OsERF940蛋白在提高水稻稻瘟病抗性中的应用

oserf940蛋白在提高水稻稻瘟病抗性中的应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及oserf940蛋白在提高水稻稻瘟病抗性中的应用。


背景技术：

2.乙烯应答因子(ethylene response factors，erf)属于erf/ap2超家族中的一个亚家族，它们的共同特点是含有一个保守的erf结构域，调控植物对生物胁迫和非生物胁迫的应答。从不同的植物中也分离出了大量编码erf因子的基因。围绕这些基因的相关研究已成为植物基因组学领域的新亮点。国内外大量研究表明erf在植物抗病应答中有重要作用。如，美国密苏里大学研究表明erf因子erf6在拟南芥灰霉病的抗性形成中有重要作用。中国农业科学院作物研究所张增艳课题组发现过表达小麦erf因子erf1可以显著抑制谷丝核菌生长提高小麦对纹枯病的抗性。德国耶拿大学的研究表明过表达水稻erf因子oserebp1提高水稻的白叶枯病的抗性。东北农业大学张淑珍课题组的研究发现大豆erf因子提高大豆对疫霉根腐病的抗性。上述国内外的研究表明efr因子在不同作物中对多种作物病害抗性均具有重要调控作用。
3.但相对于拟南芥中erf基因功能的广泛研究，而目前大部分水稻erf家族基因的功能以及在抗病应答中的调控关系还并不清楚。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供oserf940蛋白在提高水稻稻瘟病抗性中的应用。
5.本发明要求保护oserf940蛋白的应用，为增加水稻稻瘟病抗性。
6.本发明还保护oserf940基因在培育增加稻瘟病抗性的转基因植物中的应用。
7.本发明还保护一种植物育种方法，包括如下步骤：提高目的植物中oserf940蛋白的活性和/或含量，从而提高植物稻瘟病抗性。
8.本发明还保护一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：在出发植物中导入oserf940基因，得到与所述出发植物相比稻瘟病抗性增加的转基因植物。
9.oserf940蛋白具体来源于稻属亚洲栽培稻种中花11品种(oryza sativa l.zhonghua 11)。
10.以上任一所述oserf940蛋白为如下(a)或(b)或(c)或(d)或(e)：
11.(a)序列表的序列1所示的蛋白质；
12.(b)将序列1进行一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物稻瘟病增大相关的由其衍生的蛋白质；
13.(c)来源于水稻且与(a)具有95％以上同一性且与水稻稻瘟病抗性相关的蛋白质；
14.以上任一所述oserf940基因为编码所述oserf940蛋白的基因。
15.以上任一所述oserf940基因具体为如下(1)或(2)或(3)或(4)所述的dna分子：
16.(1)编码区如序列表中序列2所示的dna分子；
floral repressor early flowering1 affects spikelet fertility by modulating gibberellin signaling.rice(n y).2015dec；8(1):58.doi:10.1186/s12284-015-0058-1，公众可从申请人处获得。
34.稻瘟菌菌株(菌种gd08-t13)，湖南省农科院水稻所李小湘赠；记载在如下文献中：liu q,li x,yan s,yu t,yang j,dong j,zhang s,zhao j,yang t,mao x,zhu x,liu b.oswrky67 positively regulates blast and bacteria blight resistance by direct activation of pr genes in rice.bmc plant biol.2018oct26；18(1):257.doi:10.1186/s12870-018-1479-y，公众可从申请人处获得。
35.实施例1、转基因植物的获得
36.一、重组质粒的构建
37.1、提取水稻日本晴的总rna，然后反转录得到cdna。
38.2、以步骤1得到的cdna为模板，采用f1和r1组成的引物对进行pcr扩增，回收236bp的pcr扩增产物。
39.f1：5'-cggtaggatccatggtgccctcttcacggaaag-3'
40.r1：5'-ccccgagctcaagacagttgagttcttgttcca-3'。
41.3、用限制性内切酶sac i与bamh双酶切步骤2得到的pcr扩增产物，回收酶切产物。
42.4、用限制性内切酶sac i与bamh双酶切pcambia3301载体，回收载体骨架。
43.5、将步骤3得到的酶切产物和步骤4得到的载体骨架连接，得到重组质粒pcambia3301-oserf940。
44.根据测序结果，重组质粒pcambia3301-oserf940为在pcambia3301载体的sac i与bamh酶切位点之间插入了序列表的序列2第1-951位所示的dna分子，得到的质粒，该质粒含有oserf940基因的编码序列，表达蛋白oserf940。
45.重组质粒pcambia3301-oserf940的元件示意图见图1。
46.二、转oserf940基因水稻的获得
47.1、将重组质粒pcambia3301-oserf940导入农杆菌lba4404，得到重组农杆菌。
48.2、将步骤1得到的重组农杆菌悬浮于液体asaa培养基中，得到od
600nm
值＝0.3的菌液。
49.液体asaa培养基：含2mg/l 2，4-d和100μm/l as的液体nb培养基。
50.3、取水稻中花11(以下称为野生型水稻)的种子，用75％乙醇灭菌，然后置于固体nb培养基平板上，28℃暗培养2周，然后将愈伤组织转移到新的固体nb培养基平板上28℃暗培养2周，然后将愈伤组织转移到新的固体nb培养基平板上28℃暗培养2周。
51.4、完成步骤3后，将愈伤组织中自然分散、颜色淡黄的胚性愈伤颗粒置于继代培养基平板上，28℃暗培养3天。
52.继代培养基：含2mg/l 2，4-d的固体nb培养基。
53.5、完成步骤4后，取愈伤组织，置于步骤2得到的菌液中浸泡10-20分钟，其间轻轻摇动。
54.6、完成步骤5后，取愈伤组织，用滤纸吸干表面菌液，然后置于共培养培养基平板上，21℃-22℃暗培养3天。
55.共培养培养基：含2mg/l 2,4-d和100μm as的固体nb培养基。
56.7、完成步骤6后，取愈伤组织，置于筛选培养基平板上28℃暗培养2周，然后将愈伤组织转移到新的筛选培养基平板上28℃暗培养2周，然后将愈伤组织转移到新的筛选培养基平板上28℃暗培养2周。
57.筛选培养基:含2mg/l 2,4-d和50mg/l bar的固体nb培养基。
58.8、完成步骤7后，取生长旺盛，呈乳白色或微黄色的新鲜愈伤组织，置于预分化培养基平板上，先28℃暗培养1周再28℃光照培养2周，然后转移到分化培养基平板上，28℃光照培养，得到分化苗。
59.预分化培养基：含5mg/l aba和0.5mg/l naa的固体nb培养基。
60.分化培养基：含0.5mg/l naa和3mg/l 6-ba的固体nb培养基。
61.9、完成步骤8后，将长势好的分化成苗转移至装有固体ms培养基的三角瓶内，28℃光照培养1-2周后移栽至温室，持续培养至收获种子，即为t1代种子。
62.10、将t1代种子培育为植株，即为t1代植株，t1代植株自交，得到t2代种子。
63.12、将t2代种子培育为植株，即为t2代植株，t2代植株自交，得到t3代种子。
64.13、将t3代种子培育为植株，即为t3代植株。
65.对于某一t1代植株来说，如果满足如下两个条件，该t1代植株即为单拷贝插入的转基因植株：
①
该t1代植株具有bar抗性(田间用2％basta(公司：北京华越洋生物货号：w9062-100ml)喷3叶一心龄水稻苗，处理1周后，筛选绿色水稻苗，为阳性转基因材料)；
②
该t1代植株自交得到的t2代植株中，bar抗性植株与非bar抗性植株的数量比基本符合3:1(basta筛选后，株系中水稻植株(约50株)的basta抗性苗：basta敏感苗≈3:1)。
66.对于某一t2代植株来说，如果满足如下三个条件，该t2代植株及其自交后代为一个纯合的转基因株系：
①
该t2代植株具有bar抗性(田间用2％basta喷3叶一心龄水稻苗，处理1周后水稻苗保持绿色)；
②
其t1代植株为单拷贝插入的转基因植株(basta筛选后，株系中水稻植株(约50株)的basta抗性苗：basta敏感苗≈3:1)；
③
其抽样检测的t3代植株均具有bar抗性(田间用2％basta喷3叶一心龄水稻苗，处理1周后水稻苗保持绿色)。
67.三、pcr鉴定
68.随机从步骤二得到的纯合的转基因株系中取2个株系，oe1株系和oe2株系，对t2代植株进行鉴定。将水稻中花11作为转基因株系的野生型对照。
69.提取植株(4周苗)中的总rna，反转录为cdna,将cdna作为模板，通过定量pcr鉴定oserf940基因的表达水平。
70.qpcr鉴定oserf940基因的引物如下：
71.f2：5'-gatgagattcctgtgagcaac-3'；
72.r2：5'-gttccaatgaagcaaagtcga-3'。
73.将水稻中花11中oserf940的表达水平作为1,计算纯合的转基因株系中oserf940基因的相对表达水平。
74.结果见图2所示，可以看出，8个t2代株系中erf940的表达量均高于对照，表明获得8个t2代株系为阳性转oserf940基因水稻。
75.实施例2、转oserf940基因水稻中抗病相关基因表达情况的检测
76.阳性转oserf940基因水稻的t2代植株作为下面供试植株。
77.供试植株：oe3株系的t2代植株、oe5株系的t2代植株和水稻中花11植株(wt)。
78.提取供试植株叶片(4周苗)的总rna，反转录为cdna,将cdna作为模板，通过定量pcr鉴定各个相关基因的表达水平。将水稻中花11中抗病相关基因的表达水平作为1,计算转基因株系中抗病相关基因的相对表达水平。
79.用于鉴定osmyc2基因的引物如下：
80.上游引物：5'-atcatgactagagaggagca-3'；
81.下游引物：5'-ccaacacgagcctcacaatca-3'；
82.用于鉴定pr1基因的引物如下：
83.上游引物：5'-gcgctgcaggaggactacgta-3'；
84.下游引物：5'-ccctccggcacaagtataca-3'。
85.用于鉴定pr4基因的引物如下：
86.上游引物：5'-cttcaagaagatcgacacaga-3'；
87.下游引物：5'-cagagtgccaacctcttcca-3'。
88.用于鉴定chitinase基因的引物如下：
89.上游引物：5'-ttggcggcggtgcagtgaaca-3'；
90.下游引物：5'-catgcatatatatcggtttca-3'。
91.将水稻中花11中基因的表达水平作为1,计算转基因株系中相应基因的相对表达水平。
92.结果见图3所示，t2代转oserf940基因水稻中抗病相关基因的相对表达量均高于野生型水稻品种中花11植株中的表达量，表明过表达oserf940基因可以显著提高osmyc2、pr1、pr4和chitinase等水稻抗病相关基因表达。
93.上述结果显示，oserf940基因对水稻抗病相关基因的表达有重要的调控作用，过表达oserf940基因可以通过增加抗病相关基因表达，提高水稻稻瘟病抗性。
94.实施例3、转基因植株稻瘟病性分析
95.供试植株：水稻中花11植株(wt，对照)，oe1-oe8株系的t2代转oserf940基因水稻植株。
96.1、田间检测
97.供试植株种植于试验场田间，按生产和接种规范要求种植。
98.图4a是oe3、oe4、oe5和水稻中花11的水稻稻瘟病发病情况的照片。
99.检测田间供试植株的抗病性，方法参考国际水稻所稻瘟病抗性分级标准(中南大学肖军治2011.5月硕士论文《湖南同名异种地方稻资源核心种质遴选》)。
100.结果如下表1所示，可以看出，与对照相比，转基因株系均具有叶瘟病抗性。
101.表1为转基因株系稻瘟病菌接种抗病性统计
[0102][0103][0104]
2、室内检测：
[0105]
将保存有稻瘟菌菌株(菌种gd08-t13)的滤纸片接种至淀粉培养基(酵母提取物2g，可溶性淀粉10g，琼脂粉15g，加水定容于1l水)，26℃活化培养7天，再将活化后的菌丝接种至燕麦培养基(无糖燕麦片50g/打碎至粉末，蔗糖20g，琼脂20g，加水定容至1l)，26℃黑暗培养7天，待菌丝长满培养基之后刮去菌丝，于持续光照下保湿继续培养3-4天产孢。之后对处于三叶一心期的供试植株水稻中花11、t2代转oserf940基因水稻oe3和t2代转oserf940基因水稻oe5幼苗分别进行稻瘟菌接种：用灭菌水洗下培养基上的孢子，调节孢子浓度至5
×
105个/ml，并加入万分之二的tween20，用小型喷雾器将孢子液均匀的喷洒至水稻叶片(三叶一心期水稻苗)表面(剂量为使叶片均湿润)。
[0106]
立即用定制的有机玻璃罩子盖住幼苗，放入人工气候箱中25℃黑暗处理24h，随后转为正常光照条件。接种后5-7天调查发病情况。
[0107]
结果如图4b所示，不同材料水稻稻瘟病实验室接种后的照片，可以看出，与水稻中花11(wt)相比，t2代转oserf940基因水稻植株稻瘟病发病均显著弱于水稻中花11，转基因植株稻瘟病抗性显著高于野生型对照，表明过表达oserf940基因对提高水稻稻瘟病抗病性有重要作用。oserf940基因可以通过增加水稻抗病相关基因表达，提高水稻的稻瘟病抗性。