一种用于鸵鸟性别鉴定的PCR引物及鉴定方法

一种用于鸵鸟性别鉴定的pcr引物及鉴定方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种用于鸵鸟性别鉴定的pcr引物及鉴定方法。


背景技术：

2.鸵鸟的早期性别鉴定有利于鸵鸟雌雄分群饲养，从而加快繁育进程、提高雏鸟存活率、保证合适的雌雄比例。然而雌雄鸵鸟在性成熟前的外形相同，难以区分雌雄，造成鸵鸟早期分群饲养困难，常引起交易双方的经济纠纷。因此鸵鸟早期性别鉴定具有重要的生产经济价值。
3.传统方法在鸵鸟4月龄时才能进行性别鉴定，有经验者可在鸵鸟1月龄左右通过翻肛检查法进行鉴定。这些方法受主观影响大、过程繁琐，导致效率低下且准确率不高。此外，鸵鸟与家禽基因组差异大，针对家禽的pcr鉴定引物并不适用于鸵鸟。基于此，需要借助分子生物技术针对鸵鸟开发一种简单方便、快速准确的鸵鸟性别鉴定方法。
4.因此，提供一种用于鸵鸟性别鉴定的pcr引物及鉴定方法是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明提供了一种用于鸵鸟性别鉴定的pcr引物及鉴定方法。
6.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.一种用于鸵鸟性别鉴定的pcr引物，所述引物序列如下：
8.正向引物：5
’‑
tgctgtagcgttggtcagtgta-3’；seq id no.1；
9.反向引物：5
’‑
gccactttcagttacagcccac-3’；seq id no.2。
10.所述引物结合利用聚合酶链式反应(pcr)检测试剂，能准确地鉴定出鸵鸟的性别，可以将其应用到鸵鸟的繁育生产中。
11.进一步，一种鉴定鸵鸟性别的方法，包括以下步骤：
12.(1)提取待鉴定鸵鸟的基因组dna；
13.提取待测鸵鸟的基因组dna可以按照本领域常规方法提取，例如可以选用待鉴定鸵鸟的毛囊、血液、组织等进行基因组dna的提取；
14.(2)以步骤(1)提取的基因组dna为模板，利用所述的用于鸵鸟性别鉴定的pcr引物进行pcr扩增，得到pcr产物；
15.(3)利用凝胶电泳检测步骤(2)得到的pcr产物，并观察电泳结果；根据电泳结果鉴定鸵鸟性别：若电泳结果出现两条条带，则鸵鸟鉴定为雌性；若电泳结果仅出现一条条带，则鸵鸟鉴定为雄性。
16.进一步，步骤(2)所述pcr扩增的反应体系为：2
×
taq pcr mix 10μl，10μmol/l正向和反向引物各0.6μl，50-100ng/μl dna模板2μl，超纯水6.8μl。
17.进一步，步骤(2)所述pcr扩增的反应条件为：95℃预变性2min；95℃变性30s，56℃
退火30s，72℃延伸2min，重复34个循环。
18.进一步，步骤(3)所述根据电泳结果鉴定鸵鸟性别具体为：电泳结果鉴定为雌性鸵鸟的两条条带的大小分别为1463bp和1108bp；鉴定为雄性鸵鸟的一条条带的大小为1463bp。
19.进一步，所述的一种用于鸵鸟性别鉴定的pcr引物在鉴定鸵鸟性别中的应用。
20.进一步，所述的一种用于鸵鸟性别鉴定的pcr引物在鸵鸟养殖业中的应用。
21.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种用于鸵鸟性别鉴定的pcr引物及鉴定方法，通过设计的pcr引物，进行pcr扩增和琼脂糖凝胶电泳，利用电泳结果的条带数来确定鸵鸟的性别，操作简单方便，鉴别结果快速准确，便于基层推广和使用，具有广阔的市场应用前景。
附图说明
22.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
23.图1附图为本发明实施例1中雄鸵鸟pcr扩增产物的电泳图谱；
24.其中，m：dl2000 marker；51-56℃为六个退火温度；
25.图2附图为本发明实施例1中雌鸵鸟pcr扩增产物的电泳图谱；
26.其中，m：dl2000 marker；51-56℃为六个退火温度；
27.图3附图为本发明实施例2中10只鸵鸟pcr扩增产物的电泳图谱；
28.其中，m：dl2000 marker；1-10为10只鸵鸟。
具体实施方式
29.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
30.实施例1已知性别鸵鸟鉴定
31.(1)样品采集
32.选择雌雄鸵鸟各一只，提取毛囊基因组dna，使用鸵鸟性别鉴定引物扩增鸵鸟基因组，引物序列如下：
33.正向引物：5
’‑
tgctgtagcgttggtcagtgta-3’；seq id no.1；
34.反向引物：5
’‑
gccactttcagttacagcccac-3’；seq id no.2。
35.(2)pcr扩增
36.pcr扩增的反应体系为：
[0037]2×
taq pcrmix 10μl，10μmol/l正反方向引物各0.6μl，50-100ng/μl模板dna 2μl，超纯水6.8μl。
[0038]
pcr扩增的反应程序为：95℃2min；(95℃30s，51-56℃(设置六个退火温度梯度)
30s，72℃2min)，34个循环。
[0039]
(3)电泳检测
[0040]
pcr反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。从退火温度51℃至56℃，雄鸵鸟电泳检测只有一条1463bp的条带，结果见图1。雌鸵鸟电泳检测有1463bp和1108bp两条主带，结果见图2。在不同的退火温度条件下结果一致稳定，后续选择56℃退火。
[0041]
实施例2未知性别鸵鸟鉴定
[0042]
(1)样品采集
[0043]
采集10只未知性别的鸵鸟，提取毛囊基因组dna，并用鸵鸟性别鉴定引物扩增鸵鸟基因组，引物序列如下：
[0044]
正向引物：5
’‑
tgctgtagcgttggtcagtgta-3’；seq id no.1；
[0045]
反向引物：5
’‑
gccactttcagttacagcccac-3’；seq id no.2。
[0046]
(2)pcr扩增
[0047]
pcr扩增的反应体系为：
[0048]2×
taq pcrmix 10μl，10μmol/l正反方向引物各0.6μl，50-100ng/μl模板dna 2μl，超纯水6.8μl。
[0049]
pcr扩增的反应程序为：95℃2min；(95℃30s，56℃30s，72℃2min)，34个循环。
[0050]
(3)电泳检测
[0051]
pcr反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。雄鸵鸟电泳检测只有一条1463bp的条带，雌鸵鸟电泳检测有1463bp和1108bp两条带，结果见图3。图3结果表明，1、2、3、4、5为雄鸵鸟，6、7、8、9、10为雌鸵鸟。
[0052]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。