两种多肽及其在体外矿化、成骨与破骨细胞分化中的应用

1.本发明属于生物技术领域，尤其是一种两种多肽及其在体外矿化、成骨与破骨细胞分化中的应用。


背景技术：

2.生物矿化包括从周围环境中特定地吸取无机元素，并在有机基质、各种细胞和蛋白等的严格调控下于生物体不同部位的特定环境中组装成功能化的结构，最终转变为高度有序的生物矿物的过程。简单来说，不溶性有机大分子如胶原蛋白被称为结构基质，借助于可溶性生物聚合物(功能基质)进行矿化生成具有不同功能的特定生物矿物。
3.骨的矿化实际上是在成骨细胞、破骨细胞等的控制下，通过非胶原基质蛋白(ncps)等的调控，在以胶原基底为模板的有机基质上，逐步沉积矿物的过程。骨骼不断地进行着重建，骨重建过程包括破骨细胞贴附在旧骨区域，分泌酸性物质溶解矿物质，分泌蛋白酶消化骨基质，形成骨吸收陷窝；其后，成骨细胞移行至被吸收部位，分泌骨基质，骨基质矿化而形成新骨。
4.破骨与成骨过程的平衡是维持正常骨量的关键。


技术实现要素：

5.本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种两种多肽及其在体外矿化、成骨与破骨细胞分化中的应用。
6.本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
7.两种多肽，所述多肽的氨基酸序列分别为deeendqvk即天冬氨酸-谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-天冬酰胺-天冬氨酸-谷氨酰胺-缬氨酸-赖氨酸、edd-pser-pser即谷氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-磷酸化丝氨酸-磷酸化丝氨酸。
8.进一步地，序列为deeendqvk多肽的分子量为1105.09da，序列为edd-pser-pser多肽的分子量为711.43da。
9.如上所述的多肽在加入体外矿化模拟系统促进胶原矿化方面中的应用。
10.如上所述的多肽在用于成骨细胞培养促进细胞分化与矿化方面中的应用。
11.如上所述的多肽在用于破骨细胞培养抑制细胞分化方面中的应用。
12.如上所述的多肽在用于制备仿生矿化材料或骨修复材料方面中的应用。
13.本发明取得的优点和积极效果为：
14.1、本发明提供了上述两种多肽在胶原蛋白膜中能够促进更多的矿物沉积，并控制hap的形核及生长，进而调控生物矿化进程。同时es还能诱导羟基磷灰石(hap)沿着c轴择优生长。两种多肽用于成骨细胞培养，可以促进成骨细胞的分化与矿化；用于破骨细胞培养，可以抑制破骨细胞的分化，因此可以使用两种多肽制备仿生矿化材料或骨修复材料。两种多肽，氨基酸序列分别为deeendqvk(简称dk)、edd-pser-pser(简称es)，分子量分别为1105.09da、711.43da。
附图说明
15.图1为本发明中胶原蛋白膜基质的扫描电镜图(放大倍数为16000倍)图；
16.图2为本发明中矿化14d后的胶原蛋白膜扫描电镜图(a：dk组，放大倍数为24000倍；b：es组，放大倍数为20000倍；c：空白组，放大倍数为15000倍。)图；
17.图3为本发明中dk(a)、es(b)和空白组(c)调控矿化14d后胶原蛋白膜的xrd图；
18.图4为本发明中矿化14d后不同胶原蛋白膜的抗拉伸强度(ts)和断裂伸长率(eb)图；
19.图5为本发明中dk(a)、es(b)组诱导mc3t3-e1细胞14dalp活力测定结果：control，成骨分化培养基图；
20.图6为本发明中茜素红染色定量分析结果：a，dk；b，es。control，成骨分化培养基图；
21.图7为本发明中dk(a)、es(b)组trap染色结果。a，破骨分化培养基；b，100μg/ml，c，300μg/ml，d，500μg/ml图；
22.图8为本发明中不同浓度dk(a)、es(b)诱导raw264.7细胞trap活性测定结果：
23.control，破骨分化培养基。
具体实施方式
24.下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
25.本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
26.实施例1胶原蛋白膜基质矿化模型的建立
27.使用鼠尾i型胶原蛋白进行凝胶、成膜、交联、矿化，结果如图1所示，可以清晰地观察到胶原蛋白膜基质上的横纹结构，胶原纤维排列成网状结构。胶原蛋白自组装交联形成亮暗交替的横纹，是胶原蛋白膜基质矿化模型标志性的“d-周期”结构。通过ncps的诱导，往往会在“d-周期”中会开始矿物的沉积。在图1中d-周期的出现，以及清晰可见的纤维网状结构都标志着胶原蛋白的自组装和交联效果良好，并代表着已建立了可用的体外胶原蛋白膜基质矿化模型。
28.实施例2多肽调控矿化效果的应用
29.(1)扫描电子显微镜和能谱扫描分析
30.使用扫描电子显微镜来观测不同组的胶原蛋白膜在矿化过程中微观形态的变化，同时配合使用能谱仪进行扫描，检测蛋白膜上元素含量变化。
31.图2显示，矿化14d后，es组可以观察到多膨胀的节点以及明暗交替周期结构的消失。dk组仍可观察到“d-周期”的存在，同时也出现少量的膨胀节点。空白组可以观察到表面生成的纳米花形矿物。
32.表1显示，空白组在矿化2d后，能谱扫描显示其ca/p为1.65，接近hap 1.67的比例，说明此时胶原纤维膜内可能有hap的生成。es组在矿化14d后，ca/p比达到了1.88，而dk组在矿化14d后，ca/p比达到了1.96。表明es和dk已经开始调控acp向hap的转变。
33.(2)x射线衍射(xrd)分析
34.图3显示，胶原蛋白膜在es调控下，hap在胶原蛋白纤维内沿着002面生长从而得到了单晶，即es诱导hap沿着c轴择优生长。此外，还存在一个宽而分散的峰，这表明es诱导产生的矿物是acp和hap的混合物。dk组的xrd图谱中并没有出现明显的尖锐峰，只有一些宽峰的存在，这说明此时在dk组的胶原蛋白膜上产生的矿物是以acp为主。空白组的xrd图谱中只出现了一个典型的宽峰，这说明空白组的胶原蛋白膜上产生的矿物是以非晶态为主。因此空白组产生的并不完全是hap，主要还是以无定型的acp为主。
35.(3)质构分析
36.图4显示，经过es、dk调控矿化14d的胶原蛋白膜抗拉伸强度(ts)显著强于空白组和未矿化组；经过es调控矿化的胶原蛋白膜的断裂伸长率(eb)显著高于dk、空白组和未矿化组，而dk组、空白组和未矿化组无显著性差异。es和dk调控矿物沉积在“d-周期”，这一生物矿化的过程提高了胶原蛋白膜的抗拉伸强度。
37.实施例3多肽对成骨细胞分化与矿化的应用。
38.(1)alp活力测定
39.alp活力的高低表明细胞早期分化能力的强弱。图5显示，dk、es组均可影响细胞酶活，但作用效果随浓度改变而不同。dk组≥100μg/ml即可促进alp活力，且呈现剂量依赖性；es组＞100μg/ml显示促进作用。
40.(2)细胞矿化分析
41.图6显示，dk组≥100μg/ml以浓度依赖性方式显著促进矿化结节形成，es组＞100μg/ml表现可促进矿化。这些结果与alp活力测定结果相一致。
42.实施例4多肽对破骨细胞分化的应用
43.(1)trap染色
44.图7显示，dk组≥100μg/ml，es组＞100μg/ml被染细胞数目与对照组相比明显减少，即dk和es能够抑制破骨细胞分化。
45.(2)trap活性测定
46.trap活性的高低反映了破骨细胞分化能力的强弱。图8显示，dk和es均可有效抑制破骨细胞的trap活性，即能较好的抑制破骨细胞分化。
47.表1矿化后胶原蛋白膜上磷酸钙矿物的ca/p比
[0048][0049]
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。