一种凝结芽孢杆菌C56、其菌株特性和应用的制作方法

一种凝结芽孢杆菌c56、其菌株特性和应用
技术领域
1.本发明属于微生物培育技术领域，更具体的涉及一种凝结芽孢杆菌c56、其良好的菌株特性和应用。


背景技术：

2.凝结芽孢杆菌（bacillus coagulans/weizmannia coagulans），革兰阳性，属于硬（或厚）壁菌门，凝结芽孢杆菌分类学上属于魏茨曼氏菌属，细胞呈杆状，革兰氏阳性菌，端生芽孢，无鞭毛，分解糖类生成l-乳酸，为同型乳酸发酵，最适生长温度为45-50℃，最适ph为5.5-7.0，凝结芽孢杆菌是兼性厌氧菌，在有氧及无氧的环境下都可生长，能适应低氧的肠道环境，对酸和胆汁有较高的耐受性，能够进行乳酸发酵，产生的l-乳酸能降低肠道ph值，抑制有害菌，并能促进双歧杆菌等有益菌的生长和繁殖。
3.现有市场上的凝结芽孢杆菌较少针对其产蛋白酶和利用木寡糖的特性进行研究，且大多数菌株对病原菌的抑制效果评估不够全面，产酸效果也不够理想，对此我公司开发出凝结芽孢杆菌c56。


技术实现要素：

4.为了开发有丰富菌株特性的凝结芽孢杆菌，并提高凝结芽孢杆菌对病原菌的抑制效果和产酸能力，让凝结芽孢杆菌更好的在饲料中使用，本技术提供一种凝结芽孢杆菌c56、其良好的菌株特性和应用前景。
5.一种凝结芽孢杆菌c56，于2020年10月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no .20923，分类命名为凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans/weizmannia coagulans)。
6.凝结芽孢杆菌c56的生物学特性：凝结芽孢杆菌c56对于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都有一定的抑制作用，为乳白色不透明菌落，表面不光滑。
7.凝结芽孢杆菌c56营养体为杆状，芽孢为圆形或椭圆形，端生。芽孢未从营养体上脱落时呈特有的“火柴”状。
8.优选的，所述凝结芽孢杆菌c56能利用木寡糖，且c56利用木寡糖增殖的效果优于葡萄糖，利用木寡糖产酸的效果和葡萄糖相近。
9.优选的，所述凝结芽孢杆菌c56在有氧和无氧条件下均能产蛋白酶，而且无氧条件下产蛋白酶效果更好；此外所述凝结芽孢杆菌c56在有无易耗蛋白的情况下均能产蛋白酶。
附图说明
10.图1是本发明菌株菌落形态图；图2是本发明菌株芽孢形态图；图3是本发明菌株对不同病原菌的抑制图；图4是本发明菌株产酸测定图；
图5是本发明菌株厌氧情况产蛋白酶图；图6是本发明菌株有氧情况产蛋白酶图。
具体实施方式
11.下面结合附图1-6和实施例对本技术作进一步详细说明。予以特别说明的是：以下实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行，以下实施例中所用原料除特殊说明外均可来源于普通市售。
12.、实验材料1.1病原菌：1）：大肠杆菌k88（atcc25922）、2）：大肠杆菌k99（c83922）、3）：沙门氏菌（atcc14028）、4）：猪霍乱沙门氏菌（cmcc50018）、5）：鸡白痢沙门氏菌（c7913）、6）：肠炎沙门氏菌（cgmcc1.1194）、7）：产气荚膜梭菌a型（cvcc52）、8）：产气荚膜梭菌a型（cvcc1142）、9）：产气荚膜梭菌c型（cvcc1158）、10）：产气荚膜梭菌a型（cvcc2027）、11）：金黄色葡萄球菌（atcc6538p）、12）：维氏气单胞菌（cgmcc1.927）、13）：嗜水气单胞菌（gim1.172）、14）：迟缓爱德华菌（cicc10497）、15）：温和气单胞（gim1.890）、16）：副溶血弧菌（cicc21617）。
13.1.2稀释液：稀释液：0.9%氯化钠水溶液，配制完成后，分装9ml稀释液至15
×
150的试管中，121℃灭菌30min。
14.1.3培养基（每1000ml培养基含有）益生菌活化培养基：胰蛋白胨10g、酵母膏5g、葡萄糖5g、牛肉膏5g、无水氯化钙0.15g、一水合硫酸锰 0.1g、氯化钠2.5g、l
‑ꢀ
半胱氨酸盐酸盐0.5g、番茄粉0.5g，调节ph至5.5，121℃灭菌30min。
15.抑菌平板：成分同益生菌活化培养基，额外添加25g琼脂。其中用于病原菌12-16的抑菌平板调节ph至7.0，琼脂1.5g，121℃灭菌30min。
16.产酸测定培养基：成分同益生菌活化培养基，不添加琼脂，调节ph至7.0，分装50ml至150ml三角瓶，121℃灭菌30min。
17.na培养基：蛋白胨10g、牛肉膏3g、nacl 5g，调节ph至7.2-7.4，121℃灭菌30min。固体培养基额外添加15g琼脂粉。
18.益生菌抑菌培养基：蛋白胨20g、酵母膏10g、番茄汁200ml、葡萄糖20g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁1g。调节ph至6.5-7.0，121℃灭菌30min。（番茄汁的配制：取新鲜的番茄称重，然后按照重量以 1:1 的比例加水。用榨汁机榨成汁，4层纱布过滤除渣，配制好后将番茄汁放在4℃冰箱保存，一周内可以使用。）木寡糖利用培养基：成分同益生菌活化培养基，实验组以1g木寡糖代替原培养基中5g葡萄糖，对照组1以1g葡萄糖代替代替原培养基中5g葡萄糖，对照组2不添加葡萄糖，调节ph至7.0，121℃灭菌30min。
19.产蛋白酶培养基：成分同益生菌活化培养基，分别以8g酪蛋白、8g酪蛋白 5g胰蛋白胨、8g酪蛋白 10g胰蛋白胨代替原培养基中10g胰蛋白胨，调节ph至7.0，121℃灭菌30min。
20.1.4实验仪器
控温摇床、灭菌锅、移液器、涡旋仪、ph计、恒温培养箱、超净工作台、pcr仪、电泳仪、离心机等。
21.2、实验方法及结论2.1 凝结芽孢杆菌c56菌落形态（1）挑取活化后凝结芽孢杆菌c56单菌落至5ml益生菌活化培养基中，摇床40℃、200rpm培养24h。
22.（2）对凝结芽孢杆菌c56培养液进行10倍梯度稀释，估算培养液的菌含量，选取2-3个适当稀释度，吸取一定量稀释液（计算长出菌落在50-100个）至益生菌活化培养基平板中，用涂布器涂干，每个梯度涂布2-3个重复。将平板放入40℃培养箱中倒置培养24h后观察菌落形态，c56在益生菌活化培养基上的菌落形态如图1，为乳白色不透明菌落，表面不光滑。
23.2.2凝结芽孢杆菌c56的16s rrna基因鉴定（1）用lysis buffer（takara）按照说明对株菌株进行dna提取，所得dna直接作为pcr扩增模板。
24.（2）采用通用引物27f/1492r对dna模板进行扩增，扩增产物送由测序公司进行测序。
25.（3）序列经过拼接后在ncbi数据库中对比。
26.凝结芽孢杆菌c56 16s rrna基因序列序列如下，gtcaccttcggcggctggctccgtaaggttacctcaccgacttcgggtgttacaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccggcttcatgcaggcgggttgcagcctgcaatccgaactgggaatggttttctgggattggcttaacctcgcggtctcgcagccctttgtaccatccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcaccttagagtgcccaactgaatgctggcaactaaggtcaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcactctgtcccccgaaggggaaggccctgtctccagggaggtcagaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcagccttgcggccgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcagcactaaagggcggaaaccctctaacacttagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgcgcctcagcgtcagttacagaccagagagccgccttcgccactggtgttcctccacatctctacgcatttcaccgctacacgtggaattccactctcctcttctgcactcaagcctcccagtttcaatgaccgcttgcggttgagccgcaagatttcacatcagacttaagaagccgcctgcgcgcgctttacgcccaataattccggacacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggccgggtaccgtcaaggcgccgccctgttcgaacggcacttgttcttccccggcaacagagttttacgacccgaaggccttcttcactcacgcggcgttgctccgtcagactttcgtccattgcggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtttgggccgtgtctcagtcccaatgtggccgatcaccctctcaggtcggctacgcatcgttgccttggtgagccgttaccccaccaactagctaatgcgccgcgggcccatctgtaagtgacagccgaagccgtctttcctttttcctccatgcggaggaaaaaactatccggtattagccccggtttcccggcgttatcccgatcttacaggcaggttgcccacgtgttactcacccgtccgccgctaaccttttaaaagcaagctttaaaaggtccgcacgactgcatgtatagc在ncbi数据库中进行比对，结果显示与凝结芽孢杆菌（bacillus coagulans/weizmannia coagulans）的同源性》99%，判定为凝结芽孢杆菌。
27.2.3凝结芽孢杆菌c56芽孢染色使用芽孢染色试剂盒（索莱宝）按照说明书进行操作。
28.凝结芽孢杆菌c56经过芽孢染色后如图2，结果显示凝结芽孢杆菌c56营养体为杆状，芽孢为圆形或椭圆形，端生。芽孢未从营养体上脱落时呈特有的“火柴”状。
29.2.4凝结芽孢杆菌c56对不同病原菌的抑制作用（1）挑取活化后病原菌单菌落到5ml na液体培养基中振荡培养，37℃、200rpm 培养 24h，其中产气荚膜梭菌需用血琼脂平板活化且液体培养为厌氧静置培养，病原菌12-16在30℃培养。
30.（2）挑取活化后c56单菌落到5ml益生菌抑菌液体培养基中振荡培养，37℃、200rpm 培养 24h。
31.（3）将病原菌菌液稀释100倍后吸取200
µ
l涂布抑菌平板，涂干。静置10min后在平板上放置牛津杯，在牛津杯中加入200
µ
l c56菌液，正置放入培养箱37℃培养18h左右，其中产气荚膜梭菌需厌氧培养, 病原菌12-16在30℃培养。之后用镊子垂直取出牛津杯，测量透明圈直径，垂直测量两个方向，求平均值即为抑菌圈直径。
32.结论：如图3所示凝结芽孢杆菌c56对不同病原菌有抑制作用，抑菌圈直径测量结果如下表（牛津杯直径为7.8mm），结果显示凝结芽孢杆菌对上述革兰氏阴性菌和阳性菌均有一定的抑制作用。
33.表1 凝结芽孢杆菌c56对不同病原菌的抑菌圈直径（mm）2.5凝结芽孢杆菌c56产酸（1）挑取活化后c56单菌落到5ml益生菌抑菌液体培养基中振荡培养，40℃、200rpm培养 24h。
34.（2）将培养好菌的液分别接种到50ml产酸测定培养基中，每瓶接种400μl菌液，每4个重复中接种3瓶，另一瓶作为空白对照。混合均匀后，40℃静置培养24h，测定其中2瓶平行和空白培养液的ph。
35.（3）将未测定ph值的第3个平行培养液10000r/min离心12min，收集上清液，再用0.22μm滤膜过滤，完全去除菌体。之后送到中国农业大学农业部饲料效价与安全监督检验测试中心，进行有机酸含量的测定。
36.结论：高效液相色谱如图4所示；凝结芽孢杆菌c56培养液ph的测定结果如表2，结果表明c56能够有效降低培养液ph，从产物中分析酸种类和含量发现，c56主要产乳酸，且产酸量较高。
37.表2凝结芽孢杆菌c56培养液ph测定（2）对发酵液中的：乳酸、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸含量进行液相色谱分析，结果如表3：表3 凝结芽孢杆菌c56培养液有机酸测定（μg/ml）培养液乳酸甲酸乙酸丙酸丁酸样品c3.37
×
10322158312.6凝结芽孢杆菌c56利用木寡糖（五碳糖）（1）挑取活化后c56单菌落到5ml益生菌活化培养基中振荡培养，40℃、200rpm培养24h。
38.（2）将培养好的菌液分别接种到50ml木寡糖利用和对照培养基中，每瓶接种400μl菌液，每4个重复中接种3瓶，另一瓶作为空白对照。混合均匀后，40℃静置培养24h，测定培养液的od
600
和ph。
39.结论：c56对木寡糖的利用情况如表4，结果显示c56能利用木寡糖，且c56利用木寡糖增殖的效果优于葡萄糖，利用木寡糖产酸的效果和葡萄糖相近。
40.表4 c56对木寡糖的利用
2.7凝结芽孢杆菌c56产蛋白酶（1）挑取活化后c56单菌落到5ml益生菌活化培养基中振荡培养，40℃、200rpm培养24h。
41.（2）点种到产蛋白酶培养基，分别在厌氧和有氧条件下培养，40℃培养72h，其中厌氧培养时以丁酸梭菌作为对照。之后测量菌落和蛋白圈直径，垂直测量两个方向求平均值，通过蛋白圈和菌落直径之比，可以判断产蛋白酶的强弱。
42.结论：产蛋白酶照片如图5-6，结果显示c56在有氧和无氧条件下均能产蛋白酶，而且无氧条件下产蛋白酶效果更好；此外结果也显示c56在有无易耗蛋白的情况下均能产蛋白酶。d蛋白圈/d菌落值如表5所示。
43.表5 d蛋白圈/d菌落值培养基情况d蛋白圈/d菌落（有氧）d蛋白圈/d菌落（厌氧）7.0-10 83.186.407.0 5 82.355.337.0 10 82.535.00