纯化肉毒杆菌毒素的方法与流程

纯化肉毒杆菌毒素的方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术根据35 u.s.c.
§
119(e)要求于2019年12月20日提交的美国临时申请号62/951,828的优先权，在此通过引用将其全部内容并入本文。
发明领域
3.本技术一般涉及纯化神经毒素蛋白分子的领域。具体地说，本技术涉及一种用于纯化肉毒杆菌毒素的方法。由其纯化的肉毒杆菌毒素适用于治疗，特别是适用于向患者施用以实现所需的治疗或美容效果。


背景技术：

4.以下对本技术背景的描述仅为了帮助理解本技术而提供，并非表示承认或构成本技术的现有技术。
5.已经表征了七种通常免疫学上不同的肉毒杆菌神经毒素——肉毒杆菌神经毒素血清型a、b、c、d、e、f和g——每种都可以通过用类型特异性抗体中和来区分。作为一个实例，是a型肉毒杆菌毒素纯化的神经毒素复合物的商标，可从allergan,inc.(欧文，加利福尼亚州)商购获得。是一种流行的基于注入的美容疗法，可暂时减少细纹和皱纹的出现。
6.肉毒杆菌毒素，包括a型毒素，通常由肉毒梭菌(c.botulinum)发酵产生，该发酵可以产生培养溶液，该溶液除了肉毒杆菌毒素分子外，还含有完整细菌、裂解细菌、培养基营养物和发酵副产物。过滤肉毒梭菌培养溶液以去除完整和/或裂解的细胞组分、以及任选的其他发酵培养基残留物，产生澄清的培养物。该澄清的培养溶液含有肉毒杆菌毒素分子和各种杂质，所述杂质可被去除以获得浓缩的纯化的肉毒杆菌毒素(例如，bont/a1)，适用于复合到肉毒杆菌毒素药物组合物中。
7.用于获得药学上合适的肉毒杆菌毒素组合物的现有商业规模方法通常使用多个沉淀步骤来分离毒素复合物与来自发酵过程的残留杂质。例如，冷醇分馏(例如，cohn方法)或沉淀用于去除血浆蛋白。遗憾的是，用于纯化肉毒杆菌毒素的沉淀技术存在分辨率低、产率低、操作困难、控制和/或验证困难以及缺乏规模可伸缩性的问题。此外，干燥肉毒杆菌毒素(例如，通过冻干、沉淀等)大大降低了其毒性。这是临床上担忧的问题，因为灭活的毒素可能形成类毒素并使患者对肉毒杆菌毒素免疫。
8.尽管如此，出于稳定性原因，目前在美国获得批准的肉毒杆菌毒素产品(例如，botox和)都以冻干或冷冻干燥的形式储存。在向患者施用之前，此类制剂需要由医师在无菌盐水溶液中重构。该重构步骤与医师的时间损失、稀释错误风险和污染风险相关。肉毒杆菌毒素提供者还必须对医生进行培训，以确保重构步骤得到恰当执行。
9.因此，需要可控、规模可伸缩、高产率的方法从发酵培养基中纯化肉毒杆菌毒素，以获得高纯度、高活性、药学上适用的肉毒杆菌毒素组合物，其形式为不含、基本上不含或
实质上不含动物产品，并且该组合物在施用于患者之前不需要重构。


技术实现要素：

10.在一个方面，本公开涉及一种用于纯化肉毒杆菌毒素的方法，包括从含毒素溶液中纯化毒素，其中该方法不包括沉淀、离心或冻干。
11.在一些实施方案中，肉毒杆菌毒素是血清型a。在一些实施方案中，获得的纯化的肉毒杆菌毒素不含、基本上不含或实质上不含肉毒杆菌毒素复合物。在一些实施方案中，获得的纯化的肉毒杆菌毒素不含、基本上不含或实质上不含动物产品，包括人白蛋白。
12.在一些实施方案中，纯化包括过滤步骤，优选切向流过滤步骤。在一些实施方案中，过滤步骤使用中空纤维过滤器。在一些实施方案中，纯化包括使第一色谱柱与含毒素溶液接触以产生含毒素级分(fraction)。在一些实施方案中，第一色谱柱包括阴离子交换色谱柱。在一些实施方案中，阴离子交换色谱柱包含q sepharose。在一些实施方案中，纯化进一步包括收集含毒素级分，其中含毒素级分不吸附到第一固定相。
13.在一些实施方案中，纯化进一步包括使第二色谱柱与含毒素级分接触。在一些实施方案中，第二色谱柱包括阳离子交换色谱柱。在一些实施方案中，阳离子交换色谱柱包含sp sepharose。在一些实施方案中，纯化进一步包括从第二色谱柱洗脱肉毒杆菌毒素以产生第一含毒素洗脱液。
14.在一些实施方案中，纯化进一步包括过滤第一含毒素洗脱液以产生含毒素截留物。在一些实施方案中，过滤第一含毒素洗脱液包括缓冲液交换。在一些实施方案中，过滤第一含毒素洗脱液将肉毒杆菌毒素分子与非毒素蛋白分离以产生游离毒素分子。
15.在一些实施方案中，纯化进一步包括使第三色谱柱与含毒素截留物接触。在一些实施方案中，第三色谱柱包括第二阴离子交换色谱柱。在一些实施方案中，第二阴离子交换色谱柱包含q sepharose。在一些实施方案中，纯化进一步包括从第三色谱柱洗脱肉毒杆菌毒素以产生第二含毒素洗脱液。
16.在一些实施方案中，纯化进一步包括使第四色谱柱与第二含毒素洗脱液接触。在一些实施方案中，将含毒素洗脱液直接注入到第四色谱柱上。在一些实施方案中，第三色谱柱和第四色谱柱相互连接。
17.在一些实施方案中，第四色谱柱包括尺寸排阻色谱柱。在一些实施方案中，尺寸排阻色谱柱包括凝胶过滤色谱柱。在一些实施方案中，凝胶过滤色谱柱包含superdex 200。在一些实施方案中，纯化进一步包括从第四色谱柱洗脱肉毒杆菌毒素以产生纯化的肉毒杆菌毒素。
18.在另一个方面，从含毒素溶液中纯化肉毒杆菌毒素的方法包括：(a)过滤含毒素溶液；(b)使第一色谱柱与来自(a)的包含毒素的滤过溶液接触，其中第一色谱柱是离子交换色谱柱；(c)收集含毒素级分，其中所述含毒素级分流动通过第一色谱柱而没有吸附到固定相上；(d)使第二色谱柱与含毒素级分接触，其中第二色谱柱是离子交换色谱柱；(e)从第二色谱柱洗脱肉毒杆菌毒素以产生第一含毒素洗脱液；(f)过滤第一含毒素洗脱液以产生含毒素截留物；(g)使第三色谱柱与来自过滤(f)的含毒素截留物接触，其中第三色谱柱是离子交换柱；(h)从第三层色谱柱洗脱肉毒杆菌毒素以产生第二含毒素洗脱液；(i)使第四色谱柱与第二含毒素洗脱液接触，其中所述第四色谱柱是尺寸排阻色谱柱；以及(j)从第四色
谱柱洗脱肉毒杆菌毒素，从而产生纯化的肉毒杆菌毒素，其中该方法不包括使肉毒杆菌毒素沉淀、离心或冻干。
19.在一些实施方案中，肉毒杆菌毒素包括肉毒杆菌神经毒素血清型a。在一些实施方案中，获得的纯化的肉毒杆菌毒素不含、基本上不含或实质上不含肉毒杆菌毒素复合物。在一些实施方案中，获得的纯化的肉毒杆菌毒素不含、基本上不含或实质上不含动物产品，包括人白蛋白。
20.在一些实施方案中，第一色谱柱包括阴离子交换色谱柱。在一些实施方案中，第一色谱柱包含q sepharose。
21.在一些实施方案中，第二色谱柱包括阳离子交换色谱柱。在一些实施方案中，第二色谱柱包含sp sepharose。
22.在一些实施方案中，第一色谱柱包括阴离子交换色谱柱并且第二色谱柱包括阳离子交换色谱柱。在一些实施方案中，第一色谱柱包含q sepharose并且第二色谱柱包含sp sepharose。
23.在一些实施方案中，第三色谱柱包括阴离子交换色谱柱。在一些实施方案中，第三色谱柱包含q sepharose。
24.在一些实施方案中，第四色谱柱包括凝胶过滤柱。在一些实施方案中，第四色谱柱包含superdex 200
25.在一些实施方案中，第三色谱柱包括阴离子交换色谱柱并且第四色谱柱包括凝胶过滤色谱柱。在一些实施方案中，第三色谱柱包含q sepharose，并且第四色谱柱包含superdex 200。在一些实施方案中，将第二含毒素洗脱液直接注入到第四色谱柱上。在一些实施方案中，第三色谱柱和第四色谱柱相互连接。
26.在一些实施方案中，第一色谱柱是阴离子交换色谱柱，第二色谱柱是阳离子交换色谱柱，第三色谱柱是第二阴离子交换色谱柱，并且第四色谱柱是凝胶过滤色谱柱。在一个实施方案中，第一色谱柱包含q sepharose，第二色谱柱包含sp sepharose，第三色谱柱包含q sepharose，并且第四色谱柱包含superdex 200。
27.在一些实施方案中，第一、第二、第三和第四色谱柱是一次性色谱系统。
28.在一些实施方案中，过滤(f)使肉毒杆菌毒素蛋白分子与非毒素蛋白解离以产生游离毒素分子。在一些实施方案中，过滤(f)包括缓冲液交换。
29.在一些实施方案中，包含肉毒杆菌毒素的溶液不含、基本上不含或实质上不含动物产品。在一些实施方案中，纯化包括使肉毒杆菌毒素与缓冲溶液接触，其中缓冲溶液已进行过滤以减少生物负荷。
30.在另一方面，本公开涉及通过从含毒素溶液中纯化毒素而产生的纯化的肉毒杆菌毒素，其中该方法不包括沉淀、离心或冻干。在一些实施方案中，纯化的肉毒杆菌毒素是血清型a。在一些实施方案中，纯化的肉毒杆菌毒素不含、基本上不含或实质上不含毒素复合物。在一些实施方案中，纯化的肉毒杆菌毒素不含、基本上不含或实质上不含动物产品，包括人白蛋白。
31.在另一个方面，本公开涉及一种组合物，该组合物包含在包含磷酸盐的缓冲溶液中的纯化的肉毒杆菌毒素。在一些实施方案中，缓冲溶液还包含乙酸盐。在一些实施方案中，缓冲溶液还包含至少一种氯离子源。在一些实施方案中，至少一种氯离子源包括氯化
钠。在一些实施方案中，缓冲溶液还包含至少一种表面活性剂。在一些实施方案中，表面活性剂是聚山梨酯20。
32.在根据本公开的组合物的一些实施方案中，肉毒杆菌毒素是肉毒杆菌神经毒素血清型a。在一些实施方案中，组合物不含、基本上不含或实质上不含肉毒杆菌毒素复合物。在一些实施方案中，组合物不含、基本上不含或实质上不含动物产品。在一些实施方案中，组合物不含、基本上不含或实质上不含人白蛋白。在一些实施方案中，组合物具有约6.6至6.9之间的ph。
33.下面的详述描述是示例性和解释性的，但并不旨在进行限制。
34.附图简要说明
35.图1是显示根据本发明的从发酵培养基中纯化肉毒杆菌毒素组合物的方法的一个实施方案的流程图。
36.图2显示了使用胶体考马斯蓝染色对根据本公开制备的产物毒素溶液的sds-page结果。
37.图3显示了根据本公开制备的三种不同产物毒素溶液的sds-page结果。
38.图4显示了根据本公开制备的产物毒素溶液的sec分子量分布结果。
39.图5显示了根据本公开制备的三种产物毒素溶液的连续纯化步骤的平均工艺产率。
40.图6显示了根据本公开制备的三种产物毒素溶液的连续纯化步骤的平均累积工艺产率。
41.图7显示了根据本公开制备的三种产物毒素溶液的连续纯化步骤的平均纯度改善因子。
42.图8显示了根据本公开制备的三种产物毒素溶液的连续纯化步骤的平均累积纯度改善因子。
43.发明详述
44.下文将更全面地描述根据本公开的实施方案。然而，本公开的方面可以以不同的形式体现并且不应被解释为限于本文阐述的实施方案。相反，提供这些实施方案是为了使本公开彻底和完整，并将向本领域技术人员充分传达本技术的范围。应当理解，本技术不限于特定的方法、试剂、化合物组合物或生物系统，它们当然可以变化。在本文的描述中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的并且不旨在进行限制。
45.除非另有定义，本文使用的所有术语(包括技术和科学术语)的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。将进一步理解，术语，例如在常用词典中定义的那些，应被解释为具有与其在本技术的上下文和相关领域中的含义一致的含义，并且不应以理想化或过于正式的含义来解释，除非在本文中明确如此定义。虽然在下文没有明确定义，但这样的术语应该根据它们的常用含义来解释。
46.此外，在根据马库什组描述本公开的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本公开因此也就马库什组的任何个体成员或成员子组进行了描述。
47.如本领域技术人员将理解的，出于任何和所有目的，特别是就提供书面描述而言，本文公开的所有范围还包括其任何和所有可能的子范围及子范围的组合。任何列出的范围都可以很容易地被认识为充分描述并能够将相同的范围分解为至少相等的一半、三分之
一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为一个非限制性示例，本文讨论的每个范围可以容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，所有语言，例如“最多”、“至少”、“大于”、“小于”等，都包括所列举的数字并指代可以随后如上所述被分解为子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，一个范围包括每个个体成员。因此，例如，具有1-3个单元的组是指具有1、2或3个单元的组。类似地，具有1-5个单元的组是指具有1、2、3、4或5个单元的组，等等。
48.除非上下文另有说明，否则本文描述的发明的各种特征明确旨在可以以任何组合使用。而且，本公开还预期在一些实施方案中，可以排除或省略本文中阐述的任何特征或特征的组合。举例说明，如果说明书陈述复合物包含组分a、b和c，则明确旨在a、b或c中的任何一个，或它们的组合，可以单独地或以任何组合被省略和放弃。
49.除非另外明确指出，所有详细说明的实施方案、特征和术语旨在包括所列举的实施方案、特征或术语及其生物学等同物。
50.本文提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物在不与本说明书的明确教导相抵触的程度上通过引用以其整体并入，包括所有的图和表。
51.定义
52.如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”表示单数和复数，除非明确说明仅表示单数。
53.如本文所用，“和/或”是指并涵盖一个或多个相关所列项目的任何和所有可能的组合，以及当以替代方式(“或”)解释时不存在组合。
54.即使并不明确说明，但所有数字名称前都有术语“约(about)”或“大约(approximately)”。术语“约”或“大约”是指所理解的数字不限于本文中阐述的确切数字，并且旨在指基本上围绕所述数字而不脱离本发明范围的数字。如本文所用，“约”或“大约”将被本领域普通技术人员理解并且将在其使用的上下文中在一定程度上变化。如果给定了其使用的上下文，但本领域普通技术人员不清楚该术语的使用时，“约”或“大约”表示特定术语的最多正负10％、5％、1％或0.1％。
55.如本文所用，“不含”或“完全不含”意指在所使用的仪器或方法的检测范围内，不能检测到该物质，或不能确认其存在。
56.如本文所用，“基本上不含(essentially free)”意指只能检测到痕量的该物质。在本发明中，“基本上不含”意指该物质的水平低于整个组合物重量的0.1％，优选低于0.01％，最优选低于0.001％。
57.如本文所用，“实质上不含(substantially free)”意指该物质的水平低于整个组合物重量的5％，优选低于2％，最优选低于1％。
58.如本文所用，“肉毒杆菌毒素”是指由肉毒梭菌(clostridium botulinum)产生的神经毒素，以及由非梭菌属(non-clostridial)物种重组制成的肉毒杆菌毒素(或其轻链或重链)。如本文所用，短语“肉毒杆菌毒素”包括肉毒杆菌毒素血清型a、b、c、d、e、f和g。“肉毒杆菌毒素”还涵盖“修饰的肉毒杆菌毒素”。
59.如本文所用，“肉毒杆菌毒素复合物”或“毒素复合物”涵盖由梭菌属细菌释放的复合物，其包含肉毒杆菌毒素蛋白分子(所有血清型为～150kda)，以及一种或多种缔合的非毒素蛋白。复合物(例如，分子量为大约300kda、500kda或900kda)被认为含有非毒素血凝素
蛋白(“nth蛋白”)和非毒素非血凝素蛋白(“ntnh蛋白”)。因此，肉毒杆菌毒素复合物可包含肉毒杆菌毒素分子(神经毒性组分)和一种或多种nth和/或ntnh蛋白。这两种类型的非毒素蛋白可以稳定毒素分子以防止变性，并在毒素被摄入时免受消化酸。此外，与肉毒杆菌毒素蛋白相比，较大(300kda和更大)的肉毒杆菌毒素复合物可以从肌内注入部位更缓慢地扩散。
60.作为毒素复合物的一个实例，a型肉毒杆菌毒素复合物可由梭菌属细菌产生为900kda、500kda和300kda形式。b型和c1型肉毒杆菌毒素以500kda复合物的形式产生。d型肉毒杆菌毒素以300kda和500kda复合物的形式产生。最后，e型和f型肉毒杆菌毒素以大约300kda的复合物的形式产生。
61.关于a1型肉毒杆菌神经毒素，已知在ph大于约7时非毒素蛋白与肉毒杆菌毒素蛋白分子(～150kda)解离。因此，通过在ph为约7-8的合适缓冲液中对复合物进行分离过程，例如柱色谱法，毒素复合物可以解离成肉毒杆菌毒素蛋白和血凝素蛋白。然而，已知肉毒杆菌毒素蛋白在去除nth和/或ntnh血凝素蛋白后不稳定，并且毒素会随着ph和温度升高或由于表面拉伸或干燥(例如，在冻干或沉淀期间)而失去其毒性。此外，除非存在稳定剂，否则毒素在稀释(例如，在培养、发酵和纯化期间的稀释)时会失去其比活性。
62.如本文所用，“修饰的肉毒杆菌毒素”意指与天然肉毒杆菌毒素相比，其氨基酸中的至少一个已缺失、被修饰或替换的肉毒杆菌毒素。此外，修饰的肉毒杆菌毒素可以是重组产生的神经毒素，或重组制成的神经毒素的衍生物或片段。修饰的肉毒杆菌毒素保留天然肉毒杆菌毒素的至少一种生物活性，例如结合肉毒杆菌毒素受体的能力，或抑制从神经元释放神经递质的能力。修饰的肉毒杆菌毒素的一个实例是具有来自一种肉毒杆菌毒素血清型(例如血清型a)的轻链和来自不同肉毒杆菌毒素血清型(例如血清型b)的重链的肉毒杆菌毒素。因此，修饰的肉毒杆菌毒素可以包括来自两种不同血清型的轻链和重链，所述两种不同的血清型选自血清型a、b、c、d、e、f或g中的任一种。修饰的肉毒杆菌毒素的另一个实例是与神经递质偶联的肉毒杆菌毒素。
63.如本文所用，“纯化的肉毒杆菌毒素”、“纯毒素”、“游离的肉毒杆菌毒素”、“游离毒素”或“肉毒杆菌毒素蛋白”定义为与其他蛋白(包括形成肉毒杆菌毒素复合物的nth和/或ntnh蛋白)分离或实质上分离的肉毒杆菌毒素。纯化的肉毒杆菌毒素的纯度可以大于95％，优选地纯度大于99％。
64.如本文所用，“培养基”或“发酵培养基”意指用于培养细菌的任何培养基，以生长以便产生用于接种生产培养基(production medium)的种子培养物(seed culture)，或细菌在其中生长并产生其毒素的生产培养基。
65.如本文所用，“不含动物产品”(“apf”)、“基本上不含动物产品”或“实质上不含动物产品”分别涵盖“不含动物蛋白”、“基本上不含动物蛋白”或“实质上不含动物蛋白”，并且意指不存在、基本上不存在或实质上不存在血液衍生的、血液汇集的和其他动物衍生的产品或化合物。在这种情况下，“不含”、“基本上不含”和“实质上不含”对应于上面提供的定义。“动物”意指哺乳动物(例如人类)、禽类、爬行动物、鱼类、昆虫、蜘蛛或其他动物物种。“动物”不包括微生物，例如细菌。因此，本发明范围内的apf培养基或方法或基本上apf的培养基或方法可以包括肉毒杆菌毒素或肉毒梭菌细菌。例如，apf方法或实质上apf的方法是指不含或实质上不含动物衍生蛋白例如免疫球蛋白、人白蛋白、肉类消化物、肉类副产品以
及奶或乳制品或消化物的方法。因此，apf方法的一个实例是不包括肉类和奶制品或肉类或奶制品副产品的方法(例如细菌培养或细菌发酵方法)。
66.如本文所用，“生物负荷”是指生活在尚未进行灭菌的表面上、装置内部或溶液中的细菌。例如，本技术的实施方案包括过滤缓冲溶液以减少“生物负荷”，即生活在缓冲溶液中或已经从与溶液接触的表面(例如，玻璃器皿表面)转移到溶液中的细菌。
67.如本文所用，“切向流过滤”和“tff”是指可用于澄清、浓缩和纯化生物材料(例如蛋白)的过滤模式。在tff中，含有大分子或生物材料的溶液或悬浮液可沿膜表面切向泵送。施加的压力可以迫使溶液的一部分通过膜中的孔。这种溶液在本文中称为“渗透液”(或“滤液”)。太大而无法通过膜孔的大分子、生物材料和微粒可能被截留在上游侧。这种溶液在本文中称为“截留物”。与普通过滤方法相比，截留的物质不会堆积在膜表面。相反，它们可以通过流体的切向流动沿着膜的表面移动。参见，例如，l.schwartz和k.seeley,introduction to tangential flow filtration for laboratory and process development applications,pall life sciences(2002),https://laboratory.pall.com/content/dam/pall/laboratory/literature-library/non-gated/id-34212.pdf.
68.如本文所用，“渗透物”是指经由通过过滤器或膜的孔而穿过过滤器或膜(例如渗滤膜、切向流过滤膜、超滤膜、微滤膜或中空纤维过滤器)的溶液、悬浮液或其组分，以及已经穿过或通过过滤器或膜的溶液。一般来说，小于过滤器或膜孔径的溶剂分子和溶质分子将穿过过滤器或膜，而大于孔径的分子将不穿过过滤器或膜。
69.如本文所用，“含毒素渗透物”是指含有肉毒杆菌毒素分子的渗透物，例如当过滤器的孔径大于肉毒杆菌毒素分子时，使得肉毒杆菌毒素分子穿过过滤器。
70.如本文所用，“截留物”是指不穿过过滤器或膜的溶液、悬浮液或其组分。例如，在切向流过滤的情况下，截留物是沿着过滤器或膜切向流动但不穿过过滤器或膜的溶液或悬浮液的组分或部分。通常，大于过滤器或膜孔径的分子将不穿过过滤器或膜。
71.如本文所用，“含毒素截留物”是指含有肉毒杆菌毒素分子的截留物，例如当过滤器的孔径小于肉毒杆菌毒素分子时，使得肉毒杆菌毒素分子不能穿过过滤器。
72.如本文所用，“跨膜压力”或“tmp”是指沿过滤膜的长度施加以导致流体和可过滤溶质流动通过或穿过过滤器或膜的压力差梯度。
73.如本文所用，“渗滤”是指一种专用的过滤种类，其中用溶剂稀释截留物并重新过滤，以降低可溶性渗透物组分的浓度。渗滤可能会或可能不会导致截留组分包括蛋白(例如，bont/a)的浓度增加。例如，在连续渗滤中，溶剂以与产生渗透物相同的速率连续添加到截留物中。在这种情况下，截留物的体积和截留组分的浓度在这个过程中不会改变。另一方面，在不连续或连续稀释渗滤中，过滤步骤之后是向截留物侧添加溶剂；如果添加到截留物侧的溶剂体积小于产生的渗透物的体积，则截留组分的浓度将高于原始溶液中的浓度。渗滤可用于改变大分子(例如，bont/a等蛋白)的溶液或悬浮液的ph、离子强度、盐组成或其他性质。参见，例如，l.schwartz,diafiltration:a fast,efficient,method for desalting,or buffer exchange of biological samples,pall life sciences(2003),https://laboratory.pall.com/content/dam/pall/laboratory/literature-library/non-gated/02.0629_buffer_exchange_str.pdf(最后一次访问为2019年12月9日)。
74.如本文所用，“渗滤体积”或“dv”是指在渗滤过程期间交换的总体积。单个dv等于渗滤开始时截留物的体积。例如，如果原始溶液体积为1升，则渗滤过程产生大约等于1升的渗透物体积，并且截留物保持或恢复到1l的体积(例如，使用缓冲溶液)，然后原始溶液或悬浮液已用1个dv过滤或洗涤。连续渗滤允许交换多个dv。例如，如果原始截留物体积为1升，而渗滤过程产生的渗透物体积等于大约5升，则原始溶液或悬浮液已用5个dv过滤或洗涤。
75.如本文所用，“微滤”是指通常使用范围从大约0.1μm至大约10μm和更大的膜孔径的一类过滤。参见例如，munir cheryan,ultrafiltration and microfiltration handbook(第2版，1998)。
76.如本文所用，“超滤”是指通常使用大约0.1μm至大约0.01μm或更小的膜孔径的一类过滤。或者，标称膜孔径可以用分子量表示，例如约30kda及以下至约750kda及以下，优选50kda及以下或30kda及以下。它可以是指任何这样的技术，其中溶液或悬浮液经受半渗透膜，该半渗透膜截留大分子同时允许溶剂和小溶质分子通过。超滤可用于浓缩溶液或悬浮液中的大分子(例如，bont/a等蛋白)。参见例如，munir cheryan,ultrafiltration and microfiltration handbook(2d ed.1998)。
77.如本文所用，“色谱法”或“色谱分离”是指一种物理分离方法，通过该方法待分离的组分(例如，蛋白)分布在两个相：固定相和流动相之间。待分离的分子溶解在流动相中，流动相行进通过固定相(例如，多孔凝胶、带电荷的聚合物珠等)。分离是可能的，因为样品中的不同分子将对固定相表现出不同的亲和力，从而导致相似分子的分离。对固定相具有较高亲和力的分子将倾向于比具有较弱亲和力的分子更慢地通过固定相。当应用于蛋白(例如肉毒杆菌毒素)时，色谱分离可以根据许多不同的特性分离蛋白。例如，在凝胶过滤色谱中，流动相中的蛋白根据大小进行分离，因为不同大小的蛋白行进通过多孔固定相，较小的蛋白会被困在其中，从而减慢它们的行进。在离子交换色谱法中，蛋白根据其电荷以及与固定相产生的库仑相互作用进行分离。
78.如本文所用，“色谱柱”或简称为“柱”，是指含有色谱基质(例如，固定相或固相)的组分，其被配置为使得流动相(例如，流体样品或缓冲液)可以通过该柱从而通过保留在色谱柱中的固定相。此类柱的非限制性实例是可从g.e.healthcare商购的那些。参见色谱产品：色谱柱、系统、树脂和缓冲管理溶液，g.e.healthcare,https://www.gelifesciences.com/en/us/shop/chromatography(最后一次访问是2019年12月9日)。
79.如本文所用，“级分”是指在其离开柱子时被收集的流动相的一部分。“级分”中的组分将根据收集时间的不同而有所不同。早期收集的移动速度更快的“部分”将含有相对高浓度在固定相中移动速度更快的分子；稍后收集的移动较慢的“部分”将包含相对高浓度在固定相中移动速度较慢的分子。
80.如本文所用，“含毒素级分”是指在肉毒杆菌毒素分子(例如，bont/a分子)在流动相中离开色谱柱的时间段期间从色谱柱收集的级分。
81.如本文所用，“离子交换色谱”或“iex”是指基于分子的极性和电荷大小(例如 2、 1、中性、-1、-2等)分离分子的色谱分离技术。iex根据分析物分子(例如蛋白)与固定相的库仑相互作用的程度将分析物分子(例如蛋白)保留在固定相上。固定相表面显示与带相反电荷的分析物(例如肉毒杆菌毒素)离子相互作用的离子官能团。为了实现电中性，这些固定
相电荷与流动相中的可交换反离子相互作用。分析物分子与这些可交换的反离子竞争结合。分析物分子根据其电荷被保留或“洗脱”。最初，不与固定相结合或与固定相结合较弱的分子首先被洗掉。一般参见，例如，ion exchange chromatography:principles and methods,g.e.healthcare(2016)，https://cdn.gelifesciences.com/dmm3bwsv3/assetstream.aspx？mediaformatid＝10061&destinationid＝10016&assetid＝13101(最后一次访问是2019年12月9日)。
82.如本文所用，“阴离子交换色谱”或“aiex”是指其中将阴离子分析物分子(例如，蛋白)保留在阳离子固定相上的一种离子交换色谱。一般参见，例如，ion exchange chromatography:principles and methods,g.e.healthcare(2016)，https://cdn.gelifesciences.com/dmm3bwsv3/assetstream.aspx？mediaformatid＝10061&destinationid＝10016&assetid＝13101(最后一次访问是2019年12月9日)。
83.如本文所用，“阳离子交换色谱”或“ciex”是指其中将阳离子分析物分子(例如蛋白)保留在阴离子固定相上的一种离子交换色谱。一般参见，例如，ion exchange chromatography:principles and methods,g.e.healthcare(2016)，https://cdn.gelifesciences.com/dmm3bwsv3/assetstream.aspx？mediaformatid＝10061&destinationid＝10016&assetid＝13101(最后一次访问是2019年12月9日)。
84.如本文所用，“洗脱”是指通过改变色谱柱内的溶液条件来解吸结合到固定相的分子。可以增加可交换的反离子浓度，或者可以改变ph以影响分析物结合亲和力。对固定相失去亲和力并进入流动相的分子从色谱柱中“洗脱”出来。
85.如本文所用，“洗脱剂”或“洗涤溶液”是指一种试剂，通常是一种溶液，其用于改变分析物(例如，肉毒杆菌毒素分子)对固定相的吸附和/或从固定相去除未结合的物质。洗脱剂的洗脱特性可以取决于例如ph、离子强度和去污剂强度等因素。
86.如本文所用，“洗脱物”是指含有未结合的物质(包括“洗脱的”或解吸的分析物分子，例如肉毒杆菌毒素分子)的溶液(例如，洗涤溶液或缓冲溶液)，其在色谱分离过程中行进通过固定相并离开柱。
87.如本文所用，“含毒素洗脱液”是指含有洗脱的肉毒杆菌毒素分子的流动相，其在色谱分离柱中离开柱。
88.如本文所用，“凝胶过滤色谱”或“凝胶过滤”意指一种尺寸排阻色谱，其可以用于在将样品(例如，蛋白、蛋白复合物、多糖、核酸、小分子等)分成多个级分，每个级分都有特定的尺寸范围。或者，“凝胶过滤”可以从样品中去除所有大于特定截留尺寸的分子。在凝胶过滤色谱柱中，固定相包括多孔基质(例如珠子)，并且流动相是围绕基质流动的溶液(例如缓冲溶液)。基质可以具有定义的孔径范围，称为“级分范围(fractionation range)”。太大而不能进入孔中的分子和复合物保留在流动相中，并与缓冲溶液一起行进通过柱。可以进入孔中的较小分子和复合物进入固定相，并以较长的路径移动通过凝胶过滤柱(即通过孔，而不是围绕珠子)。可以进入固定相的分子按尺寸进行分级。较小的分子将通过孔迁移并且将比不能容易进入孔中的较大分子更慢。因此，较大的分子洗脱得更快。因此，在分级范围以上的样品组分将在分级范围内的组分之前洗脱。一般参见，例如，size exclusion chromatography:principles andmethods,g.e.healthcare(2018)，https://cdn.gelifesciences.com/dmm3bwsv3/assetstream.aspx？mediaformatid＝10061&
destinationid＝10016&assetid＝11639(最后一次访问是2019年12月9日)。
89.如本文所用的关于色谱系统的组件的“一次性”是指被配置为在每次使用后被替换或丢弃并且不打算在该系统中重复使用的组件。
90.发酵培养基
91.现在参照图1，用于纯化肉毒杆菌毒素的方法100可包括104获得包含肉毒杆菌毒素(例如，bont/a)的溶液(例如，发酵培养基)。在一些实施方案中，溶液可以是发酵培养基，优选来自发酵培养基的上清液，其包含完整的肉毒梭菌细胞、裂解细菌、培养基营养物(例如，植物蛋白胨)和发酵副产物。在一些实施方案中，发酵培养基可以实质上不含、基本上不含或不含动物产品(即，“apf”发酵培养基)，例如在共同未决的美国临时专利申请号62/951,549中描述的发酵培养基。
92.可以使用蛋白纯化领域的普通技术人员已知的蛋白纯化方法从发酵培养基中分离和纯化肉毒杆菌毒素。一般参见，例如，munir cheryan,ultrafiltration and microfiltration handbook(2d ed.1998)；ozutsumi et al.,49appl.envtl.microbiol.939(1985)；ge healthcare,strategies for protein purification handbook(2010)。
93.如本文所述的本公开的纯化方法可以包括纯化比150kda肉毒杆菌毒素蛋白分子更稳定的肉毒杆菌毒素复合物(例如，900kda复合物)，然后进一步从非毒素蛋白(即nth和/或ntnh蛋白)中纯化毒素蛋白分子，获得纯化的肉毒杆菌毒素(～150kda)产物，而无需任何沉淀、离心或冻干步骤。产物毒素溶液可以不含、基本上不含或实质上不含毒素复合物和/或动物产品。此外，因为不需要沉淀、冻干或离心步骤，肉毒杆菌毒素可以在溶液中回收，而与在向患者施用之前必须由最终使用者重构的粉末截然相反。
94.过滤
95.过滤1
96.仍然参照图1，该方法可包括第一过滤(“过滤1”)106，其包括过滤培养基或培养溶液以去除完整的或裂解的细菌、孢子(例如肉毒梭菌孢子)和碎片以提供含毒素渗透物107。含毒素渗透物107包含肉毒杆菌毒素和各种杂质并且可以被处理以获得浓缩的肉毒杆菌毒素(例如，bont/a)。
97.在特定实施方案中，第一过滤106包括使用任何合适的过滤技术(例如渗滤、切向流微滤、切向流超滤、中空纤维过滤等)从发酵培养基中去除完整的或裂解的肉毒梭菌细胞(或其组分)。用于纯化生物分子例如蛋白的过滤技术在本领域中是众所周知的。参见例如，l.schwartzhe k.seeley,introduction to tangential flow filtration for laboratory and process development applications,pall life sciences(2002),https://laboratory.pall.com/content/dam/pall/laboratory/literature-library/non-gated/id-34212.pdf(最后一次访问是2019年12月9日)；munir cheryan,ultrafiltration and microfiltration handbook(第2版，1998)。在一个实施方案中，第一过滤106包括切向流微滤。
98.在一些实施方案中，第一过滤步骤106可使用过滤器(例如，中空纤维过滤器、切向流过滤膜等)，其中至少溶剂和肉毒杆菌毒素分子或毒素复合物通过过滤器以产生含毒素渗透物107，而完整的或裂解的细胞(如果存在的话)不通过过滤器并保留在截留物中。在一
些实施方案中，过滤器包括直径在大约0.1μm和10μm之间的孔(例如，大约0.2μm)。在一个实施方案中，过滤器是中空纤维过滤器。
99.在一些实施方案中，第一过滤步骤106可进一步包括浓缩含毒素渗透物107并通过任何合适的方法(例如，渗滤)从截留物和/或含毒素渗透物107中回收另外的肉毒杆菌毒素分子。
100.过滤2
101.仍然参照图1，该方法可以进一步包括用于从含毒素渗透物107中去除发酵培养基残留物(例如，小肽、碳水化合物等)的第二过滤(“过滤2”)108。该步骤可以包括任何合适的过滤技术(例如渗滤、切向流微滤、切向流超滤、中空纤维过滤等)。在一个实施方案中，用于去除发酵培养基残留物的第二过滤108包括使用切向流过滤器(例如，中空纤维过滤器)的超滤，其孔径允许发酵培养基残留物通过过滤器同时保留肉毒杆菌毒素分子和/或毒素复合物。例如，在一些实施方案中，过滤器的孔径可以为150kda或更小、100kda或更小或50kda或更小。在这种情况下，肉毒杆菌毒素分子或肉毒杆菌毒素复合物保留在来自第二过滤108的截留物中，以产生澄清的培养物110，培养物110含有肉毒杆菌毒素分子或肉毒杆菌毒素复合物但不含、基本上不含或实质上不含完整的或裂解的肉毒梭菌细胞(或其组分)，以及发酵培养基残留物(例如，小肽、碳水化合物等)。
102.在一些实施方案中，可以收集澄清的培养物110并在随后的处理步骤中进一步纯化，而无需在纯化过程期间的任何时间从溶液中沉淀肉毒杆菌毒素分子或毒素复合物。有利地，这提高了总工艺产率，保持了毒素的活性，并且消除了最终使用者对冻干药物产品进行重构的需要。
103.柱色谱
104.第一色谱分离
105.仍然参照图1，方法100的一些实施方案进一步包括使用第一色谱分离112纯化澄清的培养物110以产生第一含毒素级分114。该步骤的目的是使肉毒杆菌毒素复合物与存在于澄清培养物110中的核酸(例如dna和rna)分离。第一色谱分离112可以包括任何合适的色谱分离技术(例如离子交换色谱——包括阴离子交换色谱或阳离子交换色谱、凝胶过滤色谱、高效液相色谱、亲和色谱等)。在一些实施方案中，第一色谱分离可包括阴离子交换色谱(aiex)。在一个实施方案中，第一色谱分离包括在q sepharose上进行的aiex。
106.第一色谱分离112可包括使第一色谱柱与包含肉毒杆菌毒素或毒素复合物的澄清的培养物110接触。流动相(包含澄清的培养物110)可流动通过第一固定相以使肉毒杆菌毒素与其他残留杂质(例如核酸)分离。第一固定相可包含任何合适的色谱基质(例如，基于琼脂糖珠的介质，例如q sepharose ff(ge healthcare))。
107.在特定实施方案中，澄清的培养物110可被调节用于柱色谱(例如，通过在缓冲溶液中稀释或通过缓冲液交换)。在一个特定实施方案中，澄清的培养物110可以在ph小于或等于约7.5、优选ph小于或等于约7、更优选ph为约6.1的磷酸盐缓冲液中调节。在一些实施方案中，澄清的培养物110可以在ph为约7.5、约7.4、约7.3、约7.2、约7.1、约7.0、约6.9、约6.8、约6.7、约6.6、约6.5、约6.4、约6.3、约6.2、约6.1、约6.0、约5.9、约5.8、约5.7、约5.6或约5.5的磷酸盐缓冲液中调节。
108.在特定实施方案中，第一色谱分离112可进一步包括使用合适的缓冲溶液(例如，
ph 6.1的磷酸盐缓冲液)通过固定相洗涤肉毒杆菌毒素或毒素复合物。此步骤的目的是通过柱尽可能多地洗涤肉毒杆菌毒素复合物，同时使肉毒杆菌毒素复合物与其他蛋白分离并去除核酸(rna和dna)。在一些实施方案中，选择该缓冲溶液的盐浓度以使流动通过柱的肉毒杆菌毒素或毒素复合物的量最大化，同时使流动通过柱的其他蛋白的量最小化。
109.在一些实施方案中，缓冲溶液包含浓度不低于约15mm、不低于约20mm、不低于约30mm、不低于约40mm、不低于约50mm、不低于约60mm、不低于约70mm、不低于约80mm、不低于约90mm、不低于约100mm、不低于约150mm、不低于约200mm、不低于约250mm、不低于约300mm、不低于约350mm、不低于约400mm、不低于约450mm或不低于约500mm(以及介于其间的范围)的氯化钠(nacl)。在一些实施方案中，缓冲溶液包含浓度为约15mm、约20mm、约30mm、约40mm、约50mm、约60mm、约70mm、约80mm、约90mm、约100mm、约150mm、约200mm、约250mm、约300mm、约350mm、约400mm、约450mm、或约500mm的nacl。在一个实施方案中，缓冲溶液包含浓度为约150mm的nacl。
110.在一个特定实施方案中，第一色谱柱可以流通模式操作，其中肉毒杆菌毒素和/或毒素复合物可以通过柱而不吸附到固定相。在这种配置中，不需要从柱中洗脱肉毒杆菌毒素或毒素复合物。相反，肉毒杆菌毒素或毒素复合物可以在含毒素级分114中离开柱子，可以收集含毒素级分114并在随后的处理步骤中对其进行进一步纯化。在一些实施方案中，通过在280nm下的流通吸光度检测(“a
280”)监测含毒素级分114的收集，其中在a
280
峰出现期间收集含毒素级分114。
111.第二色谱分离
112.方法100的一些实施方案还包括第二色谱分离步骤116，其中可以纯化含毒素级分114以去除大量杂质(例如，其他蛋白)并产生第一含毒素洗脱液118。第二色谱分离116可以包括任何合适的色谱分离技术(例如离子交换色谱——包括阴离子交换色谱或阳离子交换色谱、凝胶过滤色谱、高效液相色谱、亲和色谱等)。在一个特定实施方案中，第二色谱分离116包括阳离子交换色谱(ciex)。
113.第二色谱分离116可包括使肉毒杆菌毒素或毒素复合物与第二色谱柱接触，其中包含含毒素级分114的流动相行进通过第二固定相。第二固定相可以包含任何合适的色谱基质(例如，基于琼脂糖珠的介质，例如sp sepharose ff(ge healthcare))。在实施方案中，肉毒杆菌毒素分子或毒素复合物可以结合第二固定相。在实施方案中，肉毒杆菌毒素或毒素复合物可以结合第二固定相，并且监测洗涤通过柱的溶液的a
280
。在实施方案中，用合适的缓冲溶液(例如，50mm乙酸钠、0.2％聚山梨酯20(ph 4.5))洗涤柱直到a
280
恢复到基线值，表明所有含毒素洗脱液118已经通过柱子，尽管肉毒杆菌毒素和毒素复合物可能仍保持与第二固定相结合。
114.在一些实施方案中，第二色谱分离116可进一步包括用洗涤缓冲液进一步洗涤第二色谱柱以去除任何弱结合的蛋白，而肉毒杆菌毒素和毒素复合物保持与第二固定相强结合。这一洗涤步骤可以使用任何合适的缓冲溶液(例如50mm乙酸钠、0.2％聚山梨酯20(ph 4.5)、210mm nacl)。在一些实施方案中，这种洗涤缓冲液可以含有浓度为250mm或更低、240mm或更低、230mm或更低、220mm或更低、210mm或更低、200mm或更低、190mm或更低、180mm或更低、170mm,或更低、160mm或更低、150mm或更低、140mm或更低、130mm或更低、120mm或更低、110mm或更低、或100mm或更低、或更少的nacl。在一些实施方案中，这种洗涤缓冲液含有
浓度为约100mm、约110mm、约120mm、约130mm、约140mm、约150mm、约160mm、约170mm、约180mm、约190mm、约200mm、约210mm、约220mm、约230mm、约240mm、或约250mm的nacl。
115.在一些实施方案中，第二色谱分离116可进一步包括在使含毒素级分114与第二色谱柱接触之前调节含毒素级分114以用于柱色谱(例如，通过稀释或缓冲液交换)。例如，在一些实施方案中，可通过在ph为约3至约7、约3.5至约6、或约4至约5、优选ph为约4.5的乙酸-乙酸盐缓冲液中稀释来调节含毒素级分114。在一些实施方案中，在ph为约3.5、约3.6、约3.7、约3.8、约3.9、约4.0、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4或约5.5的缓冲液中调节含毒素级分。
116.在一些实施方案中，第二色谱分离116可进一步包括从柱洗脱肉毒杆菌毒素或毒素复合物以产生第一含毒素洗脱液118。洗脱可包括用一种或多种促进毒素(或毒素复合物)从固定相解离(例如，通过改变ph或离子强度)的缓冲溶液洗涤柱。这种洗脱缓冲液可以是用于促进毒素或毒素复合物从第二固定相解离的任何合适的缓冲溶液(例如，50mm乙酸钠、0.2％聚山梨酯20(ph 4.5))。例如，这样的缓冲溶液可以包括ph为约3至约7、约4至约6、或约4至约5、或约4.5的乙酸-乙酸盐缓冲液。在一些实施方案中，使用ph为约3.5、约3.6、约3.7、约3.8、约3.9、约4.0、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4或约5.5的缓冲液从第二色谱柱洗脱含毒素级分。
117.在一些实施方案中，这种洗脱缓冲液可包含浓度足以促进肉毒杆菌毒素或毒素复合物从第二固定相解离的盐。在实施方案中，这种洗脱缓冲液含有浓度为230mm或更高、240mm或更高、250mm或更高、260mm或更高、270mm或更高、280mm或更高、290mm或更高、300mm或更高、350mm或更高、或400mm或更高的nacl。在一些实施方案中，这种洗脱缓冲液包含浓度为约230mm、约240mm、约250mm、约260mm、约270mm、约280mm、约290mm、约300mm、约310mm、约320mm、约330mm、约340mm、约350mm、约360mm、约370mm、约380mm、约390mm、或约400mm，或介于其间的任何值的nacl。
118.在实施方案中，从柱洗脱肉毒杆菌毒素分子或毒素复合物以产生第一含毒素洗脱液118，可以收集第一含毒素洗脱液118并在随后的处理步骤中对其进行进一步纯化。在一些实施方案中，在从第二色谱柱洗脱期间测量a
280
以检测从柱中洗脱的肉毒杆菌毒素分子或毒素复合物的存在，并且将a
280
峰作为单一级分收集以产生第一含毒素洗脱液118。
119.过滤3
120.该方法的一些实施方案进一步包括在第二色谱分离116之后和第三色谱分离124之前进行的第三过滤步骤120。在一个实施方案中，第三过滤120从肉毒杆菌毒素复合物中解离nth和/或ntnh蛋白。在实施方案中，第三过滤120包括缓冲液交换，这可增加第一含毒素洗脱液118的ph(例如，从约4.5到约8.0)。在实施方案中，缓冲液交换可降低含毒素洗脱液118中的盐浓度(例如，从约270mm至约50mm)。在实施方案中，第三过滤120可以浓缩含毒素洗脱液118(例如，通过将其体积从约300ml减少到约50-60ml)。
121.第三过滤120可包括任何合适的过滤技术(例如渗滤、切向流微滤、切向流超滤、中空纤维过滤等)。在一个特定实施方案中，第三过滤120可包括使用切向流过滤器(例如，中空纤维过滤器)的超滤，该切向流过滤器具有适合保留解离的肉毒杆菌毒素分子(150kda)和nth和/或ntnh蛋白的孔径。在一些实施方案中，过滤器的孔径可以为不大于约150kda、不大于约140kda、不大于约130kda、不大于约120kda、不大于约110kda、不大于约100kda、不大
于约90kda、不大于约80kda、不大于约70kda、不大于约60kda、不大于约50kda、不大于约40kda、不大于约30kda或不大于约20kda(或介于其间的范围)。例如，切向流过滤器的孔径可以为约20kda、约25kda、约30kda、约35kda、约40kda、约45kda、约50kda、约55kda、约60kda、约65kda、约70kda、约75kda、约80kda、约85kda、约90kda、约95kda、约100kda、约110kda、约120kda、约130kda、约140kda或约150kda，或介于其间的任何值。在一个实施方案中，过滤器的孔径为约30kda。
122.在一些实施方案中，可以通过超滤浓缩含毒素洗脱液118，然后使用渗滤针对缓冲溶液进行洗涤以从肉毒杆菌毒素复合物中解离nth和/或ntnh蛋白。在一个特定实施方案中，肉毒杆菌毒素蛋白分子和nth和/或ntnh蛋白可以保留在截留物121(即，含毒素截留物)中，而其他过滤和色谱介质残留物被分离到渗透物中。
123.用于第三过滤120的缓冲溶液可以是用于将毒素复合物中的nth和/或ntnh蛋白与肉毒杆菌毒素分子解离的任何合适的缓冲溶液(例如，tris-hcl缓冲液)。在一些实施方案中，用于第三过滤120的缓冲溶液可以是用于调节第三色谱柱的相同缓冲液(例如，ph大于7的tris-hcl缓冲液，如下所述)。
124.在一些实施方案中，用于第三过滤120的缓冲溶液具有适合于使nth和/或ntnh蛋白与肉毒杆菌毒素蛋白分子解离的ph。在一些实施方案中，缓冲溶液的ph为至少约7，优选约7至约10，优选约7至约9，优选约7.5至约8.5，优选约8.0。在一些实施方案中，用于第三过滤120的缓冲溶液的ph可以是约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8.0、约8.1、约8.2、约8.3、约8.4、约8.5、约8.6、约8.7、约8.8、约8.9、约9.0、约9.5或约10.0。在一个实施方案中，用于第三过滤120的缓冲溶液的ph为约8.0。
125.在一些实施方案中，可收集来自第三过滤器120的含毒素截留物121并在随后的处理步骤中对其进行进一步纯化，而无需在纯化过程中的任何时间点从溶液中沉淀肉毒杆菌毒素分子或毒素复合物。有利地，这提高了总工艺产率并且消除了在纯化过程期间的任何时间点或由最终使用者重构冻干药物产品的需要。
126.第三色谱分离
127.方法100的一些实施方案进一步包括第三色谱分离124以分离和去除在之前的第三过滤120期间从毒素复合物中解离的nth和/或ntnh蛋白，同时保留肉毒杆菌毒素蛋白分子。所得第二含毒素洗脱液126可包含游离肉毒杆菌毒素蛋白分子(～150kda)，并且可不含、基本上不含或实质上不含毒素复合物。第三色谱分离124可包括任何合适的色谱分离技术(例如离子交换色谱——包括阴离子交换色谱或阳离子交换色谱、凝胶过滤色谱、高压液相色谱、亲和色谱等)。在一个特定实施方案中，第三色谱分离124可包括阴离子交换色谱(aiex)。
128.第三色谱分离124可包括使来自第三过滤120的含毒素截留物121中的肉毒杆菌毒素或毒素复合物与第三色谱柱接触，其中使包含含毒素截留物121(和其中的游离肉毒杆菌毒素蛋白分子)的流动相行进通过第三固定相。第三固定相可包含任何合适的色谱基质(例如，基于琼脂糖珠的介质，例如q sepharose ff(ge healthcare))。
129.在一些实施方案中，第三色谱分离124可进一步包括调节来自第三过滤120的含毒素截留物121以用于柱色谱(例如，通过稀释、缓冲液交换、过滤，或其组合)。例如，含毒素截留物121可以在缓冲溶液中进行稀释，例如在ph大于7、优选为7至10、优选为约7至约9、优选
为约7.5至约8.5或优选ph为约8.0的tris-hcl缓冲液中。在一些实施方案中，缓冲溶液的ph为约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8.0、约8.1、约8.2、约8.3、约8.4、约8.5、约8.6、约8.7、约8.8、约8.9、约9.0、约9.5或约10.0。
130.在一些实施方案中，含毒素截留物121中的肉毒杆菌毒素蛋白分子、毒素复合物和nth和/或ntnh蛋白可以吸附到第三固定相。在一些实施方案中，将含毒素截留物121装载到第三色谱柱上，并用洗涤缓冲溶液洗涤以去除未结合到第三固定相的非毒素杂质。洗涤缓冲液可以是任何合适的缓冲溶液(例如，20mm tris/hcl、50mm nacl、0.2％聚山梨酯20，ph 8.0)，并且可以监测通过该柱的溶液的a
280
，直到a
280
达到基线值，表明所有未结合的物质已流动通过第三色谱柱。
131.第三色谱分离124可进一步包括洗脱与第三固定相结合的肉毒杆菌毒素蛋白以产生第二含毒素洗脱液126。洗脱可包括用一种或多种缓冲溶液洗涤柱，以使用任何合适的蛋白相容缓冲溶液从固定相解吸肉毒杆菌毒素蛋白分子(例如，通过改变ph、离子强度等)。例如，可使用ph为大于7、优选7至10、优选约7至约9、优选约7.5至约8.5或优选ph为约8.0的tris-hcl缓冲溶液从第三固定相洗脱肉毒杆菌毒素分子。在一些实施方案中，缓冲溶液的ph为约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8.0、约8.1、约8.2、约8.3、约8.4或约8.5。
132.在一些实施方案中，用于从第三色谱柱洗脱肉毒杆菌毒素分子的缓冲溶液可以包含盐(例如，nacl)。在一些实施方案中，用于从第三色谱柱洗脱肉毒杆菌毒素分子的缓冲溶液含有浓度适合于促进肉毒杆菌毒素分子从第三固定相解吸的nacl。在实施方案中，这种洗脱缓冲液可包含浓度为约25mm至约250mm、优选约50mm至约200mm、优选约100mm至约150mm、优选约120mm的nacl。在一些实施方案中，用于从第三色谱柱洗脱肉毒杆菌毒素分子的洗脱缓冲液含有浓度为约50mm、约60mm、约70mm、约80mm、约90mm、约100mm、约110mm、约115mm、约120mm、约125mm、约130mm、约135mm、约140mm、约145mm、约150mm、约155mm、约160mm、约165mm、约170mm、约175mm、约180mm、约185mm、约190mm、约195mm、约200mm、约210mm、约220mm、约230mm、约240mm、或约250mm的nacl。在一个实施方案中，用于从第三色谱柱洗脱肉毒杆菌毒素分子的缓冲溶液含有约120mm或约150mm的nacl。
133.在一些实施方案中，用于从第三色谱柱洗脱肉毒杆菌毒素分子的缓冲溶液进一步包含表面活性剂(例如，聚山梨酯20)。在一些实施方案中，用于从第三色谱柱洗脱肉毒杆菌毒素分子的缓冲溶液包含浓度为约0.05体积-％至约1.0体积-％、优选约0.10体积-％至约0.5体积-％、优选约0.15体积-％至约0.25体积-％、优选约0.20体积-％的表面活性剂。在一些实施方案中，用于从第三色谱柱洗脱肉毒杆菌毒素分子的缓冲溶液含有浓度为约0.05体积-％、约0.10体积-％、约0.15体积-％、约0.20体积-％、约0.25体积-％、约0.30体积-％、约0.35体积-％、约0.40体积-％、约0.45体积-％、约0.50体积-％、约0.55体积-％、约0.60体积-％、约0.65体积-％、约0.70体积-％、约0.75体积-％、约0.80体积-％、约0.85体积-％、约0.90体积-％、约0.95体积-％或约1.0体积-％的表面活性剂。在一个实施方案中，用于从第三色谱柱洗脱肉毒杆菌毒素分子的缓冲溶液包含浓度为约0.20体积-％的聚山梨酯20。
134.在特定实施方案中，当第二含毒素级分126从柱中洗脱出来时将其收集并在随后的工艺步骤中对其进行进一步纯化，而无需沉淀或冻干肉毒杆菌毒素蛋白。在一个实施方案中，将第二含毒素级分126直接注入到第四色谱柱上以进行最终精制(polishing)(即，去
除包括目标蛋白聚集体在内的高分子量污染物和包括目标蛋白片段在内的低分子量污染物以及其他在前面的纯化步骤中可能无法去除的杂质)。
135.第四色谱分离
136.方法100的一些实施方案进一步包括最终精制步骤以从第二含毒素级分126去除聚集体和/或蛋白杂质，使用第四色谱分离128产生第三含毒素洗脱液130。第四色谱分离128可包括任何合适的色谱分离技术(例如离子交换色谱——包括阴离子交换色谱或阳离子交换色谱、凝胶过滤色谱、高压液相色谱、亲和色谱等)。例如，在一个实施方案中，第四色谱分离128可以包括凝胶过滤色谱。
137.第四色谱分离128可以使用能够使纯肉毒杆菌毒素蛋白分子与聚集的肉毒杆菌毒素和其他蛋白杂质分离的任何合适的蛋白相容色谱基质。例如，第四色谱分离128可以使用superdex 200色谱介质(ge healthcare))。
138.第四色谱分离128可进一步包括调节第二含毒素洗脱液126进行柱色谱(例如，通过稀释、缓冲液交换、过滤，或其组合)。或者，在一个特定实施方案中，可以将来自第三色谱分离124的第二含毒素洗脱液126在无需进一步调节的情况下直接注入到第四层色谱柱中。在这种配置中，第三和第四色谱柱可以相互连接以允许直接装载第二含毒素洗脱液126。
139.第四色谱分离128可进一步包括使用洗涤溶液或缓冲液洗涤肉毒杆菌毒素分子通过固定相以提供第三含毒素洗脱液130。缓冲溶液可以是任何合适的、蛋白相容的缓冲液。在一个特定实施方案中，缓冲溶液可以是ph为小于约7、优选约5至约7、优选约6至约7、优选约6.6至约6.9的乙酸-乙酸盐缓冲溶液。在一些实施方案中，这种缓冲溶液的ph可为约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9或约7.0。
140.在一些实施方案中，用于洗涤肉毒杆菌毒素分子通过第四色谱柱中的固定相的缓冲溶液进一步包含盐(例如，nacl)。在一些实施方案中，这种洗涤缓冲溶液含有浓度为约100mm至约1m、优选约200mm至约600mm、更优选约300mm至约500mm、最优选约400mm的nacl。在一些实施方案中，这种缓冲溶液含有浓度为约100mm、约150mm、约200mm、约250mm、约300mm、约310mm、约320mm、约330mm、约340mm、约350mm、约360mm、约370mm、约380mm、约390mm、约400mm、约410mm、约420mm、约430mm、约440mm、约450mm、约500mm、约550mm、约600mm、约650mm、约700mm、约750mm、约800mm、约850mm、约900mm、约950mm或约1m的nacl。在一个实施方案中，用于洗涤肉毒杆菌毒素分子通过第四色谱柱中的固定相的缓冲溶液含有约350mm的nacl或约370mm的nacl。
141.在一些实施方案中，用于洗涤肉毒杆菌毒素分子通过第四色谱柱的固定相的缓冲溶液进一步包含表面活性剂(例如，聚山梨酯20)。在一些实施方案中，这种缓冲溶液含有浓度为约0.05体积-％至约1.0体积-％、优选约0.10体积-％至约0.5体积-％、优选约0.15体积-％至约0.25体积-％、优选约0.20体积-％的表面活性剂。在一些实施方案中，这种缓冲溶液含有浓度为约0.05体积-％、约0.10体积-％、约0.15体积-％、约0.20体积-％、约0.25体积-％、约0.30体积-％、约0.35体积-％、约0.40体积-％、约0.45体积-％、约0.50体积-％、约0.55体积-％、约0.60体积-％、约0.65体积-％、约0.70体积-％、约0.75体积-％、约0.80体积-％、约0.85体积-％、约0.90体积-％、约0.95体积-％或约1.0体积-％的表面活性剂。在一个实施方案中，用于洗涤肉毒杆菌毒素分子通过第四色谱柱的固定相的缓冲溶液包含浓度为约0.20体积％的聚山梨酯20。
142.在一些实施方案中，通过a
280
监测通过该柱的溶液中的游离肉毒杆菌毒素分子的存在。在一个实施方案中，将a
280
峰(表明存在游离肉毒杆菌毒素分子)作为单一级分收集以产生第三含毒素洗脱液130。
143.在一些实施方案中，可以在第三含毒素洗脱液130从第四色谱柱洗脱出来时将其收集，并且在随后的工艺步骤中对其进行稀释或进一步纯化，而不进行沉淀或冻干肉毒杆菌毒素蛋白。在一些实施方案中，第三含毒素洗脱液130可在大约2-8℃下储存直到纯化后处理(post-purification processing)。在一些实施方案中，第三含毒素洗脱液130可被稀释、过滤和分配以提供产物毒素溶液134。
144.稀释、过滤和分配
145.在一些实施方案中，方法100进一步包括稀释、过滤和分配132第三含毒素洗脱液130以提供产物毒素溶液134。在一些实施方案中，可以使用任何合适的缓冲溶液将第三含毒素洗脱液130稀释至最终浓度。在一些实施方案中，稀释缓冲溶液的组成可以与第四色谱分离128中使用的洗涤缓冲液大致相同。例如，稀释缓冲溶液可包含ph为小于约7、优选约5至约7、优选约6至约7、优选约6.6至约6.9的乙酸-乙酸盐缓冲液。在一些实施方案中，这种缓冲溶液的ph为约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9或约7.0。
146.方法100还可包括过滤第三含毒素洗脱液130(或其稀释形式)以减少生物负荷并提供产物毒素溶液134。过滤第三含毒素洗脱液130可包括任何合适的过滤技术(例如渗滤、切向流微滤、切向流超滤、中空纤维过滤等)。在一些实施方案中，过滤器的孔径可以为0.1μm至10μm之间(例如，大约0.2μm)。
147.产物毒素溶液134可以分配到容器(例如低温小瓶)中，这些容器可以在保持其中肉毒杆菌毒素蛋白效力的条件下运输和储存。例如，产物毒素溶液134可以被分配、运输和/或储存在预冷的储存容器中(例如，在包含在预冷的铝块中的小瓶中)。
148.在一些实施方案中，分配产物毒素溶液134可以包括将产物毒素溶液从无菌容器(例如，无菌一次性袋子)泵送到初级储存容器(例如，低温小瓶)中。在一些实施方案中，初级储存容器可以被预冷并保持在适当的温度(例如，处于或低于0℃)，例如，通过在预冷的铝块中储存、运输和冷冻初级储存容器。这使产物毒素溶液134保持在肉毒杆菌毒素分子稳定并保持其神经毒性的温度下。还可以消除对冻干产物毒素溶液134的需要。产物毒素溶液134可以另外储存在约0℃或低于0℃、优选约-70℃或更低的温度下。
149.工艺产率
150.可以计算总工艺产率和每个步骤的产率以评价纯化工艺。可以从每个级分获得的毒素浓度计算产率。可根据以下公式计算每个工艺步骤的产率(即“工艺步骤产率”)：
[0151][0152]
其中c为毒素浓度，v是体积，下标级分表示来自当前工艺步骤的毒素浓度或体积，下标前一级分表示来自前一工艺步骤的毒素浓度或体积。例如，如果一个工艺步骤在1000ml的体积中产生1.0μg/ml的毒素，而前一工艺步骤在4000ml的体积中产生了0.5μg/ml的毒素，则工艺步骤产率为50％。([1.0μg/ml
×
1000ml]/[0.5μg/ml
×
4000ml])
×
100＝
50％。)
[0153]
可以使用以下公式计算总产率：
[0154][0155]
其中c是浓度，v是体积，下标ds表示药物物质(即产物毒素溶液)，下标ks表示收获时的培养物，并通过0.2-μm过滤器过滤去除细胞。例如，如果ds在100ml的体积中含有50μg/ml的毒素，而收获时的培养物在5000ml的体积中含有5μg/ml的毒素，则总产率为20％。([50μg/ml
×
100ml]/[5μg/ml
×
5000ml])
×
100＝20％。)。
[0156]
在一些实施方案中，总产率为至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、或介于其间的任何范围或值。在一些实施方案中，总产率为约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％或约40％，或介于其间的任何值。
[0157]
在一个实施方案中，药物物质的纯度可以通过sds-page和/或hplc-sec确定。在一个实施方案中，从根据本公开的方法获得的药物物质的纯度为至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％(以及介于其间的范围)。在一个实施方案中，药物物质的纯度可以为约96.0％、约96.5％、约97.0％、约97.5％、约98.0％、约98.5％、约99.0％、约99.5％或约100.0％的纯度，或其间的任何值。
实施例
[0158]
实施例1：纯化肉毒杆菌毒素的四柱色谱方法
[0159]
举例来说，可以根据以下描述进行所述方法的一个实施方案，其中从包含肉毒梭菌细胞和肉毒杆菌毒素a1蛋白分子和毒素复合物且实质上不含、基本上不含或不含动物产品的发酵培养基中回收肉毒杆菌毒素a1(～150kda)。在共同未决的美国临时专利申请号62/951,549中描述了一种这样的apf发酵培养基。其中的肉毒杆菌毒素根据下文更详细描述的工艺步骤进行过滤和纯化，以在不使用任何沉淀或冻干步骤的情况下产生包含肉毒杆菌毒素蛋白分子的产物毒素溶液，其不含、基本上不含或实质上不含毒素复合物。
[0160]
缓冲液制备
[0161]
如表1所示，在所述方法的本实施方案中可以使用多种不同的缓冲溶液。在一个实施方案中，使缓冲液通过0.2-μm过滤器(以减少生物负荷)进入无菌一次性袋子。断开使用的过滤器，将含有缓冲液的袋子储存在室温下直至使用。
[0162]
表1.在bont/al纯化过程中使用的缓冲溶液
[0163][0164]
在表1中，缓冲液1和2用于平衡第一色谱柱；缓冲液3用于调节澄清的培养物以进行柱色谱；缓冲液4用于以流通模式洗涤肉毒杆菌毒素复合物通过第一柱；缓冲液5和6用于平衡第二层色谱柱；缓冲液7用于调节来自第一色谱分离的含毒素级分，以进行第二色谱分离；缓冲液8用于洗涤大量杂质(例如蛋白)通过第二色谱柱；缓冲液9用于从第二色谱柱洗脱结合的肉毒杆菌毒素复合物；缓冲液10用于从肉毒杆菌毒素蛋白分子中分离nth和/或ntnh蛋白(即，调节来自第二色谱分离的第一含毒素洗脱液以进行第三色谱分离)；缓冲液11和12用于平衡第三色谱柱；缓冲液13用于洗去第三色谱柱上的杂质；缓冲液14用于将结合的肉毒杆菌毒素蛋白分子从第三色谱柱洗脱；缓冲液15用于平衡第四色谱柱；缓冲液16用于清洗肉毒杆菌毒素分子通过第四色谱柱；缓冲液17用于将来自第四色谱分离的含毒素洗脱液稀释至其最终浓度，然后将其分配到初级储存容器中以提供产物毒素溶液。
[0165]
过滤
[0166]
从共同未决的美国临时专利申请号62/951,549中描述的apf生产过程中获得肉毒梭菌发酵培养基。直接在收获后，使用大约280ml缓冲溶液(1m乙酸钠，4m nacl，ph 5.5)稀释培养物(大约5l)，以便在即将过滤前进行ph调节。通过使用0.2-μm中空纤维过滤器通过切向流过滤的微滤(“过滤1”)过滤稀释的溶液以分离孢子以及完整的和裂解的肉毒梭菌细
胞，提供澄清的培养物。对澄清的培养物进行取样以对肉毒杆菌不存在进行过程中控制。然后通过使用50kda中空纤维过滤器通过切向流超滤(“过滤2”)去除发酵培养基残留物(例如，蛋白、碳水化合物等)来纯化澄清的培养物。然后使澄清的培养物进行在磷酸钠缓冲液(ph为约6.1)中的缓冲液交换，以调节澄清的培养物以进行柱色谱。这种和其他合适的蛋白过滤方法是本领域已知的。参见例如，munir cheryan,ultrafiltration and microfiltration handbook(第2版，1998)。
[0167]
纯化
[0168]
开发了一种用于在无需使用任何沉淀、冻干步骤或离心步骤的情况下纯化bont/al蛋白分子(～150kda)的四柱色谱方法。该方法提供了不含、基本上不含或实质上不含肉毒杆菌毒素复合物和/或动物产品的产物毒素溶液。这提高了产量并消除了与重构程序相关的最终使用者错误，已知这些错误会降低肉毒杆菌毒素药物组合物的效力。
[0169]
该方法通过最初的步骤利用肉毒杆菌毒素复合物来保护毒素，同时去除蛋白酶和其他大量污染蛋白。第一个色谱步骤是阴离子交换色谱，在收获时去除培养基中的大多数核酸，否则会干扰下游色谱步骤。这抑制了纯化过程期间肉毒杆菌毒素分子的变性。然后该方法将肉毒杆菌毒素蛋白分子与其缔合的nth和/或ntnh蛋白分离以提供包含纯肉毒杆菌毒素分子(～150kda)并且不含、基本上不含或实质上不含肉毒杆菌毒素复合物的产物毒素溶液。
[0170]
此外，该方法中使用的所有色谱步骤均设计为在一次性色谱柱上进行，这些色谱柱在一次纯化程序后可丢弃。这消除了多次使用色谱系统遇到的昂贵且耗时的色谱柱再生步骤。整个过程使用封闭系统进行，使用一次性袋子、管道、过滤器和色谱柱。此外，避免了开放式处理步骤，因为工艺流体优选地保持在袋子、管道、过滤器或柱内，这保护产物毒素溶液免受污染并且保护操作者免于暴露于毒素。
[0171]
表2总结了根据本公开的用于bont/al的四柱色谱纯化方法。该方法包括以下步骤：
[0172]
(1)使用磷酸钠缓冲液(ph 6.1)以流通模式将澄清的培养物直接注入到q sepharose ff柱(2.5l，装在直径为80mm和高度为500mm的柱中)以使肉毒杆菌毒素复合物与核酸分离。在这一步骤中，肉毒杆菌毒素复合物不与固定相结合，而是在含毒素级分中流动通过色谱柱。
[0173]
(2)来自q sepharose ff柱(100ml，装在直径为50mm和高度为50mm的柱中)的含毒素级分在乙酸钠缓冲液(ph 4.5)中进行调节，并使用乙酸钠缓冲液(ph 4.5)通过sp sepharose ff柱。在这一步骤中，肉毒杆菌毒素复合物被吸附到固定相上，而大量杂质(例如，其他蛋白)则被洗涤通过色谱柱。使用含有nacl的乙酸钠缓冲液(ph 4.5)洗脱与柱结合的毒素复合物，并将其收集在第一含毒素洗脱液中。
[0174]
(3)过滤第一含毒素洗脱液以去除发酵培养基残留物，并使用30kda过滤器通过切向流超滤(“过滤3”)在合适的缓冲溶液中进行调节，以进行缓冲液交换(tris-hcl缓冲液，ph 8.0)，以使毒素复合物中的肉毒杆菌毒素分子与nth和/或ntnh蛋白解离。然后使截留物通过q sepharose ff柱(2ml，装在直径为5mm和高度为100mm的柱中)以将游离肉毒杆菌毒素蛋白与nth和/或ntnh蛋白分离。在这一步骤中，肉毒杆菌毒素分子吸附到固定相，而nth和/或ntnh蛋白(和其他大量杂质)在一定程度上被洗涤通过色谱柱(但是主要被吸附到固
定相上，强度甚至比肉毒杆菌毒素分子更高)。使用含有nacl的tris-hcl缓冲液(ph 8.0)洗脱肉毒杆菌毒素蛋白，并将其收集在第二含毒素洗脱液中。
[0175]
(4)将第二含毒素洗脱液直接注入到superdex 200凝胶过滤柱(320ml，装在直径为25mm和高度为600mm的柱中)上以进行最终精制(即去除聚集体)。在这一步骤中，将柱用含有50mm乙酸na、370mm nacl、0.2％聚山梨酯20、13mm na2hpo4和17mm naoh的缓冲液(ph 6.6-6.9)洗涤，并将纯化的肉毒杆菌毒素蛋白收集在第三含毒素洗脱液中。
[0176]
表2.bont/al纯化过程中的柱色谱步骤总结
[0177][0178]
上面讨论的每个柱色谱步骤都可能涉及在进行色谱分离之前的原位清洁(clean-in-place)程序和其他柱制备步骤。柱制备和操作程序在本领域中是众所周知的。一般参见，例如，ozutsumi等人，49appl.envtl.microbiol.939(1985)；ge healthcare,strategiesforproteinpurification handbook(2010)；schmidt等人，156 anal.biochem.213(1986)；simpson等人，165 methods enzymol.76(1988)；zhou等人，34 biochem.15175(1995)；kannan等人，15mov.disord.20(2000)；wang y-c,dermatol.las facial cosmet.surg.58(2002)；johnson等人，32 protein expr.&purif.1(2003)；us 2003/0008367a1。
[0179]
稀释/过滤/分配
[0180]
将纯化的肉毒杆菌毒素蛋白在合适的缓冲溶液(例如，50mm乙酸钠、0.2％聚山梨酯20、370mm nacl、13mm磷酸钠、17mm naoh)中稀释至最终浓度，并在平台摇杆上轻轻混合约30分钟。使用0.2μm过滤器将稀释的产品过滤到无菌一次性袋中，并使用分配泵和针头以0.4ml等分试样分配到1.8-ml低温小瓶中。然后使用储存在《-70℃的预冷铝块快速冷冻样品。根据该方法制备的用于储存的最终溶液在下文中称为“药物物质”(或“ds”)。
[0181]
根据上述步骤制备了三个不同的药物物质批次：#16852、#17043和#19139。然后测试ds批次的外观、效力、比活性和总蛋白浓度，如以下实施例中所述。
[0182]
实施例2：外观测试
[0183]
对透明度和颜色进行测试以验证药物物质是透明的且没有颜色，因为溶液中的乳光可以指示蛋白的聚集或沉淀。该方法是一种目视方法，其基于欧洲药典2.2.1标题为“液体的透明度和乳光度”和欧洲药典2.2.2标题为“液体的着色度”，但修改之处为使用药物物质的小瓶和体积而不是药典方法中指定的容器和体积。使用水作为参考溶液。
[0184]
通过该方法，根据实施例1制备的药物物质批次均为澄清且无色的溶液，表明没有可检测到的肉毒杆菌毒素蛋白分子的聚集或沉淀。
[0185]
实施例3：效力
[0186]
使用小鼠ld
50
测定来确定从实施例1获得的纯化的药物物质的效力。这是一种绝对
测定，定量测量测试样品内的效力。使用明胶-磷酸盐缓冲液作为稀释剂，并建立了以目标ld
50
值为中心的11个剂量组。效力在每剂3.0
–
0.4单位之间的剂量组以大约0.0899对数间隔等距分布。记录注入后72小时的死亡数并使用spearman-karber方法计算ld
50
。使用spearman-karber计算作为数学手段来确定死亡对数稀释曲线的中点(ld
50
)。纯化的药物物质的效力以ld
50
单位/ml表示。参见，例如m.a.ramakrishnan,determination of50％endpoint titer using a simple formula,5 world j.virol.85
–
86(2016)；还参见g.162 pathol.u pharmakol.480
–
83(131)；c.spearman,the method of“right and wrong cases”(constant stimuli)without gauss’s formula,2 br.j.psychol.227
–
42(1908)。
[0187]
纯化的药物物质批次#16852、#17043#19139的效力值分别为11x106ld
50
单位/ml、23x106ld
50
单位/ml和19x106ld
50
单位/ml。这些效力值，结合所生产的ds的体积，证实了工艺产率足以从ds批次生产大量药物产品剂量，这对于商业ds生产是期望的。
[0188]
实施例4：总蛋白浓度
[0189]
根据实施例1制备的药物物质的总蛋白浓度是根据二辛可宁酸(bca)方法测定的，因为它具有足够高的灵敏度来测定根据实施例1制备的典型药物物质批次中的蛋白浓度。参见欧洲药典2.5.33方法4；还参见usp《507》方法ii。
[0190]
使用micro bca蛋白测定试剂盒来测定总蛋白浓度，并且使用牛血清白蛋白的标准曲线用于从测得的吸光度计算蛋白浓度。结果报告为二重复制样品测量的平均值。
[0191]
对于纯化的药物物质批次#16852、#17043和#19139，总蛋白浓度经测定分别为59.4μg/ml、107.0μg/ml和91.4μg/ml。ds批次获得的这些蛋白浓度值足够高，以确保释放和表征的分析方法是精确和准确的。
[0192]
实施例5：比活性
[0193]
对于根据实施例1生产的药物物质，比活性由通过ld
50
测定(实施例3)获得的药物物质的效力值(以单位/ml计)和药物物质的总蛋白浓度(实施例4)计算，以mg/ml计。根据以下公式计算比活性：
[0194][0195]
对于纯化的药物物质批次#16852、#17043和#19139，比活性经测定分别为1.9x108u/mg、2.2x108u/mg和2.1x108u/mg。这证实了ds的高纯度，这表明该方法适用于商业生产高度纯化且完全活性的无复合物肉毒杆菌毒素。
[0196]
实施例6：蛋白相关杂质
[0197]
用于测定根据实施例1制备的药物物质中蛋白相关杂质的方法是基于欧洲药典2.2.31电泳，标题为“十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)——均匀百分比凝胶(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(sds-page)
–
uniform percentage gels)”中描述的原理。在这一方法中，sds-page与胶体考马斯蓝染色结合使用。通过稀释样品制备标准曲线；对非还原和还原样品均进行分析。通过将杂质条带的条带强度与标准曲线相关联，使用密度测量法对杂质进行定量。杂质结果以装载在凝胶
上的总蛋白量的百分比表示。
[0198]
图2显示了使用sds-page和胶体考马斯蓝染色获得的根据实施例1制备的ds批次#17043的纯度分析结果。从左到右的泳道是：1-5：来自批次#17043的标准曲线的非还原样品(1.2
–
4.0μg/ml)；6-7：非还原批次#17043重复1和2(140μg/ml)；8：分子量标志物；9-10：还原批次#17043重复1和2(140μg/ml)。对于根据实施例1制备的所有三个药物物质批次，蛋白相关杂质都《6.0％，特别是批次#16852没有显示出可检测的杂质。
[0199]
实施例7：残留核酸
[0200]
进行残留核酸的限度试验以检测根据实施例1制备的药物物质中的rna和/或dna。该方法使用市售的ribogreen rna定量试剂盒。ribogreen结合核酸，产生与样品中核酸的量成比例的荧光信号。由于dna在结合ribogreen时会产生比rna更高的信号，因此使用含有rna的标准品将高估含dna的样品的核酸含量，导致报告的核酸值是样品中核酸的最大量。
[0201]
将纯化的药物物质批次#16852、#17043和#19139与参考标准曲线(最低标准样品为0.15μg/ml rna)进行比较。所有三个批次显示出的样品荧光均低于标准，对应于≤0.15μg/ml的残留核酸(数据未显示)。
[0202]
实施例8：蛋白谱
[0203]
用于确定蛋白谱的方法是基于欧洲药典2.2.31电泳，标题为“十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)——均匀百分比凝胶(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(sds-page)
–
uniform percentage gels)”中描述的原理。在4-12％bis-tris凝胶上分析纯化的药物物质批次#16852、#17043和#19139以分离组成蛋白，并使用银染(silverquest染色试剂盒)进行染色。图3显示还原(泳道6-9)和非还原(泳道2-5)药物物质样品与分子量标志物(1和10)相比的sds-page结果。泳道3和7对应于批次#16852；泳道4和8对应于批次#17043；并且泳道5和9对应于批号#19139。(泳道2和6显示了根据四柱色谱方法制备的药物物质批次(#1014997)的结果，使用的工艺参数略有不同(例如，第一色谱分离中缓冲液的ph值略高))。
[0204]
纯化的药物物质批次#1014997、#16852、#17043和#19139显示出相当的蛋白谱，具有约150kda的强条带(分别为泳道2、3、4和5)，表明主要蛋白组分是游离bont/a。泳道6、7、8和9中的还原样品显示约100kda和150kda的两个主要蛋白组分，分别对应于bont/a的重链和轻链。
[0205]
实施例9：药物物质的分子量分布
[0206]
使用尺寸排阻色谱(sec)监测药物物质组分的分子量尺寸分布。该方法分析样品中的主要组分，包括产物毒素和可能是工艺或产品相关的任何高分子量和低分子量物质(分别为hmw和lmw)。使用sec柱进行分离。流动相是缓冲液17(上表1)，补充有0.4m l-精氨酸，ph介于6.6-6.9之间。将l-精氨酸添加到缓冲液17中以使分离的蛋白与柱基质、过滤器和色谱系统的其他润湿部分之间的二次相互作用最小化。使用0.25ml/min的流速，在没有任何预处理或稀释的情况下分析二重复制样品(来自一瓶药物物质)。检测在280nm下进行。对所得色谱图进行积分，并对每个药物物质批次报告主要成分所获得的平均面积百分比(面积％)。
[0207]
图4显示了根据实施例1制备的ds批次#17043的分子量分布。主峰对应于游离产物毒素分子。纯化的药物物质批次#16852、#17043和#19139均显示至少96％的主要组分
(bont/a)。这一数据证实了根据本公开制备的产物毒素溶液中的肉毒杆菌毒素的高纯度。
[0208]
实施例10：工艺步骤产率
[0209]
bont/a的工艺步骤产率被确定为纯化过程中每个步骤的稳健性的指标。为了计算工艺步骤产率，对每个级分进行称重以确定体积。为了测定每个级分中的bont/a的浓度，使用了bont/a特异性elisa。
[0210]
elisa方案是一种间接夹心elisa，它是基于usp《1103》“免疫试验方法——酶联免疫吸附测定”中描述的原理和一般方法。elisa方法是基于使用两种不同类型的bont/a特异性多克隆抗体的bont/a免疫结合和检测。
[0211]
通过在pbs-吐温溶液(0.05％吐温-20)中将bont/a稀释至3-28ng/ml的浓度范围，制备一系列基于商业bont/a毒素的蛋白标准稀释液。将在pbs-吐温中稀释至蛋白标准稀释液范围内的样品一式三份添加到包被有多克隆抗-bont/a抗体的微孔板孔中。孵育导致抗体识别和bont/a抗原与孔的结合。每次孵育后都使用pbs-吐温溶液进行自动洗涤步骤。
[0212]
通过结合另一种类型的多克隆抗bont/a抗体，导致形成夹心复合物，来进行初步检测。然后加入与辣根过氧化物酶(hrp)偶联的二抗。它与一抗的结合允许检测夹心复合物内的bont/a。然后将3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)底物添加到样品孔中。hrp将tmb底物转化为产生蓝色反应产物。添加终止溶液，停止tmb转化并开始将剩余tmb的颜色转化为黄色。用读板器在450nm下检测每个微孔板孔中的吸光度，测量的吸光度与孔中bont/a的量成正比。通过与标准曲线比较来计算样品吸光度值，该标准曲线是基于来自bont/a标准稀释液的吸光度值。结果报告为平均值，以μg/ml计。然后根据上面的方程式1计算工艺步骤产率。
[0213]
图5显示了批次#16852、#17043和#19139的纯化过程中每个步骤的工艺步骤产率的平均值。标有“ds”的条形图显示了最后两个色谱步骤的总产率，因为它们是相互连接的，并且在它们之间不进行采样。数据显示，工艺步骤的产率在约100％到50％之间变化。
[0214]
实施例11：累积工艺步骤产率
[0215]
通过以下公式计算每个个体工艺步骤的累积工艺步骤产率：
[0216][0217]
其中c是毒素浓度，v是体积，下标级分表示来自当前工艺步骤的毒素浓度或体积，且下标ks表示收获时的培养物，其中通过0.2-μm过滤器过滤除去细胞。收获时培养物(ks)的累积工艺步骤产率设置为100％。
[0218]
图6显示了纯化药物物质批次#16852、#17043和#19139的纯化过程中每个步骤的平均累积工艺步骤产率。标有“ds”的条形图显示了最后两个色谱步骤的总产率，因为它们是相互连接的，并且在它们之间不进行采样。
[0219]
实施例12：总产率
[0220]
与收获时的培养物(“ks”)相比，产物毒素溶液(或“ds”)中的bont/a的总产率被确定为整个纯化过程的稳健性的指标。为了计算工艺产率，对ks和ds级分进行称重以确定体积。使用bont/a特异性elisa测定ks和ds中的bont/a浓度。根据上面的方程式2计算总产率。
[0221]
对于纯化的药物物质批次#16852、#17043和#19139，总产率经确定为在13％至29％之间(数据未显示)。
[0222]
实施例13：纯度改善因子(跨步骤)
[0223]
在每个个体工艺步骤中bont/a的纯度改善因子被确定为每个步骤(以及整个纯化过程)去除不需要的蛋白组分(工艺和产品相关的)的效率的指标。为了计算跨步骤的纯度改善因子，使用bont/a特异性elisa分析每个级分的毒素浓度，以及通过micro bca方法(实施例4)分析总蛋白浓度。根据以下公式计算跨步骤的纯度改善：
[0224][0225]
其中toxc是毒素浓度，totpc是总蛋白浓度，下标级分表示来自当前工艺步骤的毒素浓度或总蛋白浓度，下标前一级分表示来自前一工艺步骤的毒素浓度或总蛋白浓度。
[0226]
图7显示了纯化的药物物质批次#16852、#17043和#19139的跨步骤纯度改善因子的平均值。标有“ds”的条形图显示了最后两个色谱步骤的总纯度改善因子，因为它们是相互连接的，并且在它们之间不进行采样。从数据中可以清楚地看出，第二色谱柱是对毒素纯化贡献最大的步骤。然而，所有步骤(除了过滤1，其去除完整的或裂解的细胞和细胞组分)都有助于相对于总蛋白浓度对毒素的整体纯化。
[0227]
实施例14：累积纯度改善因子(跨步骤)
[0228]
如下对每个个体工艺步骤的累积纯度改善因子进行计算：
[0229][0230]
其中toxc是毒素浓度，totpc是总蛋白浓度，下标级分表示来自当前工艺步骤的毒素浓度或总蛋白浓度，下标ks表示收获时培养物的毒素浓度或总蛋白浓度，其中经由通过0.2-μm过滤器过滤去除细胞。将纯化过程的第一个工艺步骤(收获时发酵)设置为纯度改善因子为1。
[0231]
图8显示了纯化的药物物质批次#16852、#17043和#19139的平均跨步骤累积纯度改善因子。标有“ds”的条形图显示了最后两个色谱步骤的总累积纯度改善因子，因为它们是相互连接的，并且在它们之间不进行采样。