一种副溶血弧菌CRISPRi的双质粒构建方法

一种副溶血弧菌crispri的双质粒构建方法
技术领域
1.本发明涉及一种副溶血弧菌crispri的双质粒构建方法，属于分子生物学和生物技术领域。


背景技术：

2.crispr全称为成簇的规律性间隔的短回文重复序列。crispr/cas9基因编辑技术是利用融合的crrna和tracrrna作为单一向导rna(sgrna)，与3’端存在的原间隔基邻近基序(pam)——20bp特异序列，将核酸酶cas蛋白9(cas9)引导到任何dna序列的靶点(jiang y,chen b,duan c,et al.multigene editing in the escherichia coli genome via the crispr-cas9 system[j].applied&environmental microbiology,2015,81(7):2506.)。从2013年以来逐渐被使用，目前已在动物、植物和微生物中构建基因编辑系统，比如人体细胞、拟南芥、酿酒酵母、大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌等。在大肠杆菌中，dcas9-sgrna复合物通过阻断rna聚合酶与与启动子dna的结合或通过阻断转录的延伸抑制转录。crispri已被用于模式菌株如大肠杆菌中的遗传回路控制以及结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)中基因表达的调控，并通过crispri改变代谢通量，从而改变代谢途径.研究显示，crispri系统已成功应用于革兰氏阳性细菌枯草芽胞杆菌(bacillus subtilis)、人类微生物群共生菌拟杆菌(bacterioides sp.)以及产生医学相关次级代谢产物的放线菌目中。但目前由于双质粒无法共存于副溶血弧菌细胞中，crispr技术仍未在副溶血弧菌中得到应用(刘伟奇.crispr系统在副溶血性弧菌中的应用研究[d].上海海洋大学,2017.)。
[0003]
由crispr/cas9技术衍生出的crispr干扰(crispri)技术是cas9蛋白序列中两个碱基突变为无催化活性的cas9(dcas9)，即氨基酸序列突变为d10a与h840a，但仍能识别sgrna并与其结合。dcas9蛋白的附着空间上阻碍了基因的正常转录，从而对基因转录有抑制作用(larson m h,gilbert l a,wang x,et al.crispr interference(crispri)for sequence-specific control of gene expression[j].nature protocols,2013,8(11):2180-2196.doi:10.1038/nprot.2013.132)。


技术实现要素：

[0004]
为了解决上述存在的技术问题，本发明通过同源重组的方法将sgrna靶向序列连接到16srrna启动子后，菌体不论在什么环境下都可以稳定转录出需要的sgrna。将dcas9基因放在改造后可进行接合转导的pbad33t载体上，利用阿拉伯糖诱导表达，降低对菌体的生长影响。该系统可更快捷地研究基因尤其是关键基因的功能，或同时干扰多个基因对副溶血弧菌的影响。
[0005]
本发明提供了一种crispri系统，所述系统包含携带sgrna表达盒的质粒和dcas9表达载体；所述sgrna表达盒包含副溶血弧菌16s rrna上游同源臂、sgrna、副溶血弧菌16s rrna下游同源臂；所述dcas9表达载体包含dcas9基因和复制起点元件。
[0006]
在本发明的一种实施方式中，所述携带sgrna表达盒的质粒以pds132质粒为载体。
[0007]
在本发明的一种实施方式中，所述dcas9表达载体以pbad33质粒为载体。
[0008]
在本发明的一种实施方式中，所述副溶血弧菌16s rrna上游同源臂的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述副溶血弧菌16s rrna下游同源臂的核苷酸序列如seq id no.2所示。
[0009]
在本发明的一种实施方式中，所述dcas9基因的核苷酸序列如seq id no.3所示
[0010]
在本发明的一种实施方式中，所述复制起点原件包括orit。
[0011]
在本发明的一种实施方式中，所述orit基因片段的核苷酸序列如seq id no.4所示。
[0012]
在本发明的一种实施方式中，所述sgrna表达盒和dcas9表达载体上携带抗性基因。
[0013]
本发明还提供了一种构建上述crispri系统的方法，所述方法包括以下步骤：
[0014]
(1)设计靶基因的sgrna，并在sgrna上游连接副溶血弧菌16s rrna上游同源臂，在sgrna下游连接副溶血弧菌16s rrna下游游同源臂构建sgrna表达盒；
[0015]
(2)将(1)中的sgrna表达盒构建至pds132质粒，得到携带sgrna表达盒的质粒psg132-en；
[0016]
(3)将(2)中的重组质粒psg132-en转化至大肠杆菌感受态细胞，得到大肠杆菌/psg132-en；
[0017]
(4)将复制起点元件构建至质粒pbad33，得到重组质粒pbad33t；
[0018]
(5)将dcas9基因连接至(4)中的重组质粒pbad33t上，得到dcas9表达载体pbad33t-d9。
[0019]
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，所述副溶血弧菌16s rrna上游同源臂的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述副溶血弧菌16s rrna下游同源臂的核苷酸序列如seq id no.2所示。
[0020]
在本发明的一种实施方式中，步骤(5)中，所述dcas9基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。
[0021]
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中，所述复制起点原件包括orit。
[0022]
在本发明的一种实施方式中，所述orit基因片段的核苷酸序列如seq id no.4所示。
[0023]
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)和(6)中，所述大肠杆菌包括但不限于s17(λpir)或cc118(λpir)。
[0024]
本发明还提供了一种上述crispri系统在干扰副溶血弧菌中靶基因的应用，所述应用的具体步骤如下：
[0025]
(1)设计靶基因的sgrna，并在sgrna上游连接副溶血弧菌16s rrna上游同源臂，在sgrna下游连接副溶血弧菌16s rrna下游游同源臂构建sgrna表达盒；
[0026]
(2)将(1)中的sgrna表达盒构建至pds132质粒，得到携带sgrna表达盒的质粒psg132-en；
[0027]
(3)将(2)中的质粒psg132-en转化至大肠杆菌感受态细胞，得到大肠杆菌/psg132-en；
[0028]
(4)将复制起点元件构建至质粒pbad33，得到重组质粒pbad33t；
[0029]
(5)将dcas9基因连接至(4)中的重组质粒pbad33t上，得到dcas9表达载体pbad33t-d9；
[0030]
(6)将(5)中的dcas9表达载体pbad33t-d9转化至大肠杆菌感受态细胞，得到大肠杆菌/pbad33t-d9；
[0031]
(7)将(3)中的大肠杆菌/psg132-en与副溶血弧菌进行接合，涂布于含有多粘菌素b与庆大霉素的培养基，获得副溶血弧菌atcc33846::psg132-en；
[0032]
(8)将(6)中的大肠杆菌/pbad33t-d9与(7)中的副溶血弧菌atcc33846::psg132-en进行接合，涂布于含有庆大霉素与氯霉素的培养基，获得副溶血弧菌atcc33846::psg132-en pbad33t-d9；
[0033]
(9)将(8)中的副溶血弧菌atcc33846::psg132-en pbad33t-d9接种至含有阿拉伯糖的培养基中培养，获得靶基因表达水平下降的副溶血弧菌。
[0034]
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，所述副溶血弧菌16s rrna上游同源臂的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述副溶血弧菌16s rrna下游同源臂的核苷酸序列如seq id no.2所示。
[0035]
在本发明的一种实施方式中，步骤(5)中，所述dcas9基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。
[0036]
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中，所述复制起点原件包括orit。
[0037]
在本发明的一种实施方式中，所述orit基因片段的核苷酸序列如seq id no.4所示。
[0038]
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)和(6)中，所述大肠杆菌包括但不限于s17(λpir)、cc118(λpir)。
[0039]
在本发明的一种实施方式中，步骤(7)中，所述含有多粘菌素b与庆大霉素的培养基为lb培养基，所述多粘菌素b与庆大霉素的添加量分别为3～6mg/l与8～12mg/l。
[0040]
在本发明的一种实施方式中，步骤(8)中，所述含有庆大霉素与氯霉素的培养基为lb培养基，所述庆大霉素与氯霉素的添加量分别为8～12mg/l与28～32mg/l。
[0041]
在本发明的一种实施方式中，步骤(7)中，所述接合为将大肠杆菌/psg132-en与副溶血弧菌分别培养至od
600
约为0.8～1.2，取相同体积的菌液用培养基清洗2-3次后，用培养基共悬浮并混合均匀后，点种于平板上，正置过夜培养。
[0042]
在本发明的一种实施方式中，步骤(8)中，所述接合为将大肠杆菌/pbad33t-d9与副溶血弧菌atcc33846::psg132-en分别培养至od
600
约为0.8～1.2，取相同体积的菌液用培养基清洗2-3次后，用培养基共悬浮并混合均匀后，点种于平板上，正置过夜培养。
[0043]
在本发明的一种实施方式中，步骤(9)中，所述含有阿拉伯糖的培养基为lb培养基，所述阿拉伯糖的添加量为20～40mmol/l。
[0044]
在本发明的一种实施方式中，所述副溶血弧菌包括但不限于atcc33846。
附图说明
[0045]
图1：psg132-en的琼脂糖凝胶电泳验证图。使用引物sgrna-test /-进行验证，正确片段长度应为782bp；
[0046]
图2：pbad33t-d9的琼脂糖凝胶电泳验证图。使用引物d9-test /-进行验证，正确
片段长度应为4537bp；
[0047]
图3：在有或无阿拉伯糖的lb平板上野生型atcc33846、δrpoe、atcc33846 pbad33t-d9、atcc33846::psg132-en pbad33t-d9的生长情况；
[0048]
图4：在有或无阿拉伯糖下使用rt-qpcr检测atcc33846::psg132-en pbad33t-d9中rpoe、rpon的转录水平。对照菌为在有或无阿拉伯糖下atcc33846 pbad33t-d9。*代表p值《0.05；
具体实施方式
[0049]
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0050]
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市售商品或者可以通过已知方法制备。
[0051]
下述实施例中涉及的培养基如下：
[0052]
培养基均使用ddh2o配制，配制完成后121℃灭菌15～20min。
[0053]
lb液体培养基(g/l)：酵母粉5，蛋白胨10，nacl10。
[0054]
lb平板(g/l)：酵母粉5.0、胰蛋白胨10.0、nacl10.0、琼脂粉15。
[0055]
表1下述实施例涉及的引物序列
[0056][0057]
表2下述实施例中涉及的菌株和质粒
[0058]
[0059][0060]
实施例1 psg132质粒的构建
[0061]
副溶血弧菌自身具有同源重组系统。利用这一点，含有同源臂的psg132质粒进入细胞后会整合到基因组上。sgrna的靶向序列由网站chopchop(uib.no)设计，由于没有副溶血弧菌基因组，故使用需钠弧菌的基因组进行比较。本技术rpoe(ncbi登录号：vp_rs12550)和rpon(ncbi登录号：vp_rs13100)为靶基因为例进行说明，但其并不能对于本发明的保护范围进行限定。
[0062]
(1)使用16s rrna引物16s-u /-与16s-d /-将16s rrna上下游基因的片段从副溶血弧菌基因组上扩增出来。使用pcr产物回收试剂盒回收pcr产物。
[0063]
(2)使用引物gm 与gm-将庆大霉素抗性基因gm从pwjw101质粒上扩增出来。
[0064]
(3)sgrna-rpoe、sgrna-rpon基因片段通过使用sgrna引物对cz-sgrna-rpoe 与cz-sgrna-gm-、cz-sgrna-rpon 与cz-sgrna-gm-进行无模板重叠pcr获得，并进行pcr产物回收。
[0065]
(4)构建含有双sgrna的质粒时，使用引物16s-u 与lx-sgrna-rpon-将步骤(1)中的16srrna上游片段与步骤(3)中的sgrna-rpoe基因片段进行重叠pcr，并进行pcr产物回收得到16su-sgrnarpoe-rpon。
[0066]
(5)使用引物gm 与16s-d-将步骤(1)中获得的16srrna下游片段与步骤(2)中的gm基因片段进行重叠pcr，并进行pcr产物回收。
[0067]
(6)使用引物16s-u 、16s-d-将步骤(3)中的sgrna-rpon与步骤(4)中的16su-sgrnarpoe-rpon与步骤(5)的产物进行重叠pcr获得完整的含有rpoe、rpon双sgrna的基因片段，并回收pcr产物。
[0068]
(7)使用快切酶smai对pds132质粒进行酶切，经rcp产物回收试剂盒回收后，与步骤(6)获得的产物进行一步克隆得到含有rpoe、rpon双sgrna的psg132-en质粒，并化转至大肠杆菌cc118(λpir)，菌落pcr验证结果如图1所示。将测序正确的质粒电转入大肠杆菌s17(λpir)，并取800μl菌液加入甘油管保种于-70℃。psg132-en质粒的核苷酸序列如seq id no.5所示。
[0069]
实施例2含有dcas9基因的pbad33t-d9质粒的构建
[0070]
(1)使用引物33-orit 、33-orit-从模板pds132扩增出orit基因片段。使用快切酶bstz17i将pbad33线性化。将orit基因片段与线性化的pbad33进行一步克隆并化转至大肠杆菌cc118(λpir)。将测序正确的质粒命名为pbad33t，提取并保存于-20℃。
[0071]
(2)使用模板pcas质粒与表1中dcas9点突变引物对dcas9-1 /dcas9-1 -、dcas9-2 /dcas9-2 -、dcas9-3 /dcas9-3 -进行pcr扩增得到三段基因片段。将这三段基因使用引物33-dcas9-1 、dcas9-3-进行重叠pcr，获得dcas9基因片段。
[0072]
(3)使用快切酶smai、bamhi将步骤(1)中的pbad33t质粒线性化，经pcr产物回收后，与步骤(2)中获得的dcas9基因片段进行一步克隆并化转至大肠杆菌cc118(λpir)，菌落pcr验证结果如图2所示。将测序正确的质粒电转入大肠杆菌s17(λpir)，并取800μl菌液加入甘油管保种于-70℃。pbad33t-d9质粒核苷酸序列如seq id no.6所示。
[0073]
实施例3基因抑制菌株的构建
[0074]
(1)将实施例1中最终获得的含有psg132-en质粒的大肠杆菌s17(λpir)与副溶血弧菌atcc33846进行接合转导：分别培养至od
600
约为1.0，各取1ml菌液用lb液体培养基清洗两次后，100μl lb液体培养基将含有psg132-en质粒的大肠杆菌s17(λpir)与副溶血弧菌atcc33846共悬浮并混合均匀后，点种于lb平板上，正置过夜培养。使用棉签刮下菌苔悬于1mllb中，涂布于含有5mg/l多粘菌素b与10mg/l庆大霉素的lb平板。经过菌落pcr验证质粒是否顺利导入副溶血弧菌中。该步将获得atcc33846::psg132-en。
[0075]
(2)将步骤(1)中的菌株atcc33846::psg132-en与实施例2中获得的含有pbad33t-d9质粒的大肠杆菌s17(λpir)进行接合转导，涂布于10mg/l庆大霉素与30mg/l氯霉素双抗性lb平板，菌落验证正确后保种于-70℃。该步将获得atcc33846::psg132-en pbad33t-d9。
[0076]
实施例4基因抑制菌株的表型与rt-qpcr的检测
[0077]
(1)将实施例3中获得的菌株atcc33846::psg132-en pbad33t-d9接种于lb液体培养基中37℃过夜培养，取5μl菌液分别点种于lb平板与含有30mmol/l阿拉伯糖的lb平板。37℃过夜培养，观察菌苔生长情况。
[0078]
(2)将实施例3中获得的菌株atcc33846::psg132-en pbad33t-d9接种于lb液体培
养基中37℃过夜培养后，将菌液转接至新的lb培养基调整od
600
为0.02，培养至od
600
至0.5左右。取1ml菌液加入终浓度30mmol/l阿拉伯糖处理1h。离心弃上清提取rna。rna提取、反转录、rt-qpcr步骤来自文献(tan x,qiao j,zhou q,et al.identification of a phosphoethanolamine transferase for lipid a modification in vibrio parahaemolyticus[j].food control,2021,125:108033.)。三组生物学重复。数据处理：control,2021,125:108033.)。三组生物学重复。数据处理：control,2021,125:108033.)。三组生物学重复。数据处理：倍数变化＝2^(-δδct)；误差值为标准差。
[0079]
(3)由图3、图4可以看出，阿拉伯糖诱导dcas9表达后，atcc33846::psg132-es pbad33t-d9的副溶血弧菌生长变差，这可能是由于dcas9的毒性导致的，敲除rpoe基因后的副溶血弧菌δrpoe生长较野生型变差，而导入双质粒抑制rpoe、rpon的副溶血弧菌在阿拉伯糖平板上的生长情况较仅导入pbad33t-d9的副溶血弧菌生长情况差，说明psg132-en正常转录出sgrna，对基因进行抑制。随后进行转录水平上的验证(rt-qpcr)，以atcc33846 pbad33t-d9为基准，atcc33846::psg132-en pbad33t-d9中rpoe、rpon的转录水平在加入阿拉伯糖诱导后表现出显著下降，其中rpoe转录水平较野生型下调了1.75倍，rpon转录水平较野生型下调了8.17倍。结果验证了该系统在副溶血弧菌中具有干扰基因转录的功能。
[0080]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。