Artv1重组蛋白及其应用

art v 1重组蛋白及其应用
技术领域
1.本发明涉及蛋白表达技术领域，具体涉及art v 1重组蛋白及其应用。


背景技术：

2.变应性鼻炎是指鼻黏膜暴露于变应原后发生的非感染性慢性炎性反应。流行病学调查表明，在过去的几十年中ar的发病率逐渐增加，目前影响全世界人口的10％～40％。变应性鼻炎不仅影响生活质量，也可造成巨大的社会经济负担，已经成为全球性健康问题，但其发病机理尚不明确。主要的变应原分为两类，季节性变应原主要包含花粉和霉菌，常年性变应原主要包含尘螨、宠物、害虫和一些霉菌。花粉是季节性变应性鼻炎的主要变应原。由于地理条件、气候因素和人为因素，植物的分布存在明显地域性，因此造成了花粉播散的区域性特征，如蒿草是我国北方地区夏秋季节最常见的变应原。art v 1是蒿草花粉的主要致敏蛋白，是一种模块化糖蛋白，具有类似防御素的结构域和富含羟脯氨酸的结构域。因此，通过art v 1重组蛋白的体外制备是研究蒿草花粉导致的季节性变应性鼻炎发病机制是一种重要手段。
3.目前针对蒿草花粉在变应性鼻炎中的探究主要使用蒿草的冻干粉或粗提物，使用无菌pbs缓冲液溶解后的冻干粉或粗提物处理细胞或用于动物实验，探究蒿草变应原在变应性鼻炎中的致病机理，但其缺点是不同批次的冻干粉或粗提物存在差异，其中主要致敏蛋白的含量不同，实验可重复性较差。且冻干粉和粗提物是一种复杂的复合成分，在致病机制的探究中无法阐明具体是那种蛋白或成分发挥的致病作用。个别研究中也有人使用art v 1的天然提取物，该天然蛋白使用液相色谱或质谱等手段从蒿草中分离提取，具有价格昂贵，提取量低等缺点。
4.随着分子生物学技术的发展，利用基因工程重组变应原用于变应性疾病成为研究热点之一。重组变应原即从编码变应原的cdna开始，通过重组dna技术，得到大量高度纯化的变应原，这些变应原具有良好的批间一致性，能够满足医学上对变应原的质量要求。目前已有研究人员将来自于蒿草的art v 1蛋白克隆于pcdna3.1/myc-his a载体，以哺乳细胞hek293f细胞为宿主进行了表达，表达蛋白纯度较高。但与以微生物为宿主进行比较，哺乳动物细胞复制再生能力弱，培养条件要求高，扩大生产难度大等特点进一步限制了该蛋白的表达，且由于该蛋白原核异源表达容易产生包涵体，增加了蛋白纯化难度，所以目前还没有该蛋白在原核模式生物中进行表达的案例出现。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供art v 1重组蛋白及其应用。
6.本发明提供了一种编码art v 1的核酸，包括如下i)～iv中的任意一种：
7.i)、序列如seq id no.2所示的核酸；
8.ii)、与如i)所示的核酸具有至少80％同源性且与i)所述核酸编码相同或相似功能的蛋白；
9.ii)、如i)所示的核酸经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基的核酸；
10.iv)、与如i)所示的核酸互补或部分互补的核酸。
11.进一步的，本发明所述的art v 1来源于蒿草，其原始核酸序列如seq id no.1所示，在充分考虑了密码子使用频率和rna酶的剪接位点、rna稳定反式作用元件后进行了优化，优化后的核酸序列如seq id no.2所示。本发明经实验表明，优化序列编码的art v 1蛋白表达量高、溶解性大、蛋白活性强。
12.本发明提供了一种重组蛋白，其包括促溶和/或纯化元件，和art v 1。进一步的，所述的促溶和/或纯化元件为gst和his。
13.更进一步的，本发明所述重组蛋白还包括蛋白酶酶切位点，所述的蛋白酶酶切位点可以包括凝血酶酶切位点(thrombin site)，也可以包括其他分子生物学常用的蛋白酶酶切位点，本发明对此不做限定。
14.在一些实施例中，本发明所述的重组蛋白由n端至c端依次包括gst-thrombin site-art v 1-his；或者由n端至c端依次包括his-gst-thrombin site-art v 1-his；或者由n端至c端依次包括gst-thrombin site-art v 1-thrombin site-his；或者由n端至c端依次包括gst-art v 1-thrombin site-his，本发明对此不做限定。在一些具体的实施例中，所述的重组蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示。
15.进一步的，本发明还提供了编码重组蛋白的核酸，编码重组蛋白的核酸如seq id no.4所示。
16.本发明提供了一种重组载体，包括载体骨架和核酸片段，核酸片段包括本发明所述的核酸，和/或本发明所述的编码重组蛋白的核酸。在本发明中，以pgex-4t-1为载体进行表达，纯化后的重组蛋白溶解性大、产量高、活性强，优于其它载体(例如：pet-28a)。在一些具体的实施例中，本发明以pgex-4t-1为受试对象，对所述的重组蛋白进行表达。
17.进一步的，本发明所述的重组载体，还包括所述的核酸或编码重组蛋白的核酸以单个或重复串联形式形成的重组载体，本发明对此不做限定。
18.本发明提供了一种表达系统，包括宿主和如下i)～iv)至少一种：
19.i)、本发明所述的核酸；
20.ii)、本发明所述的重组蛋白；
21.iii)、本发明所述的编码重组蛋白的核酸；
22.iv)、本发明所述的重组载体。
23.进一步的，本发明所述的表达系统为原核表达系统，本发明所述的宿主为大肠杆菌。
24.更进一步的，在一些具体实施例中，本发明所述的宿主为大肠杆菌bl21(de3)。
25.在本发明中，所述的表达系统还包括转化或转染所述的重组载体的其他类型的原核宿主形成的表达系统，本发明在此不做限定。
26.进一步的，在本发明中，利用lb液体培养基，在37℃、1.0mmiptg的诱导条件下诱导4h后，200mlod
600
为0.6的大肠杆菌约能纯化500μg蛋白。
27.本发明提供了所述表达系统的制备方法，包括将本发明所述的载体转化或转染宿主细胞。所述转化的方法包括：化学转化和电转化；所述转染的方法包括磷酸钙共沉淀、人工脂质体法、病毒转染。本发明一些实施例中，所述表达系统的制备方法包括将本发明所述
的重组载体通过化学转化的方法转化大肠杆菌bl21(de3)。
28.本发明提供了art v 1蛋白的制备方法，其通过发酵本发明所述的表达系统，获得含有art v 1蛋白的产物。
29.进一步的，本发明所述的含有art v 1蛋白的产物，包括art v 1蛋白及其重组蛋白的发酵液、菌体、上清、或含有art v 1蛋白或重组蛋白的活性物质，本发明对此不做限定。
30.进一步的，本发明还提供了含有所述产物的制剂，所述的制剂剂型可以为菌粉、颗粒或菌液，本发明对此不做限定。
31.本发明提供了重组蛋白在制备防治过敏性疾病的药物和/或过敏性疾病的诊断试剂中的应用。所述的过敏性疾病包括皮肤过敏、呼吸道过敏。所述的呼吸道过敏包括由蒿草引起的变应性鼻炎、过敏性哮喘等。
32.进一步的，本发明还提供了防治过敏性疾病药物和/或过敏性疾病的诊断试剂，包括本发明所述的重组蛋白，和/或本发明所述的制备方法生产的重组蛋白。
33.更进一步的，本发明所述的诊断试剂还包括用于检测art v 1表达或art v 1体内、体外蛋白互作的elisa试剂、western blot试剂、gst-pulldown试剂、co-ip试剂、ip试剂，本发明对此不做限定。
34.更进一步的，本发明所述的诊断试剂还包括医学上可接受的辅料或载体与重组蛋白制成的检测纸或检测卡。它的检测方法可以是肉眼观察、也可以是机读，也可以是肉眼观察和机读的结合，本发明对此不做限定。
35.本发明得到了以下有益效果中至少一种：
36.(1)、本发明将art v 1基因的序列进行了优化，得到适用于原核表达系统的编码art v 1重组蛋白的核酸分子；
37.(2)、本发明将所述核酸分子经人工合成后亚克隆至真核载体得到重组载体，转化原核表达系统，实现了art v 1重组蛋白的高效表达，优化后200mlod
600
为0.6的大肠杆菌约能纯化500μg蛋白。
38.(3)、本发明的制备方法操作简单、成本低、产量高，且重组蛋白活性高，没有受到标签的影响，在过敏性疾病诊断和治疗领域具有广阔的应用前景。
附图说明
39.图1示pgex-4t-1-6xhis-art v 1质粒图谱；
40.图2示gst-art v 1蛋白的表达纯化，m：marker，1：诱导前，2：诱导后，3：流出液，4：结合缓冲液，5：洗涤缓冲液，6：洗脱液；
41.图3示western blot检测art v 1蛋白表达，m：marker，1：gst，2：超声破碎上清，3：gst-art v 1；
42.图4示elisa检测art v 1蛋白结合活性；
43.图5示pet-28a-art v 1纯化后art v 1蛋白表达形式摸索，m：marker，1：诱导前，2：诱导后，3：破碎上清，4：破碎沉淀；
44.图6示pgex-4t-1-art v 1纯化后art v 1蛋白表达形式摸索，m：marker，1：诱导前，2：诱导后，3：破碎上清，4：破碎沉淀；
45.图7示elisa检测art v 1蛋白结合活性；
46.图8示pgex-4t-1-art v 1纯化后art v 1蛋白表达量比较，m：marker，1：优化前，2：优化后。
具体实施方式
47.本发明提供了art v 1重组蛋白及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
48.除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考current protocols in molecular biology(ausubel)。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用l-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。
49.本发明中，所述的至少80％同源性，是指与所述核酸序列相似度≥80％的序列，进一步的，是指与所述核酸序列相似度≥85％的序列；更进一步的，是指与所述核酸序列相似度≥90％的序列；具体的，所述的80％，是指与所述核酸序列相似度为91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的核酸序列。
50.本发明中，所述的编码art v 1的核酸序列为：atggctaaatgctcatatgtattttgtgcagtgttgctgatctttatcgtcgcaattggtgagatggaggccgcaggctcgaaactgtgtgagaagacctccaagacgtacagcggtaagtgcgataacaagaagtgcgacaaaaaatgcattgagtgggaaaaggcgcagcatggtgcatgtcacaaacgtgaagcgggcaaagaatcatgcttctgctatttcgattgtagcaaaagcccgccgggtgccaccccggcgccgccgggtgctgcgcctccaccggctgcggggggctctccgagcccgccggcggacggtggctctccgccaccgccggcggacggcggtagcccgccggttgatggcggttccccgccgccgccaagcacccactaa(如seq id no.2所示)。
51.本发明中，所述的重组蛋白氨基酸序列为:mspilgywkikglvqptrllleyleekyeehlyerdegdkwrnkkfelglefpnlpyyidgdvkltqsmaiiryiadkhnmlggcpkeraeismlegavldirygvsriayskdfetlkvdflsklpemlkmfedrlchktylngdhvthpdfmlydaldvvlymdpmcldafpklvcfkkrieaipqidkylksskyiawplqgwqatfgggdhppksdlvprgspefmakcsyvfcavllifivaigemeaagsklcektsktysgkcdnkkcdkkciewekaqhgachkreagkescfcyfdcsksppgatpappgaapppaaggspsppadggsppppadggsppvdggsppppsthvdhhhhhh(如seq id no.3所示)。
52.本发明中，所述的编码重组蛋白的核酸序列为:atgtcccctatactaggttattggaaaattaagggccttgtgcaacccactcgacttcttttggaatatcttgaagaaaaatatgaagagcatttgtatgagcgcgatgaaggtgataaatggcgaaacaaaaagtttgaattgggtttggagtttcccaatcttccttattatattgatggtgatgttaaattaacacagtctatggccatcatacgttatatagctgacaagcacaacatgttgggtggttgtccaaaagagcgtgcagagatttcaatgcttgaaggagcggttttggatattagatacggtgtttcgagaattgcatatagtaaagactttgaaactctcaaagttgattttcttagcaagctacctgaaatgctgaaaatgttcgaagatcgtttatgtcataaaacatatttaaatggtgatcatgtaacccatcctgacttcatgttgtatgacgctcttgatgttgttttatacatggacccaatgtgcctggatgcgttcccaaaattagtttgttttaaaaaacgtattgaagctatccc
acaaattgataagtacttgaaatccagcaagtatatagcatggcctttgcagggctggcaagccacgtttggtggtggcgaccatcctccaaaatcggatctggttccgcgtggatccccggaattcatggctaaatgctcatatgtattttgtgcagtgttgctgatctttatcgtcgcaattggtgagatggaggccgcaggctcgaaactgtgtgagaagacctccaagacgtacagcggtaagtgcgataacaagaagtgcgacaaaaaatgcattgagtgggaaaaggcgcagcatggtgcatgtcacaaacgtgaagcgggcaaagaatcatgcttctgctatttcgattgtagcaaaagcccgccgggtgccaccccggcgccgccgggtgctgcgcctccaccggctgcggggggctctccgagcccgccggcggacggtggctctccgccaccgccggcggacggcggtagcccgccggttgatggcggttccccgccgccgccaagcacccacgtcgaccaccaccaccaccaccac(如seqid no.4所示)。
53.在一些具体实施例中，本发明提供了所述表达系统的制备方法，包括以下步骤：
54.(1)art v 1核酸序列优化；
55.(2)art v 1核酸序列与载体骨架进行整合；
56.(3)整合体系转化大肠杆菌，经菌落pcr验证筛选正确的转化子；
57.(4)利用lb液体培养基，在37℃、1.0mmiptg的诱导条件下诱导4h；
58.进一步的，经诱导表达的蛋白产物经镍柱纯化后得到art v 1重组蛋白。
59.本发明中，所述的所述的重组载体是利用酶切连接的方式构建的，设计带有酶切位点的pcr引物，扩增得到带有酶切位点的目的片段，随后对片段及载体均进行酶切，用t4酶连接后转化大肠杆菌，得到正确的重组载体。
60.本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：
61.实施例1 art v 1重组蛋白的体外制备和应用
62.为了让蛋白质在大肠杆菌中更好表达，充分考虑了密码子使用频率和rna酶的剪接位点、rna稳定反式作用元件，进行了序列优化，优化后的序列如seq id no.2所示，我们构建了蛋白质的原核重组表达载体。选用pgex-4t-1作为载体模板，该载体是一种原核表达载体并带有gst标签，在gst标签后的ecori与sali酶切位点之间插入经序列优化后的蒿草art v 1的读码框区(cds)序列，构建gst-art v 1融合蛋白。同时在art v 1cds序列后插入6
×
his片段，构建pgex-4t-1-6
×
his-art v 1重组表达载体，质粒图谱如图1所示。所用载体均由测序公司合成。
63.将成功设计并构建的pgex-4t-1-6
×
his-art v 1重组表达载体转入大肠杆菌感受态细胞bl21(de3)。选用lb液体培养基，诱导表达条件为37℃1.0mmiptg诱导4h。sds-page电泳凝胶考马斯亮蓝染色结果如图2所示，在第6泳道中纯化出纯度较高的gst-art v 1蛋白，结果表明，200mlod
600
为0.6的大肠杆菌约能纯化500μg蛋白。
64.随后通过western blot实验检测gst-art v 1融合蛋白中art v 1的表达。首先将菌体超声破碎后的上清及纯化后的gst-art v 1蛋白进行sds-page电泳和转膜，并以纯化后的gst蛋白作为对照，随后孵育抗art v 1抗体，对art v 1蛋白的表达情况进行检测，实验结果如图3所示，在第二泳道和第三泳道均检测到art v 1蛋白的表达，同时显影结果显示第三泳道中的杂带更少，表明纯化后的gst-art v 1存在art v 1的表达且与纯化前相比纯度更高。
65.随后对纯化的gst-art v 1蛋白进行art v 1结合活性检测。elisa实验结果如图4所示，在阴性对照蛋白bsa组以及纯化的gst蛋白组(图中nc组)od
450
值均较低，证明bsa和
gst蛋白与art v 1抗体没有结合活性，而在gst-art v 1蛋白组(图中art v 1组)od
450
显示出较高的数值，证明纯化的gst-art v 1与抗art v 1抗体有较好的结合活性。
66.对比例1不同载体art v 1蛋白表达及活性比较：
67.将未经序列优化的编码art v 1蛋白的基因(seq id no.1)克隆于载体pet-28a；将未经序列优化的编码artv 1蛋白的基因(seq id no.1)克隆于载体pgex-4t-1，构建重组载体pet-28a-art v 1和pgex-4t-1-art v 1。选用lb液体培养基，诱导表达条件为37℃1.0mmiptg诱导4h，如图5所示，pet-28a-art v 1纯化后主要以包涵体形式表达，表达后的蛋白需要经过变性和复性，实验过程复杂，成本提高，同时复性后的蛋白结合活性也不如可溶性表达的蛋白。pgex-4t-1-art v 1纯化后蛋白主要以可溶性形式表达，蛋白在超声破碎上清中直接纯化即可(如图6所示)，200mlod
600
为0.6的大肠杆菌进行蛋白纯化，蛋白表达量为100μg～150μg。
68.同时由于pet-28a-art v 1纯化后主要以包涵体形式表达，需要变性复性，蛋白与art v 1抗体结合活性较pgex-4t-1-art v 1纯化后的蛋白降低(如图7所示)。
69.对比例2 pgex-4t-1-art v 1序列优化前后比较表达情况
70.将未优化的目的基因(如seq id no.1所示)，克隆于载体pgex-4t-1。将优化后目的蛋白基因序列(如seq id no.2所示)克隆于载体pgex-4t-1。载体由公司合成。诱导表达后将镍柱纯化前后的蛋白进行sds-page分析，同样使用200mlod
600
＝0.6的大肠杆菌进行蛋白纯化，优化前的蛋白表达量为100μg～150μg，序列优化后的蛋白表达量约为500μg(如图8所示)。
71.以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。