抗LILRB1抗体及其用途的制作方法

抗lilrb1抗体及其用途
技术领域
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求向韩国知识产权局于2019年12月23日提交的kr 10-2019-0173414和于2020年5月22日提交的kr 10-2020-0061907的权益，其全部公开内容通过引用并入本文。
3.本公开涉及一种抗lilrb1抗体及其用途。更具体地，提供了一种抗lilrb1抗体或其抗原结合片段，及其用于癌症治疗的用途。


背景技术：

4.白细胞免疫球蛋白样受体亚家族b成员1(lilrb1；也称为ilt2、cd85j或lir-1)是一种抑制性受体，其在细胞例如b细胞、t细胞、nk细胞、树突细胞、巨噬细胞和其他免疫细胞中表达。lilrb1通过结合经典和非经典mhc i类而参与抑制免疫细胞活性的信号转导机制。
5.同时，据报道，各种癌细胞过表达mhc i类如hla-g以进行免疫逃逸。预期阻断lilrb1与mhc i类的结合允许恢复受抑制的免疫细胞活性，从而表现出抗癌作用。
6.因此，需要开发与lilrb1结合并阻断lilrb1与mhc i类的结合和/或lilrb1与mhc i类之间的相互作用的新型药剂。


技术实现要素：

7.技术问题
8.本公开提供了与lilrb1结合、作用于表达lilrb1的免疫细胞、调节免疫细胞的活性并表现出抗癌作用的抗体，及其用于癌症治疗的用途。
9.一个实施方式提供了一种与lilrb1结合的抗lilrb1抗体或其抗原结合片段。所述抗lilrb1抗体或其抗原结合片段可具有阻断lilrb1与mhc i类的结合和/或阻断lilrb1与mhc i类之间的相互作用的活性。另外，所述抗lilrb1抗体或其抗原结合片段可以具有抑制癌细胞免疫逃逸的活性。此外，所述抗lilrb1抗体或其抗原结合片段可以具有抗癌作用。所述抗癌作用可以针对在细胞表面上表达或过表达mhc i类的癌细胞。
10.另一个实施方式提供了一种用于治疗和/或预防癌症的药物组合物，所述组合物包含抗lilrb1抗体或其抗原结合片段作为活性成分。
11.另一个实施方式提供了一种用于抑制lilrb1与mhc i类的结合和/或阻断lilrb1与mhc i类之间的相互作用的药物组合物，所述组合物包含抗lilrb1抗体或其抗原结合片段作为活性成分。
12.另一个实施方式提供了一种用于抑制癌细胞免疫逃逸的药物组合物，所述组合物包含抗lilrb1抗体或其抗原结合片段作为活性成分。
13.【技术解决方案】
14.一个实施方式提供了一种与lilrb1结合的抗lilrb1抗体或其抗原结合片段。所述抗lilrb1抗体或其抗原结合片段可以具有阻断lilrb1与mhc i类的结合和/或阻断lilrb1与mhc i类之间的相互作用的活性。另外，所述抗lilrb1抗体或其抗原结合片段可以具有抑
制癌细胞免疫逃逸的活性。另外，所述抗lilrb1抗体或其抗原结合片段可以具有抗癌作用。
15.所述抗lilrb1抗体或其抗原结合片段可以包含以下互补决定区(cdr)：
16.(1)基于根据kabat编号的cdr定义(kabat,e.a.,wu,t.t.,perry,h.,gottesman,k.和foeller,c.(1991)具有免疫意义的蛋白质序列(sequences of proteins of immunological interest),第五版.nih出版号91-3242；http://www.abysis.org/)，
17.cdr-l1，其包含seq id no:1、7、13、19、25、31、37、43、49、55、61、67、73、79、85、91、97、103、109或115的氨基酸序列，
18.cdr-l2，其包含seq id no:2、8、14、20、26、32、38、44、50、56、62、68、74、80、86、92、98、104、110或116的氨基酸序列，
19.cdr-l3，其包含seq id no:3、9、15、21、27、33、39、45、51、57、63、69、75、81、87、93、99、105、111或117的氨基酸序列，
20.cdr-h1，其包含seq id no:4、10、16、22、28、34、40、46、52、58、64、70、76、82、88、94、100、106、112或118的氨基酸序列，
21.cdr-h2，其包含seq id no:5、11、17、23、29、35、41、47、53、59、65、71、77、83、89、95、101、107、113或119的氨基酸序列，和
22.cdr-h3，其包含seq id no:6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72、78、84、90、96、102、108、114或120的氨基酸序列；或
23.(2)基于根据imgt编号的cdr定义(http://www.imgt.org/)，
24.cdr-l1，其包含seq id no:121、126、131、136、141、146、151、156、161、166、171、176、181、186、191、196、201、206、211或216的氨基酸序列，
25.cdr-l2，其包含seq id no:122、127、132、137、142、147、152、157、162、167、172、177、182、187、192、197、202、207、212或217的氨基酸序列，
26.cdr-l3，其包含seq id no:3、9、15、21、27、33、39、45、51、57、63、69、75、81、87、93、99、105、111或117的氨基酸序列，
27.cdr-h1，其包含seq id no:123、128、133、138、143、148、153、158、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、213或218的氨基酸序列，
28.cdr-h2，其包含seq id no:124、129、134、139、144、149、154、159、164、169、174、179、184、189、194、199、204、209、214或219的氨基酸序列，和
29.cdr-h3，其包含seq id no:125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215或220的氨基酸序列。
30.在一个具体实施方式中，可以包含在本公开提供的抗lilrb1抗体或其抗原结合片段中的6个cdr(cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3、cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3)的组合示于表1中：
31.【表1】
32.33.[0034][0035]
在一个实施方式中，所述抗lilrb1抗体或其抗原结合片段可以包含：
[0036]
包含cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3的轻链可变区，和
[0037]
包含cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3的重链可变区，
[0038]
其中所述cdr如上所述。
[0039]
更具体地，所述抗lilrb1抗体或其抗原结合片段可以包含：
[0040]
轻链可变区，其包含seq id no:221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、
241、243、245、247、249、251、253、255、257、259或345的氨基酸序列，和
[0041]
重链可变区，其包含seq id no:222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258或260的氨基酸序列。
[0042]
在一个具体实施方式中，可以包含在本公开提供的抗lilrb1抗体或其抗原结合片段中的轻链可变区和重链可变区的组合示于表2中：
[0043]
【表2】
[0044]
[0045]
[0046][0047]
在本公开中，表述“包含特定氨基酸序列、由特定氨基酸序列组成或由特定氨基酸序列表示的抗体或抗原结合片段(例如，cdr、可变区或重链/轻链)”可以指基本上由以下组成的抗原结合片段：(1)所述特定氨基酸序列或(2)其中在氨基酸序列(1)中引入非显著性突变(例如，氨基酸残基的取代、缺失和/或添加；导致对抗体活性没有影响)的氨基酸序列。
[0048]
当通过表面等离子体共振(spr)测量时，本公开中提供的抗lilrb1抗体或其抗原结合片段可以具有10mm以下、5mm以下、1mm以下、0.5mm以下、0.2mm或0.15mm以下，例如0.001nm至10mm、0.005nm至10mm、0.01nm至10mm、0.05nm至10mm、0.1nm至10mm、0.5nm至10mm、1nm至10mm、0.001nm至5mm、0.005nm至5mm、0.01nm至5mm、0.05nm至5mm、0.1nm至5mm、0.5nm至5mm、1nm至5mm、0.001nm至1mm、0.005nm至1mm、0.01nm至1mm、0.05nm至1mm、0.1nm至1mm、0.5nm至1mm、1nm至1mm、0.001nm至0.5mm、0.005nm至0.5mm、0.01nm至0.5mm、0.05nm至0.5mm、0.1nm至0.5mm、0.5nm至0.5mm、1nm至0.5mm、0.001nm至0.2mm、0.005nm至0.2mm、
0.01nm至0.2mm、0.05nm至0.2mm、0.1nm至0.2mm、0.5nm至0.2mm、1nm至0.2mm、0.001nm至0.15mm、0.005nm至0.15mm、0.01nm至0.15mm、0.05nm至0.15mm、0.1nm至0.15mm、0.5nm至0.15mm或1nm至0.15mm的与lilrb1(例如，人lilrb1)的结合亲和力(kd)。
[0049]
另一个实施方式提供了一种包含抗lilrb1抗体或其抗原结合片段作为活性成分的药物组合物。例如，所述药物组合物可以是用于治疗和/或预防癌症的药物组合物。所述药物组合物可以具有抑制lilrb1与mhc i类的结合和/或lilrb1与mhc i类之间的相互作用的活性。所述癌症可以是与lilrb1和mhc i类之间的相互作用相关的癌症。在一个实施方式中，所述药物组合物可以具有抑制癌细胞免疫逃逸的活性。所述癌细胞可以是在细胞表面上表达或过表达mhc i类的细胞。
[0050]
另一个实施方式提供了一种用于阻断lilrb1与mhc i类的结合和/或lilrb1与mhc i类之间的相互作用的组合物，所述组合物包含抗lilrb1抗体或其抗原结合片段作为活性成分。
[0051]
另一个实施方式提供了一种用于抑制癌细胞免疫逃逸的组合物，所述组合物包含抗lilrb1抗体或其抗原结合片段作为活性成分。
[0052]
另一个实施方式提供了一种治疗和/或预防癌症的方法，所述方法包括向需要治疗和/或预防癌症的受试者(例如，哺乳动物，包括人)施用(口服或肠胃外)药学有效量的抗lilrb1抗体或其抗原结合片段。
[0053]
另一个实施方式提供了一种阻断lilrb1与mhc i类的结合的方法和/或一种阻断lilrb1与mhc i类之间的相互作用的方法，所述方法包括向需要抑制lilrb1与mhc i类的结合和/或lilrb1与mhc i类之间的相互作用的受试者(例如，哺乳动物，包括人)施用(口服或肠胃外)药学有效量的抗lilrb1抗体或其抗原结合片段。
[0054]
另一个实施方式提供了一种抑制癌细胞免疫逃逸的方法，所述方法包括向需要抑制癌细胞免疫逃逸的受试者(例如，哺乳动物，包括人)施用(口服或肠胃外)药学有效量的抗lilrbl抗体或其抗原结合片段。
[0055]
本公开中提供的方法还可以包括在施用步骤之前，鉴定需要治疗和/或预防癌症、抑制lilrb1与mhc i类的结合和/或lilrb1与mhc i类之间的相互作用、和/或抑制癌细胞免疫逃逸的受试者的步骤。
[0056]
另一个实施方式提供了一种编码至少一种多肽的核酸分子(多核苷酸)，所述多肽选自上述抗lilrb1抗体的cdr(cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3、cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3，cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3的组合或cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3的组合)，包含cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3的轻链可变区，包含cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3的重链可变区；包含所述轻链可变区的轻链，和包含所述重链可变区的重链。
[0057]
另一个实施方式提供了一种包含所述核酸分子的重组载体。在一个实施方式中，所述重组载体可以，分别地(例如，在两个单独的载体中)或全部一起(例如，在一个载体中)，包含编码轻链可变区或轻链的核酸分子和编码重链可变区或重链的核酸分子。所述重组载体可以用作表达载体。
[0058]
另一个实施方式提供了一种包含所述核酸分子或所述重组载体的重组细胞。
[0059]
另一个实施方式提供了一种制备抗lilrb1抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在细胞中表达核酸分子。表达核酸分子的步骤可以包括培养重组细胞。
[0060]
如本文所述，抗lilrb1抗体的抗原结合片段可以指衍生自抗lilrb1抗体并保留所述抗体的抗原(lilrb1)结合亲和力的片段。在一个实施方式中，抗原结合片段可以是包含如上所述的抗lilrb1抗体的6个cdr的多肽，并且例如可以是scfv、scfv-fc、scfv-ck(κ恒定区)、scfv-cλ(λ恒定区)、(scfv)2、fab、fab'或f(ab')2，但不限于此。在一个实施方式中，抗原结合片段可以是scfv；其中scfv与免疫球蛋白(例如，iga、igd、ige、igg(igg1、igg2、igg3、igg4)、igm等)的fc区融合的融合多肽(scfv-fc)；或其中scfv与轻链的恒定区(例如，κ或λ)融合的融合多肽(scfv-ck或scfv-cλ)。
[0061]
所述抗lilrb1抗体或其抗原结合片段可以对lilrb1蛋白具有调节活性，例如拮抗或激动活性。另外，所述抗lilrb1抗体或其抗原结合片段可以具有阻断lilrb1与mhc i类的结合和/或lilrb1与mhc i类之间的相互作用的活性。另外，所述抗lilrb1抗体或其抗原结合片段可以具有抑制癌细胞免疫逃逸的活性。此外，所述抗lilrb1抗体或其抗原结合片段可以具有抗癌作用。
[0062]
作为本公开中提供的抗lilrb1抗体或其抗原结合片段的抗原的蛋白质lilrb1可以来源于哺乳动物。例如，作为抗原的lilrb1可以是人lilrb1(例如，genbank登录号aah15731.1(seq id no:348)、np_001265328.2、np_001265327.2、np_001075108.2、np_001075107.2、np_001075106.2、np_006660.4、nm_001081637.2、nm_001081638.3、nm_001081639.3、nm_001278398.2、nm_001278399.2等)，但不限于此。
[0063]
mhc i类可以是主要组织相容性复合物(mhc)分子中的一类。在一个实施方式中，所述mhc i类可以是人mhc i类并且可以是选自hla(人白细胞抗原)-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-f和hla-g中的至少一种，但不限于此。
[0064]
如本文所述，术语“抗体”可以指与特定抗原特异性结合的蛋白质，并且可以是通过免疫系统中的抗原刺激产生的蛋白质，或通过化学合成或重组产生而产生的蛋白质，没有具体限制。抗体可以是非天然存在的，例如，通过重组或合成产生而产生的。抗体可以是动物抗体(例如小鼠抗体等)、嵌合抗体、人源化抗体或人类抗体。抗体可以是单克隆或多克隆抗体。
[0065]
在本文提供的抗lilrb1抗体或其抗原结合片段中，除了如上定义的重链cdr和轻链cdr部分或重链可变区和轻链可变区之外的部分可以衍生自免疫球蛋白的任何亚型(例如，iga、igd、ige、igg(igg1、igg2、igg3、igg4)、igm等)，并且例如衍生自框架部分和/或轻链恒定区和/或重链恒定区。在一个实施方式中，本公开中提供的抗lilrb1抗体可以是人igg形式的抗体，例如igg1、igg2、igg3或igg4，但不限于此。
[0066]
完整抗体(例如igg型)具有含两条全长轻链和两条全长重链的结构，其中每条轻链经由二硫键连接到相应的重链。抗体的恒定区分为重链恒定区和轻链恒定区。重链恒定区为γ、μ、α、δ或ε型，并且具有γ1、γ2、γ3、γ4、α1或α2作为其子类。轻链恒定区具有κ或λ型。
[0067]
如本文所用，术语“重链”可以旨在涵盖全长重链及其片段，其中所述全长重链可以包含可变区vh(包括足以提供对抗原的特异性的氨基酸序列)，三个恒定区ch1、ch2和ch3，以及铰链。术语“轻链”可以旨在涵盖全长轻链及其片段，其中所述全长轻链可以包含可变区vl(包括足以提供对抗原的特异性的氨基酸序列)，和恒定区cl。
[0068]
术语“互补决定区(cdr)”可以指在抗体的可变区中赋予抗原结合特异性的部分，
并且可以指在免疫球蛋白的重链或轻链的高可变区中发现的氨基酸序列。重链和轻链可以分别包括三个cdr(cdrh1、cdrh2和cdrh3；以及cdrl1、cdrl2和cdrl3)。所述cdr可以提供在抗体与其抗原或抗原表位的结合中起重要作用的接触残基。如本文所用，术语“特异性结合”和“特异性识别”可以具有与本领域普通技术人员已知的相同的一般含义，并且表示抗体和抗原彼此特异性相互作用以导致免疫反应。
[0069]
在本公开中，除非另有说明，否则术语“抗体”不仅可以涵盖完整的抗体，而且还可以涵盖具有抗原结合能力的抗体的抗原结合片段。
[0070]
本文使用的术语“抗原结合片段”可以指任何类型的多肽，其包含能够与抗原结合的部分(例如，如本文所述的6个cdr)，并且例如可以是scfv、(scfv)2、scfv-fc、fab、fab
′
或f(ab
′
)2，但不限于此。另外，如上所述，抗原结合片段可以是scfv，其中scfv与免疫球蛋白(例如，iga、igd、ige、igg(igg1、igg2、igg3、igg4)、igm等)的fc区或恒定区(例如κ或λ)融合的融合多肽。
[0071]
在抗原结合片段中，fab包括轻链和重链可变区、轻链恒定区和第一重链恒定区ch1。
[0072]
fab'与fab的不同之处在于：fab'包含铰链区，所述铰链区在ch1的c末端处具有至少一个半胱氨酸残基。
[0073]
f(ab')2抗体是通过fab'铰链区中的半胱氨酸残基的二硫键桥接形成的。
[0074]
fv是仅由重链可变区和轻链可变区组成的最小抗体片段。产生fv片段的重组技术在本领域中是众所周知的。
[0075]
双链fv包含通过非共价键彼此连接的重链可变区和轻链可变区。单链fv通常包含重链可变区和轻链可变区，它们在c末端经由肽接头通过共价键彼此连接或直接连接以具有类似双链fv的二聚体结构。
[0076]
抗原结合片段可以使用蛋白酶获得(例如，fab可以通过用木瓜蛋白酶限制性切割整个抗体获得，并且f(ab
′
)2片段可以通过用胃蛋白酶切割获得)，或者可以通过使用基因重组技术来制备。
[0077]
术语“铰链区”可以指抗体重链内ch1和ch2结构域之间的区域，其功能是为抗体中的抗原结合位点提供灵活性。
[0078]
抗lilrb1抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，并且例如是单克隆抗体。可以使用本领域广为人知的方法，例如使用噬菌体展示技术来制备单克隆抗体。或者，抗lilrb1抗体可以通过常规方法以小鼠来源的单克隆抗体的形式构建。
[0079]
同时，基于对lilrb1的结合潜力，可以使用典型的elisa(酶联免疫吸附测定)形式筛选单个单克隆抗体。抑制活性可以通过功能分析(例如用于验证结合组件的分子相互作用的竞争性elisa)或功能分析(例如基于细胞的测定)来验证。然后，对于基于其强抑制活性而选择的单克隆抗体成员，可以各自验证它们与lilrb1的亲和力(kd值)。
[0080]
除了活性成分(抗lilrb1抗体或其抗原结合片段)之外，药物组合物还可以包含药学上可接受的载剂。所述药学上可接受的载剂可以是选自通常用于抗体制剂的任何载剂。例如，药学上可接受的载剂可以是选自乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁、矿物油等中的一种或多
种，但不限于此。所述药物组合物还可以包含选自常用于制造药物组合物的稀释剂、赋形剂、润滑剂、润湿剂、甜味剂、风味增强剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等中的一种或多种。
[0081]
所述药物组合物或所述抗体或其抗原结合片段可以药学有效量口服或肠胃外施用。肠胃外施用可以是静脉内注射、皮下注射、肌肉注射、腹膜内注射、皮内施用、鼻内施用、肺内施用、直肠施用或病灶内局部施用。由于蛋白质或肽在口服施用时被消化，因此用于口服施用的组合物中的活性成分可以被包衣或配制成防止在胃中消化。另外，所述抗体或所述组合物可以使用能够将活性成分递送至靶细胞(例如癌细胞)的任选装置来施用。
[0082]
所述抗lilrb1抗体或其抗原结合片段可以包含在药物组合物中或以药学有效量施用于受试者。如本文所用，术语“药学有效量”可以指使活性成分(抗体或其片段)可以发挥所需作用(例如，抗癌作用)的活性成分量。药学有效量可以多种方式规定，这取决于多种因素，例如受试者的年龄、体重、性别、病理状况、饮食、排泄速度和/或反应敏感性、制剂类型、施用时间、施用间隔、施用途径、施用方式等。例如，抗lilrb1抗体或其抗原结合片段可以每天0.005ug/kg至1000mg/kg、0.005ug/kg至500mg/kg、0.005ug/kg至250mg/kg、0.005ug/kg至100mg/kg、0.005ug/kg至75mg/kg、0.005ug/kg至50mg/kg、0.01ug/kg至1000mg/kg、0.01ug/kg至500mg/kg、0.01ug/kg至250mg/kg、0.01ug/kg至100mg/kg、0.01ug/kg至75mg/kg、0.01ug/kg至50mg/kg、0.05ug/kg至1000mg/kg、0.05ug/kg至500mg/kg、0.05ug/kg至250mg/kg、0.05ug/kg至100mg/kg、0.05ug/kg至75mg/kg或0.05ug/kg至50mg/kg的量施用，但不限于此。日剂量可以配制成单位剂型的单一制剂或配制成适当分开的剂型，或者它可以被制造成包含在多剂量容器中。
[0083]
所述药物组合物可以配制成在油或水性介质中的溶液、悬浮液、糖浆、乳化溶液、提取物、粉末、颗粒剂、片剂或胶囊剂的形式，并且还可以包含用于配制的分散剂或稳定剂。
[0084]
应用本公开中提供的抗体、药物组合物或方法的受试者可以选自哺乳动物，包括灵长类动物如人类和猴、啮齿类动物如大鼠和小鼠等。
[0085]
癌症可以是实体癌或血癌。癌症可以是但不限于选自肺癌(例如，肺鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌)、腹膜癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、皮肤或眼球黑色素瘤、直肠癌、肛门附近癌症、食道癌、小肠肿瘤、内分泌腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、白血病(例如慢性或急性白血病)、淋巴细胞性淋巴瘤、肝癌、胃癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞腺瘤、乳腺癌、结肠癌、大肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺肿瘤、肾细胞癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、头颈癌、脑癌、胆道癌、胆囊癌、骨骼骨肉瘤等中的一种或多种。癌症可以是原发性癌症或转移性癌症。癌症可以是特征在于在癌细胞表面上表达或过表达mhc i类的癌症，并且例如可以是结肠腺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、胰腺癌、恶性黑色素瘤、骨骼骨肉瘤、肾细胞癌或胃癌。mhc i类的过表达可以指与正常细胞或对免疫疗法无响应或抗性的癌细胞相比的过表达，所述免疫疗法例如t细胞(例如，细胞毒性t细胞)介导的免疫疗法。
[0086]
如本文所用，术语“癌症治疗”可以指预防、减轻或改善癌症症状或者部分或完全消除癌症的所有抗癌作用，例如癌细胞死亡、癌细胞增殖的抑制、癌症转移的抑制等。
[0087]
本公开中提供的抗lilrb1抗体或其抗原结合片段可以与另一种药物共同施用，所述另一种药物例如选自常规使用的免疫治疗剂、抗癌剂、细胞毒剂等中的至少一种。因此，一个实施方式提供了一种用于治疗和/或预防癌症的组合施用的药物组合物，其包含(1)抗
lilrb1抗体或其抗原结合片段，和(2)选自免疫治疗剂、抗癌剂、细胞毒剂等中的至少一种。另一个实施方式提供了一种治疗和/或预防癌症的方法，所述方法包括向需要治疗和/或预防癌症的受试者施用(1)抗lilrb1抗体或其抗原结合片段，和(2)选自免疫治疗剂、抗癌剂、细胞毒剂等中的至少一种。所述免疫治疗剂、抗癌剂和细胞毒剂可以包括常规用于癌症治疗和/或具有细胞毒性活性的任何药物，并且例如，它们可以是选自蛋白质如抗体、核酸分子如sirna和/或小分子化学品如紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel)等中的至少一种，但不限于此。
[0088]
另一个实施方式提供了一种包含如上所述的抗lilrb1抗体的重链互补决定区(cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3或其组合)、轻链互补决定区(cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3或其组合)、其组合；或重链可变区、轻链可变区或其组合的多肽分子。多肽分子可作为抗体的前体用于制备抗体，或作为组分包含在具有抗体样结构的蛋白质支架(例如肽体)、双特异性抗体或多特异性抗体中。在另一个实施方式中，多肽分子可以在用于靶标疗法的细胞治疗剂如car-t中用作靶(抗原)识别结构域或分泌抗体。在另一个实施方式中，多肽分子可以用于构建抗lilrb1抗体分泌细胞作为细胞治疗剂。
[0089]
另一个实施方式提供了一种编码抗lilrb1抗体的重链互补决定区(cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3或其组合)、重链可变区或重链的核酸分子。
[0090]
另一个实施方式提供了一种编码抗lilrb1抗体的轻链互补决定区(cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3或其组合)、轻链可变区或轻链的核酸分子。
[0091]
另一个实施方式提供了一种重组载体，其分别在两个单独的载体中或全部一起在一个载体中，包含编码抗lilrb1抗体的重链可变区或重链以及抗lilrb1抗体的轻链可变区或轻链的核酸分子。
[0092]
另一个实施方式提供了一种包含核酸分子或重组载体的重组细胞。
[0093]
术语“载体”是指用于在宿主细胞中表达靶基因的工具，例如质粒载体、粘粒载体和病毒载体如噬菌体载体、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体和腺相关病毒载体。重组载体可以由以下构建或通过操纵以下来构建：质粒(例如，psc101、pgv1106、pacyc177、cole1、pkt230、pme290、pbr322、puc8/9、puc6、pbd9、phc79、pij61、plafr1、phv14、pgex系列、pet系列、puc19等)、噬菌体(例如，λgt4λb、λ-charon、λδz1、m13等)或病毒载体(例如，sv40等)，这是本领域中常用的。
[0094]
在重组载体中，核酸分子可以与启动子可操作地连接。术语“可操作地连接”旨在涉及目标核苷酸序列与表达调控序列(例如，启动子序列)之间的功能连接。当“可操作地连接”时，调控元件可以控制目标多核苷酸的转录和/或翻译。
[0095]
重组载体通常可以构建为克隆载体或表达载体。对于重组表达载体，可以使用相关领域中通常可获得的用于在植物、动物或微生物细胞中表达外来蛋白质的载体。本领域中众所周知的各种方法可以用于构建重组载体。
[0096]
为了在宿主例如原核或真核细胞中使用，可以相应地构建重组载体。例如，当构建载体作为用于原核宿主的表达载体时，所述载体通常包括用于转录的强启动子(例如，pl
λ
启动子、cmv启动子、trp启动子、lac启动子、tac启动子、t7启动子等)、用于启动翻译的核糖体结合位点和转录/翻译终止序列。另一方面，用于真核宿主的表达载体包括可在真核细胞中操作的复制起点，例如f1复制起点、sv40复制起点、pmb1复制起点、腺病毒复制起点、aav
复制起点和bbv复制起点，但不限于此。另外，表达载体通常包括源自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或源自哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子、牛痘病毒7.5k启动子、sv40启动子、巨细胞病毒启动子、hsv的tk启动子等)，以及作为转录终止序列的多聚腺苷酸化序列。
[0097]
可以通过将重组载体引入合适的宿主细胞来制备重组细胞。本领域已知的任何宿主细胞都可以用于本公开中，只要它允许重组载体以稳定的方式连续克隆和表达。可用于本公开的原核宿主细胞的实例可以选自大肠杆菌(e.coli)如大肠杆菌jm109、大肠杆菌bl21、大肠杆菌rr1、大肠杆菌le392、大肠杆菌b、大肠杆菌x 1776、大肠杆菌w3110，芽孢杆菌属菌种如枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)和苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis)，以及肠杆菌科菌株，例如鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)和各种假单胞菌菌种。可用于转化的真核宿主细胞可以选自但不限于酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、昆虫细胞和动物细胞，例如sp2/0、cho(中国仓鼠卵巢)k1、cho dg44、cho s、cho dxb11、cho gs-ko、per.c6、w138、bhk、cos-7、293、hepg2、huh7、3t3、rin、mdck等。
[0098]
可以使用相关领域中众所周知的方法将核酸分子或携带核酸分子的重组载体引入(转染)到宿主细胞中。例如，当宿主细胞是原核细胞时，可以使用cacl2或电穿孔方法进行这种转染。对于真核宿主细胞，可以使用但不限于显微注射、磷酸钙沉淀、电穿孔、脂质体介导的转染或粒子轰击来实现基因引入。
[0099]
为了选择转化的宿主细胞，可以根据本领域中众所周知的方法利用与选择标志物相关的表型。例如，当所述选择标志物是赋予某些抗生素抗性的基因时，宿主细胞可以在存在抗生素的情况下在培养基中生长以选择目标转化体。
[0100]
另一个实施方式提供了一种制备抗lilrb1抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达核酸分子或重组载体。表达步骤可以通过在允许核酸分子表达的条件下培养包含核酸分子(例如，在重组载体中)的重组细胞来进行。所述方法还可以包括在表达或培养步骤之后从细胞培养物中分离和/或纯化所述抗体或其片段。
[0101]
有益效果
[0102]
本公开中提供的抗lilrb1抗体或其抗原结合片段可以通过抑制癌细胞的免疫逃逸机制从而使免疫细胞可以表现出其抗癌作用而具有高抗癌作用。
附图说明
[0103]
图1是显示实施例中纯化的抗lilrb1抗体的sds-page凝胶分析结果的电泳图。
[0104]
图2是显示根据一个实施例的抗lilrb1抗体b3的spr(表面等离子体共振)测定结果的传感图。
[0105]
图3是显示根据一个实施例的抗lilrb1抗体e3的spr测定结果的传感图。
[0106]
图4a是显示根据一个实施例的抗lilrb1抗体a10与人自然杀伤细胞khyg-1的结合能力的图；图4b是显示根据一个实施例的抗lilrb1抗体e3与人自然杀伤细胞khyg-1的结合能力的图；并且图4c是显示人igg4同种型对照抗体与人自然杀伤细胞khyg-1的结合能力的图。
[0107]
图5是显示当分别用根据一个实施例的抗lilrb1抗体和人igg4同种型对照抗体处
理时，通过ique筛选器测量的重组lilrb1-fc蛋白与hla-g过表达细胞表面的结合水平的图。
[0108]
图6是显示根据一个实施例的抗lilrb1抗体e3和b3的体内抗肿瘤作用的图。
[0109]
图7a至7d是根据一个实施例的抗lilrb1抗体e3.1与表达人lilr家族的各种成员的细胞结合的流式细胞术图。
[0110]
图8a至8d是根据一个实施例的抗lilrb1抗体h11与表达人lilr家族的各种成员的细胞结合的流式细胞术图。
[0111]
图9是显示当用根据一个实施例的抗lilrb1抗体e3.1或h11处理时人自然杀伤细胞khyg-1中颗粒酶b的释放水平与用对照抗体(人igg4同种型)处理的细胞中颗粒酶b的释放水平的比较的图。
[0112]
图10是显示当用根据一个实施例的抗lilrb1抗体e3.1或h11处理时人自然杀伤细胞khyg-1中穿孔素的释放水平与用对照抗体(人igg4同种型)处理的细胞中穿孔素的释放水平的比较的图。
[0113]
图11是显示用于评价根据一个实施例的抗lilrb1抗体e3.1或h11阻断lilrb1信号通路的能力的荧光素酶报告物测定结果的图。
[0114]
图12是显示根据一个实施例的抗lilrb1抗体e3.1和h11的体内抗肿瘤作用的图。
具体实施方式
[0115]
下文，通过实施例详细说明本发明。
[0116]
以下实施例仅旨在说明本发明，而不应解释为限制本发明。
[0117]
实施例1：制备针对lilrb1的人抗体
[0118]
1.1.使用噬菌体展示选择针对lilrb1的人抗体
[0119]
为了选择特异性识别人lilrb1的抗体，使用由人scfv抗体组成的文库进行噬菌体展示筛选。作为抗原，分别使用人lilrb1-his(目录号8989-t2)和人lilrb1-fc(目录号2017-t2)(rnd systems)。通过ez-link磺基-nhs-生物素试剂盒(thermofisher scientific)将每种抗原与生物素缀合以供使用。
[0120]
通过固相筛选和溶液相筛选，使用总共4种类型的lilrb1抗原(lilrb1-his、lilrb1-fc、lilrb1-his-生物素和lilrb1-fc-生物素)进行噬菌体展示筛选。通过以下进行额外筛选：逐渐降低所用抗原的浓度，与对照抗体一起针对lilrb1进行竞争性洗脱，当lilrb1-fc用作抗原时对fc进行阴性选择，等等。通过多克隆噬菌体elisa，确认所选择的产物与抗原的结合。
[0121]
1.2.单克隆可溶性scfv的筛选和分析
[0122]
在实施例1.1中证实与抗原结合的编码scfv的基因通过pcr扩增以制备表达载体。对于每次选择，将一定数量的转化体转移到96孔培养板中进行筛选。使用自诱导培养基(studier,f.w.(2005)protein expression and purification 41,207-34)表达呈scfv形式的抗体，然后通过进行delfia免疫测定(perkinelmer)分析它们与抗原的结合。另外，在表面上捕获一定量的每种scfv抗体后，对抗原进行delfia以确定抗原-抗体结合亲和力的排名。
[0123]
1.3.将筛选的scfv转化为igg抗体
[0124]
在实施例1.2中确认与抗原结合的克隆中，选择了总共376个克隆，并且通过通用dna测序分析编码所选择scfv的基因的dna序列以去除重复克隆。另外，基于实施例1.2中确定的抗原-抗体结合亲和力的排名，选择了总共93个克隆。编码重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)的基因分别通过pcr从编码所选择scfv的每个基因扩增，并插入表达载体(ptrioz-higg4，invivogen；或者，可以使用包含cmv启动子或cmv/choβ-肌动蛋白融合启动子(kr10-1038126b1)和编码人igg4重链恒定区和κ或λ轻链恒定区的基因的载体中的任一者)中，其中所述表达载体被设计用于编码人igg4抗体(igg4 fc:seq id no:341，κ恒定区：seq id no:342，λ恒定区：seq id no:343)。通过测序确认表达载体的dna序列。
[0125]
1.4.制备所选择抗体
[0126]
使用plasmid plus maxi试剂盒(qiagen)纯化实施例1.3中构建的载体。经纯化的载体用于在expicho-s
tm
细胞或expi293
tm
细胞中表达抗体。
[0127]
具体而言，通过添加80μl expifectamine
tm
cho试剂(thermo fisher)将实施例1.3中构建的载体转染到expicho-s
tm
细胞(gibco)(1.5
×
108个细胞/培养体积25ml)中。转染后一天，将150μl expicho
tm
enhancer(thermo fisher)和4ml expicho
tm
feed(thermo fisher)添加到培养物中。第5天，将4ml expicho
tm
feed添加到培养物中。转染细胞在32℃和5％co2条件下培养总共7-11天。
[0128]
另外，根据制造商的方案，通过添加320μl expifectamine
tm
293试剂(gibco)，将实施例1.3中构建的载体转染到expi293f
tm
细胞(gibco)(3
×
108个细胞/培养体积100ml)中。转染后一天，添加expifectamine
tm
293enhancer 1(thermo fisher)、expifectamine
tm
enhancer 2(thermo fisher)和葡萄糖，其量分别为每100ml培养体积0.6ml、每100ml培养体积6ml和每1升3.6g。转染细胞在36.5℃和5％co2条件下培养总共5天。
[0129]
将两种类型的培养细胞分别在4℃以4000rpm离心20分钟，然后使用0.22um瓶顶过滤系统(corning)过滤。使用akta pure l(ge healthcare)收集和纯化培养上清液。将培养上清液以1ml/min的流速上样到配备有hitrap mabselectsure 1ml柱(ge healthcare)的akta pure l中，并用20柱体积(cv)的1x pbs洗涤柱。然后，将洗脱缓冲液(0.1m柠檬酸钠ph 3.4缓冲液)上样到柱中，以洗脱目标蛋白质。使用amicon ultra filter device(mwco 10k，merck)浓缩洗脱物，离心并与1xpbs缓冲液进行缓冲液交换。
[0130]
将纯化的抗体样品用1x pbs稀释，使最终浓度为约1mg/ml。将10μl还原上样缓冲液(3x)或非还原上样缓冲液(3x)和20μl纯化抗体样品混合，并在95℃加热浴中放置2分钟，然后取出并冷却。将样品以每孔10μg的量注入配备在电泳装置上的sds-page梯度凝胶(4-20％或4-12％)中并在凝胶上显影。为了分析样品的分子量，将precision plus protein
tm
双色标准物(bio-rad)注入另一个单独的孔中。将凝胶用考马斯染色溶液染色并脱色以获得凝胶图像。
[0131]
在93种抗体中，抗体a10、b3、e3、g1、g9和h2的凝胶电泳图像代表性地显示于图1中。如图1所示，确认产生了具有二硫键的抗体。
[0132]
1.5.分析所选择抗体的结合亲和力
[0133]
使用biacore t200(ge healthcare)测量实施例1.3中选择的93种抗体与抗原lilrb1的结合亲和力。抗人igg(fc)抗体(ge healthcare，目录号br-1008-39，最终浓度为
25μg/ml)以5μl/min的流速流动360秒以使用胺偶联试剂盒(ge healthcare，目录号br-1000-508)以5000-7000ru固定在s系列传感器芯片cm5(ge healthcare，目录号br-1005-30)上。将抗原人lilrb1蛋白(lilrb1-his，rnd系统目录号8989-t2)以3.13nm至1600nm的4～9种不同浓度以30μl/min的流速注入其中以确定如表3所示的ka和kd值并从其计算kd值。
[0134]
在93种抗体中，选择了20种表现出优异结合亲和力(kd值)的抗体，并总结在表3中。其中，显示lilrb1结合亲和力(kd)为约99.8nm的抗体b3和显示lilrb1结合亲和力(kd)为约101.2nm的抗体e3的spr传感图分别显示于图2和图3中(图2：b3的spr传感图，图3：e3的spr传感图)：
[0135]
【表3】
[0136]
抗lilrb1抗体对人lilrb1的抗原结合亲和力(kd)
[0137][0138][0139]
1.6.所选择抗体的序列分析
[0140]
在实施例1.5中分析抗原结合亲和力的20种抗体中，根据kabat编号定义的cdr、轻链可变区、重链可变区、轻链和重链的氨基酸序列，以及编码轻链可变区和重链可变区的核酸序列通过一般氨基酸测序和dna测序方法进行分析，并总结在表4至表23中：
[0141]
【表4】
[0142]
抗体克隆e3
[0143][0144][0145]
【表5】
[0146]
抗体克隆b3
[0147][0148][0149]
【表6】
[0150]
抗体克隆a10
[0151][0152][0153]
【表7】
[0154]
抗体克隆g1
[0155][0156][0157]
【表8】
[0158]
抗体克隆g9
[0159][0160][0161]
【表9】
[0162]
抗体克隆h2
[0163][0164][0165]
【表10】
[0166]
抗体克隆h11
[0167][0168]
【表11】
[0169]
抗体克隆f12
[0170][0171]
【表12】
[0172]
抗体克隆b9
[0173]
[0174][0175]
【表13】
[0176]
抗体克隆g11
[0177]
[0178][0179]
【表14】
[0180]
抗体克隆g6
[0181]
[0182][0183]
【表15】
[0184]
抗体克隆f11
[0185]
[0186][0187]
【表16】
[0188]
抗体克隆d3
[0189]
[0190][0191]
【表17】
[0192]
抗体克隆b12
[0193]
[0194][0195]
【表18】
[0196]
抗体克隆e4
[0197]
[0198][0199]
【表19】
[0200]
抗体克隆e12
[0201]
[0202][0203]
【表20】
[0204]
抗体克隆d1
[0205][0206][0207]
【表21】
[0208]
抗体克隆e6
[0209][0210]
【表22】
[0211]
抗体克隆e9
[0212][0213]
【表23】
[0214]
抗体克隆a11
[0215]
[0216][0217]
实施例2：所选择抗体的体外生物活性测定
[0218]
2.1.自然杀伤细胞(nk细胞)表面结合测定
[0219]
为了测试实施例1.4中选择的93种抗体是否与免疫细胞表面上表达的lilrb1结合，进行了自然杀伤细胞(nk细胞)表面结合测定。在补充有10％(w/v)的fbs(gibco)和100u/ml的白细胞介素-2(novartis)的rpmi 1640培养基(gibco)中培养人nk细胞、khyg-1细胞(jcrb)。将khyg-1细胞以5
×
104个细胞/孔的量添加到u形底96孔组织培养板(bd falcon)。将每种所选择抗体添加到孔中至每孔最终浓度为50μg/ml并在4℃温育1小时。
[0220]
为了了解所选择抗体的lilrb1特异性结合水平，以相同方式处理人igg4同种型对照抗体(biolegend)。用facs缓冲液洗涤后，用抗人fc-生物素抗体(life technologies)处理细胞并在4℃温育1小时。用facs缓冲液洗涤后，用链霉亲和素pe(bd pharmigen)处理细胞并在4℃温育30分钟。在用facs缓冲液洗涤后，将细胞重新悬浮并使用ique筛选器
(sartorius)进行分析。
[0221]
在获得的结果中，将抗体a10、e3、e4、f12、g1、g9、g11、h2和h11的结果与人igg4同种型(对照)的结果进行了代表性比较，其示于表24中。a10、e3和人igg4同种型(对照)的流式细胞术图分别显示于图4a(a10)、图4b(e3)和图4c(同种型igg4)中：
[0222]
【表24】
[0223] 平均荧光强度群体2的％人igg4同种型对照142917.22.95a10222660.228.68e3268702.240.22e4272295.543.25f12262012.738.02g1321051.756.23g9263079.341.32g11262771.940.11h2238570.929.00h11244818.232.59
[0224]
如表24和图4a～4c中所示，与人igg4同种型对照抗体相比，所测试的抗体显示出更高水平的与人nk细胞(表面)的结合。
[0225]
2.2.分析所选择抗体对lilrb1与hla-g结合的抑制作用
[0226]
为了测试实施例1.5中选择的抗体是否对lilrb1与其配体hla-g的结合发挥抑制作用，分析了所选择抗体的阻断程度。
[0227]
为此目的，使用了表现出高hla-g表达水平的jeg-3细胞(atcc目录号htb-36)。将jeg-3细胞在补充有10％(v/v)的fbs(gibco)和1％(v/v)的青霉素-链霉素(gibco)的mem培养基(gibco)中培养。将jeg-3细胞以5
×
104个细胞/孔的量添加到u形底96孔组织培养板(bd falcon)。用1x pbs缓冲液洗涤孔板。将实施例1.5中选择的每种抗体(a10、e3、f12、g1、g9、h2和h11)和lilrb1-fc(rnd systems)在facs缓冲液(1x pbs 1％bsa 1mm edta)中混合至最终浓度分别为10μg/ml和5μg/ml。每孔用100μl混合物溶液处理细胞并在冰上温育2小时。以相同方式处理作为阳性对照的抗lilrb1抗体(克隆hp-f1，abcam)和作为阴性对照的抗溶菌酶igg4抗体(克隆d1.3)。用facs缓冲液洗涤两次后，用pe-抗huigg-fc抗体(biolegend，10μg/ml)处理细胞并在冰上温育一小时。用facs缓冲液洗涤两次后，将细胞重新悬浮在100μl相同缓冲液中，并使用ique筛选器(sartorius)进行分析。
[0228]
所得结果示于图5中。如图5所示，所有测试抗体a10、e3、f12、g1、g9、h2和h11均有效抑制lilrb1-fc与hla-g过表达细胞系的结合。
[0229]
2.3.nk细胞引起的癌细胞裂解的测定
[0230]
为了测试所选择抗体是否增加了nk细胞引起的癌细胞裂解的程度，分析由nk细胞khyg-1引起的hla-g过表达hek293细胞的细胞死亡率。将khyg-1细胞(jcrb)以2
×
104个细胞/孔(4
×
104个细胞/ml，总体积50μl)的量添加到96孔组织培养板(bd falcon)。用每种抗体(表25)处理细胞至每孔最终浓度为20μg/ml并在37℃下放置一小时。
[0231]
作为阴性对照，以相同方式处理人igg4同种型对照抗体(biolegend)。
[0232]
根据制造商的方案，用incucyte cytolight rapid red试剂(sartorius)对hla-g过表达hek293细胞(通过用被构建用于表达hla-g的慢病毒转导hek293细胞(美国典型培养物保藏中心(american typo culture collection)来制备)进行染色。一小时后，将hla-g过表达hek293细胞以1
×
104个细胞/孔(2
×
104个细胞/ml，总体积50μl)的量添加到板中。在37℃和5％co2的条件下将所述板置于配备在温育器中的incucyte s3(sartorius)中，并对其拍摄图像达72小时。测量了指示hla-g过表达活hek293细胞密度的红色区域汇合度，并计算了细胞活力。获得的细胞活力显示于表25中(其中细胞活力显示为相对于对照抗体(igg4同种型处理孔的细胞活力＝1)的相对值)：
[0233][0234]
【表25】
[0235]
抗体相对细胞活力(igg4同种型＝1)人igg4同种型对照1.00a100.70b90.81d30.83e10.82e30.64f120.81g10.64g60.78g90.77g110.82h20.78h110.60
[0236]
如表25所示，与人igg4同种型对照抗体相比，包括a10、b9、d3、e1、e3、f12、g1、g6、g9、g11、h2和h11在内的所有测试抗体都增加了由khyg-1引起的hla-g过表达hek293细胞的细胞死亡。
[0237]
实施例3：所选择抗体的体内生物活性测定
[0238]
在实施例1.5中选择的抗体中，测试了两种抗体(e3和b3)的体内抗癌功效。为此目的，测试了两种抗体的施用是否会减小肿瘤大小，其中肿瘤是通过向小鼠移植人结直肠癌细胞(bioware brite cell line hct116 red-fluc结直肠癌细胞(perkinelmer))和thp-1衍生巨噬细胞而产生的。作为阴性对照，如上制备的人结肠癌异种移植小鼠用人igg1同种型对照抗体(bioxcell，目录号bp0297)处理。下文中，详细描述该过程：
[0239]
thp-1衍生巨噬细胞的制备
[0240]
上面使用的thp-1衍生巨噬细胞是通过用150nm佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸盐(pma,sigma)、20ng/ml干扰素γ(peprotech)和10pg/ml脂多糖(lps,sigma)使thp-1细胞(atcc)分化来制备的。
[0241]
在小鼠模型中测量抗癌功效
[0242]
向5周龄雌性ciea nog小鼠[nog免疫缺陷小鼠](central institute for experimental animals，日本)皮下注射3
×
106个细胞的hct116 red-fluc结直肠癌细胞、3
×
106个细胞的thp-1衍生巨噬细胞和两种测试抗体中一者(e3或b3抗体；每只小鼠20μg)的混合物。从肿瘤移植后第4天开始，每周两次通过腹膜内注射将抗体以5mg/kg的剂量施用于小鼠模型。然后，测量移植肿瘤的大小(mm3)并显示于图6中。如图6所示，所有测试抗体，特别是抗体e3，在移植有hct116结肠癌细胞和thp-1衍生巨噬细胞的小鼠模型中表现出统计学上显著的抑制肿瘤生长的作用。
[0243]
实施例4：制备抗lilrb1抗体(e3.1)
[0244]
将编码抗体e3(其在实施例3中确认具有特别显著作用)的全长重链(seq id no:302)的核酸序列通过pcr扩增。将编码抗体e3的轻链可变区(vl)(seq id no:221)的ser1至leu110区域的核酸序列通过pcr扩增并连接到编码λ恒定区(λcl.1，seq id no:344)的核酸序列以通过pcr扩增编码λ轻链的核酸序列。将扩增的序列插入表达载体(ptrioz-higg4，invivogen；或者，可以使用包含cmv启动子或cmv/choβ-肌动蛋白融合启动子(kr10-1038126b1)和编码人igg4重链恒定区和λ轻链恒定区的基因的载体中的任一者)中，其中表达载体被设计用于编码人igg4抗体。通过测序确认表达载体的dna序列。
[0245]
参照实施例1.4使用构建的表达载体来制备抗体(e3.1)，并且参照实施例1.6分析抗体的序列并总结于表26中：
[0246]
【表26】
[0247]
抗体克隆e3.1
[0248]
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实施例5：生成人lilr过表达细胞系
[0251]
通过pcr扩增编码全长人lilr家族蛋白(表27)的核酸序列，并将每个扩增的序列插入表达载体(ptrioz-higg4，invivogen；或者，可以使用包含cmv启动子或cmv/choβ-肌动蛋白融合启动子(kr10-1038126b1)和编码人igg4重链恒定区和λ轻链恒定区的基因的载体中的任一者)中。通过测序确认表达载体的dna序列。将构建的载体转染到cho细胞中，以生成11个在表面上过表达每种lilr蛋白的稳定细胞系。
[0252]
【表27】
[0253]
[0254]
[0255]
[0256][0257]
实施例6：确定所选择抗体与lilrb1过表达细胞表面的结合的ec
50
[0258]
为了确定实施例1和4中制备的抗体与人lilrb1过表达细胞系的结合的ec
50
值，进行了细胞表面结合测定。代表所制备的抗体，测量了e3.1和h11抗体的ec
50
值。将实施例5中制备的在表面上过表达lilrb1的cho细胞以1
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105个细胞/孔的量添加到u形底96孔组织培养板(bd falcon)中。分别从600ug/ml和27ug/ml的最终浓度开始制备e3.1和h11抗体的三倍系列稀释液。用每种稀释的抗体处理细胞并在4℃温育60分钟。用facs缓冲液洗涤后，用抗人fc-生物素抗体(invitrogen)处理细胞并在4℃温育30分钟。用facs缓冲液洗涤后，用pe荧光标记的链霉亲和素(bd pharmigen)处理细胞，并在4℃温育30分钟。在用facs缓冲液
洗涤后，将细胞重新悬浮并使用ique筛选器(sartorius)进行分析。使用graphpad prism软件的非线性回归公式计算ec
50
值，并且所得结果示于表28中：
[0259]
【表28】
[0260] e3.1h11ec
50
(nm)7.1540.376
[0261]
实施例7：评估所选择抗体对人lilr家族过表达细胞系的交叉反应性
[0262]
为了确认所选择抗体是否与除lilrb1之外的人lilr家族蛋白结合，进行了细胞表面结合测定。将在表面表达各种lilr家族蛋白中的一者的cho细胞(在实施例5中制备)以1
×
105个细胞/孔的量添加到u形底96孔组织培养板(bd falcon)中。用最终浓度为20ug/ml的所选择抗体处理每个孔中的细胞并在4℃温育60分钟。用facs缓冲液洗涤后，用抗人fc-生物素抗体(invitrogen)处理细胞并在4℃温育30分钟。用facs缓冲液洗涤后，用pe或fitc荧光标记的链霉亲和素(bd pharmigen)处理细胞并在4℃温育30分钟。在用facs缓冲液洗涤后，将细胞重新悬浮并使用ique筛选器(sartorius)进行分析。用每种lilr蛋白特异性抗体(表27)处理的细胞用作阳性对照，并且用人igg4同种型对照抗体(biolegend)处理的细胞用作阴性对照。
[0263]
关于抗体e3.1获得的结果示于图7a至7d(e3.1：红色；lilr特异性抗体：蓝色；同种型(higg4)对照：灰色)，并且关于抗体h11获得的结果示于图8a至8d(h11：红色；lilr特异性抗体：蓝色；同种型(higg4)对照：灰色)。如图7a至7d和图8a至8d所示，e3.1和h11抗体完全不结合或几乎不结合除lilrb1以外的lilr。这些结果表明由实施例提供的抗体具有特异性结合lilrb1的能力。
[0264]
实施例8：通过酶联免疫吸附点(elispot)测定测量颗粒酶b和穿孔素的释放
[0265]
为了确认e3.1和h11抗体是否增加nk细胞的细胞毒性水平，进行了酶联免疫吸收点(elispot)测定。细胞毒性水平由nk细胞中细胞毒性颗粒、颗粒酶b和穿孔素的释放确定。
[0266]
将5
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103个细胞的表达lilrb1的khyg-1细胞系(jcrb)和5
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103个细胞的hla-g过表达k562细胞(通过用被构建用于表达hla-g的慢病毒转导k562细胞(美国典型培养物保藏中心)来制备)在u形底96孔组织培养板中共培养。向其中加入每种抗体(e3.1、h11或人igg4同种型对照抗体)，每孔最终浓度为50ug/ml，并在37℃温育30分钟。将共培养的细胞转移到用于elispot的96孔板(immunospot，目录hgzbpfn-2m)(pvdf膜)上，所述用于elispot的96孔板分别用抗穿孔素抗体和抗颗粒酶b抗体包被，并进一步在37℃温育8小时。pvdf膜用洗涤溶液(0.05％tween 20于pbs中)洗涤，然后用抗颗粒酶b-hrp和抗穿孔素-生物素抗体处理。然后，根据制造商的方案进行检测过程。pvdf膜在室温下干燥24小时，并且通过elispot分析仪(immunospot)计数颗粒酶b和穿孔素的斑点数。
[0267]
结果分别示于图9(颗粒酶b；gzmb)和图10(穿孔素；prf)中(y轴表示斑点总数)。如图9和图10所示，与人igg4同种型对照抗体处理组相比，e3.1或h11抗体处理组中颗粒酶b和穿孔素的释放水平都显著增加。进行非配对t检验，并且所有实验都在相同条件下进行三次，以保证实验的可靠性，并且结果以平均值示出。
[0268]
实施例9：制备嵌合ghi/75抗体
[0269]
为了了解实施例提供的抗体是否显示出与先前存在的抗体相比更高的功效，制备了包含ghi/75抗体(biolegend，目录号333721，其是小鼠来源的抗人lilrb1抗体)的可变区
和人抗体的恒定区的嵌合ghi/75抗体。
[0270]
更具体地，通过肽定位分析ghi/75抗体的氨基酸序列，并且制备了一种载体，其中将对应于人igg4抗体的可变区(vh和vl结构域)的核酸序列替换为对应于小鼠ghi/75抗体的可变区(vh和vl结构域)的核酸序列。在所述载体中，将对应于人igg4的上铰链的区域替换为对应于人igg1上铰链的氨基酸序列(epkscdktht；seq id no:359)的核酸序列。所述载体如实施例1.4中所述进行表达，并且将获得的抗体纯化并用作以下实施例中的比较抗体。
[0271]
实施例10：使用il-2启动子荧光素酶测定来测量所选择抗体对lilrb1信号传导的抑制作用
[0272]
为了确认实施例1和4中制备的抗体是否抑制lilrb1的信号传导，进行了荧光素酶报告物测定。在实施例1和4中制备的抗体中，代表性地对e3.1和h11抗体进行测定，并且使用实施例9中制备的嵌合ghi/75抗体进行比较。使用表达lilrb1和白细胞介素2(il-2)启动子荧光素酶的jurkat细胞(通过将il-2启动子荧光素酶载体(promega)插入jurkat细胞系(美国典型培养物保藏中心)，接着用被构建用于表达lilrb1的慢病毒转导来制备)和hla-g过表达k562细胞。通过在4℃与抗体温育过夜，用抗cd3抗体(biolegend)包被96孔板。次日，将表达lilrb1和il-2启动子荧光素酶的jurkat细胞以1
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105个细胞/孔的量添加到u形底96孔板中，并用每种抗体(e3.1、h11、嵌合ghi/75或人igg4同种型(对照))处理板至最终浓度为20ug/ml，并在37℃温育一小时。将hla-g过表达k562细胞(1
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105个细胞/孔)添加到板中，并在37℃温育30分钟。将所得悬浮液转移到用抗cd3抗体包被的板上，并且向其中加入抗cd28抗体(biolegend)至最终浓度为10ug/ml。将板在37℃温育6小时。将steady-溶液(promega)添加到每个孔中，并使用光度计(envision,perkinelmer)记录发光强度。
[0273]
结果示于图11中。如图11所示，与人igg4同种型对照抗体和嵌合ghi/75对照抗体相比，实施例中提供的e3.1和h11抗体表现出显著增加的lilrb1信号传导抑制活性。
[0274]
实施例11：小鼠模型中所选择抗体的抗癌作用分析
[0275]
为了分析所选择抗体的抗癌作用，参考实施例3，向5周龄雌性ciea nog小鼠(nog免疫缺陷小鼠；central institute for experimental animals，日本)皮下注射3
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106个细胞的hct116 red-fluc结直肠癌细胞、3
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106个细胞的thp-1衍生巨噬细胞和抗体(20μg/小鼠)的混合物。所用抗体为e3.1或h11抗体，并且人igg4同种型用作对照抗体以用于比较。从移植肿瘤细胞后第4天开始，每周两次通过腹膜内注射将抗体以5mg/kg的剂量施用于小鼠模型，并且测量肿瘤体积并示于图12中。如图12所示，与对照抗体相比，e3.1和h11抗体在移植有hct116结肠癌细胞和thp-1衍生巨噬细胞的小鼠模型中表现出显著的抑制肿瘤生长的作用。