一种lncRNA、其检测试剂和抑制剂的应用

一种lncrna、其检测试剂和抑制剂的应用
技术领域
1.本发明涉及缺血性心脏病的预防和治疗一种lncrna、其检测试剂和抑制剂的应用。


背景技术：

2.缺血性心脏病(ihd)是一种由炎症、离子通道损伤等多种因素导致冠状动脉梗阻或狭窄引起的冠脉血流与心肌能量状态失衡的临床综合征。动脉粥样硬化为ihd最常见病因之一。目前，ihd的发病率及总体死亡率呈逐年上升趋势，给患者带来了极大的健康危害和经济负担，已成为严重的公共卫生问题。缺血再灌注(i/r)损伤诱导的ihd引起不可逆的心肌细胞死亡和心肌功能障碍，是老年患者发病和死亡的主要原因。考虑到i/r损伤对人体健康的负面影响，人们已努力阐明其潜在机制，以改善心功能。心肌缺血后处理(ipostc)是一种内源性心肌保护现象，以多次心肌缺血和再灌注短循环保护心脏免受长期缺血，从而减少再灌注损伤。近来研究表明，缺血再灌注后会导致患者出现心律失常、心肌梗死面积扩大、心功能低下等更严重的损伤，甚至死亡，是心血管疾病临床治疗中的障碍。衰老是机体代谢的必然阶段，在组织、细胞甚至分子水平都会发生明显的变化。大量临床前报告表明衰老会增加心脏对i/r损伤的易感性和再灌注损伤的程度，且有研究报道50％心梗病人和80％因心梗死亡的病人年龄≥65岁，随着年龄的增加死亡率急剧攀升，预后差且缺乏有效的的治疗手段。
3.自噬(autophagy)作为溶酶体介导的细胞内蛋白质和细胞器降解的一种新的死亡方式，是细胞清除受损和有害物质，维持自身稳态的重要机制。在轻度缺血的情况下，自噬可能是一种适应性反应，可保持心肌细胞活力，限制梗死面积，并减弱不利的左心室重构。然而，当缺血事件较严重或持续时间较长，自噬过程可能被慢性激活，导致细胞死亡增加。研究表明，自噬在急慢性缺血性心脏中普遍存在，提示自噬对心肌组织的作用取决于诱导程度和损伤时间。yang等的研究发现i/r诱导的心肌hl-1细胞自噬和凋亡明显减少，提示自噬在心肌i/r损伤反应中具有保护作用。相反，aoyagi等人的研究表明，再灌注过程中过度的自噬增加了细胞的死亡，这对心脏是有害的。在本研究中我们通过选用22-24月龄sd衰老大鼠复制i/r及ipostc模型，细胞水平采用d-半乳糖诱导衰老心肌细胞模型，然后复制缺氧复氧(h/r)损伤及缺氧后处理(hpostc)模型用来模拟动物水平的i/r及ipostc，结果发现i/r促进衰老心肌自噬发生，而ipostc可抑制i/r诱导的自噬，这与之前的报道一致。此外，p62的增加进一步说明自噬参与了ipostc对衰老心肌i/r损伤的保护作用，但ipostc和hpostc引起衰老心肌自噬水平降低的作用机制有待进一步研究。
4.长链非编码rna(long noncoding rna，lncrna)是在真核生物中发现的一类长度大于200个核苷酸，可转录基因dna的5
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非翻译区与靶基因组成复杂的调控而发挥作用。最新研究证实了lncrna可通过多种机制参与细胞自噬调节，并在衰老心肌ipo和衰老心肌细胞hpostc中参与自噬的调控。因此，挖掘更多的与细胞自噬相关的lncrna，将有助于缺血性心脏病的预防和治疗药物的开发。


技术实现要素：

5.本发明的目的之一在于提供一种lncrna表达水平的检测试剂在制备诊断和/或预后缺血性心脏病的产品中的应用，所述lncrna为lncmstrg.7803.1，其序列如seq id no.1所示。
6.进一步的，所述lncrna在缺血性心脏病患者中表达上调。
7.更进一步的，所述试剂包括qrt-pcr检测用试剂。
8.更进一步的，所述qrt-pcr检测用试剂包括扩增所述lncrna的引物，其序列如seq id no.2-3所示。
9.本发明的目的之二在于提供所述lncrna的应用，用于筛选治疗缺血性心脏病的潜在物质。
10.进一步的，所述物质为下调所述lncrna表达水平的物质。
11.本发明的目的之三在于提供所述lncrna的抑制剂的应用，其用于制备治疗缺血性心脏病的药物。
12.进一步的，所述抑制剂包括能够靶向干扰所述lncrna的sirna。
13.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
14.本发明证明了lncmstrg.7803.1在h/r作用下的衰老心肌细胞中表达上调，而hpostc处理降低了衰老心肌组织和心肌细胞中lncmstrg.7803.1的表达；同时研究得出lncmstrg.7803.1能够促进h/r诱导的衰老心肌细胞自噬，从而减弱ipostc对i/r损伤的保护作用，导致心脏损伤加重。由此可见lncmstrg.7803.1作为大鼠心肌中调控衰老心肌细胞自噬的关键靶标，能够显著促进衰老心肌细胞自噬的改变，可作为一种用于心肌梗死临床风险评估的长链非编码rna及其应用，具有较好的可行性及推广性，为ihd等疾病的药物研究提供新靶点。
附图说明
15.图1为d-半乳糖诱导心肌细胞9d后，β-半乳糖苷酶染色观察心肌细胞衰老情况(10
×
)。a为正常对照组；b为衰老组；箭头所示为衰老的心肌细胞。
16.图2为衰老心肌细胞经h/r及hpostc处理后自噬水平的改变。a为western blot检测衰老心肌组织中自噬基因lc3和p62的蛋白表达；与sham组比较，**p《0.01；与i/r组比较，**p《0.01。b为western blot检测衰老心肌细胞中自噬基因lc3和p62的蛋白表达；与normoxia组比较，**p《0.01；与h/r组比较，**p《0.01。c为rfp-gfp-lc3自噬双标腺病毒感染心肌细胞观察衰老心肌细胞自噬情况(100
×
)；与normoxia组比较，**p《0.01；与h/r组比较，**p《0.01。
17.图3为hpostc处理抑制衰老心肌组织和心肌细胞中lncmstrg.7803.1的表达。a为qrt-pcr检测衰老心肌组织中lncmstrg.7803.1的表达水平；与sham组比较，**p《0.01；与i/r组比较，**p《0.01。b为qrt-pcr检测衰老心肌细胞中lncmstrg.7803.1的表达水平；与normoxia组比较，**p《0.01；与h/r组比较，**p《0.01。
18.图4为qrt-pcr验证si-lncmstrg.7803.1的转染效率。与normoxia组相比，**p《0.01；与hpostc si-nc组相比，**p《0.01。
19.图5为lncmstrg.7803.1对衰老心肌细胞自噬的影响。干扰lncmstrg.7803.1后，
western blot检测lncmstrg.7803.1对衰老心肌细胞lc3(a)和p62(b)蛋白表达的影响。与normoxia组相比，**p《0.01；与hpostc si-nc组相比，**p《0.01。
20.图6为衰老心肌组织中lncmstrg.7803.1的表达水平与lc3、p62蛋白表达的相关性分析。a为衰老心肌组织中lncmstrg.7803.1的表达与lc3蛋白表达水平的相关性分析；b为衰老心肌组织中lncmstrg.7803.1的表达与p62蛋白表达水平的相关性分析。
具体实施方式
21.下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
22.本发明涉及的lncrna为lncmstrg.7803.1，序列如seq id no.1所示。
23.1 材料和方法
24.1.1 材料
25.1.1.2实验试剂和仪器
26.27只22-24月龄spf级sd雄性衰老大鼠，体重500-600g购自成都达硕生物科技有限公司；大鼠心肌细胞株h9c2购自武汉普诺赛生物科技有限公司；d-半乳糖购自北京金克隆生物技术有限公司；胎牛血清、dmem培养基购自美国gibco公司；青霉素、链霉素、胰蛋白酶购自北京碧云天生物技术公司；总rna提取试剂盒购自北京天根生物技术有限公司；反转录和荧光定量pcr试剂盒购自日本takara公司；β-半乳糖苷酶染色试剂盒购自江苏凯基生物技术有限公司；lc3、p62兔单克隆抗体购自美国abcam公司；hrp标记山羊抗兔二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；lncmstrg.7803.1引物由广州锐博生物科技有限公司合成；lncmstrg.7803.1小干扰rna(si-lncmstrg.7803.1)及阴性对照(si-nc)购自上海吉玛制药技术有限公司。组织匀浆仪购自美国mp biomedicals公司；bs110s型精密天平、微量台式离心机购自德国ep-pendorf公司；荧光定量pcr仪购自耶拿分析仪器股份公司；激光共聚焦显微镜购自德国zeiss公司。
27.1.2实验方法
28.1.2.1动物模型的复制及分组
29.所有衰老大鼠置于spf(无特定病原体)级环境内，室内25℃、60％湿度、明暗交替为12h，分笼饲养。实验方案均经宁夏医科大学动物实验伦理委员会批准，动物操作严格按照《动物研究：体内实验报告指南》执行。将衰老大鼠随机分为3组：假手术组(sham)、缺血再灌注组(ischemia-reperfusion，i/r)和缺血后处理组(ischemic postconditioning，ipostc)，每组9只。术前禁食8h，术前10min腹腔注射10％水合氯醛麻醉剂麻醉，行气管插管。5-0无创缝合针从左心耳根部下方2mm处穿过心肌表层，在肺动脉圆锥旁观察ii导联心电图，待稳定后，结扎左冠脉前降支血流30min，然后松结扎线恢复血流灌注3h，建立i/r模型；ipostc是缺血30min后给予3个循环的再灌注10s和缺血10s，最后再灌注3h；假手术组(sham)大鼠接受除结扎步骤外的所有手术。
30.1.2.2心肌细胞衰老模型的建立及转染
31.用含10％胎牛血清、1％双抗的dmem培养基培养心肌细胞(h9c2)，置于37℃、5％co2培养箱中培养，当细胞生长密度达80％时，即可进行细胞传代，后采用8mg/ml d-半乳糖
诱导大鼠正常心肌细胞9d复制衰老细胞模型。将衰老心肌细胞随机分为正常氧组(normoxia组)、缺氧复氧组(h/r组)和缺氧后处理组(hpostc组)。normoxia组：衰老的心肌细胞；h/r组：衰老心肌细胞给予3h缺氧/2h复氧处理；模拟动物水平的缺血再灌注；hpostc组：缺氧3h后给予3个循环的5min缺氧/5min复氧处理后再复氧2h，模拟动物水平缺血后处理。
32.转染前选择生长状态较好的衰老心肌细胞进行培养，随机分为normoxia组、hpostc组、hpostc si-nc组和hpostc si-lncmstrg.7803.1组。根据lipofectamine
tm 2000说明书，将si-lncmstrg.7803.1及si-nc转染到衰老心肌细胞中，感染6h后，将培养液倒掉，加入新的7％培养液继续培养24h后，收集细胞进行后续实验。
33.1.2.4β-半乳糖苷酶染色观察心肌细胞衰老情况
34.将h9c2细胞按3
×
105密度接种到6孔板，每组设3个复孔。待细胞贴壁后按对照组(正常h9c2细胞)和衰老组(8mg/ml d-半乳糖刺激h9c2细胞9d)处理后，吸除培养液，用pbs冲洗2次，室温下加入1mlβ-gal固定液，室温固定15min。弃掉细胞固定液，pbs洗涤细胞3次，每次3min。按照比例配置染色工作液，吸除β-gal清洗液，接着每孔加入1ml加入含20g/lx-gal的染色工作液。37℃恒温烤箱孵育过夜，倒置光学显微镜下观察细胞衰老情况，拍照采集图像。
35.1.2.5rfp-gfp-lc3自噬双标腺病毒检测衰老心肌细胞自噬通量
36.根据实验设计随机设置normoxia组、h/r组和hpostc组。将衰老心肌细胞接种于共聚焦培养皿中，待细胞融合至70％时，更换培养基，每孔加入1ml dmem高糖培养基及2μl rfp-gfp-lc3腺病毒(mrfp-gfp-lc3自噬腺病毒携带红色荧光蛋白(mrfp)和绿色荧光蛋白(gfp)基因)感染衰老心肌细胞，待8h后更换正常培养基，病毒转染48h。弃去培养基，pbs洗涤5min；40g/l多聚甲醛固定30min，pbs洗涤3次，每次5min；抗荧光衰减封片剂封片后采集图像。
37.1.2.6 western blot检测衰老心肌细胞中lc3、p62蛋白的表达水平
38.收集实验各组衰老心肌细胞，根据全蛋白提取试剂盒说明书提取全细胞蛋白，bca法进行蛋白浓度测定及定量，加入蛋白上样缓冲液于金属浴中99℃煮沸变性5min，上样进行sds-page凝胶电泳后0.3a恒流电转2h至pvdf膜，用5％脱脂牛奶室温封闭4h，pbst洗涤3次后分别加入1∶1000稀释的lc3、p62一抗4℃孵育过夜，pbst洗膜3次，使用稀释比例1∶5000的辣根过氧化物酶标记的二抗37℃孵育2h，pbst洗膜3次；最后在凝胶成像分析仪上成像分析，以β-actin为内参，采用image j软件进行灰度分析，计算目的蛋白相对表达水平。
39.1.2.7qrt-pcr检测lncmstrg.7803.1mrna的表达水平
40.根据总rna提取试剂盒说明书提取各组衰老心肌细胞总rna，lncmstrg.7803.1引物由广州锐博生物科技有限公司合成；逆转录成cdna后进行qrt-pcr的检测。采用genebank数据库查询lncmstrg.7803.1基因序列并设计引物，lncmstrg.7803.1上游引物：5'-tgacgtggacatccgcaaag-3'，如seq id no.2所示；下游引物5'-ctggaaggtggacagcgacg-3'，如seq id no.3所示；gapdh上游引物：5'-attccacccatggcaaattcc-3'，如seq id no.4所示；下游引物：5'-gactccacgacgtactcagc-3'，如seq id no.5所示。pcr反应体系为：tb green
tm premix ex taq
tm ii 10μl，10μmol/l上游引物和下游引物各0.8μl，ddh2o 6.4μl，cdna模板0.2μl。其中总的反应体系为20μl。扩增程pcr扩增程序：95℃10min，95℃5s，60℃
20s，70℃10s，共45个循环，以gapdh作为内参，同体系扩增目的基因的相对量；根据扩增曲线数据，按照计算公式2-δδct
分析lncmstrg.7803.1的含量并进行归一化。公式如下：δδct＝[ct(sample)(待测样本)-ct(内参)(待测样本)]-[ct(gi)(校正样本)ct(内参)(校正样本)]，实验重复3次。
[0041]
2统计学处理与分析
[0042]
上述实验结果均为计量资料，采用graphpad prism 8.0统计软件对实验数据进行统计分析，符合正态分布的计量资料以表示，两样本均数间结果的比较采取student's t检验，多个样本之间比较采用one-way anova检验，再行组内两两比较。两变量之间相关性分析采用pearson相关系数。p《0.05为差异有统计学意义。
[0043]
3结果
[0044]
3.1d-半乳糖诱导心肌细胞衰老
[0045]
用8mg/ml d-半乳糖诱导大鼠心肌细胞9天后，采用β-半乳糖苷酶染色观察大鼠心肌细胞衰老情况。结果发现，与正常对照组相比，处理组中衰老细胞数量明显增多，约80％以上细胞胞质呈现蓝色，为染色阳性的衰老细胞。表明体外心肌细胞的衰老模型构建成功，见图1。
[0046]
3.2hpostc对衰老心肌细胞自噬水平的影响
[0047]
为了验证hpostc对衰老心肌细胞自噬水平的影响，western blot检测衰老心肌组织和心肌细胞中自噬相关蛋白lc3与p62的表达水平。结果显示，与sham组比较，i/r组lc3表达明显升高，p62表达降低；与i/r组比较，ipostc组lc3表达显著降低，p62升高(p《0.01，p《0.01)。同样，与normoxia组相比，h/r处理后lc3表达水平升高，p62表达降低(p《0.01)；与h/r组相比，hpostc组lc3表达水平显著降低，p62表达升高(p《0.01)，与动物水平结果一致。为了进一步区分ipostc对早期和晚期自噬水平(自噬体和自噬溶酶体)的影响，将mrfp-gfp-lc3串联标记的lc3双标腺病毒感染衰老心肌细胞。结果显示，与normoxia组比较，h/r组红点和黄点均增加，主要是自噬体(p《0.01)；与h/r组比较，hpostc组自噬体和自噬溶酶体的数量明显减少(p《0.01)，见图2。
[0048]
3.3hpostc处理抑制衰老心肌组织和心肌细胞中lncmstrg.7803.1的表达
[0049]
为了阐明lncmstrg.7803.1参与衰老心肌细胞自噬的调控，采用qrt-pcr检测衰老心肌组织中lncmstrg.7803.1的表达。结果显示，与sham组相比，i/r组中lncmstrg.7803.1的表达明显增加，而与i/r组相比，ipostc组lncmstrg.7803.1的表达降低(p《0.01，p《0.01)，见图3a。为了进一步的验证hpostc处理抑制衰老心肌细胞中lncmstrg.7803.1的表达，体外复制衰老的心肌细胞模型，qrt-pcr检测衰老心肌细胞中lncmstrg.7803.1的表达，与动物水平结果一致，与normoxia组比较，h/r组中lncmstrg.7803.1的表达显著升高，(p《0.01)；与h/r组比较，hpostc组lncmstrg.7803.1的表达减少(p《0.01)，见图3b。
[0050]
3.4干扰lncmstrg.7803.1在衰老心肌细胞中对自身表达的影响
[0051]
为了明确lncmstrg.7803.1在h/r诱导衰老心肌细胞自噬中的作用，衰老心肌细胞分别转染si-lncmstrg.7803.1和si-nc，并hpostc处理，qrt-pcr验证其转染效率。结果显示，与normoxia组相比，hpostc组中lncmstrg.7803.1的表达升高；与hpostc si-nc组相比，hpostc si-lncmstrg.7803.1组中si-lncmstrg.7803.1-769、si-lncmstrg.7803.1-2569和si-lncmstrg.7803.1-4693三个干扰片段的lncmstrg.7803.1表达水平都降低(**p《
0.01，**p《0.01，**p《0.01)，其中si-lncmstrg.7803.1-769干扰效果最为显著，见图3b。因此本文选取si-lncmstrg.7803.1-769用于后续干扰表达的实验，以上结果表明si-lncmstrg.7803.1体外构建成功。
[0052]
3.5lncmstrg.7803.1促进衰老心肌细胞自噬水平升高
[0053]
为了进一步探讨lncmstrg.7803.1对h/r诱导的衰老心肌细胞自噬的作用，转染si-lncmstrg.7803.1和si-nc至衰老心肌细胞后，同时给予hpostc处理，采用western blot检测自噬相关基因lc3和p62的蛋白表达，结果显示，转染si-lncmstrg.7803.1后，与normoxia组相比，hpostc处理后lc3表达水平升高，p62表达降低(p《0.01)；与hpostc si-nc组相比，hpostc si-si-769组中lc3的蛋白表达水平显著降低(p《0.01)，p62的蛋白表达明显升高(p《0.01)，见图5。表明lncmstrg.7803.1能够促进h/r诱导的衰老心肌细胞自噬。
[0054]
3.6衰老心肌组织中lncmstrg.7803.1的表达水平与lc3、p62蛋白表达的相关性分析
[0055]
为了明确衰老心肌组织中lncmstrg.7803.1的表达水平与细胞自噬之间的关系，运用pearson相关系数对lncmstrg.7803.1的表达水平与自噬基因lc3和p62蛋白的表达水平分别进行了相关性分析。结果显示，lncmstrg.7803.1的表达水平与lc3(r＝0.7991，p＝0.0098)蛋白表达呈正相关，而与p62(r＝-0.6356，p＝0.0658)表达则呈负相关，提示lncmstrg.7803.1的表达能够促进h/r诱导的衰老心肌细胞自噬，见图6。
[0056]
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0057]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。