一种甘薯原生质体的制备方法

1.本发明属于植物细胞生物学技术领域，尤其涉及一种甘薯原生质体的制备方法。


背景技术：

2.甘薯(ipomoea batatas[l.]lam.)，一年生草本植物，旋花科，番薯属，是一种高产而适应性强的粮食作物。块根除作主粮外，也是食品加工、淀粉和酒精制造工业的重要原料，根、茎、叶又是优良的饲料。甘薯起源于热带美洲，是世界上重要的粮食、饲料、能源以及工业原料作物，我国是世界上最大的甘薯生产和消费国。
[0003]
植物原生质体是指仅由原生质膜包裹的活细胞，由于没有细胞壁，常被用来作为细胞融合、体细胞杂交、遗传转化和亚细胞定位等研究的理想材料，在许多生理生化研究和植物细胞全能性的理论研究中有重要的应用价值。甘薯具有自交和同群杂交不亲和性，而细胞融合可以克服远源细胞间不亲和的问题，实现杂交及基因重组。目前为止，仍然缺乏一套完整的甘薯原生质体制备方法。


技术实现要素：

[0004]
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种甘薯原生质体的制备方法，采用本发明提供的方法能够获得产量高和活力强的甘薯原生质体。
[0005]
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
[0006]
本发明提供了一种甘薯原生质体的制备方法，包括以下步骤：
[0007]
1)将甘薯材料浸泡在甘露醇溶液中进行暗培养；得到暗培养材料；
[0008]
2)将所述步骤1)得到的暗培养材料与酶解液混合、酶解，得到原生质体；
[0009]
所述酶解液以水为溶剂，包括以下组分：质量百分含量为1.0～3.0％的纤维素酶rs、质量百分含量为1.5％的离析酶r10、质量百分含量为0.5～1.5％的半纤维素酶、质量百分含量为0.1％的牛血清白蛋白、摩尔浓度为80mm的吗啉乙磺酸、摩尔浓度为0.4～0.6m的甘露醇、摩尔浓度为100mm的氯化钾、摩尔浓度为20mm的氯化钙、摩尔浓度为20mm的氯化镁，ph值为5.5。
[0010]
优选的，所述步骤2)酶解液中还包括质量百分含量为1％的蜗牛酶。
[0011]
优选的，所述步骤1)甘薯材料包括甘薯的根尖、叶片、叶柄、茎尖分生组织和愈伤组织中一种或多种。
[0012]
优选的，所述甘薯材料的长度和宽度分别为0.5～1mm。
[0013]
优选的，所述步骤1)甘露醇溶液的摩尔浓度为0.6m，所述暗培养的时间为30min。
[0014]
优选的，所述步骤2)暗培养材料的质量与酶解液的体积比为1g:10ml。
[0015]
优选的，所述步骤2)酶解的条件包括：温度为28℃，振荡速度为80rpm，酶解时间为2～4h。
[0016]
优选的，当甘薯材料为叶片时，所述酶解时间为3h；
[0017]
当所述甘薯材料为叶柄时，所述酶解时间为2h；
[0018]
当所述甘薯材料为茎尖分生组织时，所述酶解时间为4h；
[0019]
当所述甘薯材料为愈伤组织时，所述酶解时间为2h；
[0020]
当所述甘薯材料为根尖时，所述酶解时间为3.5h。
[0021]
优选的，所述步骤2)酶解后，得到酶解物后还包括：将所述酶解物过滤，将得到的滤液离心，得到的沉淀进行洗涤，得到原生质体。
[0022]
优选的，所述离心的条件包括：离心力为250g，离心时间为10min；
[0023]
所述洗涤使用的洗涤缓冲液为摩尔浓度为0.4m的甘露醇溶液。
[0024]
本发明通过不断调整酶解液组成及浓度，选取最适宜的酶解液配方，在提高原生质体产量的同时，尽可能的避免酶含量过高而导致的原生质体活性降低。优化酶解时长可以避免由于原生质体在酶解液中酶解时间过长而导致的原生质体破碎想象，进而得到高产量和活力强的原生质体。此外，通过选取生理状态好的甘薯实验材料得到活性更高的原生质体。
[0025]
本发明的有益效果为：
[0026]
1)本发明通过对甘薯材料生理状态、酶解液组成和酶解时间等方面的研究，提供了一套较为完整的甘薯原生质体制备技术。
[0027]
2)本发明大大缩短了甘薯原生质体制备所需要的时间，并有利于保证原生质体活力；
[0028]
3)利用本发明技术获取的甘薯原生质体产量高、活力强，可在原生质体培养、细胞融合和遗传转化等方面中进行应用，具有显著的经济和社会效益。
附图说明
[0029]
图1为甘薯根尖原生质体。
具体实施方式
[0030]
本发明提供了一种甘薯原生质体的制备方法，包括以下步骤：
[0031]
1)将甘薯材料浸泡在甘露醇溶液中进行暗培养；得到暗培养材料；
[0032]
2)将所述步骤1)得到的暗培养材料与酶解液混合、酶解，得到原生质体；
[0033]
所述酶解液以水为溶剂，包括以下组分：质量百分含量为1.0～3.0％的纤维素酶rs、质量百分含量为1.5％的离析酶r10、质量百分含量为0.5～1.5％的半纤维素酶、质量百分含量为0.1％的牛血清白蛋白、摩尔浓度为80mm的吗啉乙磺酸、摩尔浓度为0.4～0.6m的甘露醇、摩尔浓度为100mm的氯化钾、摩尔浓度为20mm的氯化钙、摩尔浓度为20mm的氯化镁，ph值为5.5。
[0034]
本发明将甘薯材料浸泡在甘露醇溶液中进行暗培养；得到暗培养材料。
[0035]
在本发明中，所述甘薯材料优选为新鲜的甘薯材料。在本发明中，所述甘薯材料优选包括甘薯的根尖、叶片、叶柄、茎尖分生组织和愈伤组织中一种或多种。本发明对所述茎尖分生组织和愈伤组织的获取方式没有特殊限定，采用常规培养方法得到即可。在本发明中，所述甘薯材料的宽度和长度优选分别为0.5～1mm。在本发明中，所述甘薯的根尖优选为水培5d的根尖。
[0036]
在本发明中，所述甘露醇溶液的摩尔浓度优选为0.6m，所述暗培养的时间优选为
30min。在本发明中，所述甘露醇溶液的作用是使材料发生质壁分离，利于酶解，所述暗培养的作用是降低由于原生质体光敏性导致的活性低问题。在本发明中，所述甘露醇溶液的ph值优选为5.5.。
[0037]
本发明将得到的暗培养材料与酶解液混合、酶解，得到原生质体。
[0038]
在本发明中，所述暗培养材料的质量与酶解液的体积比优选为1g:10ml。在本发明中，所述酶解的条件优选包括：温度为28℃，振荡速度为80rpm，酶解时间为2～4h。在本发明中，当甘薯材料为叶片时，所述酶解时间优选为3h；当所述甘薯材料为叶柄时，所述酶解时间优选为2h；当所述甘薯材料为茎尖分生组织时，所述酶解时间优选为4h；当所述甘薯材料为愈伤组织时，所述酶解时间优选为2h；当所述甘薯材料为根尖时，所述酶解时间优选为3.5h。
[0039]
在本发明中，所述酶解液以水为溶剂，包括以下组分：质量百分含量为1.0～3.0％的纤维素酶rs、质量百分含量为1.5％的离析酶r10、质量百分含量为0.5～1.5％的半纤维素酶、质量百分含量为0.1％的牛血清白蛋白、摩尔浓度为80mm的吗啉乙磺酸、摩尔浓度为0.4～0.6m的甘露醇、摩尔浓度为100mm的氯化钾、摩尔浓度为20mm的氯化钙、摩尔浓度为20mm的氯化镁，ph值为5.5。在本发明中，所述纤维素酶rs的作用是酶解细胞壁，来源为优选cellulase rs(yakult,cas no.9012-54-8)。在本发明中，所述离析酶r10的作用是使植物组织分离成单个细胞，来源优选为macerozyme r-10(yakult,cas no.9032-75-1)。在本发明中，所述半纤维素酶的作用是酶解细胞壁，来源优选为来源于黑曲霉的半纤维素酶(macklin,cas no.9025-56-3)。在本发明中，所述牛血清白蛋白是一种酶活性稳定剂。在本发明中，所述吗啉乙磺酸的作用是表面活性剂，增强酶活性。在本发明中，所述甘露醇的作用是作为维持细胞膜内外渗透压平衡的稳定剂。在本发明中，所述氯化钾、氯化钙和氯化镁作用是激活酶活性。本发明优选使用0.1mtris hcl来调节酶解液的ph值为5.5。
[0040]
在本发明中，所述酶解液中还优选包括质量百分含量为1％的蜗牛酶。在本发明中，所述蜗牛酶的作用是酶解细胞壁，来源优选为snailase(solarbio，cas no.9032-75-1)。
[0041]
酶解后，得到酶解物后还优选包括：将所述酶解物过滤，将得到的滤液离心，得到的沉淀进行洗涤，得到原生质体。
[0042]
在本发明中，所述过滤使用额滤膜孔径优选为70μm。
[0043]
在本发明中，所述所述离心的条件优选包括：离心力为250g，离心时间为10min。在本发明中，所述洗涤使用的洗涤缓冲液为摩尔浓度为0.4m的甘露醇溶液，所述甘露醇的作用是作为维持细胞膜内外渗透压平衡的稳定剂。在本发明中，所述洗涤的次数优选为3次，以材料的质量与酶解液的体积比为1g:10ml为例，操作优选包括：第一次加入与酶解液等体积洗涤缓冲液，第二次加入洗涤缓冲液5ml和第三次加入洗涤缓冲液2ml。
[0044]
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0045]
实施例1
[0046]
一种甘薯原生质体的制备方法，步骤为：
[0047]
(1)取水培5d的甘薯不定根根尖5mm，用刀片切成宽度和长度分别约为1mm小段，黑暗条件下置于预处理液中培养30min。其中预处理液组成为：0.6m的甘露醇溶液，ph值为
5.5；
[0048]
(2)酶解：将步骤(1)中的根尖组织取出置于离心管中，加入适量酶解液(每1g材料加10ml酶解液)，然后放置于80rpm的摇床上，28℃、黑暗条件下酶解3.5h，得到含有原生质体的酶解反应液。
[0049]
表1酶解液组分
[0050]
纤维素酶rs1.5％离析酶r101.5％半纤维素酶1.5％bsa0.1％mes80mm甘露醇0.4m氯化钾100mm氯化钙20mm氯化镁20mm0.1mtrishcl调ph至5.5酶解液的溶剂为去离子水 [0051]
注：为质量百分含量
[0052]
(3)洗涤纯化：酶解结束后对酶解反应液进行过滤(滤膜孔径为70μm)，滤液置于离心管中，离心(250
×
g、10min)后弃上清，用洗涤缓冲液(0.4m的甘露醇溶液)清洗3次，得到原生质体重悬液。
[0053]
实施例2
[0054]
与实施例1的方法相同，区别在于，酶解液中另外还加入1.0％蜗牛酶(质量百分含量)。
[0055]
实施例3
[0056]
与实施例2的方法相同，区别在于，材料为甘薯叶片，酶解时间为3h。
[0057]
实施例4
[0058]
与实施例2的方法相同，区别在于，材料为甘薯叶柄，酶解时间为2h。
[0059]
实施例5
[0060]
与实施例2的方法相同，区别在于，材料为甘薯茎尖分生组织，酶解时间为4h。
[0061]
实施例6
[0062]
与实施例2的方法相同，区别在于，材料为甘薯的茎尖胚性愈伤组织，酶解时间为4h。
[0063]
对比例1
[0064]
与实施例1的方法相同，区别在于，酶解液中的1.5％半纤维素酶替换为1.0％果胶酶，均为质量百分含量。
[0065]
对比例2
[0066]
与实施例1的方法相同，区别在于，酶解液中1.5％半纤维素酶替换为1.0％崩溃酶，均为质量百分含量。
[0067]
对比例3
[0068]
与实施例1的方法相同，区别在于，酶解液中的1.5％半纤维素酶替换为0.5％半纤维素酶，均为质量百分含量。
[0069]
对比例4
[0070]
与实施例1的方法相同，区别在于，酶解液中1.5％半纤维素酶替换为0.5％半纤维素酶，1.5％纤维素酶rs替换为3.0％纤维素酶rs，均为质量百分含量。
[0071]
对比例5
[0072]
与实施例1的方法相同，区别在于，酶解液中的1.5％半纤维素酶替换为1.0％半纤维素酶，均为质量百分含量。
[0073]
对比例6
[0074]
与实施例1的方法相同，区别在于，酶解液中1.5％半纤维素酶替换为1.0％半纤维素酶，1.5％纤维素酶rs替换为1.0％纤维素酶rs，均为质量百分含量。
[0075]
对比例7
[0076]
一种甘薯原生质体的制备方法，步骤为：
[0077]
(1)取甘薯叶柄，用刀片切成宽度和长度分别约为1mm小段，黑暗条件下置于预处理液中培养30min。其中预处理液组成为：0.6m的甘露醇溶液，ph值为5.5；
[0078]
(2)酶解：将步骤(1)中的叶柄组织取出置于离心管中，加入适量酶解液(每1g材料加10ml酶解液)，然后放置于80rpm的摇床上，28℃、黑暗条件下酶解16h，得到含有原生质体的酶解反应液。
[0079]
表2酶解液组分(均为质量百分含量)
[0080]
纤维素酶r100.4％离析酶r100.2％mes5mm甘露醇0.6m氯化钙0.5％0.1mtrishcl调ph至5.5酶解液的溶剂为去离子水 [0081]
注：为质量百分含量
[0082]
其中，纤维素酶r10为cellulase r10(yakult,cas no.9012-54-8)。
[0083]
(3)洗涤纯化：酶解结束后对酶解反应液进行过滤(滤膜孔径为70μm)，滤液置于离心管中，离心(250
×
g、10min)后弃上清，用洗涤缓冲液(0.4m的甘露醇溶液)清洗3次，得到原生质体重悬液。
[0084]
将实施例1～6和对比例1～7中的甘薯原生质体制备方法收集得到的甘薯原生质体，用血球计数板统计中央大方格内25个中方格的原生质体数目，重复3次。根据如下公式计算原生质体产量：
[0085]
原生质体产量(个/g)＝(中央大方格内的原生质体数
×
104×
悬浮液总体积)/用于分离原生质体的材料鲜质量
[0086]
用台盼蓝染色对甘薯原生质体活力进行检测，重复3次。取纯化后的原生质体悬浮液20μl于载玻片上，加入2μl 0.4％台盼蓝染色液，室温静置孵育3min，显微镜下镜检，未染色的原生质体具有活性，呈蓝色的无活性。采用如下公式统计原生质体活力：
[0087]
原生质体活力(％)＝未染色的原生质体数/原生质体总数
×
100
[0088]
具体数据如表3所示。
[0089]
由表3数据显示，经过对酶解液体系等内容的调整，最后实施例2中所得酶解液配方所制备的甘薯原生质体产量高、活力强，可以应用于甘薯不同组织部位。
[0090]
表3甘薯原生质体产量及活性
[0091][0092][0093]
注：原生质体产量与活力数值均取平均值
[0094]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。