纯化肉毒杆菌毒素的方法与流程

技术特征：
1.一种纯化肉毒杆菌毒素的方法，其包括从含毒素溶液中纯化所述毒素，其中该方法不包括沉淀、离心或冻干。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述肉毒杆菌毒素是血清型a。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所获得的纯化的肉毒杆菌毒素不含、基本上不含或实质上不含肉毒杆菌毒素复合物。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所获得的纯化的肉毒杆菌毒素不含、基本上不含或实质上不含动物产品。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所获得的纯化的肉毒杆菌毒素不含、基本上不含或实质上不含人白蛋白。6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述纯化包括过滤步骤，优选切向流过滤步骤。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述过滤步骤使用中空纤维过滤器。8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述纯化包括使第一色谱柱与所述含毒素溶液接触以产生含毒素级分。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述第一色谱柱包括阴离子交换色谱柱。10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述阴离子交换色谱柱包含qsepharose。11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述纯化进一步包括收集所述含毒素级分，其中所述含毒素级分不吸附到第一固定相。12.根据权利要求8-11中任一项所述的方法，其中所述纯化进一步包括使第二色谱柱与所述含毒素级分接触。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述第二色谱柱包括阳离子交换色谱柱。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述阳离子交换色谱柱包含sp sepharose。15.根据权利要求12-14中任一项所述的方法，其进一步包括从所述第二色谱柱洗脱所述肉毒杆菌毒素以产生第一含毒素洗脱液。16.根据权利要求12-15中任一项所述的方法，其还包括过滤所述第一含毒素洗脱液以产生含毒素截留物。17.根据权利要求16所述的方法，其中过滤所述含毒素洗脱液包括缓冲液交换。18.根据权利要求16或17所述的方法，其中过滤所述第一含毒素洗脱液将肉毒杆菌毒素分子与非毒素蛋白分离以产生在所述含毒素截留物中的游离毒素分子。19.根据权利要求16-18中任一项所述的方法，其进一步包括使第三色谱柱与所述含毒素截留物接触。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述第三色谱柱包括第二阴离子交换色谱柱。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述第二阴离子交换色谱柱包含q sepharose。22.根据权利要求19-21中任一项所述的方法，其进一步包括从所述第三色谱柱洗脱所述肉毒杆菌毒素以产生第二含毒素洗脱液。23.根据权利要求19-22中任一项所述的方法，其进一步包括使第四色谱柱与所述第二含毒素洗脱液接触。24.根据权利要求23所述的方法，其中所述第四色谱柱包括尺寸排阻色谱柱。25.根据权利要求24所述的方法，其中所述尺寸排阻色谱柱包括凝胶过滤色谱柱。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述凝胶过滤色谱柱包含superdex 200。27.根据权利要求23-26中任一项所述的方法，其进一步包括从所述第四色谱柱洗脱所述肉毒杆菌毒素以产生纯化的肉毒杆菌毒素。28.一种从包含肉毒杆菌毒素的溶液中纯化所述毒素的方法，其包括：(a)过滤包含所述毒素的溶液；(b)使第一色谱柱与来自(a)的包含毒素的滤过溶液接触，其中所述第一色谱柱是离子交换色谱柱；(c)收集含毒素级分，其中所述含毒素级分流动通过所述第一色谱柱而没有吸附到固定相上；(d)使第二色谱柱与所述含毒素级分接触，其中所述第二色谱柱是离子交换色谱柱；(e)从所述第二色谱柱洗脱肉毒杆菌毒素以产生第一含毒素洗脱液；(f)过滤所述第一含毒素洗脱液以产生含毒素截留物；(g)使第三色谱柱与来自过滤(f)的含毒素截留物接触，其中所述第三色谱柱是离子交换柱；(h)从所述第三色谱柱洗脱肉毒杆菌毒素以产生第二含毒素洗脱液；(i)使第四色谱柱与所述第二含毒素洗脱液接触，其中所述第四色谱柱是尺寸排阻色谱柱；(j)从所述第四色谱柱洗脱肉毒杆菌毒素，从而产生纯化的肉毒杆菌毒素，其中所述方法不包括使肉毒杆菌毒素沉淀、离心或冻干。29.根据权利要求28所述的方法，其中所述肉毒杆菌毒素包括肉毒杆菌神经毒素血清型a。30.根据权利要求28或29所述的方法，其中所获得的纯化的肉毒杆菌毒素不含、基本上不含或实质上不含肉毒杆菌毒素复合物。31.根据权利要求28-30中任一项所述的方法，其中所获得的纯化的肉毒杆菌毒素不含、基本上不含或实质上不含动物产品。32.根据权利要求28-31中任一项所述的方法，其中所述纯化的肉毒杆菌毒素不含、基本上不含或实质上不含人白蛋白。33.根据权利要求28-32中任一项所述的方法，其中所述第一色谱柱包括阴离子交换色谱柱。34.根据权利要求28-33中任一项所述的方法，其中所述第一色谱柱包含q sepharose。35.根据权利要求28-34中任一项所述的方法，其中所述第二色谱柱包括阳离子交换色谱柱。36.根据权利要求28-35中任一项所述的方法，其中所述第二色谱柱包含sp sepharose。37.根据权利要求28-36中任一项所述的方法，其中所述第一色谱柱包括阴离子交换色谱柱并且所述第二色谱柱包括阳离子交换色谱柱。38.根据权利要求28-37中任一项所述的方法，其中所述第一色谱柱包含q sepharose并且所述第二色谱柱包含sp sepharose。39.根据权利要求28-38中任一项所述的方法，其中所述第三色谱柱包括阴离子交换色
谱柱。40.根据权利要求28-39中任一项所述的方法，其中所述第三色谱柱包含q sepharose。41.根据权利要求28-40中任一项所述的方法，其中所述第四色谱柱包括凝胶过滤柱。42.根据权利要求28-41中任一项所述的方法，其中所述第四色谱柱包含superdex 200。43.根据权利要求28-42中任一项所述的方法，其中所述第三色谱柱包括阴离子交换色谱柱并且所述第四色谱柱包括凝胶过滤色谱柱。44.根据权利要求28-43中任一项所述的方法，其中所述第三色谱柱包含q sepharose并且所述第四色谱柱包含superdex 200。45.根据权利要求28-44中任一项所述的方法，其中将所述第二含毒素洗脱液直接注入到所述第四色谱柱上。46.根据权利要求28-45中任一项所述的方法，其中所述第三色谱柱和所述第四色谱柱相互连接。47.根据权利要求28-46中任一项所述的方法，其中所述第一色谱柱为阴离子交换色谱柱，所述第二色谱柱为阳离子交换色谱柱，所述第三色谱柱为第二阴离子交换色谱柱，并且所述第四色谱柱是凝胶过滤色谱柱。48.根据权利要求28-47中任一项所述的方法，其中所述第一色谱柱包含q sepharose，所述第二色谱柱包含sp sepharose，所述第三色谱柱包含q sepharose，并且所述第四色谱柱包含superdex 200。49.根据权利要求28-48中任一项所述的方法，其中所述第一、第二、第三和第四色谱柱是一次性色谱系统。50.根据权利要求28-49中任一项所述的方法，其中过滤(f)使肉毒杆菌毒素蛋白分子与非毒素蛋白解离以产生游离毒素分子。51.根据权利要求28-50中任一项所述的方法，其中过滤(f)包括缓冲液交换。52.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述包含肉毒杆菌毒素的溶液是不含动物产品、基本上不含动物产品或实质上不含动物产品的发酵培养基。53.根据权利要求28-51中任一项所述的方法，其中所述包含肉毒杆菌毒素的溶液是不含动物产品、基本上不含动物产品或实质上不含动物产品的发酵培养基。54.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其进一步包括使肉毒杆菌毒素与缓冲溶液接触，其中所述缓冲溶液已进行过滤以减少生物负荷。55.根据权利要求28-51中任一项所述的方法，其进一步包括使肉毒杆菌毒素与缓冲溶液接触，其中所述缓冲溶液已进行过滤以减少生物负荷。56.根据权利要求1至27中任一项所述的方法生产的纯化的肉毒杆菌毒素。57.根据权利要求56所述的纯化的肉毒杆菌毒素，其中所述肉毒杆菌毒素是血清型a。58.根据权利要求56或57所述的纯化的肉毒杆菌毒素，其中所述纯化的肉毒杆菌毒素不含、基本上不含或实质上不含毒素复合物。59.根据权利要求56-58中任一项所述的纯化的肉毒杆菌毒素，其中所述纯化的肉毒杆菌毒素不含、基本上不含或实质上不含动物产品。60.根据权利要求56-59中任一项所述的纯化的肉毒杆菌毒素，其中所述纯化的肉毒杆
菌毒素不含、基本上不含或实质上不含人白蛋白。61.根据权利要求28-51中任一项所述的方法生产的纯化的肉毒杆菌毒素。62.根据权利要求61所述的纯化的肉毒杆菌毒素，其中所述毒素是血清型a。63.根据权利要求61或62所述的纯化的肉毒杆菌毒素，其中所述纯化的肉毒杆菌毒素不含、基本上不含或实质上不含毒素复合物。64.根据权利要求61至63中任一项所述的纯化的肉毒杆菌毒素，其中所述纯化的肉毒杆菌毒素不含、基本上不含或实质上不含动物产品。65.根据权利要求61-64中任一项所述的纯化的肉毒杆菌毒素，其中所述纯化的肉毒杆菌毒素不含、基本上不含或实质上不含人白蛋白。66.一种包含在缓冲液中的纯化的肉毒杆菌毒素的组合物，所述缓冲液包含磷酸盐。67.根据权利要求66所述的组合物，其中所述缓冲液还包含乙酸盐。68.根据权利要求66或67所述的组合物，其中所述缓冲液还包含至少一种氯离子源。69.根据权利要求68所述的组合物，其中所述至少一种氯离子源是氯化钠。70.根据权利要求66-69中任一项所述的组合物，其中所述缓冲液还包含至少一种表面活性剂。71.根据权利要求70所述的组合物，其中所述至少一种表面活性剂包括聚山梨酯20。72.根据权利要求66-71中任一项所述的组合物，其中所述肉毒杆菌毒素是肉毒杆菌神经毒素血清型a。73.根据权利要求66-72中任一项所述的组合物，其中所述组合物不含、基本上不含或实质上不含肉毒杆菌毒素复合物。74.根据权利要求66-73中任一项所述的组合物，其中所述组合物不含、基本上不含或实质上不含动物产品。75.根据权利要求66-74中任一项所述的组合物，其中所述组合物不含、基本上不含或实质上不含人白蛋白。76.根据权利要求66-75中任一项所述的组合物，其中所述组合物具有约6.6至6.9之间的ph。

技术总结
本技术涉及用于纯化获自细胞培养物的肉毒杆菌毒素组合物的商业规模方法。根据本公开的纯化方法基于一系列过滤和色谱分离步骤，产生高纯度肉毒杆菌毒素组合物，该组合物包含在溶液中的肉毒杆菌毒素蛋白分子(～150kDa)，其不含、基本上不含或实质上不含肉毒杆菌毒素复合物和动物产品，并且无需使肉毒杆菌毒素蛋白分子沉淀或冻干。根据本公开的纯化方法不使用沉淀、冻干或离心步骤，允许生产高纯度、高活性、游离的在溶液中的肉毒杆菌毒素蛋白分子(～150kDa)，且无需最终使用者重构。且无需最终使用者重构。且无需最终使用者重构。


技术研发人员：U
受保护的技术使用者：益普生生物制药有限公司
技术研发日：2020.12.19
技术公布日：2022/8/26