两个或更多个ecd源自tgfβriii(例如人tgfβriii)，在本发明中也被成为“tgfβriii ecd”或“tgfβriii ecds”。在某些实施方式中，所述两个或更多个ecd的氨基酸序列是相同的。在某些实施方式中，所述两个或更多个ecd的氨基酸序列的差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个氨基酸。在某些实施方式中，所述两个或更多个ecd的氨基酸序列不同但相互具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性。在某些实施方式中，所述两个或更多个ecd的氨基酸序列不同但与seq id no:163-165中任何一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性但仍然保持与tgfβ的结合特异性。
[0136]
在某些实施方式中，所述两个或更多个ecd源自至少两个不同的tgfβ受体。例如，两个或更多个(例如，三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个等)ecd源自至少两个(例如，两个、三个)不同的tgfβ受体，所述受体选自tgfβri(例如，人tgfβri)、tgfβrii(例如，人tgfβrii)、tgfβriii(例如，人tgfβriii)。在某些实施方式中，所述两个或更多个ecd包括源自tgfβri(例如人tgfβri)的第一ecd和源自tgfβrii(例如人tgfβrii)的第二ecd。在某些实施方式中，所述两个或更多个ecd包括源自tgfβri(例如人tgfβri)的第一ecd和源自tgfβriii(例如人tgfβriii)的第二ecd。在某些实施方式中，所述两个或更多个ecd包括源自tgfβrii(例如人tgfβrii)的第一ecd和源自tgfβriii(例如人tgfβriii)的第二ecd。
[0137]
在某些实施方式中，所述抗cd39/tgfβ陷阱阻断tgfβ和tgfβ受体相互作用的能力随着tgfβ受体ecd的增加而提高。例如，有四个tgfβrii ecd的抗cd39/tgfβ陷阱比有两个tgfβrii ecd的抗cd39/tgfβ陷阱在阻断tgfβ和tgfβrii之间的相互作用方面更有效。
[0138]
在某些实施方式中，所述两个或更多个ecd可操作地串联。在某些实施方式中，所述两个或更多个ecd共价或非共价地相互连接。在某些实施方式中，所述两个或更多个ecd
直接相互连接或通过连接子相互连接。在某些实施方式中，所述两个或更多个ecd通过第一连接子连接。
[0139]
本发明中使用的术语“连接子”或“接头”是指具有1、2、3、4或5个氨基酸残基，或长度介于5和15、20、30、50或更多个氨基酸残基之间的人工氨基酸序列，通过肽键连接，并用于连接一个或多个多肽。连接子可能有也可能没有二级结构。连接子序列在本领域是已知的，例如，参见holliger et al.,proc.natl.acad.sci.usa 90:6444-6448(1993)；poljak et al.,structure 2:1121-1123(1994)。
[0140]
在某些实施方式中，所述第一连接子选自下组：可切割连接子、非可切割连接子、肽连接子、柔性连接子、刚性连接子、螺旋连接子和非螺旋连接子。可以使用本领域已知的任何合适的连接子。在某些实施方式中，所述第一连接子包含肽连接子。例如，本发明中的有用连接子可能富含甘氨酸和丝氨酸残基。示例包括具有包含苏氨酸/丝氨酸和甘氨酸的单个或重复序列的连接子，例如tgggg(seq id no:172)、ggggs(seq id no:173)或sgggg(seq id no:174)或其串联重复(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多重复)。在某些实施方式中，本发明中使用的第一连接子包括ggggsggggsggggs(seq id no:175)。可选地，所述连接子可能是包含如gapgggggaaaaaggggg(seq id no:176)所示的氨基酸序列的一个或多个顺序或串联重复的长肽链。在某些实施方式中，所述第一连接子包括seq id no:176的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多顺序或串联重复。在某些实施方式中，所述肽接头包括gs连接子。在某些实施方式中，所述gs连接子包括gggs(seq id no:177)或seq id no:173的一个或多个重复。在某些实施方式中，所述肽连接子包括如ggggsggggsggggsg(seq id no:182)所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第一连接子包括选自下组的氨基酸序列或由选自下组的氨基酸序列组成：与seq id no:172-177，182中的任何一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性的氨基酸序列。上述第一连接子的描述适用于下述的第一连接子。
[0141]
在某些实施方式中，所述tgfβ结合域包括选自下组的氨基酸序列：seq id no:166、seq id no:167、seq id no:168、seq id no:169、seq id no:170、seq id no:171或其任何组合。
[0142]
几个示例性tgfβ受体ecd的氨基酸序列如下表30所示。用下划线示出了第一连接子。
[0143]
表30：示例性tgfβ受体ecd的氨基酸序列
[0144]
[0145]
[0146]
[0147][0148]
cd39结合域
[0149]
在某些实施方式中，本发明所述的cd39结合域与cd39(例如，人cd39、食蟹猴cd39或小鼠cd39)结合。在某些实施方式中，本发明所述的cd39结合域与人cd39结合。
[0150]
在某些实施方式中，本发明所述的cd39结合域包括抗cd39抗体部分。示例性抗cd39抗体部分包括，例如，us10556959b2、us20200277394a1、ep3429692a1、wo2018065552a1中描述的抗cd39抗体或其抗原结合片段，其每一个都通过整体引用并入本发明中。在某些实施方式中，本发明所述的抗cd39抗体部分一节和示例性抗cd39抗体部分一节中公开了示例性抗cd39抗体部分。
[0151]
在某些实施方式中，所述抗cd39抗体部分包含一个或多个cdr。在某些实施方式中，所述抗cd39抗体部分包含如本发明的示例性抗cd39抗体部分一节中所描述的一个或多个cdr。在某些实施方式中，所述抗cd39抗体部分包含重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)。在某些实施方式中，所述抗cd39抗体部分包括如本发明的示例性抗cd39抗体部分一节中所公开的抗cd39抗体的vh和vl。
[0152]
在某些实施方式中，所述抗cd39抗体部分进一步包括附加到重链可变区的羧基末端的重链恒定区。在某些实施方式中，所述重链恒定区源自下组：iga、igd、ige、igg和igm。在某些实施方式中，所述重链恒定区源自人igg1、igg2、igg3、igg4、iga1、iga2或igm。在某些实施方式中，所述重链恒定区源自人igg1(seq id no:178)或igg4(seq id no:179)。在某些实施方式中，所述抗cd39抗体部分进一步包括附加到轻链可变区的羧基末端的轻链恒定区。在某些实施方式中，所述轻链恒定区源自kappa轻链或lamda轻链。kappa轻链恒定区和lamda轻链恒定区的氨基酸序列分别如seq id no:180和seq id no:181所示。几个示例性恒定区的氨基酸序列如下表31所示。
[0153]
表31：示例性恒定区的氨基酸序列
[0154][0155]
tgfβ结合域和cd39结合域之间的连接
[0156]
在本发明中，所述tgfβ结合域可连接到cd39结合域的任何部分(例如抗cd39抗体部分)。在某些实施方式中，所述tgfβ结合域在选自下组的位置连接到抗cd39抗体部分：所述抗cd39抗体部分的1)所述重链可变区的氨基末端，2)所述轻链可变区的氨基末端，3)所述重链可变区的羧基末端；4)所述轻链可变区的羧基末端；5)所述重链恒定区的羧基末端；以及6)所述轻链恒定区的羧基末端。
[0157]
所述tgfβ结合域能够被连接(共价地或非共价地)到抗cd39抗体部分(例如，直接或通过第二连接子)的任何部分(例如，免疫球蛋白的氨基末端或羧基末端)。共价键可以是化学键或基因连接。在某些实施方式中，所述第二连接子选自下组：可切割连接子、非可切割连接子、肽连接子、柔性连接子、刚性连接子、螺旋连接子和非螺旋连接子。可以使用本领域已知的任何合适的连接子。例如，本发明中的有用连接子可能富含甘氨酸和丝氨酸残基。示例包括具有包含苏氨酸/丝氨酸和甘氨酸的单个或重复序列的连接体，例如tgggg(seq id no:172)、ggggs(seq id no:173)或sgggg(seq id no:174)或其串联重复(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多重复)。在某些实施方式中，本发明中使用的第二连接子包括ggggsggggsggggs(seq id no:175)。可选地，所述连接子可能是包含如gapgggggaaaaaggggg(seq id no:176)所示的氨基酸序列的一个或多个顺序或串联重复的长肽链。在某些实施方式中，所述第二连接子包括seq id no:176的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多顺序或串联重复。在某些实施方式中，所述肽接头包括gs连接子。在某些实施方式中，所述gs连接子包括gggs(seq id no:177)或seq id no:173的一个或多个重复。在某些
实施方式中，所述肽连接子包括如ggggsggggsggggsg(seq id no:182)所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二连接子包括选自下组的氨基酸序列或由选自下组的氨基酸序列组成：与seq id no:172-177，182中的任何一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性的氨基酸序列。上述第二连接子的描述适用于下述的第二连接子。
[0158]
在某些实施方式中，所述tgfβ结合域连接到抗cd39抗体部分的重链可变区。所述tgfβ结合域能够连接至重链可变区的任何部分，包括抗cd39抗体部分的重链可变区的氨基末端(n-末端)或羧基末端(c-末端)氨基酸残基。在某些实施方式中，所述tgfβ结合域连接(例如，直接或通过第二连接子连接)到抗cd39抗体部分的重链可变区的氨基末端。在某些实施方式中，所述tgfβ结合域连接(例如，直接或通过第二连接子连接)到抗cd39抗体部分的重链可变区的羧基末端。
[0159]
示例性抗cd39/tgfβ陷阱分子的示意图如本发明的图24c所示，所述分子包括两个连接到抗cd39抗体部分的每个重链可变区的氨基末端的tgfβrii ecd。
[0160]
在某些实施方式中，所述tgfβ结合域连接抗cd39抗体部分的轻链可变区。所述tgfβ结合域能够连接轻链可变区的任何部分，包括抗cd39抗体部分的轻链可变区的氨基末端或羧基末端的氨基酸残基。在某些实施方式中，所述tgfβ结合域连接(例如，直接或通过第二连接子连接)到抗cd39抗体部分的轻链可变区的氨基末端。在某些实施方式中，所述tgfβ结合域连接(例如，直接或通过第二连接子连接)到抗cd39抗体部分的轻链可变区的羧基末端。
[0161]
示例性抗cd39/tgfβ陷阱分子的示意图如本发明的图24d所示，所述分子包括两个连接到抗cd39抗体部分的每个轻链可变区的氨基末端的tgfβrii ecd。
[0162]
在某些实施方式中，所述tgfβ结合域连接抗cd39抗体部分的重链恒定区。所述tgfβ结合域能够连接到重链恒定区的任何部分，包括抗cd39抗体部分的重链恒定区的氨基末端或羧基末端的氨基酸残基。在某些实施方式中，所述tgfβ结合域连接(例如，直接或通过第二连接子连接)到抗cd39抗体部分的重链恒定区的氨基末端。在某些实施方式中，所述tgfβ结合域连接(例如，直接或通过第二连接子连接)到抗cd39抗体部分的重链恒定区的羧基末端。
[0163]
示例性抗cd39/tgfβ陷阱分子的示意图如本发明的图24a所示，所述分子包括一个连接到抗cd39抗体部分的每个重链恒定区的羧基末端的tgfβrii ecd。示例性抗cd39/tgfβ陷阱分子的示意图如本发明的图24b所示，所述分子包括两个连接到抗cd39抗体部分的每个重链恒定区的羧基末端的tgfβrii ecd。
[0164]
在某些实施方式中，所述tgfβ结合域连接抗cd39抗体部分的轻链恒定区。所述tgfβ结合域能够连接轻链恒定区的任何部分，包括抗cd39抗体部分的轻链恒定区的氨基末端或羧基末端的氨基酸残基。在某些实施方式中，所述tgfβ结合域连接(例如，直接或通过第二连接子连接)到抗cd39抗体部分的轻链恒定区的氨基末端。在某些实施方式中，所述tgfβ结合域连接(例如，直接或通过第二连接子连接)到抗cd39抗体部分的轻链恒定区的羧基末端。
[0165]
示例性抗cd39/tgfβ陷阱分子的示意图如本发明的图24f所示，所述分子包括两个连接到抗cd39抗体部分的每个轻链恒定区的羧基末端的tgfβrii ecd。
[0166]
在某些实施方式中，本发明所述的蛋白质包括两个或更多个(例如，三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)tgfβ结合域，所述tgfβ结合域全部连接(例如，直接或通过第二连接子连接)到抗cd39抗体部分的重链可变区。在某些实施方式中，本发明所述的蛋白质包括两个或更多个(例如，三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)tgfβ结合域，所述tgfβ结合域全部连接(例如，直接或通过第二连接子连接)到抗cd39抗体部分的重链可变区的氨基末端。在某些实施方式中，本发明所述的蛋白质包括两个或更多个(例如，三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)tgfβ结合域，所述tgfβ结合域全部连接(例如，直接或通过第二连接子连接)到抗cd39抗体部分的重链可变区的羧基末端。在某些实施方式中，本发明所述的蛋白质包括两个或更多个(例如，三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)tgfβ结合域，所述tgfβ结合域分别连接(例如，直接或通过第二连接子连接)到抗cd39抗体部分的重链可变区的氨基末端和羧基末端。在某些实施方式中，所述两个或更多个tgfβ结合域直接或通过第一连接子相互连接。
[0167]
在某些实施方式中，本发明所述的蛋白质包括两个或更多个(例如，三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)tgfβ结合域，所述tgfβ结合域全部连接(例如，直接或通过第二连接子连接)到抗cd39抗体部分的轻链可变区。在某些实施方式中，本发明所述的蛋白质包括两个或更多个(例如，三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)tgfβ结合域，所述tgfβ结合域全部连接(例如，直接或通过第二连接子连接)到抗cd39抗体部分的轻链可变区的氨基末端。在某些实施方式中，本发明所述的蛋白质包括两个或更多个(例如，三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)tgfβ结合域，所述tgfβ结合域全部连接(例如，直接或通过第二连接子连接)到抗cd39抗体部分的轻链可变区的羧基末端。在某些实施方式中，本发明所述的蛋白质包括两个或更多个(例如，三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)tgfβ结合域，所述tgfβ结合域分别连接(例如，直接或通过第二连接子连接)到抗cd39抗体部分的轻链可变区的氨基末端和羧基末端。在某些实施方式中，所述两个或更多个tgfβ结合域直接或通过第一连接子相互连接。
[0168]
在某些实施方式中，本发明所述的靶向cd39和tgfβ的蛋白质包括两个或更多个(例如，三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)tgfβ结合域，所述tgfβ结合域分别连接到抗cd39抗体部分的重链和轻链可变区。在某些实施方式中，本发明所述的蛋白质包括至少一个(例如，一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)tgfβ结合域，所述tgfβ结合域连接到抗cd39抗体部分的重链可变区的氨基末端，以及至少一个(例如，一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)tgfβ结合域，所述tgfβ结合域连接到抗cd39抗体部分的轻链可变区的氨基末端。在某些实施方式中，本发明所述的蛋白质包括至少一个(例如，一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)tgfβ结合域，所述tgfβ结合域连接到抗cd39抗体部分重链可变区的羧基末端，以及至少一个(例如，一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)tgfβ结合域，所述tgfβ结合域连接到抗cd39抗体部分的轻链可变区的羧基末端。在某些实施方式中，本发明所述的蛋白质包括至少一个(例如，一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)tgfβ结合域，所述tgfβ结合域连接到抗cd39抗体部分的重链可变区的氨基末端，以及至少一个(例如，一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)tgfβ结合域，所述tgfβ结合域连接到抗cd39抗体部分的轻
链可变区的羧基末端。在某些实施方式中，本发明所述的蛋白质包括至少一个(例如，一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)tgfβ结合域，所述tgfβ结合域连接到抗cd39抗体部分的重链可变区的羧基末端，以及至少一个(例如，一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)tgfβ结合域，所述tgfβ结合域连接到抗cd39抗体部分的轻链可变区的氨基末端。
[0169]
示例性抗cd39/tgfβ陷阱分子的示意图如本发明的图24e所示，所述分子包括一个连接到抗cd39抗体部分的每个重链可变区的氨基末端的tgfβrii ecd，以及一个连接到抗cd39抗体部分的每个轻链可变区的氨基末端的tgfβrii ecd。
[0170]
在某些实施方式中，本发明所述的靶向cd39和tgfβ的蛋白质包括两个或更多个(例如，三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)tgfβ结合域，所述tgfβ结合域全部连接(例如，直接或通过第二连接子连接)到抗cd39抗体部分的重链恒定区。在某些实施方式中，本发明所述的靶向cd39和tgfβ的蛋白质包括两个或更多个(例如，三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)tgfβ结合域，所述tgfβ结合域全部连接(例如，直接或通过第二连接子连接)到抗cd39抗体部分的重链恒定区的氨基末端。在某些实施方式中，本发明所述的靶向cd39和tgfβ的蛋白质包括两个或更多个(例如，三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)tgfβ结合域，所述tgfβ结合域全部连接(例如，直接或通过第二连接子连接)到抗cd39抗体部分的重链恒定区的羧基末端。在某些实施方式中，本发明所述的靶向cd39和tgfβ的蛋白质包括两个或更多个(例如，三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)tgfβ结合域，所述tgfβ结合域分别连接(例如，直接或通过第二连接子连接)到抗cd39抗体部分的重链恒定区的氨基末端和羧基末端。在某些实施方式中，所述两个或更多个tgfβ结合域直接或通过第一连接子相互连接。
[0171]
在某些实施方式中，本发明所述的靶向cd39和tgfβ的蛋白质包括两个或更多个(例如，三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)tgfβ结合域，所述tgfβ结合域全部连接(例如，直接或通过第二连接子连接)到抗cd39抗体部分的轻链恒定区。在某些实施方式中，本发明所述的靶向cd39和tgfβ的蛋白质包括两个或更多个(例如，三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)tgfβ结合域，所述tgfβ结合域全部连接(例如，直接或通过第二连接子连接)到抗cd39抗体部分的轻链恒定区的氨基末端。在某些实施方式中，本发明所述的靶向cd39和tgfβ的蛋白质包括两个或更多个(例如，三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)tgfβ结合域，所述tgfβ结合域全部连接(例如，直接或通过第二连接子连接)到抗cd39抗体部分的轻链恒定区的羧基末端。在某些实施方式中，本发明所述的靶向cd39和tgfβ的蛋白质包括两个或更多个(例如，三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)tgfβ结合域，所述tgfβ结合域分别连接(例如，直接或通过第二连接子连接)到抗cd39抗体部分的轻链恒定区的氨基末端和羧基末端。在某些实施方式中，所述两个或更多个tgfβ结合域直接或通过第一连接子相互连接。
[0172]
在某些实施方式中，本发明所述的蛋白质包括两个或更多个tgfβ结合域，所述tgfβ结合域分别连接(例如，直接或通过第二连接子连接)到抗cd39抗体部分的重链和轻链恒定区。在某些实施方式中，本发明所述的蛋白质包括至少一个(例如，一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)tgfβ结合域，所述tgfβ结合域连接到抗cd39抗体部分的重链恒定区的氨基末端，以及至少一个(例如，一个、二个、三个、四个、五
个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)tgfβ结合域，所述tgfβ结合域连接到抗cd39抗体部分的轻链恒定区的氨基末端。在某些实施方式中，本发明所述的蛋白质包括至少一个(例如，一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)tgfβ结合域，所述tgfβ结合域连接到抗cd39抗体部分的重链恒定区的羧基末端，以及至少一个(例如，一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)tgfβ结合域，所述tgfβ结合域连接到抗cd39抗体部分的轻链恒定区的羧基末端。在某些实施方式中，本发明所述的蛋白质包括至少一个(例如，一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)tgfβ结合域，所述tgfβ结合域连接到抗cd39抗体部分重链恒定区的氨基末端，以及至少一个(例如，一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)tgfβ结合域，所述tgfβ结合域连接到抗cd39抗体部分轻链恒定区的羧基末端。在某些实施方式中，本发明所述的蛋白质包括至少一个(例如，一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)tgfβ结合域，所述tgfβ结合域连接到抗cd39抗体部分的重链恒定区的羧基末端，以及至少一个(例如，一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)tgfβ结合域，所述tgfβ结合域连接到抗cd39抗体部分的轻链恒定区的氨基末端。
[0173]
示例性抗cd39/tgfβ陷阱分子的示意图如本发明的图24g所示，所述分子包括一个连接到抗cd39抗体部分的每个重链恒定区的羧基末端的tgfβrii ecd，以及两个连接到抗cd39抗体部分的每个轻链恒定区的羧基末端的tgfβrii ecd。
[0174]
在某些实施方式中，包括连接到抗cd39抗体部分的重链(例如，重链可变区、重链恒定区)或轻链(例如，轻链可变区、轻链恒定区)c-末端的tgfβ结合域的抗cd39/tgfβ陷阱分子，比连接到抗cd39抗体部分的重链(例如，重链可变区、重链恒定区)或轻链(例如，轻链可变区、轻链恒定区)n-末端的tgfβ结合域的抗cd39/tgfβ陷阱分子，与cd39和/或tgfβ结合更有效力。在某些实施方式中，包括连接到抗cd39抗体部分的重链(例如，重链可变区、重链恒定区)或轻链(例如，轻链可变区、轻链恒定区)n-末端的tgfβ结合域的抗cd39/tgfβ陷阱分子，比连接到抗cd39抗体部分的重链(例如，重链可变区、重链恒定区)或轻链(例如，轻链可变区、轻链恒定区)c-末端的tgfβ结合域的抗cd39/tgfβ陷阱分子，与cd39和/或tgfβ结合更有效力。
[0175]
抗cd39抗体部分
[0176]
在某些实施方式中，本发明提供的缀合物分子的cd39结合域包括抗cd39抗体部分或其抗原结合片段。在某些实施方式中，所述抗cd39抗体部分及其抗原结合片段能够与cd39特异性结合。
[0177]
在某些实施方式中，本发明提供的抗cd39抗体部分及其抗原结合片段能够以不超过10-7
m、不超过8
×
10-8
m、不超过5
×
10-8
m、不超过2
×
10-8
m、不超过8
×
10-9
m、不超过5
×
10-9
m、不超过2
×
10-9
m、不超过10-9
m、不超过8
×
10-10
m、不超过7
×
10-10
m或不超过6
×
10-10
m的kd值与人类cd39特异性结合，所述kd值是通过biacore检测法测定的。biacore检测法基于表面等离振子共振技术(参见，例如，murphy,m.et al.,current protocols in protein science,chapter 19,unit 19.14,2006)。在某些实施方式中，通过本发明的实施例5.1中所述的方法测定kd值。在某些实施方式中，kd值在约25℃或约37℃下测量。在某些实施方式中，本发明提供的抗cd39抗体部分及其抗原结合片段在25℃下测量的kd值与在37℃下测量的kd值相当，例如在25℃下测量的kd值是在37℃下测得的kd值的约80％至约150％、约90％
至约130％、或约90％至约120％、约90％至约110％。
[0178]
在某些实施方式中，本发明提供的抗cd39抗体部分及其抗原结合片段以不超过10-8
m、不超过8
×
10-9
m、不超过5
×
10-9
m、不超过4
×
10-9
m、不超过3
×
10-9
m、不超过2
×
10-9
m、不超过1
×
10-9
m、不超过9
×
10-10
m、不超过8
×
10-10
m、不超过7
×
10-10
m或不超过6
×
10-10
m的kd值与人类cd39特异性结合，所述kd值是通过octet检测法测定的。octet检测法基于生物层干涉技术(参见，例如，abdiche,yasmina n.,et al.analytical biochemistry 386.2(2009):172-180和sun y s.,instrumentation science&technology,2014,42(2):109-127)。在某些实施方式中，通过本发明的实施例5.1中所述的方法测定kd值。
[0179]
本发明提供的抗体部分或其抗原结合片段与人类cd39的结合也可以用“半最大有效浓度”(ec
50
)值表示，该值是指观察到抗体的最大结合的50％时的抗体浓度。可以通过本领域已知的结合检测法，例如直接或间接结合检测法(例如酶联免疫吸附检测法(elisa)、facs检测法和其他结合检测法)来测定ec
50
值。在某些实施方式中，本发明提供的抗体部分及其抗原结合片段以不超过10-7
m、不超过8
×
10-8
m、不超过5
×
10-8
m、不超过2
×
10-8
m、不超过10-8
m、不超过8
×
10-9
m、不超过5
×
10-9
m、不超过2
×
10-9
m、不超过10-9
m、不超过8
×
10-10
m、不超过7
×
10-10
m或不超过6
×
10-10m的ec
50
(即50％结合浓度)与人类cd39特异性结合，所述ec
50
值是通过facs(流式细胞荧光分选技术)检测法测定的。在某些实施方式中，所述结合是通过elisa或facs检测法测定的。
[0180]
在一些实施方式中，本发明提供的抗cd39抗体部分或其抗原结合片段与人类cd39(即entpd酶1)特异性结合。在一些实施方式中，本发明提供的抗cd39抗体部分或其抗原结合片段不与entpd酶家族的其他成员结合。在一些实施方式中，根据elisa检测法测定，本发明提供的抗cd39抗体部分或其抗原结合片段与人类cd39特异性结合，但不与entpd酶2、3、5或6特异性结合。
[0181]
在某些实施方式中，例如，根据facs检测法测定，本发明提供的抗cd39抗体部分及其抗原结合片段与人类cd39特异性结合，但不与小鼠cd39特异性结合。
[0182]
在某些实施方式中，本发明提供的抗cd39抗体部分及其抗原结合片段以不超过10-7
m、不超过8
×
10-8
m、不超过5
×
10-8
m、不超过2
×
10-8
m、不超过10-8
m、不超过8
×
10-9
m、不超过5
×
10-9
m、不超过2
×
10-9
m、不超过10-9
m、不超过8
×
10-10
m、不超过7
×
10-10
m或不超过6
×
10-10
m的ec
50
特异性地与食蟹猴cd39结合，所述ec
50
通过facs检测法测定。
[0183]
在某些实施方式中，本发明提供的抗cd39抗体部分及其抗原结合片段以不超过50nm、不超过40nm、不超过30nm、不超过20nm、不超过10nm、不超过8nm、不超过5nm、不超过3nm、不超过1nm、不超过0.9nm、不超过0.8nm、不超过0.7nm、不超过0.6nm、不超过0.5nm、不超过0.4nm、不超过0.3nm、不超过0.2nm、不超过0.1nm、不超过0.09nm、不超过0.08nm、不超过0.07nm、不超过0.06nm或不超过0.05nm的ic
50
抑制在表达cd39的细胞中的atp酶活性，所述ic
50
通过atp酶活性分析测定。可以使用本领域已知的方法来确定atp酶活性测定，例如通过比色检测作为atp酶活性的结果而释放的磷酸盐。在某些实施方式中，通过本发明的实施例3.3中描述的那些方法确定atp酶活性。
[0184]
在某些实施方式中，本发明提供的抗cd39抗体部分及其抗原结合片段能够以不超过50nm(例如，不超过40nm、不超过30nm、不超过20nm、不超过10nm、不超过5nm、不超过3nm、不超过2nm、不超过1nm、不超过0.5nm或不超过0.2nm)的浓度增强atp介导的单核细胞活化，
no:4)、dynmy(seq id no:5)、dtyvh(seq id no:6)、lintytgeptyaddfkd(seq id no:7)、eirlksnkygthyaesvkg(seq id no:8)、qirlnpdnyathx1aesvkg(seq id no:9)、x
58
idpax
59
x
60
nikydpkfqg(seq id no:151)、fidpyngytsynqkfkg(seq id no:11)、ridpaidnskydpkfqg(seq id no:12)、kgiyydyvwffdv(seq id no:13)、qldlywffdv(seq id no:14)、hgx2rgfay(seq id no:15)、spyyygsgyrifdv(seq id no:16)、iygyddayyfdy(seq id no:17)、yycalydgynvyamdy(seq id no:18)、kasqdinryia(seq id no:19)、rasqsisdylh(seq id no:20)、kssqslldsdgrthln(seq id no:21)、safssvnymh(seq id no:22)、satssvsymh(seq id no:23)、rssknllhsngityly(seq id no:24)、ytstllp(seq id no:25)、yasqsis(seq id no:26)、lvsklds(seq id no:27)、ttsnlas(seq id no:28)、stsnlas(seq id no:29)、rastlas(seq id no:30)、lqysnllt(seq id no:31)、qnghslplt(seq id no:32)、wqgtlfpwt(seq id no:33)、qqrstypft(seq id no:34)、qqritypft(seq id no:35)和aqllelpht(seq id no:36)，其中x1为y或f，x2为s或t，x
58
为r或k，x
59
为n、g、s或q，x
60
为g、a或d。在某些实施方式中，本发明所述的抗cd39抗体部分及其抗原结合片段具有不超过一个、两个或三个对如seq id nos:1-9、11-36和151所示的序列中任何一个的氨基酸残基取代。
[0196]
本发明中使用的抗体“mab13”是指包括重链可变区和轻链可变区的单克隆抗体，其中所述重链可变区具有如seq id no:42所示的序列，所述轻链可变区具有如seq id no:51所示的序列。
[0197]
本发明中使用的抗体“mab14”是指包括重链可变区和轻链可变区的单克隆抗体，其中所述重链可变区具有如seq id no:43所示的序列，所述轻链可变区具有如seq id no:52所示的序列。
[0198]
本发明中使用的抗体“mab19”是指包括重链可变区和轻链可变区的单克隆抗体，其中所述重链可变区具有如seq id no:44所示的序列，所述轻链可变区具有如seq id no:53所示的序列。
[0199]
本发明中使用的抗体“mab21”是指包括重链可变区和轻链可变区的单克隆抗体，其中所述重链可变区具有如seq id no:45所示的序列，所述轻链可变区具有如seq id no:54所示的序列。
[0200]
本发明中使用的抗体“mab23”是指包括重链可变区和轻链可变区的单克隆抗体，其中所述重链可变区具有如seq id no:47所示的序列，所述轻链可变区具有如seq id no:56所示的序列。
[0201]
本发明中使用的抗体“mab34”是指包括重链可变区和轻链可变区的单克隆抗体，其中所述重链可变区具有如seq id no:49所示的序列，所述轻链可变区具有如seq id no:58所示的序列。
[0202]
本发明中使用的抗体“mab35”是指包括重链可变区和轻链可变区的单克隆抗体，其中所述重链可变区具有如seq id no:50所示的序列，所述轻链可变区具有如seq id no:59所示的序列。
[0203]
在某些实施方式中，本发明所述的抗cd39抗体部分及其抗原结合片段包括抗体mab13、mab14、mab19、mab21、mab23、mab34或mab35的一个或多个(例如，1、2、3、4、5或6个)cdr序列。
[0204]
在某些实施方式中，本发明所述的抗cd39抗体部分及其抗原结合片段包括hcdr1、hcdr2和hcdr3，和/或lcdr1、lcdr2和lcdr3，其中所述hcdr1包括选自下组的氨基酸序列：seq id no:1-6，所述hcdr2包括选自下组的氨基酸序列：seq id no:7-9、11-12和151，所述hcdr3包括选自下组的氨基酸序列：seq id no:13-18，所述lcdr1包括选自下组的氨基酸序列：seq id no:19-24，所述lcdr2包括选自下组的氨基酸序列：seq id no:25-30，所述lcdr3包括选自下组的氨基酸序列：seq id no:31-36。
[0205]
在某些实施方式中，本发明所述的抗cd39抗体部分及其抗原结合片段包括hcdr1、hcdr2和hcdr3，和/或lcdr1、lcdr2和lcdr3，其中所述hcdr1包括如seq id no:1所示的序列，所述hcdr2包括如seq id no:7所示的序列，所述hcdr3包括如seq id no:13所示的序列，所述lcdr1包括如seq id no:19所示的序列，所述lcdr2包括如seq id no:25所示的序列，所述lcdr3包括如seq id no:31所示的序列。
[0206]
在某些实施方式中，本发明所述的抗cd39抗体部分及其抗原结合片段包括hcdr1、hcdr2和hcdr3，和/或lcdr1、lcdr2和lcdr3，其中所述hcdr1包括如seq id no:2所示的序列，所述hcdr2包括如seq id no:8所示的序列，所述hcdr3包括如seq id no:14所示的序列，所述lcdr1包括如seq id no:20所示的序列，所述lcdr2包括如seq id no:26所示的序列，所述lcdr3包括如seq id no:32所示的序列。
[0207]
在某些实施方式中，本发明所述的抗cd39抗体部分及其抗原结合片段包括hcdr1、hcdr2和hcdr3，和/或lcdr1、lcdr2和lcdr3，其中所述hcdr1包括如seq id no:3所示的序列，所述hcdr2包括如seq id no:37所示的序列，所述hcdr3包括如seq id no:40所示的序列，所述lcdr1包括如seq id no:21所示的序列，所述lcdr2包括如seq id no:27所示的序列，所述lcdr3包括如seq id no:33所示的序列。
[0208]
在某些实施方式中，本发明所述的抗cd39抗体部分及其抗原结合片段包括hcdr1、hcdr2和hcdr3，和/或lcdr1、lcdr2和lcdr3，其中所述hcdr1包括如seq id no:3所示的序列，所述hcdr2包括如seq id no:38所示的序列，所述hcdr3包括如seq id no:41所示的序列，所述lcdr1包括如seq id no:21所示的序列，所述lcdr2包括如seq id no:27所示的序列，所述lcdr3包括如seq id no:33所示的序列。
[0209]
在某些实施方式中，本发明所述的抗cd39抗体部分及其抗原结合片段包括hcdr1、hcdr2和hcdr3，和/或lcdr1、lcdr2和lcdr3，其中所述hcdr1包括如seq id no:4所示的序列，所述hcdr2包括如seq id no:10所示的序列，所述hcdr3包括如seq id no:16所示的序列，所述lcdr1包括如seq id no:22所示的序列，所述lcdr2包括如seq id no:28所示的序列，所述lcdr3包括如seq id no:34所示的序列。
[0210]
本发明所述的抗cd39抗体部分及其抗原结合片段包括hcdr1、hcdr2和hcdr3，和/或lcdr1、lcdr2和lcdr3，其中所述hcdr1包括如seq id no:5所示的序列，所述hcdr2包括如seq id no:11所示的序列，所述hcdr3包括如seq id no:17所示的序列，所述lcdr1包括如seq id no:23所示的序列，所述lcdr2包括如seq id no:29所示的序列，所述lcdr3包括如seq id no:35所示的序列。
[0211]
在某些实施方式中，本发明所述的抗cd39抗体部分及其抗原结合片段包括hcdr1、hcdr2和hcdr3，和/或lcdr1、lcdr2和lcdr3，其中所述hcdr1包括如seq id no:6所示的序列，所述hcdr2包括如seq id no:12所示的序列，所述hcdr3包括如seq id no:18所示的序
列，所述lcdr1包括如seq id no:24所示的序列，所述lcdr2包括如seq id no:30所示的序列，所述lcdr3包括如seq id no:36所示的序列。
[0212]
下表1显示了抗体部分mab13、mab14、mab19、mab21、mab23、mab34和mab35的cdr氨基酸序列。所述cdr边界是根据kabat规则定义或确定的。下表2显示了抗体部分mab13、mab14、mab19、mab21、mab23、mab34和mab35的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
[0213]
表1：7个单克隆抗体部分的cdr氨基酸序列
[0214][0215]
[0216]
表2：7个单克隆抗体部分的可变区氨基酸序列
[0217]
[0218][0219]
鉴于每个抗体部分mab13、mab14、mab19、mab21、mab23、mab34和mab35均可以结合至cd39，并且抗原结合特异性主要由cdr1、cdr2和cdr3区提供，抗体部分mab13、mab14、mab19、mab21、mab23、mab34和mab35的hcdr1、hcdr2和hcdr3序列以及lcdr1、lcdr2和lcdr3序列可以被“混合并匹配”(即，来自不同抗体部分的cdr可以被混合并匹配，但每个抗体部分必须包含hcdr1、hcdr2和hcdr3以及lcdr1、lcdr2和lcdr3)，以产生本发明的抗cd39结合分子。可以使用上文和实施例中所述的结合测定法来测试此类“混合并匹配”抗体的cd39结合。优选地，当vh cdr序列被混合并匹配时，来自特定vh序列的hcdr1、hcdr2和/或hcdr3序列被结构相似的cdr序列取代。同样，当vl cdr序列被混合并匹配时，来自特定vl序列的lcdr1、lcdr2和/或lcdr3序列优选被结构相似的cdr序列取代。例如，抗体部分mab13和mab19的hcdr1具有一些结构相似性，因此易于混合并匹配。对于本领域技术人员显而易见的是，可以通过将一个或多个vh和/或vl cdr序列用本发明公开的单克隆抗体部分mab13、mab14、mab19、mab21、mab23、mab34和mab35的cdr序列中结构相似的序列替换来产生新的vh和vl序列。
[0220]
已知cdr负责抗原结合。然而，已经发现并非所有6个cdr都是必不可少的或不可改变的。换句话说，可以替换或改变或修饰抗cd39抗体部分mab13、mab14、mab19、mab21、mab23、mab34和mab35中的一个或多个cdr，但基本上保留与cd39的特异性结合亲和性。
[0221]
在某些实施方式中，本发明所述的抗cd39抗体部分及其抗原结合片段包含适当的框架区(fr)序列，只要所述的抗体部分及其抗原结合片段可以与cd39特异性结合。上述的
表1中所示的cdr序列获取自小鼠抗体，但可使用本领域公知的合适方法(例如，重组技术)将其嫁接到任何合适物种(例如，小鼠、人、大鼠、兔以及其他)的任何合适的fr序列。
[0222]
在某些实施方式中，本发明所述的抗cd39抗体部分及其抗原结合片段是人源化的。预期人源化的抗体部分或其抗原结合片段在人体具有降低的免疫原性。人源化的抗体部分在其可变区是嵌合的，因为非人cdr序列被嫁接到人或基本上是人的fr序列中。抗体部分或抗原结合片段的人源化基本上可通过在人免疫球蛋白基因上用非人(例如，小鼠)cdr基因替换对应的人cdr基因来完成(参见，例如jones et al.(1986)nature 321:522-525；riechmann et al.(1988)nature332:323-327；verhoeyen et al.(1988)science 239:1534-1536)。
[0223]
可以使用本领域公知的方法选择合适的人重链和轻链可变结构域，以达到这一目的。在一个示例性的实例中，可以使用“最佳拟合(best-fit)”的方法，其中对非人(例如，啮齿动物)抗体可变结构域序列进行筛选，或者将其与已知的人可变结构域序列的数据库进行blast比对，并且识别出最接近非人查询序列的人序列，用作用于嫁接非人cdr序列的人框架(参见，例如sims et al.,(1993)j.immunol.151:2296；chothia et al.(1987)j.mot.biol.196:901)。可选地，可以将源自所有人抗体的共有序列的框架用于嫁接非人cdr(参见，例如carter et al.(1992)proc.natl.acad.sci.usa,89:4285；presta et al.(1993)j.immunol.,151:2623)。
[0224]
在某些实施方式中，本发明提供c14的16种人源化抗体部分，其分别被命名为hu14.h1l1、hu14.h2l1、hu14.h3l1、hu14.h4l1、hu14.h1l2、hu14.h2l2、hu14.h3l2、hu14.h4l2、hu14.h1l3、hu14.h2l3、hu14.h3l3、hu14.h4l3、hu14.h1l4、hu14.h2l4、hu14.h3l4和hu14.h4l4。c14的每种人源化抗体部分的重链可变区和轻链可变区的seq id no如实施例5.1的表16所示。c14的16种人源化抗体部分中的每一种均包括hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，所述hcdr1包括如seq id no:2所示的序列，所述hcdr2包括如seq id no:8所示的序列，所述hcdr3包括如seq id no:14所示的序列，所述lcdr1包括如seq id no:20所示的序列，所述lcdr2包括如seq id no:26所示的序列，和所述lcdr3包括如seq id no:32所示的序列。所述cdr边界是根据kabat规则定义或确定的。
[0225]
在一些实施方式中，本发明提供c23的31种人源化抗体部分，其分别被命名为hu23.h1l1、hu23.h2l1、hu23.h3l1、hu23.h4l1、hu23.h1l2、hu23.h2l2、hu23.h3l2、hu23.h4l2、hu23.h1l3、hu23.h2l3、hu23.h3l3、hu23.h4l3、hu23.h1l4、hu23.h2l4、hu23.h3l4、hu23.h4l4、hu23.h5l1、hu23.h6l1、hu23.h7l1、hu23.h1l5、hu23.h5l5、hu23.h6l5、hu23.h7l5、hu23.h1l6、hu23.h5l6、hu23.h6l6、hu23.h7l6、hu23.h1l7、hu23.h5l7、hu23.h6l7和hu23.h7l7。c23的每种人源化抗体部分的重链和轻链可变区的seq id no如实施例5.1的表13和14所示。c23的31种人源化抗体部分中的每一种均包括hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，所述hcdr1包括如seq id no:4所示的序列，所述hcdr2包括如seq id no:10所示的序列，所述hcdr3包括如seq id no:16所示的序列；所述lcdr1包括如seq id no:22所示的序列，所述lcdr2包括如seq id no:28所示的序列，和所述lcdr3包括如seq id no:34所示的序列。所述cdr边界是根据kabat规则定义或鉴定的。
[0226]
在一些实施方式中，本发明还提供6种人源化抗体部分，其与c23具有相同的cdr，不同之处在于hcdr2的氨基酸序列不同。在一些实施方式中，这些c23变体(c23’)的人源化
抗体部分的hcdr2的氨基酸序列包括如x
58
idpax
59
x
60
nikydpkfqg(seq id no:151)所示的氨基酸序列，其中x
58
是r或k，x
59
是n、g、s或q，x
60
是g、a或d。在一些实施方式中，这些c23变体(c23’)的人源化抗体部分的hcdr2的氨基酸序列包括选自下组的序列：ridpaggnikydpkfqg(seq id no:134)、ridpasgnikydpkfqg(seq id no:135)、ridpaqgnikydpkfqg(seq id no:136)、ridpananikydpkfqg(seq id no:137)、ridpandnikydpkfqg(seq id no:138)和kidpangnikydpkfqg(seq id no:139)。所述cdr边界是根据kabat规则定义或鉴定的。
[0227]
在一些实施方式中，本发明还提供通过酵母展示的c23变体的4种人源化抗体部分，其被命名为hu23.201、hu23.203、hu23.207和hu23.211。人源化抗体部分hu23.201、hu23.203、hu23.207和hu23.211的重链可变区和轻链可变区如实施例5.1的表15所示。4种人源化抗体部分hu23.201、hu23.203、hu23.207和hu23.211中的每一种均包括hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，所述hcdr1包括如seq id no:4所示的序列，所述hcdr2包括如seq id no:10所示的序列，所述hcdr3包括如seq id no:16所示的序列；所述lcdr1包括如seq id no:22所示的序列，所述lcdr2包括如seq id no:28所示的序列，所述lcdr3包括如seq id no:34所示的序列。cdr边界是根据kabat规则定义或确定的。
[0228]
下表3显示了人源化c14重链可变区的4个变体(即hu14.vh_1、hu14.vh_2、hu14.vh_3和hu14.vh_4)和人源化c14轻链可变区的4个变体(即hu14.vl_1、hu14.vl_2、hu14.vl_3和hu14.vl_4)。下表4显示了人源化c14重链和轻链可变区的fr的氨基酸序列。下表5显示了嵌合抗体部分c14的16种人源化抗体部分的重链和轻链的fr氨基酸序列，16种人源化抗体部分分别被命名为hu14.h1l1、hu14.h2l1、hu14.h3l1、hu14.h4l1、hu14.h1l2、hu14.h2l2、hu14.h3l2、hu14.h4l2、hu14.h1l3、hu14.h2l3、hu14.h3l3、hu14.h4l3、hu14.h1l4、hu14.h2l4、hu14.h3l4、hu14.h4l4。这16种人源化抗体部分的重链可变区和轻链可变区如实施例5.1的表16所示。
[0229]
表3：c14人源化抗体部分的人源化可变区的氨基酸序列
[0230][0231]
表4：c14人源化抗体部分的人源化fr的氨基酸序列
[0232]
[0233][0234]
表5：c14人源化抗体部分的每种人源化重链可变区和轻链可变区的fr氨基酸序列
[0235][0236]
下表6显示了人源化c23重链可变区的7个变体(即hu23.vh_1、hu23.vh_2、hu23.vh_3、hu23.vh_4、hu23.vh_5、hu23.vh_6和hu23.vh_7)和人源化c23轻链可变区的的7个变体(即hu23.vl_1、hu23.vl_2、hu23.vl_3、hu23.vl_4、hu23.vl_5、hu23.vl_6和hu23.vl_7)。下表7显示了通过酵母展示获得的用于嵌合抗体部分c23的4种人源化抗体部分的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。下表8显示了c23的35种人源化抗体部分的fr氨基酸序列。下表9显示了c23的35种人源化抗体部分的每条重链和轻链的fr氨基酸序列。
[0237]
表6：c23人源化抗体部分可变区的氨基酸序列
[0238]
[0239][0240]
表7：通过酵母展示获得的c23人源化抗体部分的人源化可变区的氨基酸序列
[0241][0242]
表8：c23人源化抗体部分的人源化fr的氨基酸序列
[0243]
[0244][0245]
表9：c23人源化抗体部分的每种人源化重链可变区和轻链可变区的fr氨基酸序列
[0246]
[0247][0248]
在某些实施方式中，本发明提供的人源化抗cd39抗体部分或其抗原结合片段基本上由除了非人cdr序列以外的所有人的序列组成。在一些实施方式中，可变区fr和恒定区(如果存在的话)全部或基本上来自人免疫球蛋白序列。人fr序列和人恒定区序列可以源自不同的人免疫球蛋白基因，例如，源自一种人抗体的fr序列和源自另一种人抗体的恒定区。在一些实施方式中，人源化抗体部分或其抗原结合片段包含人重链hfr1-4和/或轻链lfr1-4。
[0249]
在一些实施方式中，源自人的fr区可以包含与其所源自的人免疫球蛋白相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，人fr的一个或多个氨基酸残基由来自亲本非人抗体的对应残基取代。这在某些实施方式中是需要的，以使人源化抗体或其片段密切接近非人亲本抗体结构，以最优化结合特征(例如，增加结合亲和性)。在某些实施方式中，本发明所述的人源化抗体部分或其抗原结合片段包含在各个人fr序列中不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基取代，或者在重链可变区或轻链可变区的所有fr序列中不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基取代。在一些实施方式中，这种氨基酸残基的变化可能仅存在于重链fr区、仅存在于轻链fr区，或在两条链上都存在。在某些实施方式中，人fr序列的一个或多个氨基酸被随机突变以增加结合亲和性。在某些实施方式中，人fr序列的一个或多个氨基酸被反向突变为亲本非人抗体的相应氨基酸，以增加结合亲和性。
[0250]
在某些实施方式中，本发明所述的人源化抗cd39抗体部分及其抗原结合片段，其包括重链hfr1、重链hfr2、重链hfr3和重链hfr4，其中所述重链hfr1包括如x
19
vqlvx
20
sgx
21
x
22
x
23
x
24
kpgx
25
sx
26
x
27
x
28
scx
29
asgx
30
x
31
x
32
x
33
(seq id no:76)所示的序列或与其具有至少80％序列同一性的同源序列，所述重链hfr2包括如wvx
34
qx
35
pgx
36
x
37
lewx
38
x
39
(seq id no:77)所示的序列或与其具有至少80％序列同一性的同源序列，所述重链hfr3包括如x
40
x
41
tx
42
x
43
x
44
dx
45
sx
46
x
47
tx
48
yx
49
x
50
x
51
x
52
slx
53
x
54
edtavyycx
55
x
56
(seq id no:78)所示的序列或与其具有至少80％序列同一性的同源序列，以及所述重链hfr4包括如wgqgtx
57
vtvss(seq id no:126)所示的序列或与其具有至少80％序列同一性的同源序列，其中x
19
是q或e；x
20
是e或q；x
21
是g或a；x
22
是g或e；x
23
是l或v；x
24
是v或k；x
25
是g或a；x
26
是l,m或v；x
27
是r或k；x
28
是v或l；x
29
是a或k；x
30
是f或y；x
31
是n或t；x
32
是f或l；x
33
是s或k；x
34
是r或k；x
35
是a或s；x
36
是k或q；x
37
是r或；x
38
是m、i或v；x
39
是g或a；x
40
是r或k；x
41
是v、a或f；x
42
是i或l；x
43
是s或t；x
44
是r或a；x
45
是d或t；x
46
是k、a或s；x
47
是s或n；x
48
是l、v或a；x
49
是m或l；x
50
是q或e；x
51
是m或l；x
52
是s、i或n；x
53
是r或k；x
54
是s或t；x
55
是a或t；x
56
是r、n或t以及x
57
是t或l。
[0251]
在某些实施方式中，本发明所述的人源化抗cd39抗体部分及其抗原结合片段，其包括轻链lfr1、轻链lfr2、轻链lfr3和轻链lfr4，其中所述轻链lfr1包括如x3ivx4tqspatlx5x6spgerx7tx8x9c(seq id no:80)所示的序列或与其具有至少80％序列同一性的同源序列，所述轻链lfr2包括如wyqqkpgqx
10
px11lliy(seq id no:81)所示的序列或与其具有至少80％序列同一性的同源序列，所述轻链lfr3包括如gx
12
px
13
rfsgsgsgtx
14
x
15
tltissx
16
epedfavyx
17
c(seq id no:820)所示的序列或与其具有至少80％序列同一性的同源序列，所述轻链lfr4包括如fgx
18
gtkleik(seq id no:152)所示的序列或与其具有至少80％序列同一性的同源序列，其中x3是e或q；x4是l或m；x5是s或t；x6是l、v或a；x7是a或v；x8是l或i；x9是s或t；x
10
是a或s；x
11
是r或k；x
12
是i或v；x
13
是a或t；x
14
是d或s；x
15
是f或y；x
16
是l、m或v；x
17
是y或f；x
18
是g或q。
[0252]
在某些实施方式中，本发明所述的人源化抗cd39抗体部分及其抗原结合片段，其包括重链hfr1、重链hfr2、重链hfr3和重链hfr4，其中所述重链hfr1包括如evqlvesggglvkpggsx
61
rlscaasgftfs(seq id no:154)所示的序列或与其具有至少80％序列同一性的同源序列；所述重链hfr2包括如wvrqx
62
pgkglewvx
63
(seq id no:155)所示的序列或与其具有至少80％序列同一性的同源序列；所述重链hfr3包括如rftisrddskntx
64
ylqmnslktedtavyyctt(seq id no:156)所示的序列或与其具有至少80％序列同一性的同源序列；所述重链hfr4包括如wgqgttvtvss(seq id no:79)所示的序列或与其具有至少80％序列同一性的同源序列，其中x
61
是l或m，x
62
是a或s，x
63
是g或a，x
64
是l或v。
[0253]
在某些实施方式中，本发明所述的人源化抗cd39抗体部分及其抗原结合片段，其包括轻链lfr1、轻链lfr2、轻链lfr3和轻链lfr4，其中所述轻链lfr1包括如eivx
65
tqspatlsx
66
spgerx
67
tlsc(seq id no:157)所示的序列或与其具有至少80％序列同一性的同源序列所述轻链lfr2包括如wyqqkpgqx
68
prlliy(seq id no:158)所示的序列或与其具有至少80％序列同一性的同源序列；所述轻链lfr3包括如giparfsgsgsgtdftltissx
69
epedfavyx
70
c(seq id no:159)所示的序列或与其具有至少80％序列同一性的同源序列；以及所述轻链lfr4包括如fgggtkleik(seq id no:153)所示的序列或与其具有至少80％序列同一性的同源序列，其中x
65
是l或m；x
66
是l或v；x
67
是a或v；x
68
是a或s；x
69
是l或v；x
70
是y或f。
[0254]
在某些实施方式中，本发明所述的人源化抗cd39抗体部分及其抗原结合片段，其包括重链hfr1、重链hfr2、重链hfr3和重链hfr4，其中所述重链hfr1包括如x
71
vqlvqsgaevkkpgasvkx
72
sckasgyx
73
lk(seq id no:160)所示的序列或与其具有至少80％序列同一性的同源序列；所述重链hfr2包括如wvx
74
qapgqx
75
lewx
76
g(seq id no:161)所示的序列或与其具有至少80％序列同一性的同源序列；所述重链hfr3包括如x
77
x
78
tx
79
tx
80
dtsx
81
x
82
tayx
83
elx
84
slrsedtavyycax
85
(seq id no:149)所示的序列或与其具有至少80％序列同一性的同源序列；所述重链hfr4包括如wgqgtx
57
vtvss(seq id no:126)所示的序列或与其具有至少80％序列同一性的同源序列；其中x
57
如上文所定义，x
71
是q或e；x
72
是v或l；x
73
是n或t；x
74
是r或k；x
75
是r或g；x
76
是m或i；x
77
是r或k；x
78
是v或a；x
79
是i或l；x
80
是r或a；x
81
是a或s；x
82
是s或n；x
83
是m或l；x
84
是s或i；x
85
是r或n。
[0255]
在某些实施方式中，本发明所述的人源化抗cd39抗体部分及其抗原结合片段，其包括轻链lfr1、轻链lfr2、轻链lfr3和轻链lfr4，其中所述轻链lfr1包括如x
86
ivltqspatlx
87
x
88
spgerx
89
tx
90
x
91
c(seq id no:150)所示的序列或与其具有至少80％序列同一性的同
源序列；所述轻链lfr2包括如wyqqkpgqx
10
px
11
lliy(seq id no:81)所示的序列或与其具有至少80％序列同一性的同源序列；所述轻链lfr3包括如gx
92
px
93
rfsgsgsgtx
94
x
95
tltissx
96
epedfavyyc(seq id no:148)所示的序列或与其具有至少80％序列同一性的同源序列；以及所述轻链lfr4包括如fgqgtkleik(seq id no:83)所示的序列或与其具有至少80％序列同一性的同源序列，其中x
10
和x
11
如上文所定义，x
86
是e或q；x
87
是s或t；x
88
是l或a；x
89
是a或v；x
90
是l或i；x
91
是s或t；x
92
是i或v；x
93
是a或t；x
94
是d或s；x
95
是f或y；以及x
96
是l或m。
[0256]
在某些实施方式中，本发明所述的人源化抗cd39抗体部分及其抗原结合片段，其包括重链hfr1、重链hfr2、重链hfr3和重链hfr4，和/或轻链lfr1、轻链lfr2、轻链lfr3和轻链lfr4，所述重链hfr1包括选自下组的序列：seq id no:84-86、115、119-120和131，所述重链hfr2包括选自下组的序列：seq id no:87-90和121-123，所述重链hfr3包括选自下组的序列：seq id no:91-97、116-117和124-125，并且所述重链hfr4包括选自下组的序列：seq id no:79和118；所述轻链lfr1包括选自下组的序列：seq id no:98-103和127-129，所述轻链lfr2包括选自下组的序列：seq id no:104、105和130，所述轻链lfr3包括选自下组的序列：seq id no:106-110和132-133，并且所述轻链lfr4包括选自下组的序列：seq id no:83和153。
[0257]
在某些实施方式中，本发明所述的人源化抗cd39抗体部分及其抗原结合片段，其包括重链可变区内的hfr1、hfr2、hfr3和/或hfr4序列，所述重链可变区包括选自下组的序列：hu14.vh_1(seq id no:68)、hu14.vh_2(seq id no:70)、hu14.vh_3(seq id no:72)、hu14.vh_4(seq id no:74)、hu23.vh_1(seq id no:60)、hu23.vh_2(seq id no:62)、hu23.vh_3(seq id no:64)、hu23.vh_4(seq id no:66)、hu23.vh_5(seq id no:140)、hu23.vh_6(seq id no:141)、hu23.vh_7(seq id no:142)、hu23.201h(seq id no:146)、hu23.207h(seq id no:147)和hu23.211h(seq id no:39)。
[0258]
在某些实施方式中，本发明所述的人源化抗cd39抗体部分及其抗原结合片段，其包括轻链可变区内的lfr1、lfr2、lfr3和/或lfr4序列，所述轻链可变区包括选自下组的序列：hu14.vl_1(seq id no:69)、hu14.vl_2(seq id no:71)、hu14.vl_3(seq id no:73)、hu14.vl_4(seq id no:75)、hu23.vl_1(seq id no:61)、hu23.vl_2(seq id no:63)、hu23.vl_3(seq id no:65)、hu23.vl_4(seq id no:67)、hu23.vl_5(seq id no:143)、hu23.vl_6(seq id no:144)、hu23.vl_7(seq id no:145)、hu23.201l(seq id no:111)、hu23.203l(seq id no:112)和hu23.211l(seq id no:63)。
[0259]
在某些实施方式中，本发明所述的人源化的抗cd39抗体部分及其抗原结合片段，其包括选自下组的重链可变区序列：seq id no:39、60、62、64、66、68、70、72、74、140、141、142、146、147，和/或选自下组的轻链可变区序列：seq id no:61、63、65、67、69、71、73、75、111、112、143、144和145。
[0260]
本发明还提供了嵌合抗体c14的示例性人源化抗体部分，包括：
[0261]
1)“hu14.h1l1”，其包括如hu14.vh_1(seq id no:68)所示的重链可变区和如hu14.vl_1(seq id no:69)所示的轻链可变区；
[0262]
2)“hu14.h2l1”，其包括如hu14.vh_2(seq id no:70)所示的重链可变区和如hu14.vl_1(seq id no:69)所示的轻链可变区；
[0263]
3)“hu14.h3l1”，其包括如hu14.vh_3(seq id no:72)所示的重链可变区和如
hu14.vl_1(seq id no:69)所示的轻链可变区；
[0264]
4)“hu14.h4l1”，其包括如hu14.vh_4(seq id no:74)所示的重链可变区和如hu14.vl_1(seq id no:69)所示的轻链可变区；
[0265]
5)“hu14.h1l2”，其包括如hu14.vh_1(seq id no:68)所示的重链可变区和如hu14.vl_2(seq id no:71)所示的轻链可变区；
[0266]
6)“hu14.h2l2”，其包括如hu14.vh_2(seq id no:70)所示的重链可变区和如hu14.vl_2(seq id no:71)所示的轻链可变区；
[0267]
7)“hu14.h3l2”，其包括如hu14.vh_3(seq id no:72)所示的重链可变区和如hu14.vl_2(seq id no:71)所示的轻链可变区；
[0268]
8)“hu14.h4l2”，其包括如hu14.vh_4(seq id no:74)所示的重链可变区和如hu14.vl_2(seq id no:71)所示的轻链可变区；
[0269]
9)“hu14.h1l3”，其包括如hu14.vh_1(seq id no:68)所示的重链可变区和如hu14.vl_3(seq id no:73)所示的轻链可变区；
[0270]
10)“hu14.h2l3”，其包括如hu14.vh_2(seq id no:70)所示的重链可变区和如hu14.vl_3(seq id no:73)所示的轻链可变区；
[0271]
11)“hu14.h3l3”，其包括如hu14.vh_3(seq id no:72)所示的重链可变区和如hu14.vl_3(seq id no:73)所示的轻链可变区；
[0272]
12)“hu14.h4l3”，其包括如hu14.vh_4(seq id no:74)所示的重链可变区和如hu14.vl_3(seq id no:73)所示的轻链可变区；
[0273]
13)“hu14.h1l4”，其包括如hu14.vh_1(seq id no:68)所示的重链可变区和如hu14.vl_4(seq id no:75)所示的轻链可变区；
[0274]
14)“hu14.h2l4”，其包括如hu14.vh_2(seq id no:70)所示的重链可变区和如hu14.vl_4(seq id no:75)所示的轻链可变区；
[0275]
15)“hu14.h3l4”，其包括如hu14.vh_3(seq id no:72)所示的重链可变区和如hu14.vl_4(seq id no:75)所示的轻链可变区；
[0276]
16)“hu14.h4l4”，其包括如hu14.vh_4(seq id no:74)所示的重链可变区和如hu14.vl_4(seq id no:75)所示的轻链可变区。
[0277]
本发明所述的嵌合抗体c23的示例性人源化抗体部分包括：
[0278]
1)“hu23.h1l1”，其包括如hu23.vh_1(seq id no:60)所示的重链可变区和如hu23.vl_1(seq id no:61)所示的轻链可变区；
[0279]
2)“hu23.h2l1”，其包括如hu23.vh_2(seq id no:62)所示的重链可变区和如hu23.vl_1(seq id no:61)所示的轻链可变区；
[0280]
3)“hu23.h3l1”，其包括如hu23.vh_3(seq id no:64)所示的重链可变区和如hu23.vl_1(seq id no:61)所示的轻链可变区；
[0281]
4)“hu23.h4l1”，其包括如hu23.vh_4(seq id no:66)所示的重链可变区和如hu23.vl_1(seq id no:61)所示的轻链可变区；
[0282]
5)“hu23.h1l2”，其包括如hu23.vh_1(seq id no:60)所示的重链可变区和如hu23.vl_2(seq id no:63)所示的轻链可变区；
[0283]
6)“hu23.h2l2”，其包括如hu23.vh_2(seq id no:62)所示的重链可变区和如
hu23.vl_2(seq id no:63)所示的轻链可变区；
[0284]
7)“hu23.h3l2”，其包括如hu23.vh_3(seq id no:64)所示的重链可变区和如hu23.vl_2(seq id no:63)所示的轻链可变区；
[0285]
8)“hu23.h4l2”，其包括如hu23.vh_4(seq id no:66)所示的重链可变区和如hu23.vl_2(seq id no:63)所示的轻链可变区；
[0286]
9)“hu23.h1l3”，其包括如hu23.vh_1(seq id no:60)所示的重链可变区和如hu23.vl_3(seq id no:65)所示的轻链可变区；
[0287]
10)“hu23.h2l3”，其包括如hu23.vh_2(seq id no:62)所示的重链可变区和如hu23.vl_3(seq id no:65)所示的轻链可变区；
[0288]
11)“hu23.h3l3”，其包括如hu23.vh_3(seq id no:64)所示的重链可变区和如hu23.vl_3(seq id no:65)所示的轻链可变区；
[0289]
12)“hu23.h4l3”，其包括如hu23.vh_4(seq id no:66)所示的重链可变区和如hu23.vl_3(seq id no:65)所示的轻链可变区；
[0290]
13)“hu23.h1l4”，其包括如hu23.vh_1(seq id no:60)所示的重链可变区和如hu23.vl_4(seq id no:67)所示的轻链可变区；
[0291]
14)“hu23.h2l4”，其包括如hu23.vh_2(seq id no:62)所示的重链可变区和如hu23.vl_4(seq id no:67)所示的轻链可变区；
[0292]
15)“hu23.h3l4”，其包括如hu23.vh_3(seq id no:64)所示的重链可变区和如hu23.vl_4(seq id no:67)所示的轻链可变区；
[0293]
16)“hu23.h4l4”，其包括如hu23.vh_4(seq id no:66)所示的重链可变区和如hu23.vl_4(seq id no:67)所示的轻链可变区；
[0294]
17)“hu23.h5l1”，其包括如hu23.vh_5(seq id no:140)所示的重链可变区和如hu23.vl_1(seq id no:61)所示的轻链可变区；
[0295]
18)“hu23.h6l1”，其包括如hu23.vh_6(seq id no:141)所示的重链可变区和如hu23.vl_1(seq id no:61)所示的轻链可变区；
[0296]
19)“hu23.h7l1”，其包括如hu23.vh_7(seq id no:142)所示的重链可变区和如hu23.vl_1(seq id no:61)所示的轻链可变区；
[0297]
20)“hu23.h1l5”，其包括如hu23.vh_1(seq id no:60)所示的重链可变区和如hu23.vl_5(seq id no:143)所示的轻链可变区；
[0298]
21)“hu23.h5l5”，其包括如hu23.vh_5(seq id no:140)所示的重链可变区和如hu23.vl_5(seq id no:143)所示的轻链可变区；
[0299]
22)“hu23.h6l5”，其包括如hu23.vh_6(seq id no:141)所示的重链可变区和如hu23.vl_5(seq id no:143)所示的轻链可变区；
[0300]
23)“hu23.h7l5”，其包括如hu23.vh_7(seq id no:142)所示的重链可变区和如hu23.vl_5(seq id no:143)所示的轻链可变区；
[0301]
24)“hu23.h1l6”，其包括如hu23.vh_1(seq id no:60)所示的重链可变区和如hu23.vl_6(seq id no:144)所示的轻链可变区；
[0302]
25)“hu23.h5l6”，其包括如hu23.vh_5(seq id no:140)所示的重链可变区和如hu23.vl_6(seq id no:144)所示的轻链可变区；
[0303]
26)“hu23.h6l6”，其包括如hu23.vh_6(seq id no:141)所示的重链可变区和如hu23.vl_6(seq id no:144)所示的轻链可变区；
[0304]
27)“hu23.h7l6”，其包括如hu23.vh_7(seq id no:142)所示的重链可变区和如hu23.vl_6(seq id no:144)所示的轻链可变区；
[0305]
28)“hu23.h1l7”，其包括如hu23.vh_1(seq id no:60)所示的重链可变区和如hu23.vl_7(seq id no:145)所示的轻链可变区；
[0306]
29)“hu23.h5l7”，其包括如hu23.vh_5(seq id no:140)所示的重链可变区和如hu23.vl_7(seq id no:145)所示的轻链可变区；
[0307]
30)“hu23.h6l7”，其包括如hu23.vh_6(seq id no:141)所示的重链可变区和如hu23.vl_7(seq id no:145)所示的轻链可变区；
[0308]
31)“hu23.h7l7”，其包括如hu23.vh_7(seq id no:142)所示的重链可变区和如hu23.vl_7(seq id no:145)所示的轻链可变区；
[0309]
32)“hu23.201”，其包括如hu23.201h(seq id no:146)所示的重链可变区和如hu23.201l(seq id no:111)所示的轻链可变区；
[0310]
33)“hu23.203”，其包括如hu23.201h(seq id no:146)所示的重链可变区和如hu23.203l(seq id no:112)所示的轻链可变区；
[0311]
34)“hu23.207”，其包括如hu23.207h(seq id no:147)所示的重链可变区和如hu23.201l(seq id no:111)所示的轻链可变区；
[0312]
35)“hu23.211”，其包括如hu23.211h(seq id no:39)所示的重链可变区和如hu23.211l(seq id no:63)所示的轻链可变区。
[0313]
这些示例性的人源化抗cd39抗体部分保留了对cd39的特异性结合能力或亲和性，并且在该方面至少与亲本小鼠抗体mab14或mab23相当或甚至更好。
[0314]
在某些实施方式中，本发明所述的抗cd39抗体部分或其抗原结合片段包括所述重链可变区的全部或一部分，和/或所述轻链可变区的全部或一部分。在一个实施方式中，本发明所述的抗cd39抗体部分或其抗原结合片段是单域抗体，其由本发明所述的重链可变区的全部或一部分组成。关于单域抗体的更多信息是本领域已知的(参见，例如，美国专利号6,248,516)。
[0315]
在某些实施方式中，本发明所述的抗cd39抗体部分或其抗原结合片段进一步包括免疫球蛋白(ig)恒定区，其可选地进一步包含重链和/或轻链恒定区。在某些实施方式中，重链恒定区包括ch1、铰链和/或ch2-ch3区(或任选的ch2-ch3-ch4区)。在某些实施方式中，本发明所述的抗cd39抗体或其抗原结合片段包括人igg1、igg2、igg3、igg4、iga1、iga2或igm的重链恒定区。在某些实施方式中，轻链恒定区包括cκ或cλ。本发明所述的抗cd39抗体部分或其抗原结合片段可以与野生型恒定区序列相同或在一个或多个突变点上不同。
[0316]
在某些实施方式中，所述重链恒定区包括fc区。已知fc区介导效应功能，例如抗体的抗体依赖性细胞毒性(adcc)和补体依赖性细胞毒性(cdc)。不同ig同种型的fc区诱导效应功能的能力不同。例如，已经认识到igg1和igg3的fc区比igg2和igg4的fc区更有效地诱导adcc和cdc。在某些实施方式中，本发明所述的抗cd39抗体部分或其抗原结合片段包括igg1或igg3同种型的fc区，其可以诱导adcc或cdc；或者包括igg4或igg2同种型的恒定区，其具有降低的或者耗竭的效应功能。在一些实施方式中，源自人igg1的所述fc区具有降低
的效应功能。在一些实施方式中，源自人igg1的所述fc区包括l234a和/或l235a突变。在某些实施方式中，本发明所述的抗cd39抗体部分或其抗原结合片段包括野生型人igg4的fc区或其他野生型人igg4等位基因。在某些实施方式中，本发明所述的抗cd39抗体部分或其抗原结合片段包括人igg4的fc区，所述fc区包括s228p突变和/或l235e突变和/或f234a和l235a突变。在某些实施方式中，源自人igg4的所述fc区包括s228p突变和/或f234a和l235a突变。
[0317]
在某些实施方式中，本发明所述的抗cd39抗体部分或其抗原结合片段具有足以用于诊断和/或治疗用途的与人类cd39特异结合的亲和性。
[0318]
本发明所述的抗cd39抗体部分或其抗原片段可以是单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、标记抗体、二价抗体、抗独特型抗体或融合蛋白。重组抗体是在体外使用重组方法(而不是在动物体内)制备的抗体。
[0319]
某些实施方式中，本发明提供的抗cd39抗体部分或其抗原结合片段，其与根据本发明所述的抗体部分或其抗原结合片段竞争结合人类cd39。在某些实施方式中，本发明提供的抗cd39抗体部分或其抗原结合片段，其与包括重链可变区和轻链可变区的抗体竞争结合人类cd39，所述重链可变区包括如seq id no:43所示的序列，并且所述轻链可变区包括如seq id no:52所示的序列。在某些实施方式中，本发明提供的抗cd39抗体部分或其抗原结合片段，其与包括重链可变区和轻链可变区的抗体竞争结合人类cd39，所述重链可变区包括如seq id no:44所示的序列，并且所述轻链可变区包括如seq id no:53所示的序列。在某些实施方式中，本发明提供的抗cd39抗体部分或其抗原结合片段，其与包括重链可变区和轻链可变区的抗体竞争结合人类cd39，所述重链可变区包括如seq id no:45所示的序列，并且所述轻链可变区包括如seq id no:54所示的序列，或与包括重链可变区和轻链可变区的抗体竞争结合人类cd39，所述重链可变区包括如seq id no:47所示的序列，并且所述轻链可变区包括如所述seq id no:56所示的序列。
[0320]
在某些实施方式中，本发明提供了与cd39的表位特异性结合的抗cd39抗体部分或其抗原结合片段，其中所述表位包括选自下组的一个或多个残基：q96、n99、e143、r147、r138、m139、e142、k5、e100、d107、v81、e82、r111和v115。
[0321]
在一些实施方式中，所述表位包括选自下组的一个或多个残基：q96、n99、e143和r147。在一些实施方式中，所述表位包括全部残基q96、n99、e143和r147。
[0322]
在一些实施方式中，所述表位包括选自下组的一个或多个残基：r138、m139和e142。在某些实施方式中，所述表位包括全部残基r138、m139和e142。
[0323]
在一些实施方式中，所述表位包括选自下组的一个或多个残基：k5、e100和d107。i在某些实施方式中，所述表位包括全部残基k5、e100和d107。
[0324]
在一些实施方式中，所述表位包括选自下组的一个或多个残基：v81、e82、r111和v115。在某些实施方式中，所述表位包括全部残基v81、e82、r111和v115。
[0325]
在某些实施方式中，所述cd39是人类cd39。在某些实施方式中，所述cd39是人类cd39，其包含如seq id no：162所示的氨基酸序列。
[0326]
在某些实施方式中，所述的抗cd39抗体部分或其抗原结合片段不是抗体9-8b、抗体t895和抗体i394中的任何一种。
[0327]
本发明所使用的“9-8b”是指包含重链可变区和轻链可变区的抗体或其抗原结合
片段，所述重链可变区具有如seq id no：46所示的氨基酸序列，所述轻链可变区具有如seq id no：48所示的氨基酸序列。
[0328]
本发明所使用的“t895”是指包含重链可变区和轻链可变区的抗体或其抗原结合片段，所述重链可变区具有如seq id no：55所示的氨基酸序列，所述轻链可变区具有如seq id no：57所示的氨基酸序列。
[0329]
本发明所使用的“i394”是指包含重链可变区和轻链可变区的抗体或其抗原结合片段，所述重链可变区具有如seq id no：113所示的氨基酸序列，所述轻链可变区具有如seq id no：114所示的氨基酸序列。
[0330]
抗体变体
[0331]
本发明提供的抗cd39抗体部分和其抗原结合片段还包含本发明提供的抗体序列的各种变体。
[0332]
在某些实施方式中，所述抗体变体在以上的表1提供的一个或多个cdr序列中、以上的表4、5、8和9提供的重链可变区或轻链可变区序列的一个或多个非cdr序列中、和/或恒定区(例如，fc区)中包含一个或多个修饰或取代。这些抗体变体保持其亲本与cd39特异性结合的亲和性，但具有一种或多种所述修饰或取代带来的所需要的特性。例如所述抗体变体可能具有改善的抗原结合亲和性、改善的糖基化模式、降低的糖基化风险、减少的脱氨基作用、减少的或耗竭的效应功能、改善的fcrn受体结合、提高的药代动力学半衰期、ph敏感性，和/或对缀合的兼容性(例如一个或多个引入的半胱氨酸残基)。
[0333]
可以使用本领域公知的方法，例如“丙氨酸扫描诱变”，筛选亲本抗体序列以识别合适的或优选的待修饰或取代的残基(参见，例如cunningham and wells(1989)science,244:1081-1085)。简要地说，可以识别靶标残基(例如带电的残基，如arg、asp、his、lys和glu)并由不带电的或带负电的氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)取代，产生被修饰的抗体，并且针对目标特性对其进行筛选。如果在一个特定的氨基酸位置上的取代表现出目标功能性改变，则该位置可以被识别为潜在的用于修饰或取代的残基。可以通过用另一种残基(例如半胱氨酸残基、带正电荷的残基等)取代来进一步评估所述潜在的残基。
[0334]
亲和性变体
[0335]
抗体的亲和性变体可以在以上的表1提供的一个或多个cdr序列、以上的表4、5、8和9提供的一个或多个fr序列，或者以上的表2、3、6和7提供的重链可变区或轻链可变区序列中包含修饰或取代。本领域技术人员基于以上的表1中的cdr序列以及以上的表2、3、6和7中的可变区序列可以容易地确定fr序列，因为在本领域中众所周知，在可变区中，cdr区的两侧是两个fr区。所述亲和性变体保持亲本抗体的与cd39特异性结合的亲和性，或者甚至相对于亲本抗体具有改善的与cd39特异性结合的亲和性。在某些实施方式中，cdr序列、fr序列或可变区序列中的至少一个(或全部)取代包含保守取代。
[0336]
本领域技术人员将理解，在以上的表1所提供的cdr序列、在以上的表2、3、6和7提供的可变区序列中，一个或多个氨基酸残基可以被取代，而得到的抗体或抗原结合片段仍然保持与cd39的结合亲和性或结合能力，或甚至具有改善的结合亲和性或能力。可以使用本领域公知的各种方法来达到这一目的。例如，可以生成抗体变体库(例如，fab或scfv变体)，并用噬菌体展示技术表达，随后针对与人类cd39结合的亲和性对其进行筛选。又例如，可以使用电脑软件虚拟抗体与人类cd39的结合，并识别抗体上形成结合界面的氨基酸残
基。在取代中可以避开这些残基以防止结合亲和性的降低，或者可以做为取代的靶标以获得更强的结合。
[0337]
在某些实施方式中，本发明所述的人源化抗体或其抗原结合片段在一个或多个cdr序列中和/或一个或多个fr序列中包含一个或多个氨基酸残基取代。在某些实施方式中，亲和性变体在cdr序列和/或fr序列中包含总共不超过20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个取代。
[0338]
在某些实施方式中，所述抗cd39抗体部分或其抗原结合片段包含1、2或3个cdr序列，所述cdr序列与以上的表1中列出的序列具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)的序列同一性，而同时保持相对于其亲本抗体水平相似或更高的与cd39特异的结合亲和性。
[0339]
在某些实施方式中，所述抗cd39抗体部分或其抗原结合片段包含一个或多个可变区序列，所述可变区序列与以上的表2、3、6和7中列出的序列具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)的序列同一性，而同时保持相对于其亲本抗体水平相似或更高的与cd39特异的结合亲和性。在一些实施方式中，在以上的表2、3、6和7列出的可变区的序列中，总共有1至10个氨基酸被取代、插入或缺失。在一些实施方式中，所述取代、插入或缺失发生在cdr之外的区域(例如，在fr)。
[0340]
糖基化变体
[0341]
本发明所述的抗cd39抗体部分或其抗原结合片段还包含糖基化变体，可以获取该糖基化变体以提高或降低抗体或其抗原结合片段的糖基化程度。
[0342]
所述抗cd39抗体部分或其抗原结合片段可以包括一个或多个引入或去除糖基化位点的修饰。糖基化位点是一种带有侧链的氨基酸残基，碳水化合物部分(例如，寡糖结构)可以附接至所述侧链。抗体的糖基化通常是n连接的或o连接的。n连接的是指碳水化合物部分附接至天冬氨酸残基的侧链，例如，三肽序列中的天冬氨酸残基，如天冬氨酸-x-丝氨酸和天冬氨酸-x-苏氨酸，其中x是除脯氨酸以外的任何氨基酸。o连接的糖基化是指n-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一的糖附接至羟基氨基酸，最常见的是附接至丝氨酸或苏氨酸。可以很方便地去除天然糖基化位点，例如通过改变氨基酸序列，使得存在于该序列中的上述三肽序列(对于n连接的糖基化位点)或者丝氨酸或苏氨酸残基(对于o连接的糖基化位点)中的一个被取代。用相似的方式，可以通过引入这样的三肽序列或者丝氨酸或苏氨酸残基，产生新的糖基化位点。
[0343]
某些实施方式中，本发明提供抗cd39抗体部分或其抗原结合片段，在选自n55、g56和n297的位置上包含一个或多个突变，以去除一个或多个脱酰胺位。某些实施方式中，本发明提供的抗cd39抗体或其抗原结合片段，包括n55的突变(例如n55g、n55s或n55q)和/或g56的突变(例如g56a、g56d)和/或n297的突变(例如n297a、n297q或n297g)。测试了这些突变，并认为它们不会对本发明提供抗体的结合亲和性有负面影响。
[0344]
半胱氨酸工程化的变体
[0345]
本发明所述的抗cd39抗体部分或其抗原结合片段还包括半胱氨酸工程化的变体，其包括一个或多个引入的游离半胱氨酸氨基酸残基。
[0346]
游离半胱氨酸残基是不为二硫键的一部分的半胱氨酸残基。半胱氨酸工程化的变体可用于通过例如马来酰亚胺或卤乙酰基，在工程化的半胱氨酸的位点与例如细胞毒性化
合物和/或成像化合物、标签或放射性同位素以及其他物质缀合。用于改造抗体或其抗原结合片段以引入游离半胱氨酸残基的方法是本领域公知的，参见例如wo2006/034488。
[0347]
fc变体
[0348]
本发明所述的抗cd39抗体部分或其抗原结合片段还包括fc变体，其包括在fc区和/或铰链区的一个或多个氨基酸残基修饰或取代，例如，以提供改变的效应功能，例如adcc和cdc。通过抗体工程化改变adcc活性的方法已经描述于现有技术中，参见，例如shields rl.et al.,j biol chem.2001.276(9):6591-604；idusogie ee.et al.,j immunol.2000.164(8):4178-84；steurer w.et al.,j immunol.1995,155(3):1165-74；idusogie ee.et al.,j immunol.2001,166(4):2571-5；lazar ga.et al.,pnas,2006,103(11):4005-4010；ryan mc.et al.,mol.cancer ther.,2007,6:3009-3018；richards jo,.et al.,mol cancer ther.2008,7(8):2517-27；shields r.l.et al.,j.biol.chem,2002,277:26733-26740；shinkawa t.et al.,j.biol.chem,2003,278:3466-3473。
[0349]
本发明提供的抗体部分或抗原结合片段的cdc活性也可以例如通过改善或减少c1q结合和/或cdc而改变(参见，例如wo99/51642；duncan&winter nature 322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821)；和关于fc区变体的其他实例的wo94/29351)。可以将选自fc区的氨基酸残基329、331和322的一个或多个氨基酸替换为不同的氨基酸残基，以改变c1q结合和/或减少或消除补体依赖性细胞毒性(cdc)(参见idusogie等人的美国专利号6,194,551)。也可以引入一个或多个氨基酸取代，以改变抗体固定补体的能力(参见bodmer等人的pct公开号wo 94/29351)。
[0350]
在某些实施方式中，本发明提供的抗cd39抗体部分或其抗原结合片段具有降低的效应功能，并且在igg1选自下组的位点中包含一个或多个氨基酸取代：234、235、237、238、268、297、309、330和331。在某些实施方式中，本发明提供的抗cd39抗体部分或其抗原结合片段是igg1同种型，并且包含一个或多个选自下组的氨基酸取代：n297a、n297q、n297g、l235e、l234a、l235a、l234f、l235e、p331s及其任何组合。在某些实施方式中，本发明提供的抗cd39抗体部分或其抗原结合片段为igg1同种型，并包含l234a和l235a突变。在某些实施方式中，本发明提供的抗cd39抗体部分或其抗原结合片段为igg2同种型，并且包含一个或多个选自下组的氨基酸取代：h268q、v309l、a330s、p331s、v234a、g237a、p238s、h268a及其任何组合(例如，h268q/v309l/a330s/p331s、v234a/g237a/p238s/h268a/v309l/a330s/p331s)。在某些实施方式中，本发明提供的抗cd39抗体部分或其抗原结合片段为igg4同种型，并且包含一个或多个选自下组的氨基酸取代：s228p、n297a、n297q、n297g、l235e、f234a、l235a及其任何组合。在某些实施方式中，本发明提供的抗cd39抗体部分或其抗原结合片段是igg2/igg4交叉同种型。igg2/igg4交叉同种型的实例在rother rp et al.,nat biotechnol 25:1256
–
1264(2007)中进行了描述。
[0351]
在某些实施方式中，本发明提供的抗cd39抗体部分和其抗原结合片段是igg4同种型，并且在228、234和235的一个或多个位点包含一个或多个氨基酸取代。在某些实施方式中，本发明提供的抗cd39抗体部分和抗原结合片段为igg4同种型，并在fc区具有s228p和/或l235e和/或f234a和l235a突变。
[0352]
在某些实施方式中，所述的抗cd39抗体部分或其抗原结合片段包括一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代可以改善与新生儿fc受体(fcrn)的ph依赖性结合。这样的变体
可以具有延长的药代动力学半衰期，因为它在酸性ph下与fcrn结合，使其得以免于在溶酶体中降解，并且随后被转移并释放到细胞外。工程化抗体或其抗原结合片段以改善与fcrn的结合亲和性的方法是本领域公知的，参见，例如，vaughn,d.et al.,structure,6(1):63-73,1998；kontermann,r.et al.,antibody engineering,volume 1,chapter 27:engineering of the fc region for improved pk,published by springer,2010；yeung,y.et al.,cancer research,70:3269-3277(2010)；and hinton,p.et al.,j.immunology,176:346-356(2006)。
[0353]
在某些实施方式中，所述的抗cd39抗体部分或抗原结合片段包括位于fc区界面的一个或多个氨基酸取代，以便于和/或促进异二聚体化。这些修饰包括将突起引入至第一fc多肽，以及将空腔引入第二fc多肽，其中所述突起可位于所述空腔内，以促进所述第一和第二fc多肽的相互作用，以形成异二聚体或复合体。产生具有这些修饰的抗体的方法是本领域公知的，例如，如美国专利号5,731,168所述。
[0354]
抗原结合片段
[0355]
本发明还提供了抗cd39抗原结合片段。抗原结合片段的多种类型是本领域公知的，并且可基于本发明所述的抗cd39抗体部分进行研发，包括示例性抗体部分，其cdr示于上述的表1中，其可变区序列示于上述的表2、3、6和7中，及其不同的变体(例如，亲和性变体、糖基化变体、fc变体、半胱氨酸工程化抗体等)。
[0356]
在某些实施方式中，本发明提供的抗cd39抗原结合片段是双功能抗体(diabody)、fab、fab’、f(ab’)2、fd、fv片段、二硫键稳定的fv片段(dsfv)、(dsfv)2、双特异性dsfv(dsfv－dsfv’)、二硫键稳定的双功能抗体(ds diabody)、单链抗体分子(scfv)、scfv二聚体(双价的双功能抗体)、多特异性抗体、骆驼化单域抗体(camelized single domain antibody)、纳米抗体(nanobody)、域抗体(domain antibody)和双价域抗体。
[0357]
多种技术可用于这种抗原结合片段的生产。示例性的方法包括对完整抗体进行酶消化(参见例如morimoto et al.,journal of biochemical and biophysical methods 24:107-117(1992)；and brennan et al.,science,229:81(1985))、由宿主细胞(如大肠杆菌)重组表达(例如对于fab、fv和scfv抗体片段)、如上文讨论的噬菌体展示文库筛选(例如对于scfv)，以及化学耦合两个fab
’‑
sh片段以形成f(ab’)2片段(carter et al.,bio/technology 10:163-167(1992))。生产抗体片段的其它技术对于本领域将是显而易见的。
[0358]
在某些实施方式中，所述抗原结合片段是scfv。scfv的生成记述于例如wo93/16185；美国专利号5,571,894和5,587,458。scfv可以在氨基末端或羧基末端与效应蛋白融合以获得融合蛋白(参见例如antibody engineering,borrebaeck编)。
[0359]
在某些实施方式中，本发明提供的抗cd39抗体部分或其抗原结合片段是二价、四价、六价或多价的。任何大于二价的分子被认为是多价的，包括例如三价、四价、六价等。
[0360]
如果两个结合位点均能特异性结合相同抗原或相同表位，则二价分子可以是单特异性的。在某些实施方式中，这提供了比对应的单价分子更强的与抗原或表位的结合。类似地，多价分子也可以是单特异性的。在某些实施方式中，在二价或多价抗原结合部分中，结合位点的第一价和结合位点的第二价在结构上相同(即，具有相同的序列)或在结构上不同(即，具有不同的序列，但具有相同的特异性)。
[0361]
如果两个结合位点对不同的抗原或表位具有特异性，则二价也可以是双特异性
的。这也适用于多价分子。例如，当两个结合位点对于第一抗原(或表位)来说是单特异性的，而第三结合位点对第二抗原(或表位)来说是特异性时，三价分子可以是双特异性的。
[0362]
双特异性抗体
[0363]
在某些实施方式中，所述的抗cd39抗体部分或其抗原结合片段是双特异性的。在某些实施方式中，所述抗cd39抗体部分或其抗原结合片段进一步与具有不同于所述抗cd39抗体或其抗原结合片段的结合特异性的第二功能部分连接。
[0364]
在某些实施方式中，本发明提供的双特异性抗体或其抗原结合片段能够特异性结合至除cd39以外的第二抗原或cd39上的第二表位。在某些实施方式中，所述第二抗原选自下组：tgfbeta、cd73、pd1、pdl1、4-1bb、ctla4、tigit、gita、vista、tigit、b7-h3、b7-h4、b7-h5、cd112r、siglec-15、lag3、sirpα、cd47和tim-3。
[0365]
缀合物
[0366]
在一些实施方式中，所述抗cd39抗体部分或其抗原结合片段还包括一个或多个缀合物部分。所述缀合物部分可以连接到所述抗体部分或其抗原结合片段。缀合物部分是可以附接至所述抗体或其抗原结合片段的部分。可以设想，本发明所述的抗体部分或其抗原结合片段可以与多种缀合物部分连接(参见例如“conjugate vaccines”,contributions to microbiology and immunology,j.m.cruse and r.e.lewis,jr.(eds.),carger press,new york,(1989))。这些缀合物部分可以通过共价结合、亲和结合、嵌入、协同结合(coordinate binding)、络合(complexation)、结合(association)、混合(blending)或加入(addition)等其他方式与所述抗体部分或其抗原结合片段连接。在某些实施方式中，所述抗体部分或其抗原结合片段经连接子与一个或多个缀合物连接。
[0367]
在某些实施方式中，本发明中提供的抗cd39抗体部分或其抗原结合片段可以工程化以在表位结合部分之外含有特定位点，所述特定位点可以用于与一个或多个缀合物部分结合。例如，该位点可以包括一个或多个反应性的氨基酸残基(例如半胱氨酸或组氨酸残基)，以便于与缀合物部分的共价连接。
[0368]
在某些实施方式中，所述抗cd39抗体部分或其抗原结合片段可以间接地或通过另一缀合物部分与缀合物部分连接。例如，本发明提供的抗cd39抗体部分或其抗原结合片段可以与生物素缀合，然后间接地与第二缀合物缀合，所述第二缀合物与抗生物素蛋白缀合。在某些实施方式中，所述缀合物部分包括清除修饰剂(例如，延长半衰期的聚合物(例如peg))、化疗剂、毒素、放射性同位素、镧系元素、可检测标记(例如，发光标记、荧光标记、酶底物标记)、dna烷化剂、拓扑异构酶抑制剂、微管蛋白结合剂、纯化部分或其他抗癌药物。
[0369]“毒素”可以是对细胞有害或可以损害或杀死细胞的任何试剂。毒素的示例包括但不限于：紫杉醇、细胞松弛素b、短杆菌肽d、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊甙、长春新碱、mmae、mmaf、dm1、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素d、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素及其类似物、抗代谢物(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶达卡巴嗪)、烷化剂(例如氮芥、塞替派苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、美法仑、卡莫司汀(bsnu)和洛莫司汀(ccnu)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素c和二氯二胺铂(ii)(ddp)顺铂)、蒽环类抗生素(例如柔红霉素(以前的道诺霉素)和阿霉素)、抗生素(例如更生霉素(以前称为放线菌素)、博来霉素、光神霉
素和氨茴霉素(amc))、抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春碱)、拓扑异构酶抑制剂和微管蛋白结合剂。
[0370]
可检测标记的实例可以包括荧光标记(例如荧光素、罗丹明、丹磺酰、藻红蛋白或德克萨斯红)、酶-底物标记(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶或β-d-半乳糖苷酶)、放射性同位素(例如
123
i、
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at、
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188
re、
153
sm、
212
bi、and 32
p、其他镧系元素)、发光标记、发色团部分、地高辛、生物素/亲和素、dna分子或用于检测的金。
[0371]
在某些实施方式中，缀合物部分可以是清除修饰剂，其有助于增加抗体的半衰期。说明性实例包括水溶性聚合物(例如peg、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇/丙二醇共聚物等)。该聚合物可以具有任何分子量，并且可以是支链或非支链的。连接至抗体的聚合物的数量可以变化，并且如果连接的聚合物多于一种，则它们可以是相同或不同的分子。
[0372]
在某些实施方式中，缀合物部分可以是纯化部分，例如磁珠。
[0373]
在某些实施方式中，本发明提供的抗cd39抗体部分或其抗原结合片段用作缀合物的基础。
[0374]
多核苷酸和重组方法
[0375]
本发明提供了编码所述抗cd39/tgfβ陷阱分子的分离的多核苷酸。本发明所用的术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)及其聚合物。除非另有说明，否则特定的多核苷酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如简并的密码子取代)、等位基因、直向同源物、snp和互补序列以及明确指出的序列。具体而言，简并的密码子取代可通过产生这样的序列来实现：其中一个或多个选定的(或全部)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(参见batzer et al.,nucleic acid res.19:5081(1991)；ohtsuka et al.,j.biol.chem.260:2605-2608(1985)以及rossolini et al.,mol.cell.probes 8:91-98(1994))。
[0376]
使用传统的步骤，可以容易地对编码所述单克隆抗体的dna进行分离和测序(例如通过使用能够与编码所述抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。编码dna也可以通过合成方法获得。
[0377]
使用本领域公知的重组技术，可以将编码所述抗cd39/tgfβ陷阱分子的分离的多核苷酸插入载体，用于进一步的克隆(dna的扩增)或用于表达。有多种载体可供选择。载体组分通常包括但不限于下列的一种或多种：信号序列、复制起始点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子(例如sv40、cmv、ef-1α)和转录终止序列。
[0378]
本发明提供了包括分离的多核苷酸的载体。在某些实施方式中，本发明提供的多核苷酸编码抗cd39/tgfβ陷阱、与核酸序列可操作连接的至少一种启动子(例如sv40、cmv、ef-1α)和至少一种选择标记。载体的实例包括但不限于：逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳多空病毒(例如sv40)、λ噬菌体和m13噬菌体、质粒pcdna3.3、pmd18-t、poptivec、pcmv、pegfp、pires、pqd-hyg-gseu、palter、pbad、pcdna、pcal、pl、pet、pgemex、pgex、pci、pegft、psv2、pfuse、pvitro、pvivo、pmal、pmono、pselect、puno、pduo、psg5l、pbabe、pwpxl、pbi、p15tv-l、ppro18、ptd、prs10、plexa、pact2.2、pcmv-script.rtm.、pcdm8、pcdna1.1/amp、
al.,proc.natl.acad.sci.usa 77:4216(1980)；小鼠睾丸支持细胞(tm4,mather,biol.reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(cv1 atcc ccl 70)；非洲绿猴肾细胞(vero-76,atcc crl-1587)；人宫颈癌细胞(hela,atcc ccl 2)；犬肾细胞(mdck,atcc ccl 34)；布法罗大鼠肝细胞(brl 3a,atcc crl 1442)；人肺细胞((w138,atcc ccl75)；人肝细胞(hep g2,hb 8065)；小鼠乳腺瘤(mmt 060562,atcc ccl51)；tri细胞(mather et al.,annals n.y.acad.sci.383:44-68(1982))；mrc 5细胞；fs4细胞；及人肝癌细胞系(hep g2)。在某些实施方式中，所述宿主细胞是哺乳动物培养的细胞系，例如cho、bhk、ns0、293及其衍生物。
[0383]
用上述的可产生抗cd39/tgfβ陷阱分子的表达或克隆载体转化宿主细胞，并将其在常规的营养培养基中培养，所述营养培养基经修饰后适宜于诱导启动子、选择转化细胞或扩增编码目的序列的基因。在另一实施方式中，所述抗cd39/tgfβ陷阱分子可通过本领域公知的同源重组的方法制得。在某些实施方式中，所述宿主细胞能够产生本发明中的抗cd39/tgfβ陷阱分子。
[0384]
本发明还提供了一种表达本发明的抗cd39/tgfβ陷阱分子的方法，包括在表达本发明所述的载体的条件下培养本发明提供的宿主细胞。本发明中用于产生所述抗cd39/tgfβ陷阱分子的宿主细胞可在多种培养基中培养。市售的培养基如ham’s f10(sigma)、最基本培养液(mem，(sigma))、rpmi-1640(sigma)、及dulbecco’s modified eagle’s medium(dmem，(sigma)可用于培养所述宿主细胞。另外，任何在ham et al.,meth.enz.58:44(1979)，barnes et al.,anal.biochem.102:255(1980)，美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655或5,122,469；wo 90/03430；wo 87/00195或美国专利号re.30,985中描述的培养基都可以用作所述宿主细胞的培养基。这些培养基都可添加必要的激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐类(如氯化钠、氯化钙、氯化镁和磷酸盐)、缓冲液(如hepes)、核苷酸(如腺苷酸和胸腺嘧啶)、抗生素(如庆大霉素)、微量元素(定义为终浓度通常在微摩尔范围无机化合物)，和葡萄糖或与之等同的能量源。所述培养基还可含有本领域公知的适当浓度的任何其他必要的添加剂。所述培养基的条件，如温度、ph值等类似条件，为选择用于表达的宿主细胞此前所使用的条件，为普通技术人员所熟知。
[0385]
使用重组技术时，可以在壁膜间隙细胞内产生抗cd39/tgfβ陷阱分子，或者直接分泌进入基质。如果在细胞内产生抗cd39/tgfβ陷阱分子，则第一步是移除颗粒碎片(宿主细胞或裂解的片段)，例如通过离心或超滤。carter et al.,bio/technology 10:163-167(1992)描述了将分泌至大肠杆菌的壁膜间隙的抗体分离的方法。简要地说，在乙酸钠(ph 3.5)、edta和苯甲基磺酰氟(pmsf)的存在下将细胞浆解冻30分钟以上。可以通过离心移除细胞碎片。抗体分泌进入基质时，通常首先使用市售的蛋白浓缩过滤器，例如amicon或millipore pellicon超滤装置，将来自该表达系统的上清浓缩。任何前述步骤可以包括蛋白酶抑制剂，如pmsf，以抑制蛋白水解，并且可以包括抗生素，以防止偶然污染物的生长。
[0386]
从所述细胞中制得的抗cd39/tgfβ陷阱分子可采用纯化方法进行纯化，例如羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析、deae-纤维素离子交换色谱柱、硫酸铵沉淀、盐析以及亲和色谱，其中亲合色谱为优选的纯化技术。
[0387]
在某些实施方式中，固定于固相的蛋白a用于所述抗cd39/tgfβ陷阱分子的免疫亲和纯化。所述抗体的种类以及所述抗体中存在任何免疫球蛋白的fc结构域决定了蛋白a作
为亲和配体是否适合。蛋白a可用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(lindmark et al.,j.immunol.meth.62:1-13(1983))。蛋白g适用于所有鼠源同种型和人γ3(guss et al.,embo j.5:1567 1575(1986))。琼脂糖是最常用的亲和配体附着基质，但也可选用其他基质。机械力稳定的基质如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯)苯与用琼脂糖相比可实现更快的流速和更短的处理时间。如该抗体含有ch3结构域，则可用bakerbond abx
tm
树脂进行纯化(j.t.baker,phillipsburg,n.j.)。也可根据需要获得的抗体确定其他蛋白纯化的技术，如离子交换柱中的分馏、乙醇沉淀、反相hplc、硅胶色谱、基于阴离子或阳离子交换树脂的肝素琼脂糖凝胶色谱(如聚天冬氨酸柱)、层析聚焦、sds-page、以及硫酸铵沉淀。
[0388]
在任何初步纯化步骤之后，可用低ph疏水相互作用色谱的方法处理包含目标抗体和杂质的混合物，用ph约2.5-4.5的洗涤缓冲液，优选地在低盐浓度下进行(例如，从约0到0.25m盐浓度)。
[0389]
药物组合物
[0390]
本发明进一步提供了包含本发明所述的抗cd39/tgfβ陷阱分子的药物组合物，和一个或多个药学上可接受的运载体。
[0391]
用于本发明中公开的药物组合物的药学上可接受的运载体可包括，例如，药学上可接受的液体、凝胶或固体载剂、水相溶媒、非水相溶媒、抗微生物物质、等渗物质、缓冲液、抗氧化剂、麻醉剂、悬浮剂/分散剂、螯合剂、稀释剂、佐剂、辅料或无毒辅助物质，其他本领域公知的组分或以上的多种组合。
[0392]
适用的组分可包括，例如，抗氧剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、缓冲液、防腐剂、润滑剂、搅味剂、增稠剂、着色剂、乳化剂或稳定剂例如糖和环糊精。适用的抗氧剂可包括，例如，甲硫氨酸、抗坏血酸、edta、硫代硫酸钠、铂、过氧化氢酶、柠檬酸、半胱氨酸、巯基甘油、巯基乙酸、巯基山梨醇、丁基甲基茴香醚、丁基化羟基甲苯和/或没食子酸丙酯。如本发明所公开，在包含本发明公开的抗cd39/tgfβ陷阱分子的组合物中包括一种或多种抗氧剂如甲硫氨酸，可降低所述抗cd39/tgfβ陷阱分子的氧化。对氧化作用的减少可防止或减少结合亲和性的降低，从而提高抗体稳定性并延长保质期。因此，在某些实施方式中，本发明提供的药物组合物中包含一种或多种本发明所述的抗cd39/tgfβ陷阱分子以及一种或多种抗氧化剂例如甲硫氨酸。本发明进一步提供多种防止所述抗cd39/tgfβ陷阱分子氧化、延长其保质期和/或提高其活性的方法，例如，通过将本发明中提供的抗cd39/tgfβ陷阱分子与一种或多种抗氧剂(例如，甲硫氨酸)混合来实现。
[0393]
进一步地说，药学上可接受的运载体可包括，例如，水相介质如氯化钠注射液、林格氏液注射液、等渗葡萄糖注射液、无菌水注射液、或葡萄糖和乳酸林格注射液、非水介质例如：植物来源的不挥发性油、棉花子油、玉米油、芝麻油、或者花生油、细菌抑制或真菌抑制浓度下的抗菌物质、等渗剂如：氯化钠或葡萄糖、缓冲液如：磷酸盐或枸橼酸酸盐缓冲液，抗氧化剂如：硫酸氢钠，局部麻醉剂如：盐酸普鲁卡因，助悬剂和分散剂如：羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮，乳化剂如：聚山梨醇酯80(吐温-80)、螯合试剂如edta(乙二胺四乙酸)或egta(乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸)、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。作为运载体的抗菌剂可加入多剂量容器中的药物组合物中，其包括酚类或甲酚、汞制剂、苯甲醇、氯代丁醇、甲基和丙基对羟基苯甲酸酯、噻汞撒、氯苯甲烷铵和氯苯乙铵。适用的辅料可包括，例如，水、盐、葡萄糖、甘油或乙醇。适用的无毒辅
助物质可包括，例如，润湿剂、乳化剂、ph缓冲剂、稳定剂、增溶剂，或者醋酸钠、去水山梨糖醇月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或者环糊精之类的物质。
[0394]
所述药物组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳剂、丸剂、胶囊、片剂、持续释放制剂或粉末。口服制剂可以包括标准运载体如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
[0395]
在某些实施方式中，所述药物组合物被制剂成可注射的组合物。可注射的药物组合物可以任何常规的形式制备，例如，液体溶剂、悬浮剂、乳化剂或适用于产生液体溶剂、悬浮剂或乳化剂的固体形式。注射制剂可包括现用的无菌和/或无热原溶液、使用前现与溶剂结合的无菌干燥的可溶物，如冻干粉，包括皮下片、注射即用的无菌悬浮剂、使用前现与介质结合的无菌干燥不溶产品，和无菌和/或无热原的乳剂。溶剂可以为水相或非水相。
[0396]
在某些实施方式中，单位剂量的注射制剂包装在一个安瓿、一支管或一支带有针的针筒中。本领域习知，所有注射给药的制剂应为无菌无热原。
[0397]
在某些实施方式中，通过将本发明中公开的抗体或其抗原结合片段溶解于某适当的溶剂中可制备无菌冻干的粉末。所述溶剂可含有一种可提高粉末或由粉末制得的重组溶液的稳定性，或改善粉末或重组溶液的其他药理组分。适用的辅料包括，但不限于，水、葡萄糖、三梨糖醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其他适用的物质。溶剂可含有缓冲液，如枸橼酸缓冲液、磷酸钠或磷酸钾缓冲液或其他本技术人员公知的缓冲液，在一种实施方式中，缓冲液的ph为中性。在本领域公知的标准条件下进行对所述溶解进行随后的过滤除菌，然后冻干制得理想的制剂。在一种实施方式中，将所得的溶剂分装至小管中冻干。每支小管可容纳单次剂量或多次剂量的所述抗cd39/tgfβ陷阱分子或其组合物。每支小管中的装入量可略微高于每次剂量所需或多次剂量所需(例如10％过量)，从而保证取样精确和给药精确。冻干粉可在适当的条件下储存，如在约4℃到室温范围。
[0398]
用注射用水将冻干粉重溶得到用于注射给药的制剂。在一种实施方式中，可将冻干粉加至无菌无热原水或其他适用的液体载剂中重溶。精确的量由选择的疗法决定，可根据经验值决定。
[0399]
试剂盒
[0400]
在某些实施方式中，本发明提供了一种试剂盒，其包含本发明提供的抗cd39/tgfβ陷阱分子和/或本发明提供的药物组合物。在某些实施方式中，本发明提供了一种试剂盒，其包含本发明提供的抗cd39/tgfβ陷阱分子和第二治疗剂。在某些实施方式中，第二治疗剂选自化疗剂、抗癌药物、放疗剂、免疫治疗剂、抗血管生成剂、靶向治疗剂、细胞治疗剂、基因治疗剂、激素治疗剂、抗病毒剂、抗生素、镇痛药、抗氧化剂、金属螯合剂和细胞因子。
[0401]
如果需要，这样的试剂盒可以进一步包括各种常规药物试剂盒组分中的一种或多种，例如具有一种或多种药学上可接受的载体的容器、另外的容器等，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。试剂盒中还可以包括指示要施用的组分的量的说明书(作为插入物或标签)、施用指南和/或混合组分的指南。
[0402]
使用方法
[0403]
本发明还提供了在受试者中治疗、预防或减轻与cd39相关和/或与tgfβ相关的疾病、病症或状况的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的根据本发明所述的抗cd39/tgfβ陷阱分子和/或根据本发明所述的药物组合物。在某些实施方式中，所述受试者是人
类。本技术的发明人意外地发现，通过同时阻断腺苷通路(通过抑制cd39)和阻断tgfβ信号通路(通过tgfβ陷阱)，可以在治疗、预防或减轻受试者的cd39相关和/或tgfβ相关疾病、病症或状况方面实现协同效应。
[0404]
在一些实施方式中，与cd39相关的疾病、病症或状况的特征在于表达或过表达cd39。在一些实施方式中，与tgfβ相关的疾病、病症或状况的特征在于表达或过表达tgfβ。
[0405]
在一些实施方式中，与cd39相关的疾病、病症或状况所述疾病、病症或状况是癌症。在一些实施方式中，所述癌症是表达cd39的癌症。本发明中所用的“表达cd39的”癌症是指特征在于在癌细胞或浸润肿瘤的免疫细胞或免疫抑制细胞中表达cd39，并且在癌细胞或浸润肿瘤的免疫细胞或免疫抑制细胞表达cd39的水平显着高于正常细胞所预期的水平的癌症。可以使用多种方法来确定来自受试者的测试生物样品中cd39的存在或含量。例如，测试生物样品可以暴露于抗cd39抗体或其抗原结合片段，其结合至并检测表达的cd39蛋白。或者，也可以使用诸如qpcr、逆转录酶pcr、微阵列、sage、fish等方法在核酸表达水平上检测cd39。在一些实施方式中，所述测试样品来自癌细胞或组织或浸润肿瘤的免疫细胞。参考样品可以是从健康或未患病的个体获得的对照样品，或者是从从其获得测试样品的同一个人获得的健康或未患病的样品。例如，参考样品可以是与测试样品(例如肿瘤)相邻或附近的未患病样品。
[0406]
在一些实施方式中，与tgfβ相关的疾病、病症或状况所述疾病、病症或状况是癌症。在一些实施方式中，所述癌症是表达tgfβ的癌症。本发明中所用的“表达tgfβ的”癌症是指特征在于在癌细胞或浸润肿瘤的免疫细胞或免疫抑制细胞中表达tgfβ，并且在癌细胞或浸润肿瘤的免疫细胞或免疫抑制细胞表达tgfβ的水平显着高于正常细胞所预期的水平的癌症。
[0407]
本发明还提供了治疗、预防或减轻与受试者体内tgfβ水平和/或活性增加相关的疾病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本发明提供的抗cd39/tgfβ陷阱分子和/或本发明提供的药物组合物。
[0408]
可以使用多种方法来确定来自受试者的测试生物样品中tgfβ的存在或含量。例如，可以把测试生物样品暴露于抗tgfβ抗体或其抗原结合片段，其结合至并检测表达的tgfβ蛋白。或者，也可以使用诸如qpcr、逆转录酶pcr、微阵列、sage、fish等方法在核酸表达水平上检测tgfβ。在一些实施方式中，所述测试样品来自癌细胞或组织或浸润肿瘤的免疫细胞。参考样品可以是从健康或未患病的个体获得的对照样品，或者是从从其获得测试样品的同一个人获得的健康或未患病的样品。例如，参考样品可以是与测试样品(例如肿瘤)相邻或其附近的未患病样品。
[0409]
在某些实施方式中，所述疾病、病症或状况是癌症、胰腺萎缩或纤维化。
[0410]
在某些实施方式中，所述癌症选自下组：肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、胆囊癌、胃癌、肺癌、支气管癌、骨癌、肝胆管癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、睾丸癌、肾癌、肾盂和输尿管癌、唾液腺癌、小肠癌、尿道癌、膀胱癌、头颈癌、脊柱癌、脑癌、宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、结肠癌、结直肠癌、直肠癌、食道癌、胃肠道癌、皮肤癌、前列腺癌、垂体癌、阴道癌、甲状腺癌、喉癌、胶质母细胞瘤、黑素瘤、骨髓增生异常综合征、肉瘤、畸胎瘤、慢性淋巴细胞白血病(cll)、慢性髓性白血病(cml)、急性淋巴细胞白血病(all)、急性髓性白血病(aml)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、t或b细胞淋巴瘤、胃肠道间质
瘤、软组织肿瘤、肝细胞癌和腺癌。在某些实施方式中，所述癌症是白血病、淋巴瘤、膀胱癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、卵巢癌、黑素瘤、前列腺癌、甲状腺癌、食道癌或乳腺癌。
[0411]
tgfβ是大多数(如果不是全部的话)慢性肾病(ckd)中导致纤维化的主要因素。在多种疾病模型中，抑制tgf-β同种型(tgf-β1)或其下游信号通路可显著限制肾纤维化，而tgf-β1过度表达可诱导肾纤维化。tgf-β1可通过激活典型(基于smad)和非典型(基于非smad)信号通路诱导纤维化，导致肌成纤维细胞激活、细胞外基质(ecm)过度产生和ecm降解抑制。smad蛋白在纤维化调节中的作用是复杂的，具有竞争性促纤维化和抗纤维化作用(包括调节间质转化)，并且tgf-β/smad与其他信号通路之间存在复杂的相互作用。研究已经确定调节纤维化中tgf-β1/smad信号作用的其他机制，包括短和长非编码rna分子以及dna和组蛋白的表观遗传修饰。尽管由于tgf-β1参与其他过程，直接靶向tgf-β1不太可能产生可行的抗纤维化治疗，但对tgf-β1控制纤维化的各种途径的更深入理解已经确定了开发新疗法的替代靶点，以阻止ckd中这一最具破坏性的过程。
[0412]
腺苷在炎症和组织重塑中具有重要作用，并通过腺苷受体(a2ar)激活促进皮肤纤维化。胞外腺苷由外酶cd39和cd73串联产生，促进真皮纤维化。腺苷轴参与肾缺血再灌注损伤(iri)，cd39和cd73作用产生的腺苷具有保护作用。但是，腺苷的慢性升高与肾纤维化的发生有关。有证据表明，在博莱霉素激发后，cd39和/或cd73的缺失降低了胶原含量，并阻止了皮肤增厚和拉伸强度的增加。在cd39-和/或cd73缺陷小鼠中，真皮纤维化特征的减少与促纤维化介质、转化生长因子-β1和结缔组织生长因子的表达减少以及肌成纤维细胞数量的减少有关。
[0413]
我们假设cd39和tgf-β的抑制可能在硬皮病、肝纤维化和肾纤维化等疾病的纤维化治疗中具有前景。
[0414]
在某些实施方式中，所述纤维化选自下组：硬皮病、肾纤维化、肺纤维化(例如，囊性纤维化、特发性肺纤维化)、肝纤维化(例如，桥接纤维化、肝硬化)、脑纤维化、关节纤维化、纵隔纤维化、骨髓纤维化、肾源性系统纤维化、腹膜后纤维化和心肌纤维化(例如，间质纤维化、替代性纤维化)。在一些实施方式中，所述受试者已被确定为具有癌细胞或肿瘤浸润性免疫细胞或表达cd39和/或tgfβ的免疫抑制细胞，可选地，其水平显著高于通常在非癌细胞或非免疫抑制细胞上发现的水平。
[0415]
在一些实施方式中，所述免疫抑制细胞是调节性t细胞。所述调节性t细胞(“treg”)是一种独特的t淋巴细胞群体，其具有在体外主要抑制应答t细胞增殖和在体内抑制自身免疫疾病的能力。本发明所述的treg可能是具有抑制特性的cd4

cd25

foxp3

t细胞。在某些实施方式中，本发明所述的treg是cd4

treg，特别地，过度表达cd39的cd4

treg。
[0416]
在一些实施方式中，所述受试者已被鉴定为在肿瘤微环境中与正常在对照受试者中发现的调节性t细胞的活性相比具有过度活跃的调节性t细胞。所述肿瘤微环境中调节性t细胞的活性可通过本领域的传统方法确定，例如，t细胞上的cd25

foxp3

上调，tgfβ和il-10的分泌，ctl细胞毒性的抑制等。
[0417]
在一些实施方式中，所述受试者预期从免疫抑制的逆转或功能失调的耗尽t细胞的逆转中受益。
[0418]
在一些实施方式中，所述疾病、病症或状况是自身免疫性疾病或感染。在一些实施方式中，所述自身免疫性疾病是免疫性血小板减少症、系统性硬皮病、硬化症、成人型呼吸
窘迫综合征、湿疹、哮喘、干燥综合征、艾迪生氏病、巨细胞动脉炎、免疫复合体肾炎、免疫性血小板减少性紫癜、自身免疫性血小板减少症、乳糜泻、牛皮癣、皮炎、结肠炎或系统性红斑狼疮。在一些实施方式中，所述感染是病毒感染或细菌感染。在一些实施方式中，所述感染是hiv感染、hbv感染、hcv感染、炎性肠病或克罗恩氏病。
[0419]
在另一个方面，提供在会从cd39活性和/或tgfβ活性的调节中受益的个体中治疗、预防或减轻疾病、病症或状况的方法，所述方法包含向有需要的个体施用如本发明所述的治疗有效量的抗cd39/tgfβ陷阱分子和/或药物组合物。在某些实施方式中，所述疾病、病症或状况是以上定义的与cd39相关和/或与tgfβ相关的疾病、病症或状况。
[0420]
本发明所述的抗cd39/tgfβ陷阱分子的治疗有效剂量依赖于本领域公知的多种因素，例如体重、年龄、过往病史、现用治疗、对象的健康状况和交叉感染的潜力、过敏、超敏和副作用，以及给药途径和肿瘤发展的程度。本领域技术人员(例如医生或兽医)可根据这些或其它条件或要求按比例降低或升高剂量。
[0421]
在某些实施方式中，如本发明所述的抗cd39/tgfβ陷阱分子可以在治疗有效剂量约0.01mg/kg到约100mg/kg之间给药。在某些实施方式中，给药剂量可随治疗进程变化。例如，在某些实施方式中，初始给药剂量可比后续给药剂量高。在某些实施方式中，给药剂量在治疗进程中根据给药对象的反应进行调整。
[0422]
给药方案可通过调整达到最优反应(如治疗反应)。例如，可进行单剂量给药或在一段时间分多个分隔的剂量给药。
[0423]
本发明中公开的抗cd39/tgfβ陷阱分子可通过本领域公知的给药方式给药，例如肠胃外给药(如，皮下注射、腹腔注射、静脉注射，包括静脉滴注，肌肉注射或皮内注射)或非肠胃外给药途径(如，口服给药、鼻腔给药、舌下给药、直肠给药或外用给药)。
[0424]
在一些实施方式中，本发明中公开的抗cd39/tgfβ陷阱分子可以单独给药或与治疗有效量的第二治疗剂联合给药。例如，本发明公开的抗cd39/tgfβ陷阱分子可以与第二治疗剂(例如，化疗剂、抗癌药、放疗剂、免疫治疗剂、抗血管生成剂、靶向治疗剂、细胞治疗剂、基因治疗剂、激素治疗剂、抗病毒剂、抗生素、镇痛药、抗氧化剂、金属螯合剂或细胞因子)联合给药。
[0425]
本发明使用的术语“免疫疗法”是指刺激免疫系统对抗疾病(例如癌症)或以一般方式增强免疫系统的一种疗法。免疫疗法的实例包括但不限于检查点调节剂、过继性细胞转移、细胞因子、溶瘤病毒和治疗性疫苗。
[0426]“靶向疗法”是一种作用于与癌症有关的特定分子的疗法，例如存在于癌细胞中但不存在于正常细胞中或在癌细胞中更为丰富的特定蛋白质，或癌症微环境中有助于癌症生长和生存的靶分子。靶向疗法将治疗剂瞄准肿瘤，从而使正常组织免受治疗剂的影响。
[0427]
在某些这样的实施方式中，本发明公开的抗cd39/tgfβ陷阱分子与一种或多种另外的治疗剂联用时，可与所述的一种或多种另外的治疗剂同时给药，在某些这样的实施方式中，所述的抗cd39/tgfβ陷阱分子和所述另外的治疗剂可作为同一个药物组合物的一部分同时给药。但是，与其他治疗剂“联用”的抗cd39/tgfβ陷阱分子不需要同时给药或与该治疗剂在同一组合物中给药。本发明中“联用”的含义还包括，在另一个治疗剂之前或之后给药的抗cd39/tgfβ陷阱分子也被认为是与该治疗剂“联用”，即使所述抗cd39/tgfβ陷阱分子与第二种物质通过不同给药方式给药。在可能的情况下，与本发明中公开的抗cd39/tgfβ陷
阱分子联用的其他治疗剂可参照该其他治疗剂的产品说明书的方法用药，或参照外科医生的案头参考书2003(physicians’desk reference,57th ed；medical economics company；isbn:1563634457；57th edition(november 2002))，或参照其他本领域公知的方法。
[0428]
在另一方面，本发明进一步提供了调节cd39阳性细胞中cd39活性的方法，包括将cd39阳性细胞暴露于本发明提供的抗cd39/tgfβ陷阱分子。在一些实施方式中，cd39阳性细胞是免疫细胞。
[0429]
在另一方面，本发明进一步提供了调节tgfβ阳性细胞中tgfβ活性的方法，包括将tgfβ阳性细胞暴露于本发明提供的抗cd39/tgfβ陷阱分子。
[0430]
在另一方面，本发明提供了检测样品中cd39和/或tgfβ的存在或含量的方法，其包括将所述样品与所述抗cd39/tgfβ陷阱和/或本发明提供的药物组合物接触，以及确定样品中cd39和/或tgfβ的存在或含量。
[0431]
在另一方面，本发明提供了一种在个体中诊断与cd39相关和/或与tgfβ相关的疾病、病症或状况的方法，其包括：a)将获取自所述个体的样品与本发明所述的抗cd39/tgfβ陷阱分子和/或本发明提供的药物组合物接触；b)确定在所述样品中cd39和/或tgfβ的存在或含量；以及c)将cd39和/或tgfβ的存在或含量与所述与cd39相关和/或与tgfβ相关的疾病、病症或状况在个体中的存在情况或状况相关联。
[0432]
在另一方面，本发明提供了试剂盒，所述试剂盒包含本发明所述的抗cd39/tgfβ陷阱分子和/或本发明提供的药物组合物，其任选地与可检测部分缀合，可以用于检测与cd39相关和/或与tgfβ相关的疾病、病症或状况。所述试剂盒可以进一步包括使用说明。
[0433]
在另一方面，本发明还提供本发明所述的抗cd39/tgfβ陷阱分子和/或本发明提供的药物组合物在制备用于在个体中治疗、预防或减轻与cd39相关和/或与tgfβ相关的疾病、病症或状况的药物中的用途、在制备用于诊断与cd39相关和/或与tgfβ相关的疾病、病症或状况的诊断试剂中的用途。
[0434]
在另一方面，本发明提供了一种在受试者中治疗、预防或减轻可通过降低cd39的atp酶活性而可治疗的疾病的方法，包括向受试者施用本发明提供的治疗有效量的抗cd39/tgfβ陷阱分子和/或本发明提供的药物组合物。例如，可以施用本发明提供的抗cd39/tgfβ陷阱分子以降低表达cd39的癌细胞或浸润肿瘤的免疫细胞或免疫抑制细胞的atp酶活性。在一些实施方式中，受试者是人类。在一些实施方式中，受试者具有选自下组的疾病、病症或状况：癌症、胰腺萎缩、纤维化、自身免疫性疾病和感染。
[0435]
在另一方面，本发明提供了一种在受试者中治疗、预防或减轻与腺苷介导的t细胞、单核细胞、巨噬细胞、dc、apc、nk和/或b细胞活性的抑制相关的疾病的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明所述的抗cd39/tgfβ陷阱分子和/或本发明所述的药物组合物。
[0436]
以下实施例旨在更好地说明本发明，且不应理解为限制本发明的范围。所有下述的特定组合物、材料和方法，其整体或部分，都在本发明的范围内。这些特定的组合物、材料和方法不是为了限制本发明，而只是为说明特定的实施方式在本发明的范围内。本领域熟练技术人员可不经过创造性劳动以及不偏离本发明范围而开发出等同的组合物、材料和方法。应理解，在对本发明的方法作出的多种改动可以仍然包括在本发明范围内。发明人意在将这样的变动包括在本发明的范围内。
[0437]
实施例
[0438]
实施例1.制备材料
[0439]
1.1参考抗体的产生
[0440]
基于已公开的序列产生抗cd39参考抗体。专利申请wo2016/073845a1中公开了抗体9-8b，其重链和轻链可变区序列在本技术中分别为seq id no:46和48。抗体t895在专利申请wo 2019/027935a1中被公开为抗体31895，并且其重链和轻链可变区序列在本技术中分别为seq id no:55和57。专利申请wo 2018/167267a1中公开了抗体i394，其重链和轻链可变区序列在本技术中分别为seq id nos:113和114。抗体9-8b、t895和i394的重链可变区和轻链可变区如下表10所示。在expi293细胞(invitrogen)中克隆并表达编码参考抗体的dna序列。收集细胞培养基并离心除去细胞沉淀。使用蛋白a亲和色谱柱(mabselect sure，ge healthcare)纯化收获的上清液，以获得参考抗体制剂。
[0441]
表10：三种参考抗体的可变区氨基酸序列
[0442]
[0443][0444]
1.2人、食蟹猴和小鼠cd39稳定表达细胞系的建立
[0445]
分别将编码全长人cd39(np_001767.3)、食蟹猴cd39(xp_015311944.1)和小鼠cd39(np_033978.1)的dna序列克隆到表达载体中，然后在hek293细胞中转染并表达。在选择培养基中分别培养表达人cd39、食蟹猴cd39和小鼠cd39的转染细胞。通过有限稀释分离稳定表达人cd39、食蟹猴cd39或小鼠cd39的单细胞克隆。然后使用抗人cd39抗体(bd,cat#555464)、抗食蟹猴cd39抗体(9-8b)、抗小鼠cd39抗体(biolegend,cat#143810)通过facs筛选细胞。
[0446]
以类似的方式，在选择培养基中培养被人cd39、食蟹猴cd39或小鼠cd39表达质粒转染的chok1细胞(invitrogen)。通过有限稀释分离稳定表达人cd39、食蟹猴cd39或小鼠cd39的单细胞克隆，然后使用所述的抗人cd39抗体、所述的抗食蟹猴cd39抗体或所述的抗小鼠cd39抗体通过facs筛选细胞。
[0447]
将稳定细胞系分别命名为hek293-hcd39、hek293-cynocd39、hek293-mcd39、chok1-hcd39、chok1-cynocd39和chok1-mcd39，它们均显示出高表达和atp酶活性。
[0448]
1.3重组蛋白的产生
[0449]
将编码人cd39的细胞外结构域(ecd)的dna序列克隆到表达载体中，并转染到hek293细胞中，以表达ecd重组蛋白。
[0450]
实施例2.抗体的产生
[0451]
2.1免疫和杂交瘤的产生与筛选
[0452]
为了产生针对cd39的抗体，用重组表达的人cd39抗原或其片段或编码全长人cd39的dna和/或表达人cd39的细胞免疫balb/c和sjl/j小鼠(slac)。在免疫操作的过程中，通过尾静脉或眼眶后取血获得血浆和血清样品，来监测免疫反应。将具有足够滴度的抗cd39抗体的小鼠用于融合实验。分离来自免疫小鼠的脾细胞和/或淋巴结细胞，并将其与小鼠骨髓瘤细胞系(sp2/0)融合。通过用人cd39 ecd重组蛋白进行elisa分析，或通过用稳定表达人cd39的chok1-hcd39细胞进行acumen分析(ttp labtech)筛选出能产生cd39特异性抗体的杂交瘤。通过facs和酶活性阻断实验证实了杂交瘤克隆对hcd39的特异性，并对其进行亚克隆以获得稳定的杂交瘤克隆。在1-2轮亚克隆后，扩增单克隆杂交瘤以产生抗体，并冷冻贮存。
[0453]
通过有限稀释法，将分泌抗体的杂交瘤进行亚克隆。在体外培养稳定的亚克隆，以在组织培养基中产生用于表征的抗体。在1-2轮亚克隆后，扩增单克隆杂交瘤以产生抗体。
[0454]
培养约14天后，收集杂交瘤细胞培养基并通过蛋白a亲和色谱柱(ge)纯化。所述杂交瘤克隆抗体分别命名为mab13、mab14、mab19、mab21、mab23、mab34和mab35。
[0455]
实施例3.抗体表征
[0456]
3.1抗体
[0457]
在以下描述的一系列结合和功能分析中，对杂交瘤抗体克隆mab13、mab14、mab19、
mab21、mab23、mab34和mab35进行表征分析。
[0458]
3.2与人cd39、食蟹猴cd39和小鼠cd39的结合亲和力
[0459]
使用facs来确定抗体与天然表达cd39的细胞系(sk-mel-28)或重组表达cd39的细胞系(chok1-hcd39、chok1-cynocd39和chok1-mcd39)、或作为阴性对照的缺乏cd39表达的细胞(chok1-blank)的结合。
[0460]
根据atcc步骤，将chok1-hcd39、chok1-ccd39、chok1-mcd39和chok1-blank细胞培养于培养基中。收集细胞，并以3
×
106个细胞/ml的密度将细胞重悬于封闭缓冲液中。将细胞以100μl/孔(3x105个细胞/孔)的密度转移到96孔facs板中，将板离心并用facs缓冲液(pbs、1％fbs、0.05％tween-20)洗涤两次。从30μg/ml开始，用facs缓冲液制备抗cd39抗体的4倍系列稀释液。分别使用参考抗体9-8b和小鼠/人igg对照作为阳性对照和阴性对照。将细胞重悬于100μl/孔稀释的抗体中，并将板在4℃下培养60分钟。用facs缓冲液洗涤板，将alexa488标记的二抗(在facs缓冲液中1：1000)添加到每个孔中，并在4℃下培养30分钟。用facs缓冲液洗涤板，并将细胞重悬于100μl/孔的pbs中。然后用facsverse
tm
分析细胞，并确定平均荧光强度。通过检测一系列抗体的浓度，生成cd39表达细胞的完整的结合曲线。使用prism软件确定每种抗体的表观亲和力。
[0461]
同样，将表达人cd39的细胞sk-mel-5、sk-mel-28或molp-8在4℃下与梯度浓度的抗cd39抗体培养30分钟。用facs缓冲液洗涤细胞3次，然后与荧光标记的二抗(山羊抗小鼠igg或山羊抗人igg)在4℃下培养30分钟。将细胞洗涤3次，然后重悬于facs缓冲液中，并在bd celesta上通过流式细胞术进行分析。使用graphpad prism 8.02绘制和分析数据。
[0462]
与已知的抗cd39抗体9-8b相比，7种纯化的杂交瘤抗体的结合亲和力如表11所示。所有杂交瘤抗体均以剂量依赖性方式与人和食蟹猴cd39结合，但在facs分析中没有杂交瘤抗体识别小鼠cd39。
[0463][0464]
3.3检测atp酶的抑制
[0465]
用pbs缓冲液洗涤表达cd39的细胞sk-mel-5和molp-8，并在37℃下与梯度抗体一
起培养30分钟。向每个孔中加入50mm atp，并与细胞一起培养16小时。收集上清液，并根据制造商的使用手册，用孔雀绿磷酸盐检测试剂盒(malachite green phosphate detection kit,r&d systems,catalog#dy996)检测来自atp降解的正磷酸盐产物。同种型和/或9-8b用作对照。使用graphpad prism8.02绘制和分析数据。ec
50
是在该分析中达到50％信号时所示抗体的浓度。
[0466]
如表11中所总结，与参考抗体9-8b相比，所有7种纯化的杂交瘤抗体均具有良好的atp酶抑制活性。
[0467]
3.4 atp介导的t细胞增殖抑制分析
[0468]
在atp存在下，将用csfe标记并用抗cd3和抗cd28刺激的人t细胞与抗cd39抗体或同种型对照一起培养。通过csfe稀释在facs中分析t细胞的增殖。migg2a用作同种型对照。
[0469]
所选的抗cd39抗体mab21和mab23的t细胞增殖活性如图1所示，并汇总于表11中。ec
50
是在该分析中达到50％信号时所示抗体的浓度。两种抗体均以剂量依赖性方式增强t细胞增殖，即两种抗体均阻断对t细胞增殖的atp介导的抑制作用。
[0470]
3.5表位分组(epitope binning)
[0471]
使用alex488标记试剂盒标记抗cd39抗体，并进行一系列浓度稀释，然后再与chok1-hcd39细胞混合，以使用facs检测结合ec
80
。检测了未标记抗体对标记抗体的阻断功效。简单地说，将chok1-hcd39单核细胞制备至密度为2x106/ml，并以50μl/孔接种到96孔板中，然后与梯度抗体混合至100μl的终体积，然后以两倍的ec
80
浓度添加等体积的alex488标记抗体。将96孔板在4℃下培养1小时，离心并用200μl facs缓冲液洗涤3次。在facscelesta机器上进行facs分析，并通过flowjo软件分析数据。与无竞争孔(仅alex488标记抗体)相比，计算了阻断百分比，并将其中竞争率高于80％的归入同一表位群中。
[0472]
竞争结果如表12所示。基于竞争结果，可将4种抗cd39杂交瘤抗体(mab14、mab19、mab21、mab23)分为4个不同的表位群，如表11所示。具体而言，抗cd39抗体mab19和mab21竞争高度相似的表位，并归为表位群i，如表11所示。mab14不与所测试的任何其他抗体竞争，归为表位群iv，如表11所示。mab23显示与mab19和mab21交叉竞争，并在表11中归为表位群ii。
[0473]
表12.抗cd39杂交瘤抗体的表位分组总结
[0474]
[0475]
3.6杂交瘤测序
[0476]
从单克隆杂交瘤细胞中分离出rna，并用商业试剂盒反转录成cdna。然后以cdna为模板，用mouse ig-primer set(novagen)的引物扩增出重链可变区和轻链可变区。收集并纯化大小正确的pcr产物，然后用合适的质粒载体连接。连接产物转化至dh5α感受态细胞。筛选克隆，并通过dna测序分析插入片段。
[0477]
杂交瘤抗体的可变区序列如下表2中所示。
[0478]
实施例4.嵌合抗体的产生和表征
[0479]
4.1嵌合抗体的产生与生产
[0480]
合成编码4种选择的杂交瘤抗体(mab14、mab19、mab21和mab23)可变区的dna，并将其亚克隆到预先包含人igg恒定基因的表达载体中。将载体转染到哺乳动物细胞中用于重组蛋白表达，并使用蛋白a亲和色谱柱纯化表达的抗体。所得的嵌合抗体在本技术中被称为c14、c19、c21和c23，其中前缀“c”表示“嵌合”，数字表示杂交瘤抗体克隆，例如数字“14”表示它来自杂交瘤抗体mab14。
[0481]
4.2嵌合抗体的表征
[0482]
检测4种纯化的嵌合抗体阻断atp介导的t细胞增殖抑制的活性(与实施例3.4中描述的方法类似)。如图2所示，抗cd39嵌合抗体c14、c19、c21和c23以剂量依赖性方式(在100nm、10nm、1nm、0.1nm、0.01nm和0.001nm的浓度范围)阻断cd4

t细胞增殖的抑制。cfse-cd4

t和higg4分别作为atp介导的t细胞增殖的阳性对照和阴性对照。
[0483]
进一步检测纯化的4种嵌合抗体在存在atp的情况下增强atp诱导的树突状细胞(dc)活化和成熟的能力。atp通过刺激单核细胞来源的树突状细胞的p2y11受体来诱导dc成熟。
[0484]
简单地说，从健康人血液中分离出人单核细胞，并在存在gm-csf和il-4的情况下分化为modc，持续6天。然后用4种不同剂量的抗cd39嵌合抗体在存在atp的情况下再将分化的modc处理24小时。然后，用facs分析cd86、cd83和hla-dr的表达来评价dc成熟。
[0485]
图3显示了facs检测的dc表面的cd39水平。图4a至4c分别显示了抗体处理后的cd86(图4a)、cd83(图4b)和hla-dr(图4c)表达。atp诱导的dc成熟表现为，与溶媒(vehicle)处理相比，cd86、cd83和hla-dr的表达增加。4种抗cd39抗体c14、c19、c21和c23均对atp诱导的dc成熟有显著促进作用。
[0486]
还检测了嵌合抗体的体内抗肿瘤活性。在nod-scid小鼠的右后胁腹区域皮下接种0.1ml pbs混合基质胶(1：1)中的肿瘤细胞(10x106)，用于肿瘤发展。当肿瘤平均大小达到约80mm3时，将小鼠随机分组。在随机分组的同一天开始处理，剂量为30mg/kg，每周两次。随机分组后，每周用卡尺在二维层面上测量肿瘤体积两次，并使用以下公式以mm3表示体积：v＝(l x w x w)/2，其中v是肿瘤体积，l是肿瘤长度(最长的肿瘤尺寸)，w是肿瘤的宽度(垂直于l的最长的肿瘤尺寸)。在层流柜(laminar flow cabinet)中进行给药，并测量肿瘤和体重。使用graphpad prism进行双因素方差分析。
[0487]
嵌合抗cd39抗体c23的肿瘤生长结果如图5所示。获得并检测了c23的人igg1型和igg4型。与溶媒组相比，c23-higg4和c23-higg1嵌合抗体均显示出抗肿瘤的作用，c23-higg4和c23-higg1之间无显著性差异。
[0488]
实施例5.抗体的人源化与亲和力成熟
[0489]
5.1人源化
[0490]
选择嵌合抗体c23和c14作为人源化克隆。将抗体序列与人种系序列比对以确定最佳拟合模型。基于与原始小鼠抗体序列的同源性，选择最匹配的人种系序列作为人源化的模板。然后将来自小鼠抗体序列的cdr与保持抗体的上核和中心核结构的残基一起嫁接到模板上。将优化的突变引入框架区以产生人源化重链可变区的变体和人源化轻链可变区的变体，将它们混合并匹配以提供多个人源化抗体克隆。移植和突变后，人源化抗体对表达人cd39的细胞保持相似的结合亲和力。通过cd39 atp酶抑制实验和体外免疫细胞活化实验进一步评估人源化抗体。还对一些人源化抗体进行了体内研究。
[0491]
总共获得了c23的31种人源化抗体克隆，混合并匹配人源化c23重链可变区的7种变体(即hu23.vh_1、hu23.vh_2、hu23.vh_3、hu23.vh_4、hu23.vh_5、hu23.vh_6和hu23.vh_7)和人源化c23轻链可变区的7种变体(即hu23.vl_1、hu23.vl_2、hu23.vl_3、hu23.vl_4、hu23.vl_5、hu23.vl_6和hu23.vl_7)。31种人源化抗体克隆被命名为hu23.h1l1、hu23.h1l2等，如上表9和下表13、14和15所示，其中前缀“hu”表示“人源化”，后缀例如“h1l1”表示具有hu23.vh_1可变区变体和hu23.vl_1可变区变体的编号为c23的人源化抗体克隆。
[0492]
表13：c23的人源化抗体的重链可变区和轻链可变区
[0493][0494][0495]
表14：c23的人源化抗体的重链可变区和轻链可变区
[0496][0497]
表15：c23的人源化抗体的重链可变区和轻链可变区
[0498][0499]
类似地，总共获得了c14的16种人源化抗体，混合并匹配了人源化c14重链可变区的4种变体(即hu14.vh_1、hu14.vh_2、hu14.vh_3和hu14.vh_4)和人源化c14轻链可变区的4种变体(即hu14.vl_1、hu14.vl_2、hu14.vl_3和hu14.vl_4)。16种人源化抗体克隆分别被命名为hu14.h1l1、hu14.h1l2等等以此类推，如下表16所示。
[0500]
表16：c14的16种人源化抗体的重链可变区和轻链可变区
[0501][0502]
还通过酵母展示获得了c23的几种人源化抗体克隆。简单地说，将小鼠重链和轻链
序列与人抗体序列的内部数据库进行比对。分别选择同源性最高的模板ighv1-3*01和igkv3-11*01用于重链和轻链cdr嫁接。通过使用酵母展示的高通量方法识别反向突变。具体而言，识别了有助于cdr构象的位置(游标区残基)，并通过在dna合成过程中在每个位置掺入模板和小鼠残基来创建反向突变库。通过测序人类cd39蛋白的主要结合物来确定最终候选物。通过酵母展示获得的c23的人源化抗体被命名为hu23.201(具有seq id nos:146/111的vh/vl)、hu23.203(具有seq id no:146/112的vh/vl)、hu23.207(具有seq id no:147/111的vh/vl)和hu23.211(具有seq id no:39/63的vh/vl)。
[0503]
表13、14、15和16中的人源化抗体由重组产生，随后进行结合亲和力检测，显示其能够保留结合人cd39的特异性。在包括cd39阻断实验和体外免疫细胞活化实验在内的功能实验中进一步评估具有相对较高亲和力的那些抗体。
[0504]
具体地，使用biacore(ge)表征人源化抗体hu23.h5l5、hu23.201、hu14.h1l1以及参考抗体i394和t895对人cd39的结合亲和力。简单地说，使用人类抗体捕获试剂盒(human antibody capture kit,ge)将待测抗体捕获到cm5芯片(ge)中。将6xhis标记的人cd39抗原连续稀释多次，并以30μl/min的速度注射180秒。维持缓冲液流解离400秒。使用3m mgcl2进行芯片再生。将缔合和解离曲线与1：1结合模型拟合，并计算每种抗体的ka/kd/kd值。下表17总结了所检测的抗体亲和力的数据。
[0505]
表17：通过biacore测定法检测的抗体对人cd39的结合亲和力
[0506]
抗体ka(1/ms)kd(1/s)kd(m)hu23.h5l58.22e 041.60e-031.95e-08hu23.2016.75e 041.62e-032.40e-08hu14.h1l19.03e 054.55e-035.03e-09i3942.03e 051.26e-036.21e-09t8951.33e 051.39e-011.04e-06
[0507]
此外，根据制造商的使用说明，使用octet测定法(creative biolabs)，对人源化抗体hu23.h5l5和hu14.h1l2以及参考抗体i394、t895和9-8b的抗人cd39结合亲和力进行表征。简单地说，将抗体偶联到传感器上，然后将传感器浸入cd39梯度液中(起始浓度为200nm，2倍稀释，共8个剂量)。对它们的结合反应进行实时测量，并对结果进行全局拟合。下表18中总结了检测的抗体的亲和力数据。
[0508]
表18：通过octet测定法检测的抗体对人cd39的结合亲和力
[0509]
[0510][0511]
另外，在c23抗体的人源化抗体克隆(例如hu23.h5l5)的hcdr2中鉴定出了一个易于脱酰胺的ng基序(n55g56)。为了除去脱酰胺位点，将不同的突变引入n55或g56，发现n55和g56可各自突变为多种残基，但仍保留与人cd39结合的特异性。例如，发现当n55被g、s或q单点替换时，抗体结合亲和力得以保留，并且对其与人cd39的结合没有负面影响。类似地，当g56被a或d替换时，突变抗体也保留了其对人cd39的特异性结合和结合亲和力。预计其他突变也起同样作用。
[0512]
5.2结合特异性检测
[0513]
通过elisa测定法检测纯化的人源化抗体hu23.h5l5对entpdase家族成员的结合特异性。简单地说，将entpd1(即cd39)和entpd 2/3/5/6蛋白包被在96孔elisa板上，在4℃下放置过夜，第二天，用200μl/孔的封闭缓冲液(含1％bsa的pbs与0.05％tween20混合液)洗涤并封闭elisa板2小时。然后将hu23.h5l5梯度液转移到孔中，并用抗higg-hrp染色。板洗涤后，将板用tmb底物显影，并用2n hcl终止反应。使用读板器记录od450，并用graphpad prism作图。hu23.h5l5的结合特异性如图6所示。从图6a可以看出，人源化抗体hu23.h5l5特异性结合人cd39，但不结合entpd 2/3/5/6蛋白中的任何一个。图6b显示阴性对照higg4不结合entpd 1/2/3/5/6蛋白中的任何一个。
[0514]
5.3人源化抗体的表征
[0515]
使用与实施例3.2中所述类似的方法，通过facs检测c23的人源化抗体的结合亲和力。显示出良好结合亲和力的c23人源化抗体克隆列于下表19和表20中，并且还示于图7a、7b和图8中。ec
50
是在该分析中信号指示达到50％时所示的抗体浓度。
[0516]
表19：c23人源化抗体与molp8细胞的结合活性
[0517]
[0518][0519]
nd:在该实验条件下检测不到。
[0520]
表20：c23的人源化抗体对molp8的结合活性
[0521]
抗体hu23.201hu23.203hu23.207hu23.211c23higg4ec
50
(nm)1.2890.4292.2461.5571.279nd
[0522]
nd:在该实验条件下检测不到。
[0523]
在sk-mel-28细胞上检测所选的c23人源化抗体以进行atp酶抑制分析(如实施例3.3中所述)。图9a和9b显示了所示的抗体的抑制图，并总结在表21中。选择hu23.h5l5和hu23.201用于进一步验证。
[0524]
表21：c23的人源化抗体对sk-mel-28细胞的atp酶抑制活性
[0525][0526]
使用与实施例3.2中所描述的类似方法，利用表达人cd39的molp-8细胞通过facs检测c14的人源化抗体的结合亲和力。
[0527]
显示出良好结合亲和力的c14的人源化抗体克隆如图10a、10b和10c所示。表22总结了ec
50
值。
[0528]
表22：c14人源化抗体与molp8细胞的结合活性
[0529]
抗体hu14.h1l1hu14.h2l2hu14.h3l1hu14.h3l3hu14.h3l4hu14.h4l4c14ec
50
(nm)7.2126.9085.9526.0886.0465.45917.52
[0530]
5.4表位分组
[0531]
检测所选择的人源化抗体的竞争性结合(方法如实施例3.5所描述)。人源化抗体hu23.h5l5和hu14.h1l1与参考抗体的表位分组结果如图19a所示。
[0532]
根据竞争结果(如图19a所示)，可以将2种人源化抗cd39抗体hu23.h5l5和hu14.h1l1分为2个不同的表位群(参见图19b)。具体而言，抗cd39抗体hu23.h5l5与参考抗体i394、t895和9-8b竞争高度相似的表位，被归为表位群i。hu14.h1l1、c34和c35除与t895部分竞争以外，未与测试的任何其他抗体竞争，因此被归为表位群ii。
[0533]
5.5优化的人源化抗体的表征
[0534]
5.5.1 hu23.h5l5对cd39的阻断增强了在存在细胞外atp(eatp)的情况下的人t细胞增殖。
[0535]
在存在atp的情况下，将用抗cd3抗体和抗cd28抗体刺激的人pbmc分别与25nm人源化抗cd39抗体hu23.h5l5和溶媒一起培养。收集细胞培养上清液，分别用于检测il-2和ifn-γ的分泌。第5天时，在facs中通过cell trace violet稀释染料分析cd4

t和cd8

t细胞的增殖。
[0536]
如图11a至11d所示，hu23.h5l5在25nm的浓度下显著增强了cd4

和cd8

t细胞的增殖，并激活了它们的il-2和ifn-γ的产生。如图11a、11b和11d所示，在增强pbmc中的t细胞活化方面，hu23.h5l5显示出比i394明显更高的活性。
[0537]
从健康供体pbmc中分离人cd8

t细胞，然后用细胞增殖染料标记，用抗cd3看台和抗cd28抗体激活，然后用不同剂量的人源化抗cd39抗体hu23.h5l5或参考抗体i394处理5天。在第3天，在开始cd39阻断处理之后，向细胞中加入200μm atp。在第5天，用流式细胞术分析cd8

t细胞增殖百分比(％)、cd25

细胞百分比(％)和活细胞百分比(％)。
[0538]
如图23a至23c所示，hu23.h5l5显著性地逆转了由eatp抑制的人cd8

t细胞增殖。
[0539]
按照实施例3.2中所描述的相似方法，通过facs在不同细胞上检测了人源化抗体hu23.h5l5和hu14.h1l1的结合亲和力。
[0540]
图12a至12e显示了抗体hu23.h5l5和hu14.h1l1分别对sk-mel-5(图12a)、sk-mel-28(图12b)、molp-8(图12c)、chok1-cynocd39(图12d)和chok1-mcd39(图12e)的结合亲和力。平行检测了参考抗体t895和i394作为对照抗体。如图12所示和表23所示，抗体hu23.h5l5和hu14.h1l1均以剂量依赖性方式结合表达人cd39和食蟹猴cd39的细胞，并在亚纳摩尔或纳摩尔水平上具有相似的ec
50
亲和力。它们都没有在facs研究中识别出小鼠cd39。每种抗体在细胞之间的最大信号(平均荧光强度，mfi)不同可能是由于它们的表达水平不同所致。
[0541]
表23：通过facs检测抗体亲和力ec
50
(nm)
[0542]
细胞hu23.h5l5hu14.h1l1t895i394sk-mel-50.697.880.210.49sk-mel-280.9929.140.360.94molp-80.140.350.110.11cho-k1/cynocd393.375nd4.1922.708
cho-k1/mcd39ndndndnd
[0543]
nd：在该实验条件下检测不到。
[0544]
图13显示hu23.h5l5阻断了sk-mel-5细胞(图13a)或molp-8细胞(图13b)上的cd39 atp酶活性，与参考抗体t895和i394的结果相似(方法如实施例3.3所描述)。结果总结在表24中。
[0545]
hu23.h5l5在sk-mel-5细胞中显示酶促阻断ic
50
值为70pm，在molp-8细胞中显示酶促阻断ic
50
值为330pm，这与参考抗体t895和i394相似或比参考抗体t895和i394稍好。在该检测中9-8b被鉴定为非阻断剂。
[0546]
表24：人源化抗体的atp酶活性抑制(ic
50
)(nm)
[0547]
ic
50
(nm)hu23.h5l5t895i3949-8bsk-mel-50.070.090.10ndmolp-80.330.510.21nd
[0548]
nd：在该实验条件下检测不到。
[0549]
5.5.2 hu23.h5l5对cd39的阻断增强了atp介导的单核细胞活化。
[0550]
也在atp介导的单核细胞活化测定中检测了人源化抗体hu23.h5l5。atp介导的促炎活性在调节多种免疫细胞类型(包括单核细胞)的功能中具有重要作用。为了评估cd39阻断是否可以增强atp介导的单核细胞活化，从人类健康血液中纯化出人类单核细胞，然后在存在atp的情况下，将抗cd39抗体以0.2nm至100nm的不同浓度进行培养。显示hu23.h5l5可在0.2nm的浓度(即，最低检测浓度)下有效诱导单核细胞活化。通过facs检测法分析cd80(图14a)、cd86(图14b)和cd40(图14c)的表达来评估单核细胞的活化(hu23.h5l5的浓度为50nm)。参考抗cd39抗体i394和t895用作对照，higg4用作同种型对照。
[0551]
结果显示在图14中。单独刺激atp证明了cd80和cd86的表达上调，表明单核细胞活化。人源化的抗cd39抗体hu23.h5l5进一步增强了atp介导的单核细胞活化，这由cd80、cd86和cd40的上调所证明，其水平与参考抗体i394相当。参考抗体t895对atp诱导的活化单核细胞没有显著影响。
[0552]
5.5.3 hu23.h5l5对cd39的阻断增强了atp介导的dc活化。
[0553]
还在atp介导的dc活化测定中检测了选择的人源化抗体hu23.h5l5(按照实施例4.2中描述的类似方法)。简单地说，通过facs测定法分析cd83表达来评估dc成熟。atp通过显示cd83的表达增加来诱导dc成熟(图15a)。从低至0.2nm的水平开始，hu23.h5l5以剂量依赖性方式增加cd83的表达，并且在抗体水平为0.6nm时，hu23.h5l5显著地增加了cd83的表达。这比参考抗体t895和i394中的任何一个都更有效。
[0554]
为了进一步评估atp介导的dc活化对t细胞活化的影响，洗涤atp活化的dc，然后与同种异体t细胞一起培养以进行混合淋巴细胞反应(mlr)。分析了t细胞增殖(图15b)和由活化的t细胞产生的ifn-γ(图15c)。
[0555]
与参考抗体i394和t895相比，抗cd39抗体hu23.h5l5对促进atp诱导的dc成熟具有剂量依赖性和显著地影响，参考i394显示出相似但稍弱的活性，而t895的作用非常轻微。同样，如图15b和15c所示，在mlr分析中，抗cd39阻断抗体hu23.h5l5增强了atp介导的modc成熟，导致更高的t细胞增殖和ifn-γ产生。
[0556]
5.5.4 hu23.h5l5对cd39的阻断促进了由lps刺激诱导的人巨噬细胞il1β释放。
[0557]
从健康人pbmc中分离人cd14

t细胞，然后以2x106/孔的密度将富集的cd14

单核细胞接种至6孔板，并与100ng/ml人gm-csf一起培养6天，产生m1样巨噬细胞。用剂量增加的hu23.h5l5或者参考抗体i394处理体外分化的巨噬细胞1小时，然后用10ng/ml lps刺激3小时，然后加入800μm atp培养2小时。用elisa定量细胞培养上清液里的il-1β。
[0558]
结果如图20所示。星号表示各个条件之间的显著性差异。如图20所示，hu23.h5l5显著地促进了由lps刺激诱导的人巨噬细胞il1β释放，并且在促进由lps刺激诱导的人巨噬细胞il1β释放方面，hu23.h5l5表现出了比参考抗体i394显著更高的活性。
[0559]
5.6体内研究
[0560]
根据实施例4.2中描述的方法，在molp-8异种移植小鼠上测定了人源化抗体hu23.h5l5和hu14.h1l1的作用。
[0561]
结果显示在图16中，与溶媒组相比，所有抗cd39抗体均抑制肿瘤生长。i394观察到的功效略弱于其他抗体，包括hu23.h5l5和hu14.h1l1。
[0562]
根据实施例4.2中描述的方法，也在pbmc移植动物模型(ncg小鼠，接种molp-8细胞，5m/小鼠)中考察了不同剂量(0.03mg/kg、0.3mg/kg、3mg/kg、10mg/kg、30mg/kg，腹膜内给药，每周两次，6个剂量)的人源化抗体hu23.h5l5的抗肿瘤作用。
[0563]
结果显示在图21中。如图21所示，人源化抗体hu23.h5l5在测试的所有剂量下均能有效地抑制肿瘤生长。
[0564]
发明人还确定了抗cd39抗体的抗肿瘤作用是否依赖于nk细胞或巨噬细胞。在第7天开始抗-asialo-gm1 nk耗竭处理，20μl/小鼠腹膜内给药，每5天一次。在第7天和第9天也开始氯膦酸盐脂质体的巨噬细胞耗竭处理，200μl/小鼠静脉内给药，每周一次。血液样品分析数据表明该试剂可显著去除单核吞噬细胞或nk。
[0565]
在nk细胞(图17)或巨噬细胞(图18)被耗竭的模型中，hu23.h5l5的肿瘤生长抑制作用被消除，表明抗cd39抗体的抗肿瘤作用依赖于nk细胞和巨噬细胞。
[0566]
具体地，如图17所示，与溶媒相比，抗-asialo-gm1在晚期阶段略微增强了肿瘤的生长。并且，与hu23.h5l5处理组相比，hu23.h5l5与抗-asialo-gm1的组合完全消除了hu23.h5l5的肿瘤生长抑制作用。如图18所示，与溶媒相比，氯膦酸盐脂质体对肿瘤的生长没有影响。但是，氯膦酸盐脂质体处理完全消除了hu23.h5l5的肿瘤生长抑制作用。
[0567]
实施例6.表位作图(epitope mapping)
[0568]
为了确定抗cd39抗体的表位，发明人设计了cd39突变体并用人cd39分子表面上暴露的氨基酸的取代来定义。将突变体克隆至融合了c末端egfp序列的表达载体，并转染至hek-293f细胞，如以下的表25所示。使用uniprotkb-p49961(entp1_human)的编号来表示目标氨基酸突变，uniprotkb-p49961(entp1_human)是人cd39的野生型氨基酸序列，其序列如seq id no：162所示。例如，v77g表示seq id no：162的第77位的缬氨酸被甘氨酸替换。
[0569]
表25：人cd39突变体
[0570]
[0571][0572]
简单地说，通过基因合成产生人cd39突变体，并克隆至表达载体pcmv3-gfpspark。制备包含经确证的突变体序列的载体，并转染至hek293f细胞。转染后3天，收集细胞并检测egfp以确认转基因表达。在产生的20种突变体中通过facs测试一系列剂量(从100nm开始，3倍稀释，11个点)的抗体，并用alexfluor647标记的抗higg染色。将抗体结合描述为alexfluor647强度除以gfp强度的相对结合。结果显示在图22中。
[0573]
如图22所示，人源化抗体hu23.h5l5与突变体kw27-6和kw27-20失去结合，但是并未与其他突变体失去结合。突变体kw27-6在残基q96、n99、e143和r147处有氨基酸取代，表明该突变体的上述残基中的一个或多个或全部对于hu23.h5l5的核心表位是至关重要的；突变体kw27-20在残基r138、m139和e142处有氨基酸取代，表明该突变体的上述残基中的一个或多个或全部对于hu23.h5l5的核心表位也是至关重要的。
[0574]
如图22所示，嵌合抗体c34与突变体kw27-16失去结合，但是并未与其他突变体失去结合。突变体kw27-16在残基k5、e100和d107处有氨基酸取代，表明该突变体的上述残基中的一个或多个或全部对于c34的核心表位是至关重要的。
[0575]
如图22所示，嵌合抗体c35与突变体kw27-2失去结合，但是并未与其他突变体失去结合。突变体kw27-2在残基v81、e82、r111和v115处有氨基酸取代，表明该突变体的上述残基中的一个或多个或全部对于c35的核心表位是至关重要的。
[0576]
如图22所示，参考抗体t895与突变体kw27-20失去结合，但是并未与其他突变体失去结合。突变体kw27-20在残基r138、m139和e142处有氨基酸取代，表明该突变体的上述残基中的一个或多个或全部对于t895的核心表位是至关重要的。
[0577]
如图22所示，参考抗体i394与突变体kw27-6和kw27-20失去结合，但是并未与其他突变体失去结合。突变体kw27-6在残基q96、n99、e143和r147处有氨基酸取代，表明该突变体的上述残基中的一个或多个或全部对于i394的核心表位是至关重要的；突变体kw27-20
在残基r138、m139和e142处有氨基酸取代，表明该突变体的上述残基中的一个或多个或全部对于i394的核心表位也是至关重要的。
[0578]
如图22所示，参考抗体9-8b与突变体kw27-6失去结合，但是并未与其他突变体失去结合。突变体kw27-6在残基q96、n99、e143和r147处有氨基酸取代，表明该突变体的上述残基中的一个或多个或全部对于9-8b的核心表位是至关重要的。
[0579]
实施例7.抗cd39/tgfβ陷阱分子的构建和表达
[0580]
抗cd39/tgfβ陷阱分子构建为在抗cd39抗体部分的重链和/或轻链的n-末端或c-末端连接到tgfβ受体ii ecd(tgfβrii ecd)的抗cd39抗体部分。柔性(gly4ser)3连接子与tgfβrii ecd的n-末端基因相连。构建了几个抗cd39/tgfβ陷阱分子，它们的tgfβrii ecd摩尔比和在抗cd39抗体部分上的位置不同，其示意图分别如图24a-g所示。可以通过类似方式产生包括与tgfβ受体i ecd(tgfβri ecd)或tgfβ受体iii ecd(tgfβriii ecd)连接的抗cd39抗体部分的抗cd39/tgfβ陷阱分子，在本技术中未显示。
[0581]
抗cd39/tgfβ陷阱分子es014-1包括一个抗cd39抗体部分(即hu23.h5l5)和两个tgfβrii ecd(即seq id no:164)，其中，抗cd39抗体部分的每个重链恒定区的c-末端分别连接一个tgfβrii ecd(图24a)。
[0582]
抗cd39/tgfβ陷阱分子es014-2包括一个抗cd39抗体部分(即hu23.h5l5)和四个tgfβrii ecd(即seq id no:164)，其中，抗cd39抗体部分的每个重链恒定区的c-末端分别连接两个tgfβrii ecd(图24b)。
[0583]
抗cd39/tgfβ陷阱分子es014-3包括一个抗cd39抗体部分(即hu23.h5l5)和四个tgfβrii ecd(即seq id no:164)，其中，抗cd39抗体部分的每个重链可变区的n-末端分别连接两个tgfβrii ecd(图24c)。
[0584]
抗cd39/tgfβ陷阱分子es014-4包括一个抗cd39抗体部分(即hu23.h5l5)和四个tgfβrii ecd(即seq id no:164)，其中，抗cd39抗体部分的每个轻链可变区的n-末端分别连接两个tgfβrii ecd(图24d)。
[0585]
抗cd39/tgfβ陷阱分子es014-5包括一个抗cd39抗体部分(即hu23.h5l5)和四个tgfβrii ecd(即seq id no:164)，其中，抗cd39抗体部分的每个重链可变区的n-末端分别连接一个tgfβrii ecd，并且抗cd39抗体部分的每个轻链可变区的n-末端分别连接一个tgfβrii ecd(图24e)。
[0586]
抗cd39/tgfβ陷阱分子es014-6包括一个抗cd39抗体部分(即hu23.h5l5)和四个tgfβrii ecd(即seq id no:164)，其中，抗cd39抗体部分的每个轻链恒定区的c-末端分别连接两个tgfβrii ecd(图24f)。
[0587]
抗cd39/tgfβ陷阱分子es014-7包括一个抗cd39抗体部分(即hu23.h5l5)和六个tgfβrii ecd(即seq id no:164)，其中，抗cd39抗体部分的每个重链恒定区的c-末端分别连接一个tgfβrii ecd，并且抗cd39抗体部分的每个轻链恒定区的c-末端分别连接两个tgfβrii ecd(图24g)。
[0588]
对于表达，使用在相同表达载体或单独表达载体中编码轻链和重链的dna转染cho细胞进行转染。收集培养基，用蛋白a琼脂糖柱纯化融合蛋白。
[0589]
实施例8.用elisa测定抗cd39/tgfβ陷阱分子与tgfβ的结合
[0590]
为确定抗cd39/tgfβ陷阱分子的结合能力和特异性，使用人tgfβ1、人tgfβ2、人tgf
β3以及小鼠tgfβ1进行elisa分析。测试抗原以1μg/ml的浓度涂覆在nunc 96孔免疫板上。使用pbt缓冲液中稀释的抗人fc抗体-辣根过氧化物酶缀合物测量浓度逐渐增加的抗cd39/tgfβ陷阱分子的结合，然后用tmb底物显影。使用可溶性tgfβ陷阱作为对照。如图25a-25c所示，抗cd39/tgfβ陷阱分子es014-1和es014-2与所有三种tgfβ同系物(人tgfβ1、tgfβ2和tgfβ3)结合。其他经测试的抗cd39/tgfβ陷阱分子(包括es014-3、es014-4、es014-5、es014-6、es014-7)的结果相似，未在本技术中显示。人tgfβ1的ec
50
在下表26中列出。此外，抗cd39/tgfβ陷阱分子es014-1与小鼠tgfβ1的结合和与人tgfβ1的结合亲和性类似(图25d)。
[0591]
表26：抗cd39/tgfβ陷阱分子与人tgfβ1的结合ec
50
[0592]
抗cd39/tgfβ陷阱es014-1es014-2es014-3es014-4ec
50
(nm)0.260.260.240.11抗cd39/tgfβ陷阱es014-5es014-6es014-7tgfβriiec
50
(nm)0.090.070.090.017
[0593]
实施例9.tgfβ和tgfβr阻断测定实验
[0594]
对于阻断测定实验，将tgfβ肽(tgfβ1)涂覆在微孔板上。纯化抗体的系列稀释液与重组tgfβrii-his蛋白(sinobiogical)在tgfβ1涂层板中培养1h。洗涤后，通过抗his-hrp缀合的二抗检测剩余的tgfβrii-his。在微量滴定板读取器(molecular devices corp)上读取450nm处的吸光度值，以定量tgfβrii his与tgfβ1的结合。所有测试的抗cd39/tgfβ陷阱分子(即es014-1、es014-2、es014-3、es014-6)均能有效阻断人tgfβ1与tgfβ受体tgfβrii的结合(图26，可溶性tgfβ陷阱(即tgfβrii)用作对照)。使用graphpad prism分析抗cd39/tgfβ陷阱分子的ic
50
值。含有四个tgfβrii ecd的抗cd39/tgfβ陷阱分子(如es014-2、es014-3和es014-6)比含有两个tgfβrii ecd的抗cd39/tgfβ陷阱分子(如es014-1)更有效(表27)。
[0595]
表27：抗cd39/tgfβ陷阱分子对人tgfβ1和tgfβrii的阻断ic
50
[0596][0597]
实施例10.用facs测定抗cd39/tgfβ陷阱分子与cd39的结合
[0598]
用洗涤缓冲液洗涤过表达cd39的约100,000个molp-8骨髓瘤细胞，并用100μl系列稀释的抗cd39/tgfβ陷阱分子在冰上培养30分钟。然后用洗涤缓冲液洗涤细胞两次，并在冰上与100μl抗人fc-pe培养30分钟。然后用洗涤缓冲液洗涤细胞两次，并在facs canto ii分析仪(bd biosciences)上进行分析。如图27a所示，所有测试的抗cd39/tgfβ陷阱分子(例如es014-1、es014-2、es014-3、es014-4、es014-5、es014-6、es014-7)以剂量依赖性方式与molp-8细胞结合。如图27b所示，es014-1以剂量依赖性方式与chok1/hcd39细胞结合。其他测试的抗cd39/tgfβ陷阱分子(例如es014-2、es014-3、es014-4、es014-5、es014-6、es014-7)与chok1/hcd39细胞的结合特征相似，未在本技术中显示。
[0599]
实施例11.抗cd39/tgfβ陷阱分子与cd39和tgfβ1同时结合
[0600]
cd39/his蛋白(sino biological)-涂层板或cho-k1/hcd39细胞与es014-1、抗cd39抗体或tgfβ陷阱对照的连续稀释液一起培养，然后与生物素化tgfβ1一起培养。使用链霉亲和素-辣根过氧化物酶或链霉亲和素-异硫氰酸荧光素评估结合。在450nm处读取光密
度(od)。数据为平均值
±
sd，显示了非线性最佳拟合(n＝2个技术重复)。结果如图28所示。如图28所示，代表性抗cd39/tgfβ陷阱分子(es014-1)能够分别通过elisa检测(图28a)和facs检测(图28b)检测到同时与cd39和tgfβ结合。其他测试的抗cd39/tgfβ陷阱分子(例如es014-2、es014-3、es014-4、es014-5、es014-6、es014-7)的结果相似，未在本技术中显示。
[0601]
实施例12.抗cd39/tgfβ陷阱分子抑制tgfβ信号
[0602]
使用hek-blue
tm tgf-β报告细胞分析(invivogen)来评估抗cd39/tgfβ陷阱分子对经典tgfβ信号传导的影响。抗cd39/tgfβ陷阱分子或抗cd39的系列稀释液与hek-blue
tm tgf-β报告细胞在重组人tgf-β1(5ng/ml)存在下培养24小时。在转染hek293细胞的tgf-βsmad报告分析中，抗cd39/tgf-β陷阱分子(但不是抗cd39)阻断tgf-β经典信号[半最大抑制浓度(ic
50
)＝32pm](图29a)。此外，用cd39蛋白预培养抗cd39/tgfβ陷阱分子不会影响抗cd39/tgfβ陷阱分子的tgf-β中和活性(图29b)。图29a和29b显示了代表性抗cd39/tgfβ陷阱分子es014-1的结果。其他测试的抗cd39/tgfβ陷阱分子(例如es014-2、es014-3、es014-4、es014-5、es014-6、es014-7)的结果相似，未在本技术中显示。
[0603]
实施例13.抗cd39/tgfβ陷阱分子对恶性细胞cd39活性的影响
[0604]
使用celltiterglo(ctg)分析测定抗cd39/tgfβ陷阱分子抑制恶性细胞系上cd39酶活性的能力。简单地说，用抗cd39/tgfβ陷阱分子、抗cd39抗体或对照抗体和100μm atp处理细胞60分钟。使用celltiterglo荧光分析试剂盒(promega)测量剩余atp水平。本分析使用molp-8(人多发性骨髓瘤细胞系)或cho/hcd39细胞。如图30a-b所示，用一定浓度的抗cd39/tgfβ陷阱分子或对照抗体处理molp-8细胞(如图所示)，在atp存在的情况下导致受试分子es014-1、es014-2和es014-6对cd39活性的剂量依赖性抑制。cd39活性的抑制由atp残留的程度确定，并以抑制率(％)表示。如下表28所列出的ic
50
，es014-1、es014-2和es014-6显示出强烈的抑制活性(纳摩尔ic
50
)。如图30c所示，用一系列浓度的示例性抗cd39/tgfβ陷阱分子es014-1或对照抗体处理cho/hcd39细胞(如图所示)，在atp存在的情况下导致所有受试抗体对cd39活性的剂量依赖性抑制。使用一定浓度范围内的其他受试抗cd39/tgfβ陷阱分子(例如es014-2、es014-3、es014-4、es014-5、es014-6、es014-7)处理cho/hcd39细胞得到的结果相似，未在本技术中显示。
[0605]
表28：抗cd39/tgfβ陷阱分子对molp-8细胞上的cd39 atp酶活性的ic
50
[0606]
抗cd39/tgfβ陷阱es014-1es014-2es014-6cd39ic
50
(nm)1.213.426.90.2641
[0607]
实施例14.抗cd39/tgfβ陷阱分子的结合亲和性
[0608]
根据制造商手册使用octet分析(forebio)分别对代表性抗cd39/tgfβ陷阱分子es014-1与人tgfβ1或cd39的结合亲和性进行表征。简单地说，将抗体偶联在传感器上，然后将传感器浸入tgfβ或cd39蛋白梯度中(从200nm开始，稀释2倍，共8个剂量)。其结合反应为实时测量，并对结果做全局拟合。受试分子es014-1的亲和性数据汇总如下表29所示。其他受试分子(例如es014-2、es014-3、es014-4、es014-5、es014-6、es014-7)的亲和性数据相似，未在本技术中显示。
[0609]
表29：octet分析检测的双特异性抗体es014-1对人tgfβ1和cd39的结合亲和性
[0610]
结合靶点kd(m)kon(1/ms)kdis(1/s)tgfβ13.70e-116.32e 062.34e-04
cd393.76e-109.14e 043.44e-05
[0611]
实施例15.treg抑制分析
[0612]
由于treg是tgfβ的主要分泌源，并且cd39在treg和dc上表达，因此使用treg抑制分析检测抗cd39/tgfβ陷阱分子对抗treg介导的t细胞抑制的相对能力。简单地说，在从pbmc分离的自体cd4

/cd25

天然tregs(ntreg)存在下，将从人pbmc分离的cd3

总t细胞添加到用il-4和gm-csf刺激的同种异体dc中，并在存在il-2、抗cd3/cd28和雷帕霉素(以1:1:10的比例)的x-vivo培养基中扩增。
[0613]
使用抗cd39/tgfβ陷阱分子、抗cd39抗体、可溶性tgfβ陷阱或抗cd39抗体与tgfβ陷阱的组合培养这些混合淋巴细胞3天后，通过使用cfse细胞示踪剂测量cd4 和cd8 t细胞增殖和使用htrf(cisbo)测定ifnγ分泌来评估t细胞的功能。正如预期的那样，添加自体treg抑制了由同种dc触发的t细胞激活(图31a)。代表性的抗cd39/tgfβ陷阱分子es014-1比抗cd39抗体、可溶性tgfβ陷阱或其组合更有效地对抗自体treg存在时treg介导的抑制和恢复t细胞活化(图31b-d)。这些数据表明，在恢复t细胞功能方面，抗cd39/tgfβ陷阱分子es014-1比抗cd39抗体、可溶性tgfβ陷阱或其组合更有效。其他测试分子(例如es014-2、es014-3、es014-4、es014-5、es014-6、es014-7)也显示出类似的效果(数据未显示)。
[0614]
实施例16.抗cd39/tgfβ陷阱分子在没有刺激时抑制人t细胞凋亡
[0615]
将2x104个纯化的pmbc总cd3

t细胞培养过夜，并与抗cd39/tgfβ陷阱分子es014-1和es014-2、tgfβr死亡突变体es014_v2、抗cd39死亡突变体es014_v1和双阴性突变体es014_v3以等摩尔浓度培养过夜。根据制造商的说明，通过流式细胞仪的apc标记的膜联蛋白v和pi来测量人类t细胞的凋亡。
[0616]
如图32a和图32b所示，与tgfβr死亡突变体es014_v2、抗cd39死亡突变体es014_v1和双阴性突变体es014_v3相比，抗cd39/tgfβ陷阱分子es014-1和es014-2以剂量依赖性方式抑制人类t细胞凋亡。
[0617]
实施例17.抗cd39/tgfβ陷阱分子在有刺激时促进人t细胞存活和活化
[0618]
将5x103个纯化的总cd3

t细胞与相同摩尔的抗cd39/tgfβ陷阱分子es014-1和es014-2、抗cd39抗体es014_v2、tgfβ陷阱es014_v1、组合(es014_v2和es014_v1)和双突变抗体es014_v3作为对照，在抗cd3和抗cd28珠刺激下共同培养持续4天。通过测定活死染色的t存活率、细胞追踪标记的t细胞增殖、cd25表达的t激活和细胞因子产生来量化t细胞功能。
[0619]
如图33a所示，除抗cd39/tgfβ陷阱分子组外，所有组中均在具有抗cd3/cd28刺激的情况下出现多数死亡细胞。此外，抗cd39/tgfβ陷阱分子组中的活细胞维持较高的细胞增殖和活化(图33a)，以及il-2和ifn-γ的产生(图33b)。这些数据表明，抗cd39/tgfβ陷阱分子比抗cd39抗体、tgfβ陷阱或其组合在t细胞过度活化中更有效。
[0620]
实施例18.抗cd39/tgfβ陷阱分子阻断tgfβ诱导的foxp3在总t细胞上的表达
[0621]
将5x104个纯化的t细胞用相同摩尔的抗cd39/tgfβ陷阱分子(es014-1和es014-2)、抗cd39抗体(es014_v2)、tgfβ陷阱(es014_v1)、组合(es014_v2 es014_v1)和对照抗体(es014_v3)在抗cd3和抗cd28珠刺激下预处理30min，并添加10ng/ml tgfβ。在tgf-β处理4天后测量treg分化。
[0622]
如图34a和34b所示，使用抗cd39/tgfβ陷阱分子(es014-1和es014-2)、tgfβ陷阱
(es014_v1)和组合(es014_v2 es014_v1)处理与使用培养基、抗cd39(es014_v2)和对照抗体(es014_v3)处理相比，前者可阻断cd4

和cd8

t细胞上tgfβ诱导的foxp3表达。值得注意的是，经抗cd39/tgfβ陷阱分子(尤其是抗cd39/tgfβ陷阱分子es014-1)处理组的阻断效果比经tgfβ陷阱(es014_v1)和组合(es014_v2 es014_v1)处理组的阻断效果显示出更好的活性。
[0623]
实施例19.抗cd39/tgfβ陷阱分子恢复atp诱导的对人t细胞增殖的抑制
[0624]
将5x104个纯化的t细胞用celltrace紫罗兰标记，并用抗cd39/tgfβ陷阱分子(es014-1和es014-2)、抗cd39抗体(es014_v2)、tgfβ陷阱(es014_v1)、组合(es014_v2 es014_v1)和对照抗体(es014_v3)在抗cd3和抗cd28珠刺激下预处理过夜。第1天，添加200μm atp，并在用atp处理3天后测量t增殖。如图35a和35b所示，用抗cd39/tgfβ陷阱分子(es014-1和es014-2)、抗cd39抗体(es014_v2)和组合(es014_v2 es014_v1)处理与用培养基、tgf-β陷阱(es014_v1)和对照抗体(es014_v3)处理相比，前者能逆转atp诱导的对cd4

和cd8

t增殖的抑制。恢复的t细胞增殖结果显示，抗cd39/tgf-β陷阱分子具有阻断cd39活性的作用，这与atp酶抑制活性结果一致。

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