一种高效表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的工程菌及应用的制作方法

一种高效表达d-阿洛酮糖3-差向异构酶的工程菌及应用
1.技术领域：本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种高效表达d-阿洛酮糖3-差向异构酶的工程菌及应用。
2.

背景技术：
阿洛酮糖又称d-阿洛酮糖，为d-果糖三号位碳所对应的差向异构体，阿洛酮糖具有与蔗糖相似的口感，但其甜度相当于蔗糖的70%，热量相当于蔗糖的0.3 %，且几乎不在体内代谢。并且由于可以通过抑制葡萄糖的吸收来抑制葡萄糖，因此具有降血糖的功效，是最具潜力的蔗糖替代品之一。
3.阿洛酮糖天然存在于葡萄干、无花果、猕猴桃和红糖等食物中，是自然界中含量极少的稀有单糖，依靠天然产物提取的方法成本高，且很难达到量产。现有技术中，制造d-阿洛酮糖的方法中有化学方法和生物方法。如比利克(bilik)等人曾研发利用钼酸离子的催化作用来由果糖生产阿洛酮糖的技术。麦克唐纳(mcdonald)通过对1,2:4,5-二-o-丙酮缩甘油-β-d-果糖进行三步骤化学处理过程来生产了阿洛酮糖。
4.但化学方法会产生大量的副产物和使用大量化学试剂，且生产效率并不高。近年来，生物方法制备阿洛酮糖以其安全、绿色、环保的优势而逐渐成为未来的主流趋势。早期，肯
·
伊兹莫里(kenizumori)等人证实了利用微生物细胞反应以半乳糖醇、d-塔格糖或d-塔罗糖醇为原料生产阿洛酮糖，但原料不易取得，成本高。经过前人的不断研究，现阶段的生物转化法主要是以果糖为原料，经d-阿洛酮糖3-差向异构酶催化合成d-阿洛酮糖，该方法催化合成效率较高，是目前合成阿洛酮糖的主要方式。
5.如申请号为201710124243.x公开的一种d-阿洛酮糖3-差向异构酶的应用，其中记载的d-阿洛酮糖3-差向异构酶为类芽孢杆菌(paenibacillus senegalensis)的d-阿洛酮糖3-差向异构酶，并且该d-阿洛酮糖3-差向异构酶用于在工业上催化生产阿洛酮糖，或用作工业上催化生产阿洛酮糖的催化剂。
6.但由于来源于野生菌株未经改造的d-阿洛酮糖3-差向异构酶在热稳定性、催化活性等方面存在一定的局限性，导致酶的应用成本偏高，限制了其工业应用范围。现有技术常通过改造菌体来提高d-阿洛酮糖3-差向异构酶的催化活性，如申请号为201610818847.x公开的一种d-阿洛酮糖3-差向异构酶的突变体及其应用，该专利提供了d-阿洛酮糖3-差向异构酶的突变体，含有g86d、d164e、w262s突变位点中的一个或多个突变位点，催化活性得到显著提高，催化活性为野生型的1.4倍以上，降低了合成d-阿洛酮糖过程中的酶的用量。
7.虽然现有技术通过突变等方式提高了酶的催化活性，但仍然存在用大肠杆菌或芽孢杆菌表达蛋白时有大量包涵体蛋白，表达出可溶蛋白效率较低的问题。且由于阿洛酮糖与果糖的差价较低，因此制备阿洛酮糖的关键因素在于酶的制备成本。基于此，如何构建出高效可溶性表达d-阿洛酮糖3-差向异构酶的工程菌株成为低成本制备阿洛酮糖的关键点。
8.

技术实现要素：
为了解决上述技术问题，本发明构建了高效表达d-阿洛酮糖3-差向异构酶的工程菌，该工程菌中包含构建的重组表达载体和共表达载体，提高了表达出可溶蛋白的效率，从
而提高了d-阿洛酮糖3-差向异构酶的表达水平。
9.本发明用于解决上述技术问题的技术方案如下：发明提供的技术方案之一，是提供重组表达载体，所述重组表达载体包含表达d-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因和组成型启动子hce基因。
10.进一步的，所述d-阿洛酮糖3-差向异构酶是如下a）或b）蛋白质：a）具有seq no：1所示氨基酸序列的蛋白质；b）由seq no：1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有d-阿洛酮糖3-差向异构酶活性的由（a）衍生的蛋白质。
11.进一步的，所述组成型启动子hce是如下c）或d）的dna片段：c)具有seq no：2所示核苷酸序列的dna片段；d)与seq no：2所示核苷酸序列具有90％以上同源性，且具有启动子功能的dna片段。
12.优选的，所述载体为pet21a、pet20b、pet22b、pet28a中的任意一种。
13.本发明提供的技术方案之二，是提供共表达载体，所述共表达载体包含分子伴侣蛋白的基因，所述分子伴侣蛋白包括dnaj、dnak、groel和grpe。
14.进一步的，所述dnaj基因的核苷酸序列如序列表seq id no.3所示。
15.进一步的，所述dnak基因的核苷酸序列如序列表seq id no.4所示。
16.进一步的，所述groel基因的核苷酸序列如序列表seq id no.5所示。
17.进一步的，所述grpe基因的核苷酸序列如序列表seq id no.6所示。
18.在一种具体实施方式中，所述的共表达载体的构建方法，包括：将dnaj、dnak、groel和grpe的基因序列按照dnaj-dnak-groel-grpe的顺序进行全合成，将全合成的序列插入到载体的多克隆位点，构建成共表达载体。
19.在另一种具体实施方式中，所述的共表达载体的构建方法，包括：将dnaj、dnak、groel和grpe的基因序列按照dnaj-dnak-grpe-groel的顺序进行全合成，将全合成的序列插入到载体的多克隆位点，构建成共表达载体。
20.本发明提供的技术方案之三，是一种高效表达d-阿洛酮糖3-差向异构酶的工程菌，所述工程菌的底盘菌株中包含上述重组表达载体和共表达载体。
21.优选的，述底盘菌株选自e.coli k12、e.coli bl21、e.coli jm109、e.coli rosetta、e.coli bl21 plyss、e.coli top 10、e.coli dh5α中的一种。
22.在一种具体实施方式中，所述高效表达d-阿洛酮糖3-差向异构酶的工程菌的构建方法为：将上述重组表达载体和共表达载体转入底盘菌株中，得到工程菌。
23.本发明提供的一种高效表达d-阿洛酮糖3-差向异构酶的工程菌的应用：是用于胞内生产d-阿洛酮糖3-差向异构酶，催化d-果糖生产d-阿洛酮糖。
24.本发明提供的技术方案之四，是一种制备d-阿洛酮糖的方法，包括如下步骤：1)将权利要求7所述基因工程菌株接种至发酵培养基中进行发酵培养；2)在发酵培养基中添加诱导剂进行诱导表达，得到发酵液；3)分离发酵液，获得菌体，加入缓冲液重悬，得到菌液；4)向d-果糖溶液中加入菌液进行生物转化，得到d-阿洛酮糖。
25.现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明一方面将表达d-阿洛酮糖3-差向异构酶的载体中表达目的基因的启动子替换为组成型启动子hce，通过替换启动子更高效的进行表达。另一方面，本发明将在表达d-阿洛酮糖3-差向异构酶的工程菌中同时转化含分子伴侣蛋白dnaj、dnak、groel和grpe的载体，使d-阿洛酮糖3-差向异构酶与分子伴侣共表达，有效减少包涵体蛋白的形成，分子伴侣进行辅助折叠形成四聚体高级结构，提高表达出可溶蛋白的效率，从而提高d-阿洛酮糖3-差向异构酶的表达水平，降低制备成本。且本发明的组成型启动子hce和分子伴侣蛋白的基因来源于同一供体生物，同源性好，有助于目的基因表达的稳定性，进而提升表达效率。
26.附图说明：图1为实施例1的核酸电泳验证图。
27.图2为实施例1构建的重组表达载体phce-dpe的质粒图谱。
28.图3为实施例2构建的共表达载体puc19-jkle的质粒图谱。
29.图4为实施例3构建的共表达载体puc19-jkel的质粒图谱。
30.图5为实施例5中三种工程菌制备的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶粗酶液的蛋白电泳验证图。
31.图6为实施例6的样品hplc色谱图。
32.具体实施方式：本发明提供的重组表达载体，所述重组表达载体包含表达d-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因和组成型启动子hce基因。
33.其中，所述d-阿洛酮糖3-差向异构酶来源于瘤胃球菌（ruminococcus sp．）。
34.上述d-阿洛酮糖3-差向异构酶是如下a）或b）蛋白质：a）具有seq no：1所示氨基酸序列的蛋白质；b）由seq no：1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有d-阿洛酮糖3-差向异构酶活性的由（a）衍生的蛋白质。
35.所述组成型启动子hce来源于芽孢杆菌（geobacillus sp. wch70），芽孢杆菌（geobacillus sp. wch70）是从威斯康星州middleton的热堆肥中分离出来的嗜热生物之一，于2009年12月保藏在ncbi（cp001638）。
36.上述组成型启动子hce是如下c）或d）的dna片段：c)具有seq no：2所示核苷酸序列的dna片段；d)与seq no：2所示核苷酸序列具有90％以上同源性，且具有启动子功能的dna片段。
37.常用的载体均适用于该重组表达载体，没有特殊限制。优选的，载体为质粒，选择但不限于pet21a、pet20b、pet22b、pet28a中的任意一种。
38.进一步优选的，本发明采用的载体为pet28a质粒。
39.本发明还提供共表达载体，所述共表达载体包含分子伴侣蛋白的基因，所述分子伴侣蛋白包括dnaj、dnak、groel和grpe。
40.上述分子伴侣蛋白dnaj、dnak、groel和grpe来源于芽孢杆菌geobacillussp. wch70。
41.其中，dnaj基因的核苷酸序列如序列表seq id no.3所示；dnak基因的核苷酸序列如序列表seq id no.4所示；
groel基因的核苷酸序列如序列表seq id no.5所示；grpe基因的核苷酸序列如序列表seq id no.6所示。
42.用的载体均适用于该共表达载体，没有特殊限制。优选的，载体为质粒，选择但不限于puc18、puc19中的一种。
43.dnaj、dnak、groel和grpe基因在载体中的组装顺序不同，对表达有一定影响。
44.优选的，在一种具体实施方式中，所述的共表达载体的构建方法，包括：将dnaj、dnak、groel和grpe的基因序列按照dnaj-dnak-groel-grpe的顺序进行全合成，将全合成的序列插入到载体的多克隆位点，构建成共表达载体。
45.在另一种具体实施方式中，所述的共表达载体的构建方法，包括：将dnaj、dnak、groel和grpe的基因序列按照dnaj-dnak-grpe-groel的顺序进行全合成，将全合成的序列插入到载体的多克隆位点，构建成共表达载体。
46.在上述重组表达载体和共表达载体的基础上，本发明还提供一种高效表达d-阿洛酮糖3-差向异构酶的工程菌，所述工程菌的底盘菌株中包含上述重组表达载体和共表达载体。
47.优选的，所述底盘菌株选自e.coli k12、e.coli bl21、e.coli jm109、e.coli rosetta、e.coli bl21 plyss、e.coli top 10、e.coli dh5α中的一种。
48.在一种具体实施方式中，所述高效表达d-阿洛酮糖3-差向异构酶的工程菌的构建方法为：将上述重组表达载体和共表达载体转入底盘菌株中，得到工程菌。
49.本发明提供的一种高效表达d-阿洛酮糖3-差向异构酶的工程菌的应用：是用于胞内生产d-阿洛酮糖3-差向异构酶，催化d-果糖生产d-阿洛酮糖。
50.本发明提供的技术方案之四，是一种制备d-阿洛酮糖的方法，包括如下步骤：1)将权利要求7所述基因工程菌株接种至发酵培养基中进行发酵培养；2)在发酵培养基中添加诱导剂进行诱导表达，得到发酵液；3)分离发酵液，获得菌体，加入缓冲液重悬，得到菌液；4)向d-果糖溶液中加入菌液进行生物转化，得到d-阿洛酮糖。
51.进一步的，步骤1）中，所述发酵培养基为：酵母浸膏20～25g/l，大豆蛋白胨5～10g/l，甘油4～6g/l，磷酸二氢钾2～3g/l，磷酸氢二钾12～16g/l。
52.发酵培养的条件为：初始ph6～7，培养温度22～37℃，200～600rpm，培养20～28h，溶氧20%～30%。
53.进一步的，步骤2）中，发酵培养至od600大于20后，降温至22～25℃，开始加入诱导剂，诱导剂的加入量为0.21～0.25mm终浓度。
54.优选的，所述诱导剂为iptg。
55.进一步的，步骤3中的缓冲液选用tris-hcl缓冲液，ph＝8.0，缓冲液与菌体的添加比例为5：1。
56.进一步的，步骤4）中，d-果糖溶液为500～800g/l，菌液加入量为6-12g/l。
57.生物转化的条件为ph6-7，50～60℃，转化16～18h。
58.为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。
59.应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。
本发明所用的试剂或原料，若无特殊声明，均为市售可得。本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆实验指南：第4版》中所述的条件进行，或按照试剂盒说明书、试剂生产厂商建议的条件进行。
60.实施例1重组表达载体的构建本实施例中，d-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因来源于瘤胃球菌ruminococcussp．,组成型启动子hce的基因来源于芽孢杆菌geobacillussp.wch70。
61.d-阿洛酮糖3-差向异构酶基因的核苷酸序列由genescript公司优化，在5’端添加组成型启动子hce及核糖体结合位点（rbs）序列，两端分别引入xbai和xhoi酶切位点，并进行全合成，得到全合成基因片段。上述全合成基因片段的核苷酸序列如序列表seqidno.7所示。
62.分别将全合成基因片段和pet28a载体进行xbaⅰ和xhoⅰ双酶切，通过胶回收试剂盒回收并纯化目的片段，用t4连接酶将两个产物进行连接，得到重组质粒。
63.将此重组质粒转化入e.colidh5α感受态细胞，涂布卡那霉素抗性平板，37℃培养过夜。挑取长出的阳性克隆，提取质粒进行测序验证，获得重组表达载体phce-dpe。
64.进一步，提取质粒，用pcr获取目的基因片段，进行核酸电泳验证。
65.pcr引物如下：p1：atgaagtacggtatctactatgcttattgggp2：cctcgaaaacgtgtttaacaaaatgcaac核酸电泳验证如图1所示，目的基因的大小为873bp，电泳验证结果与目的基因的大小一致，表明成功构建了该重组表达载体。
66.实施例2dnaj-dnak-groel-grpe共表达载体的构建本实施例中，4个分子伴侣蛋白dnaj、dnak、groel、grpe的基因来源于芽孢杆菌geobacillussp.wch70。
67.将分子伴侣蛋白dnaj、dnak、grpe、groel按照dnaj-dnak-groel-grpe的顺序组装，在dnaj和groel之后插入rbs序列，在dnak之后插入lac启动子和rbs序列。整个序列两端分别引入xbai和kpni酶切位点，由genescript公司进行全合成，得到全合成基因片段，该基因片段的核苷酸序列如序列表seqidno.8所示。
68.分别将全合成基因片段和puc19载体进行xbai和kpni双酶切，通过胶回收试剂盒回收并纯化目的片段，用t4连接酶将两个产物进行连接，得到重组质粒。
69.将此重组质粒转化入e.colidh5α感受态细胞，涂布氨苄抗性平板，37℃培养过夜。挑取长出的阳性克隆，提取质粒进行测序验证，获得共表达载体pucmod-jkle。
70.实施例3dnaj-dnak-grpe-groel共表达载体的构建本实施例中，4个分子伴侣蛋白dnaj、dnak、groel、grpe的基因来源于芽孢杆菌geobacillussp.wch70。
71.将分子伴侣蛋白dnaj、dnak、grpe、groel按照dnaj-dnak-grpe-groel的顺序组装，在dnaj和grpe之后分别插入rbs序列，在dnak之后插入lac启动子和rbs序列。序列两端分别引入xbai和kpni酶切位点，由genescript公司进行全合成，得到全合成基因片段，该基因片段的核苷酸序列如序列表seqidno.9所示。
72.分别将全合成基因片段和puc19载体进行xbai和kpni双酶切，通过胶回收试剂盒
回收并纯化目的片段，用t4连接酶将两个产物进行连接，得到重组质粒。
73.将此重组质粒转化入e.colidh5α感受态细胞，涂布氨苄抗性平板，37℃培养过夜。挑取长出的阳性克隆，提取质粒进行测序验证，获得共表达载体pucmod-jkel。
74.实施例4工程菌的构建将实施例1制备得到的重组表达质粒phce-dpe转化入e.colibl21（de3）感受态细胞，用含有卡那霉素的平板进行培养，挑取阳性克隆，提取质粒，测序验证正确后，获得菌株dpe-a。
75.用dpe-a菌株制备感受态细胞，将实施例2制备得到的分子伴侣质粒pucmod-jkle转化入dpe-1感受态细胞，用含有氨苄青霉素的平板进行培养，挑取阳性克隆，提取质粒，测序验证正确后，获得工程菌dpe-b1。
76.用dpe-a菌株制备感受态细胞，将实施例3制备得到的分子伴侣质粒pucmod-jkel转化入dpe-1感受态细胞，用含有氨苄青霉素的平板进行培养，挑取阳性克隆，提取质粒，测序验证正确后，获得工程菌dpe-b2。
77.对比例1本实施例中，d-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因来源于瘤胃球菌ruminococcussp．,组成型启动子hce的基因来源于芽孢杆菌geobacillussp.wch70。
78.d-阿洛酮糖3-差向异构酶基因的核苷酸序列由genescript公司优化，两端分别引入xbai和xhoi酶切位点，进行全合成，得到全合成基因片段。分别将全合成基因片段和pet28a载体进行xbaⅰ和xhoⅰ双酶切，通过胶回收试剂盒回收并纯化目的片段，用t4连接酶将两个产物进行连接，得到重组质粒。
79.将此重组质粒转化入e.colidh5α感受态细胞，涂布卡那霉素抗性平板，37℃培养过夜。挑取长出的阳性克隆，提取质粒进行测序验证，获得重组表达载体pet28a-dpe。
80.将重组表达载体pet28a-dpe转化入e.colibl21（de3）感受态细胞，用含有卡那霉素的平板进行培养，挑取阳性克隆，提取质粒，测序验证正确后，获得工程菌dpe-c。
81.实施例5菌株培养及表达实验菌株：实施例4构建的工程菌dpe-b1；实施例4构建的工程菌dpe-b2；对比例1构建的工程菌dpe-c。
82.挑取上述工程菌dpe-b1、工程菌dpe-b2和工程菌dpe-c，分别接种在含有相应抗性的lb液体培养基中，37℃培养至od
600
达到0.7-0.8，加入终浓度为0.5mmiptg，在22℃、150rpm条件下诱导表达过夜。4℃，6000r/min离心10-15min，收集菌体，用缓冲液（20mmol/ltris-hcl，ph8.0）按照5：1的比例（1克湿菌体添加5ml缓冲液）重悬菌体，超声破碎，10000r/min离心20min，收集上清液，得到d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的粗酶液。
83.将收集到的三种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的粗酶液进行蛋白电泳验证，结果如图5所示，其中，1工程菌dpe-b1制备出的粗酶液；2为工程菌dpe-b2制备出的粗酶液；3为工程菌dpe-c制备出的粗酶液。蛋白电泳验证结果与目的基因的大小一致，表明上述三种工程菌均成功表达了该目的基因。
84.d-阿洛酮糖-3-差向异构酶转化率测定：
反应体系如下：10ml反应体积，100μl粗酶液、50mm tris-hcl缓冲液(ph＝8.0)、700mg/ml d-果糖，60℃条件下反应2、4、8、12、16小时，分别取样，hplc检测果糖和阿洛酮糖的含量，计算转化率。
85.hplc色谱条件如下：分析柱：chromcore sugar-10ca；流动相：去离子水柱温：80℃；示差检测器温度：50℃；流速：0.5ml/min；进样量：10μl。
86.反应结果如下表1所示，从表1所列出的数据可以看出，实施例4构建的工程菌，的d-阿洛酮糖3-差向异构酶与高浓度的果糖反应时，仅仅经过约18个小时 转化率就达到超过33％的最大转化率：表1
工程菌2小时阿洛酮糖转化率，%4小时阿洛酮糖转化率，%8小时阿洛酮糖转化率，小时阿洛酮糖转化率，小时阿洛酮糖转化率，%dpe-b111.5717.3525.9927.3429.25dpe-b211.3116.4524.2526.9428.82dpe-c8.7014.5119.5322.2024.38
实施例6 制备d-阿洛酮糖选择实施例5中转化率最好的工程菌dpe-b1为生物合成制备d-阿洛酮糖用菌株，上述基因工程菌株接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养基为酵母浸膏25g/l，大豆蛋白胨8g/l，甘油6g/l，磷酸二氢钾2g/l，磷酸氢二钾15g/l。发酵培养的初始ph为7，培养温度26℃，溶氧控制在20%～30%，培养24h。当发酵培养至od
600
大于20后，降温至22℃，开始加入诱导剂，诱导剂选用iptg，iptg的加入量为0.25mm终浓度。发酵结束，得到发酵液，6000r/min离心10-15min，获得菌体。
87.用缓冲液（20mmol/l tris-hcl，ph8.0）按照5：1的比例重悬菌体，得到菌液，在700g/l的d-果糖溶液中加入12 g/l菌液，ph为6，60℃进行生物转化，转化时间为18h，转化结束后，取样进行hplc测定d-阿洛酮糖含量，计算转化率，结果如图6所示。结果显示，d-阿洛酮糖的峰面积为29.19。
88.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。