斑马鱼hoxba基因簇缺失突变体的制备方法和应用

1.本发明属于分子生物学领域，具体涉及斑马鱼hoxba基因簇缺失突变体的制备方法和应用。


背景技术：

2.crispr-cas9是继zfn、talens等基因编辑技术推出后的第三代基因编辑技术，短短几年内，crispr-cas9技术风靡全球，成为现有基因编辑和基因修饰里面效率高、简便、成本低、容易上手的技术之一，成为当今主流的基因编辑系统。crispr/cas9系统是建立在一种原核免疫机制的基础上的，它可以防御核酸的入侵，属于细菌和古细菌的适应性免疫防御机制。它是在生物不断进化的过程中产生，用来保护自身基因组免受外源核酸的干扰。最早于1987年被大阪大学(osaka university)的研究人员发现，到2012年，doudna与charpentier两个团队合作对wt的产脓链球菌streptococcus pyogenes的crispr/cas系统进行改造，将tracrrna和crrna整合为一条单链，称为crrna:tracrrna chimera，也就是现在的grna。该嵌合的rna与靶dna相应序列互补配对可启动cas9的活性，对dna进行剪切，这一研究奠定了crispr/cas成为基因编辑工具的基础，同时crispr/cas也因为其操作的便利性成为在模式动物斑马鱼中应用较多的基因编辑技术。2013年，科学家成功用crispr/cas系统在人类细胞内实现了基因组编辑。cas9介导的基因编辑步骤：首先，cas9核酸内切酶在grna的介导下对基因组dna进行剪切，dna会发生双链断裂(dsb)；然后，断裂的dna会被细胞自身的dna修复系统所修复。
3.斑马鱼因为身材小、生长快，在发育生物学、肿瘤学、毒理学、生殖研究、遗传学、神经生物学、环境科学、干细胞研究、再生医学等领域都取得了进展。斑马鱼作为发育遗传学的最佳模式动物，是协助人类基因组研究的有力工具。斑马鱼还是药物发现和开发的良好模型，已广泛应用于人类疾病模型研究、新药筛选、药物毒性与安全性评价，目前已有8000多种斑马鱼的突变体，其中1/4左右成为人类疾病模型，是目前较为理想的基因编辑工具。目前已经有在酵母，大米，小鼠等生物中采用多个grna与cas9共同进行多个基因或者小片段基因敲除的报道，但几乎没有报道在斑马鱼中利用crispr/cas9技术进行超过100kb的片段删除。
4.hox基因是一大类含有同源框的转录因子家族，全名同源异型基因。它们在染色体上成簇地排列，分布在不同的染色体上。hox基因家族在早期胚胎发育过程中控制着身体形态的构建，hox基因产生突变常常会导致身体的对应部位产生相应的畸形。相关报道显示hox基因在脊椎动物心脏发育形成时起到重要作用。medina-martinez等在2000年首先利用同源重组基因敲除方法构建了hoxb1-hoxb9(除hoxb13外)共90kb的hoxb基因簇大片段删除的小鼠突变品系，但该小鼠品系并未完全敲除整个hoxb基因簇，且其异常心脏表型的具体机制也有待深入分析。也有研究发现临床病人因为缺少了部分hoxb基因簇(hoxb1-hoxb9)或多个hoxb基因而出现一系列的生长迟缓、心肺脑发育异常、手足异常、脸部先天畸形等临床表现，其中最严重的病人在出生后四个月面临死亡。然而这些研究并没有深入探究该基
因的下游调控通路，因此需要进一步的阐述与研究。


技术实现要素：

5.本发明的主要目的在于提供斑马鱼hoxba基因簇缺失突变体的制备方法，利用斑马鱼这一模式生物，通过crispr/cas9技术设计靶点序列，对hoxba基因簇进行基因编辑以实现目的基因的定位敲除，为基因组上多个连续基因共同敲除获得稳定突变体提供一种构建思路。
6.本发明的另一目的是提供斑马鱼hoxba基因簇缺失突变体作为动物模型在研究hoxba基因簇的生物学功能及与hoxba基因簇缺失相关的疾病中的应用，hoxba簇在心脏的发育中有着十分重要的作用，缺失该基因会在心脏上表现出明显的缺陷，通过该斑马鱼hoxba基因簇缺失突变体构建的动物模型可以为心脏发育异常等相关疾病的研究提供方式方法。
7.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.本发明提供斑马鱼hoxba基因簇缺失突变体的制备方法，包括以下步骤：
9.s1、确定hoxba基因簇敲除的靶点在斑马鱼hoxb13a基因第1个外显子和hoxb1a基因第1个外显子上设计grna序列；
10.s2、设计合成grna的上游引物t7-hoxb13a-sfd、t7-hoxb1a-sfd和下游grna反向引物；
11.s3、以grna骨架质粒为模板，使用引物t7-hoxb13a-sfd、t7-hoxb1a-sfd和下游grna反向引物分别进行pcr扩增；
12.s4、对步骤s3的pcr产物进行体外转录，转化获得hoxb13a grna和hoxb1a grna；
13.s5、将上述hoxb13a grna和hoxb1a grna与cas9蛋白混合后显微注射导入到斑马鱼一细胞期胚胎中；
14.s6、培养获得稳定遗传的斑马鱼hoxba基因簇缺失突变体。
15.作为优选，步骤s1中，所述靶点grna序列为
16.hoxb13a：ggatgagctgaagaatatgg(seq id no:1)
17.hoxb1a：ggaactgggacaacaagtta(seq id no:2)
18.作为优选，步骤s2中，上游引物f1即引物t7-hoxb13a-sfd的序列为
[0019][0020]
引物t7-hoxb1a-sfd的序列为
[0021][0022]
下游引物r1(trans reverse)，即grna反向引物的序列为
[0023]
aaaaaaagcaccgactcggtgccac(seq id no:5)。
[0024]
作为优选，步骤s4中，所述hoxb13a grna的序列为
[0025]
taatacgactcactataggatgagctgaagaatatgggttttagagctagaaatagcggacagattca
tgtcctggacgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttt(seq id no:6)。
[0026]
所述hoxb1a grna的序列为
[0027]
taatacgactcactataggaactgggacaacaagttagttttagagctagaaatagcggacagattcatgtcctggacgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttt(seq id no:7)。
[0028]
作为优选，步骤s5中，hoxb13a grna和hoxb1a grna的终浓度均为100ng/μl，cas9蛋白终浓度为800ng/μl，总体积为1nl。
[0029]
作为优选，步骤s6具体包括如下步骤：
[0030]
a1、分别取导入grna与cas9蛋白的斑马鱼以及野生型未注射的斑马鱼胚胎进行hoxba基因簇敲除检测，确定hoxba基因簇敲除阳性f0养至成鱼；
[0031]
a2、将hoxba基因簇敲除阳性f0成鱼与野生型斑马鱼外交进行可遗传性及有效突变检测，筛选可遗传的有效突变f1进行喂养至成鱼，经基因型鉴定获得hoxba基因簇f1突变体斑马鱼；
[0032]
a3、将相同突变的hoxba基因簇f1突变体斑马鱼内交，获得hoxba基因簇f2突变体斑马鱼；
[0033]
a4、鉴定为f2代中hoxba基因簇敲除的纯合子即稳定遗传的斑马鱼hoxba基因簇缺失突变体。
[0034]
作为优选，步骤a1中，hoxba基因簇敲除检测采用的检测引物包括：
[0035]
上游引物hoxb13a-f：cgtcacgtggtactgctctc(seq id no:8)；
[0036]
下游引物hoxb1a-r：caatccacctgttttggggg(seq id no:9)；
[0037]
上游引物hoxb1a-f：acgctgatggacgactttacg(seq id no:10)
[0038]
作为更优选，步骤s6包括如下步骤：
[0039]
(1)在靶点周围设计引物，使其距离靶位点两侧都大于100bp，且引物距离靶点的距离之差的绝对值大于100bp；选择一对健康的wt斑马鱼作为亲本，剪尾巴进行pcr，将pcr产物直接测序，检测亲鱼待敲除的基因是否为纯合子，要求待注射的成鱼对靶点序列为纯合子，如果测序结果显示靶点序列为杂合子，重新选择待注射的成鱼；
[0040]
(2)将grna与cas9蛋白显微注射入斑马鱼中，混合注射体系的终浓度grna:100ng/μl；cas9蛋白：800ng/μl，总体积为1nl；
[0041]
(3)注射当天晚上将死卵挑出，同时换一半新水，之后每天早晚换水一次，受精后48h，双外侧引物pcr检测，敲除成功f0斑马鱼进行饲养；
[0042]
(4)3-4个月斑马鱼性成熟后，将突变的f0斑马鱼与野生型的斑马鱼杂交，得到一定概率的杂合子，收集胚胎提取基因组，使用检测引物进行pcr后，ta克隆送测序确定基因型，确定可遗传且为有效突变的f1斑马鱼进行饲养；
[0043]
(5)经过3-4个月后性成熟后，有突变的f1斑马鱼成年的雄鱼与雌鱼再次剪尾巴，进行基因型鉴定筛选，将突变体斑马鱼再次交配，得到纯合的hoxba基因簇缺失突变体斑马鱼。
[0044]
作为优选，所述斑马鱼hoxba-/-突变体在3.5dpf时观察到心包腔水肿、心脏环化异常的心脏发育畸形现象。
[0045]
本发明还提供斑马鱼hoxba基因簇缺失突变体作为动物模型在研究hoxba基因簇的生物学功能及与hoxba基因簇缺失相关的疾病中的应用，所述斑马鱼hoxba基因簇缺失突
变体通过上述任一所述斑马鱼hoxba基因簇缺失突变体的制备方法得到。
[0046]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0047]
1)本发明首次利用crispr/cas9技术分别在hoxb13a基因第1个外显子和hoxb1a基因第1个外显子上设计grna靶点进行hoxba基因簇大片段删除，hoxba基因簇共包含13个基因，全长116.9kb，从3’到5’依次是hoxb1a、hoxb2a、hoxb3a、hoxb4a、hoxb5a、hoxb6a、hoxb7a、hoxb8a、hoxb9a、hoxb10a、hoxb11a、hoxb12a和hoxb13a)，成功实现hoxba基因簇的特异敲除，获得斑马鱼hoxba基因簇缺失突变体，为基因组上多个连续基因共同敲除并获得稳定突变体提供方式方法，同时其表型为研究hoxba基因簇的生物学功能及与hoxba基因簇缺失相关的疾病奠定基础。
[0048]
2)hoxba基因簇突变可稳定遗传，便于后续hoxba基因簇功能机制的深入研究。
[0049]
3)hoxba-/-突变体斑马鱼表型明显，在3.5dpf时观察到心包腔水肿、心脏环化异常等明显的心脏发育畸形的现象。
[0050]
4)本发明通过基因组大片段敲除实现目的基因定点敲除的同时，又不干扰其他基因簇的功能，为后续相关研究提供依据。
附图说明
[0051]
图1为crispr/cas9介导的斑马鱼hoxba基因簇的删除模式图。
[0052]
图2为hoxba基因簇删除的打靶序列信息和位点分别位于hoxb13a的第一个外显子和hoxb1a的第一个外显子。
[0053]
图3为突变体筛选过程中分别利用双外侧引物pcr检测f0，f1，f2斑马鱼基因型。
[0054]
图4为测序峰图显示在纯合突变体中，hoxba基因簇成功删除。
[0055]
图5为hoxba基因簇f1突变体基因型pcr检测结果。
[0056]
图6为hoxba基因簇纯合突变体的基因序列。
[0057]
图7为hoxba基因簇缺失后斑马鱼胚胎的突变表型图。野生型(a)和hoxba突变体(b)在3.5dpf时期的心脏表型；(c)hoxba突变体的心脏环化角度相比于野生型显著性增大。n≥3，p＝0.00537。*：p《0.05，**：p《0.01，***：p《0.001。标尺＝0.1mm。
[0058]
图8为hoxba基因簇缺失后斑马鱼胚胎的突变表型图。野生型(a)和hoxba突变体(d,g)在3.5dpf时期的心脏表型；图中*号代表心包腔肿大的位置，(b,e,h)心脏区域放大图，黑色虚线描绘心包腔轮廓；(c,f,i)心脏荧光标记图，hoxba突变体的心脏环化相比于野生型明显异常，白色虚线描绘心脏轮廓。(a,d,g)标尺＝0.2mm，(c,f,i)标尺＝0.1mm。
具体实施方式
[0059]
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
[0060]
实施例
[0061]
1材料及设备
[0062]
1.1实验用鱼
[0063]
本实验中所用的斑马鱼来源于上海海洋大学水产与生命学院斑马鱼平台。
[0064]
1.2质粒
[0065]
grna骨架质粒来源于文献：chang n，sun c，gao l，zhu d，xu x，zhu x，xiong jw，xi jj.genome editing with rna-guided cas9 nuclease in zebrafish embryos，cell res，2013，23(4):465-472。
[0066]
1.3主要试剂
[0067]
dnaclean&contentrator-5(zymo research，d4004)，t7 in vitro transcription kit(ambion，am1314)，乙醇(无水乙醇)(国药集团化学试剂有限公司，10009218)，gencrispr nls-cas9-nls(金斯瑞，z03389-25)，普通dna纯化试剂盒(tiangen，dp204-03)，premix taq
tm
(ex taq
tm version 2.0 plus dye)(takara，rr902)，dna marker i(tiangen，md101-02)，t7endonuclease 1(new englandinc.，m0302l)，dh5a感受态细胞(天根生化科技有限公司，cb101-03)，2beasytaq pcr supermix( dye)(takara，as111-12)，lb broth(上海生工，d915ka6602)，快速质粒小提试剂盒(tiangen，dp105)，lb broth agar(上海生工，d911ka6566)，pmd
tm 19-t vector cloning kit(takara，6013)。
[0068]
1.4主要仪器
[0069]
pcr仪(品牌：bio-rad，型号：c1000 touch
tm
thermal cycler)，小离心机(品牌：eppendorf，型号：centrifuge 5424)，震荡混匀仪(品牌：vortex-genie，型号：g560e)，紫外分光光度计(品牌：thermo scientific，型号：nanodrop 2000c)，高压蒸汽灭菌锅(品牌：sanyo，型号：mls-3780)，电泳仪(品牌：bio-rad，型号：powerpac basic)，照胶仪(品牌：bio-rad，型号：gel doc ez imager)，电子天平(品牌：mettler toledo，型号：al104)，milli-q direct 8超纯水系统(品牌：millipore，型号：milli-q direct 8)，垂直拉针仪(品牌：narishige，型号：pc-10)，恒温摇床(品牌：innova，型号：40r)，磨针器(品牌：narishige，型号：eg-400)，微量注射泵(品牌：warner，型号：pli-100a)，恒温水浴锅(品牌：精宏，型号：h1401438，dk-8d)，玻璃毛细管(品牌：wpi，型号：tw100f-4)，4℃冰箱(品牌：haier，型号：hyc-610)，-40℃低温冰箱(品牌：haier，型号：dw-40l508)，-80℃超低温冰箱(品牌：pana-sonic，型号：mdf-u53v)。
[0070]
2实验方法
[0071]
2.1hoxba基因敲除靶点的设计与筛选
[0072]
(1)hoxba基因簇靶点的特异性检测和选择分析
[0073]
a、下载序列：在ensembl数据库查找并下载斑马鱼hoxb13a和hoxb1a的基因序列。
[0074]
b、靶点设计：利用http://zifit.partners.org/zifit/choicemenu.aspx网站在hoxb13a和hoxb1a基因atg之后的外显子序列上设计靶点，得到hoxb13a两个靶点序列为
①
ggatgagctgaagaatatgg；
②
ggacgtatcgacttcaagtt。得到hoxb1a三个靶点序列为
①
ggaactgggacaacaagtta；
②
ggtgcgtactgcggggcaca；
③
ggcctctcaaggaacggaga。经过实验验证，发现hoxb13a靶点：ggatgagctgaagaatatgg(seq id no:1)，和hoxb1a靶点：ggaactgggacaacaagtta(seq id no:2)敲除效果最好，具体靶点信息如表1所示。
[0075]
表1：hoxb13a和hoxb1a靶位点序列
[0076][0077]
c、靶点特异性检测：在ncbi网站将设计的靶点序列通过blast比对，验证靶位点特异性。
[0078]
d、亲本检测：将用于基因敲除的wt斑马鱼剪尾并用碱裂解法获得基因组dna，进行pcr扩增靶点附近的一段序列。
[0079]
e、测序鉴定：将pcr产物送测序，峰图及序列比对，确认亲本为纯合子，不存在自然突变，从而保证后续制备的突变体为基因敲除后造成的。
[0080]
(2)靶点检测引物的设计：设计的引物应保证距离靶点两侧大于100bp，并且上下游引物到靶点的距离与下游引物到靶点的距离应相差大于100bp，至少50bp，引物扩增应具备特异性，扩增片段约500bp，引物在上海生工生物工程股份有限公司合成(表2)。
[0081]
表2：实验所用引物信息
[0082][0083][0084]
(3)grna产物合成：以grna骨架质粒为模板，使用引物t7-hoxb13a-sfd，t7-hoxb1a-sfd分别和grna反向引物及2
×
easytaq pcr supermix( dye)扩增片段并用试剂盒纯化。
[0085]
(4)体外转录：反应体系：
[0086]
表3
[0087]
nuclease-free waterto 20μldna template1μg10
×
transcription buffer2μl10mm atp1μl10mm ctp1μl10mm gtp1μl10mm utp1μlt7enzyme mix2μl
[0088]
注意：最后添加10
×
transcription buffer和t7enzyme mix
[0089]
混匀并短暂离心后，37℃孵育80min；之后向体系中加入1μl turbo dnase并混匀，短暂离心后37℃孵育15min。
[0090]
(5)纯化grna：
[0091]
a、向20μl体外转录体系中加入2.5μl4 m的licl和100μl体无水乙醇，混匀并短暂离心后放于-80℃冰箱至少1h。
[0092]
b、到时间后从冰箱取出，4℃，12000rmp，离心15min。弃上清后用70％乙醇清洗沉淀。4℃，8000rmp，离心5min。弃上清后将离心管放于通风橱中使乙醇挥发干净。
[0093]
c、根据沉淀大小加入适量depc水溶解grna沉淀。
[0094]
d、用nanodrop检测浓度和od值并用电泳检测。
[0095]
其中，hoxb13a grna的序列为
[0096]
taatacgactcactataggatgagctgaagaatatgggttttagagctagaaatagcggacagattcatgtcctggacgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttt(seq id no:6)；
[0097]
hoxb1a grna的序列为
[0098]
taatacgactcactataggaactgggacaacaagttagttttagagctagaaatagcggacagattcatgtcctggacgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttt(seq id no:7)。
[0099]
2.2显微注射
[0100]
将grna与cas9蛋白(购买于gencrispr nls-cas9-nls(金斯瑞，z03389-25))混合，利用显微注射仪器将混合后的物质注射到斑马鱼一细胞期胚胎中，每次注射都留一批未注射的同批次胚胎作为对照组。混合注射终浓度：grna为100ng/μl，cas9蛋白为800ng/μl。
[0101]
2.3检测敲除是否成功及敲除效率(pcr检测)
[0102]
a、提取鱼卵基因组
[0103]
每组5枚卵，加35μl 50mm naoh，95℃孵育20min，中间取出振荡，短暂离心一次。之后加3.5μl 1m的tris
·
hcl(ph≈8.0)，剧烈振荡混匀后离心。
[0104]
b、pcr扩增目的片段
[0105]
根据靶点附近设计的引物扩增目的片段。
[0106]
pcr反应体系：
[0107]
表4
[0108]
h2oto 25μl
酶12.5μlf0.5μlr0.5μl模板10ng
[0109]
pcr反应条件：
[0110]
98℃预变性2sec；98℃变性10sec，60.3℃退火30sec，72℃延伸1min，共32个循环；72℃再延伸5min；4℃保存。
[0111]
2％琼脂糖凝胶120v电泳25min。
[0112]
c、电泳检测
[0113]
电泳后利用凝胶电泳成像仪对电泳的琼脂糖凝胶成像，观察目的条带，判断敲除是否成功。
[0114]
2.4 hoxba基因簇缺失纯合突变体斑马鱼基因型鉴定
[0115]
不同的缺失类型进行基因型筛选鉴定。
[0116]
3实验结果
[0117]
3.1 hoxba基因簇突变体的构建
[0118]
3.1.1 hoxbaf0基因敲除检测结果
[0119]
pcr结果显示hoxba基因簇敲除成功。测序峰图显示hoxb13a基因靶点和hoxb1a基因靶点之间的基因组序列均被删除，证明敲除成功(图1、2、3、4)。
[0120]
3.1.2 hoxbaf
0 germline transmission检测结果
[0121]
取20尾hoxba f0基因检测敲除成功的成鱼与野生型斑马鱼外交，得到的f1胚胎5枚一管，取3-4管进行双外侧引物pcr鉴定，结果显示，有1尾斑马鱼将突变传递给后代(图1、2、3、4)。
[0122]
3.1.3hoxba f1杂合突变体斑马鱼基因型鉴定
[0123]
剪尾检测71尾外交获得的斑马鱼hoxba基因，经pcr检测，获得48条阳性斑马鱼，并进行测序验证，确认发生hoxba基因簇大片段删除(图5和图6)。
[0124]
3.1.4hoxba f2突变体斑马鱼表型观察拍照
[0125]
(1)将hoxba基因簇杂合突变体内交，产卵后收集培养用于早期胚胎发育观察，在3.5dpf时观察到心包水肿，心脏环化异常等明显的心脏畸形的现象(图7)。
[0126]
(2)为进一步确定hoxba基因簇突变体表型，故取3.5dpf的hoxba基因簇缺失的突变体和野生型的心脏进行观察拍照，并用于后续基因型鉴定(图8)。
[0127]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。