一种基于LAMP和Multi-LAMP的快速检测细胞种属及交叉污染的试剂组

一种基于lamp和multi-lamp的快速检测细胞种属及交叉污染的试剂组
技术领域
1.本发明属于生命科学及医学领域，主要涉及到一种实验用细胞种属，及其他种属交叉污染的快速检测试剂组。


背景技术：

2.细胞是生命科学和医学领域体外研究的重要模型，为了确保相关研究的正确性和可重复性，细胞的种属必须是正确的，且没有其他种属污染。原代细胞在分离的时候，细胞系在建系的时候，取材错误，耗材共用会导致交叉污染。永生化的细胞因为具备无限传代的能力，在传代的过程中，操作失误也很容易引入其它细胞，导致污染。在细胞培养相关研究的早期，人们就意识到了细胞种属来源鉴定和交叉污染检测的重要性，一旦身份错误的细胞被使用，相关研究无效，造成各种资源，时间和金钱的浪费。错误的实验结论如果用于临床，后果会非常严重。
3.目前关于细胞种属鉴定及交叉污染检测的技术主要有同工酶法和pcr法。在过去的五六十年，同工酶检测一直是种属鉴定的标准方法，该方法是基于不同种属间同工酶(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶g6pd，乳酸脱氢酶ld，核苷磷酸化酶np，苹果酸脱氢酶md)电泳条带数量和大小的差异来鉴定细胞的种属。同工酶分析需要优化实验条件，包括电泳、显色时间来确定合适的条带迁移距离，以及选择合适的酶的组合来判断预期物种。有些物种的条带相似，很难区分，因此电泳结果的分析需要跟一组已知物种进行比对，才能确定种属来源。此外，商业化的试剂盒已于2015年停止销售，用于配制电泳缓冲液的药品在管控范围内，很难购买。这些因素限制了同工酶电泳在细胞种属鉴定中的应用。
4.细胞种属鉴定的pcr法是最近20年发展起来的，该方法通过pcr仪扩增种属特异性基因获得不同大小的条带，通过琼脂糖凝胶电泳来判断细胞的种属来源，跟同工酶法相比较，检测速度较快，相关试剂容易购买，但是需要pcr仪，dna成像仪。
5.环介导等温扩增法lamp(loop-mediated isothermal amplification)是一种新型的核酸扩增技术，针对目的基因设计4条引物，恒温反应几十分钟，就能肉眼判断实验结果。该方法比pcr法更简单，灵敏度更高，不需要价格万元以上的pcr仪，普通的水浴锅，就能满足实验需求。目前还没有人将lamp用于细胞种属鉴定和交叉污染的检测中。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种基于lamp和multi-lamp的快速检测细胞种属及交叉污染的试剂组，本发明的目的还在于提供所述试剂组的使用方法。
7.本发明的目的通过下述技术方案实现：
8.一种基于lamp和multi-lamp的快速检测细胞种属及交叉污染的试剂组，包含下述表1中所示的14种种属的lamp引物。
9.表1. 14种种属的lamp引物
10.[0011][0012]
进一步地，所述的试剂组还包含不同种属的dna。
[0013]
进一步地，所述的试剂组还包含lamp反应试剂。所述的lamp反应试剂包含bst dna聚合酶、dntp、缓冲液。所述的缓冲液优选为含2.5mm mg
2
的tris-hcl缓冲液。
[0014]
进一步地，所述的试剂组还包括染料。常用于lamp反应的染料包括孔雀绿、sybr green i、picogreen、羟基溴酚蓝等。更进一步地，所述的染料为孔雀绿。
[0015]
进一步地，所述的试剂组还包含细胞裂解液。所述的细胞裂解液的配方优选为：
2％triton x-100，1％sds，5％蔗糖，25mm tris-hcl，ph＝7.4。
[0016]
使用上述试剂组进行已知细胞种属及交叉污染鉴定的方法，包括如下步骤：
[0017]
(1)收集待检细胞，加入细胞裂解液，裂解后的液体直接用于下述反应。
[0018]
(2)取6个ep管；
[0019]
其中3个ep管用于lamp反应，分别加入待检细胞所属种属的lamp引物、bst dna聚合酶、dntp、缓冲液、孔雀绿，再各分别加入水作为阴性对照、加入待检细胞所属种属dna作为阳性对照、加入裂解后的液体作为样品；
[0020]
另3个ep管用于multi-lamp反应，分别加入非待检细胞所属种属的13种种属lamp引物混合物、bst dna聚合酶、dntp、缓冲液、孔雀绿，再各分别加入水作为阴性对照、加入非待检细胞所属种属的13种种属dna混合物作为阳性对照、加入裂解后的液体作为样品。
[0021]
(3)将配制好的6管试剂置于60-65℃孵育35-40分钟。
[0022]
(4)反应结束后，观察每管的颜色，用于lamp反应的样品与阳性对照颜色一致，则待检细胞为所属种属细胞；用于multi-lamp反应的样品与阴性对照颜色一致，则说明待检细胞无其它种属细胞污染。
[0023]
使用上述试剂组进行未知细胞种属及交叉污染鉴定的方法，包括如下步骤：
[0024]
(1)收集待检细胞，加入细胞裂解液，裂解后的液体直接用于下述反应。
[0025]
(2)取42个ep管，按照每3个ep管一组对应一个种属，分别为阴性对照、阳性对照、样品管，各组分别加入bst dna聚合酶、dntp、缓冲液、孔雀绿、相应种属的lamp引物；阴性对照、阳性对照、样品管中分别加入水、对应种属的dna、上述裂解后的液体。
[0026]
(3)将配制好的42管试剂置于60-65℃孵育35-40分钟。
[0027]
(4)反应结束后，根据样品与不同种属阳性对照、阴性对照的颜色，确定待检细胞的种属以及是否有交叉污染。
[0028]
本发明的优点和有益效果：
[0029]
1、不需要提取样品dna，样品经过快速裂解后，可以直接用于lamp反应。
[0030]
2、不需要大型设备pcr仪和dna成像仪，水浴锅中反应，结果肉眼可读。
[0031]
3、可以在一管中同时检测出13种种属的细胞。
附图说明
[0032]
图1为实施例1中待检人源细胞的lamp和multi-lamp实验结果。
[0033]
图2为实施例2中14种物种阳性对照(模板为物种dna)的lamp结果。
[0034]
图3为实施例2中14种物种阴性对照(模板为超纯水)的lamp结果。
[0035]
图4为实施例2中待检未知细胞的lamp结果。
具体实施方式
[0036]
本发明针对14种常用细胞(牛，叙利亚仓鼠，猫，狗，人，小鼠，鸡，猪，中国仓鼠，大鼠，兔，豚鼠，绿猴，恒河猴)的种属，选取细胞色素氧化酶，atp合酶为目标基因，设计种属特异性lamp引物，如上表1所示。
[0037]
通常，lamp反应需要设计4-6条引物来扩增目的基因。为了避免lamp反应的假阳性，表1中提到的引物都是经过大量筛选后，确定具备足够的种属特异性。
[0038]
为了快速鉴定14种种属细胞(牛，叙利亚仓鼠，猫，狗，人，小鼠，鸡，猪，中国仓鼠，大鼠，兔，豚鼠，绿猴，恒河猴)，制备14个lamp反应试剂组和14个multi-lamp反应试剂组，组分如表2所示。multi-lamp反应是指将多个种属的引物按照比例混合后，加到同一个管子中，当出现相应种属的dna模板后，扩增反应就会开始。为了防止引物交联，影响引物与目的模板的配对，提高引物的灵敏度，所有种属的引物序列都是经过大量比对调整，引物浓度都是经过大量筛选，先2、3组引物混合，再5、6组引物混合，最后13组引物混合在一起。
[0039]
对于未知种属来源细胞的鉴定，lamp反应试剂组的组分如表3所示。
[0040]
表2. 14种种属鉴定的lamp反应试剂组
[0041]
[0042]
[0043]
[0044][0045]
表3.未知种属鉴定的lamp反应试剂组
[0046]
[0047][0048]
上述表2、3中的lamp反应预混液各组分浓度为：1u bst酶/50μl，0.25mm dntp，0.1％孔雀绿，含2.5mm mg
2
的tris-hcl缓冲液，200nm对应种属引物。
[0049]
上述表2中multi-lamp反应预混液各组分浓度为：1u bst酶/50μl，0.25mm dntp，0.1％孔雀绿，含2.5mm mg
2
的tris-hcl缓冲液，100-200nm各种属引物。每一个交叉污染检测试剂组中各引物的比例都不一样，具体如表4所示。为了防止引物之间的交联、引物与模板的非特异性结合，能够同时检测13种种属的混合引物必须是按照表4中的比例混合，这个比例是经过实验反复摸索得出的；如果不按照这个比例混合引物，某种种属或者某几种种属的dna无法检测出来。
[0050]
表4.交叉污染检测用引物混合比例(表中比例关系为摩尔比)
[0051]
[0052]
[0053][0054]
每个lamp反应试剂组中，除了表2和表3中提到的成分，还配有细胞裂解液。细胞裂解液的配方为：2％triton x-100，1％sds，5％蔗糖，25mm tris-hcl，ph＝7.4。
[0055]
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0056]
实施例1人源细胞种属及交叉污染的鉴定
[0057]
实验试剂：待检人源细胞，人源细胞lamp试剂组，超纯水。
[0058]
实验器材：水浴锅，加样枪，枪头。
[0059]
实验步骤：
[0060]
(1)收集待检细胞，细胞数量1
×
106～3
×
106。
[0061]
(2)加入细胞裂解液100μl，室温裂解5分钟，裂解后的液体，可以直接用于lamp反应。
[0062]
(3)取6个干净的1.5ml ep管，分别标记为“人
‑”
、“人 ”、“人样品”、“混
‑”
、“混 ”、“混样品”。
[0063]
(4)在“人
‑”
、“人 ”、“人样品”管中分别加入49μl试剂2(人源细胞lamp反应预混液：酶，dntp，缓冲液，孔雀绿，人lamp引物)，在“混
‑”
、“混 ”、“混样品”管中分别加入49μl试剂4(非人源细胞multi-lamp反应预混液：酶，dntp，缓冲液，孔雀绿，非人源13种种属lamp引物混合物)。
[0064]
(5)在“人
‑”
和“混
‑”
管中分别加入1μl超纯水，作为阴性对照；在“人 ”管中加入1μl试剂1(阳性对照：人dna)，在“混 ”管中加入1μl试剂3(阳性对照：非人源13种种属dna混合物)，作为阳性对照；在“人样品”和“混样品”管中，分别加入裂解好的样品1μl。
[0065]
(6)将配制好的6管试剂，放入水浴锅中，65℃孵育40分钟。
[0066]
(7)反应结束后，观察每管颜色的变化。如图1所示，待检细胞“人样品”与“人 ”管颜色一致，说明待检细胞为人源细胞；待检细胞“混样品”与“混
‑”
管颜色一致，说明待检细胞无其它种属细胞污染。
[0067]
实施例2未知细胞种属及交叉污染的鉴定
[0068]
实验试剂：待检未知细胞，未知种属细胞lamp试剂组，超纯水。
[0069]
实验器材：水浴锅，加样枪，枪头。
[0070]
实验步骤：
[0071]
(1)收集待检细胞，细胞数量1
×
106～3
×
106。
[0072]
(2)加入细胞裂解液100μl，室温裂解5分钟，裂解后的液体，可以直接用于lamp反应。
[0073]
(3)取42个干净的1.5ml ep管，14个为阴性对照，14个为阳性对照，14个为样品管，分别标记好。
[0074]
(4)所有ep管，按照每3个一组(阴性，阳性，样品各一管)，对应一个种属，分别加入14个种属的lamp反应预混液49μl。
[0075]
(5)在14个阴性对照管中再分别加入1μl超纯水，作为阴性对照；在14个阳性对照管中再加入对应种属的dna，作为阳性对照；在14个样品管中，再分别加入裂解好的样品1μl。
[0076]
(6)将配制好的42管试剂，放入水浴锅中，65℃孵育40分钟。
[0077]
(7)反应结束后，观察每管颜色的变化(图2、图3、图4)。如图4所示，待检细胞仅仅与“小鼠 ”管颜色一致，说明待检细胞为小鼠细胞，且无其它种属细胞污染。
[0078]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。