一种柑橘DNA快速提取方法与流程

一种柑橘dna快速提取方法
【技术领域】
1.本发明属于植物dna提取技术领域，具体涉及一种柑橘dna快速提取方法。


背景技术：

2.柑橘属芸香科(rutaceae)植物，种类繁多。中国作为柑橘重要的原产地之一，拥有丰富的柑橘种类资源和悠久的栽培历史。在前人的研究中，有多种重要的柑橘药材被开发利用，如陈皮、青皮、佛手、香橼、化橘红、枳实、枳壳等。因药材的特殊性，保证其真实性、道地性极为重要，而在制作成药过程中，不同的炮制工艺会改变原料的形态、色泽等，故而造成一些道地性药材很容易被掺假、造假，利用常规手段辨识真伪极为困难，如广陈皮与陈皮、化橘红中的毛橘红与光橘红等。但是，炮制后的药材基因组dna降解严重，使用市面上现有试剂盒提取的dna浓度太低且含有较多杂质。
3.不同生物间基因组dna各不相同，所以利用现代分子生物学技术可以有效的鉴定出不同样本材料的来源，包括柑橘类药材。dna提取是分子生物学试验最基础的试验，也是进行后期基因研究最重要的保证。植物细胞含有细胞壁，含有较多的多糖、多酚等次生代谢产物，并且不同的植物细胞中含有的次生代谢产物的种类及含量差异较大，dna含量相对较小，会导致在提取过程中一些其他杂质类的物质与dna粘附或者在繁琐提取过程中导致dna片段的丢失，进而影响dna的提取质量和纯度。
4.目前，已有相关的研究，例如中国专利申请号cn202010051044.2公开了一种植物dna的快速提取方法，包括以下步骤：步骤1：将新鲜植物组织研磨成匀浆；步骤2：向匀浆中加入改良裂解液，离心，获取上清液；所述改良裂解液包含以下组分：tris-hcl、nacl溶液、edta溶液、pvp、改性活性炭；步骤3：向上清液中加入95％乙醇溶液，离心获取沉淀；步骤4：用75％乙醇溶液进行洗涤沉淀，得到纯品dna；该方法简单易实施，未使用高毒化学试剂，有利于试验人员的身心健康，更重要的是，通过裂解液的改良，可以明显的提高植物dna的提取质量和纯度，实用性比较强。
5.综上所述，进行dna提取常用的方法有ctab法、试剂盒法、sds法，但是这些方法在进行植物基因提取的过程中存在步骤多、操作繁琐、操作时间长、使用高毒有害试剂等缺点。而只有提取高质量、高纯度的dna才能对限制性酶切、pcr扩增、分子杂交、遗传多态性分析、基因组学等分子生物学研究打下良好基础。


技术实现要素：

6.针对现有技术的柑橘dna提取方法存在步骤多、操作繁琐、操作时间长、使用高毒有害试剂等不足，本发明提供了一种柑橘dna快速提取方法，直接用两颗钢珠之间摩擦所得热量加热植物组织匀浆代替65℃、45min水浴过程，在质量更好的同时，本发明所述的一种柑橘dna快速提取方法用时更少，抽提出浓度较高、纯度比较好柑橘基因组dna，在科研实践中具有很强的实用性。
7.本发明的目的通过以下技术方案实现：
8.一种柑橘dna快速提取方法，包括如下步骤：
9.1)用流水冲净柑橘叶片，用纸吸干水分后，切取0.1-0.2cm2植物组织，放入2ml无菌离心管，并放入2颗6mm无菌钢珠，加入1200ul提取液，盖好管盖，放入震荡磨样机，震荡15min得均浆组织；
10.2)取800ul均浆组织，转移入另一新的2ml无菌离心管中，加入800ul酚/氯仿/异戊醇混合液(tris饱和酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1的体积比)，涡旋混匀，离心，14000rpm，25℃，10min，保留上清液；
11.3)将上步骤得到的700ul上清液转移到一新的无菌2ml离心管中，加入700ul氯仿/异戊醇混合液(氯仿:异戊醇＝24:1的体积比)，涡旋混匀，离心，14000rpm，25℃，10min，保留上清液；
12.4)取上步骤得到的600ul上清液转移到一新的2ml无菌离心管中，盖好管盖后置于-20℃冷却5min，加入2倍体积(即1200ul)的冰冻100％乙醇和1/10体积(即60ul)的醋酸钠，轻轻翻转离心管10次，混匀液体；
13.5)将上步骤得到的液体离心，14000rpm，4℃，15min，保留滤渣；
14.6)向上步骤得到的滤渣中，加入1ml冰冻70％乙醇，轻轻翻转10次，离心，14000rpm，4℃，5min；
15.7)重复步骤6)；
16.8)在室温下，将离心管晾干；
17.9)向步骤8)的离心管中加入50ul 1
×
te溶解dna。
18.本发明中：
19.步骤1)所述的提取液，是含2.5％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮的dna提取缓冲液:裂解液:5％十二烷基肌氨酸钠＝3:3:2的体积比；
20.所述的dna提取缓冲液，成份为：20mm edta(ph 8.0)，350mm山梨糖醇，100mm tris-hcl(ph 8.0)；
21.所述的裂解液，成份为：50mm edta(ph 8.0)，2m氯化钠，2％ctab，200mm tris-hcl(ph 8.0)。
22.步骤1)所述的震荡15min得均浆组织，是以60赫兹的研磨15min得均浆组织。
23.步骤2)所述的酚混合液的酚，其中的tris饱和酚，ph》7.8。
24.步骤8)所述的将离心管晾干，是为了完全移除乙醇。
25.步骤9)所述的溶解dna，是置于4℃过夜溶解。
26.和现有技术相比，本发明具有如下优点：
27.1、本发明所述的一种柑橘dna快速提取方法，通过两颗钢珠之间的摩擦生热，加上15分钟60赫兹的研磨，使得dna抽提管中的植物植物组织在研磨破碎的同时可得到升温加热，以此减少了65℃水浴45分钟的时间，较大的缩短了柑橘dna提取所需的时间，提高了科研工作者的工作效率。
28.2、本发明所述的一种柑橘dna快速提取方法，经过多次重复实验测量，两颗钢珠之间及其和无菌磨样管之间通过15min的摩擦生热能使植物组织匀浆达到50℃的加热温度，在这个温度下配合钢珠的充分研磨和提取液缓冲的液裂解作用，能够使植物组织样品的细胞充分裂解释放dna，较大提高dna得率。
29.3、本发明所述的一种柑橘dna快速提取方法，多次重复实验所得柑橘dna用赛默飞超微量紫外分光光度计(nanodrop onec)检测其dna质量，结果显示本发明所述方法提取的柑橘dna浓度较高、纯度较好，达到后续分子科研实验所需的要求。
30.4、本发明所述的一种柑橘dna快速提取方法，简化了dna提取过程中的步骤、极大的缩短了提取实验所需时间，其所得dna质量比原来繁琐的操作过程所得质量更好，浓度更高、纯度更好。
【附图说明】
31.图1是本发明实施例和对比实验提取dna的电泳检测图(m为100bp dna ladder；其中1-5为实施例提取的柑橘dna；6-7为对比实验提取的柑橘dna)。
【具体实施方式】
32.以下结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步说明。
33.实施例：
34.一种柑橘dna快速提取方法，包括如下步骤：
35.1)用流水冲净柑橘叶片，用纸吸干水分后，切取0.1-0.2cm2植物组织，放入2ml无菌离心管，并放入2颗6mm无菌钢珠，加入1200ul提取液(含2.5％聚乙烯吡咯烷酮的dna提取缓冲液:裂解液:5％十二烷基肌氨酸钠＝3:3:2的体积比；所述的dna提取缓冲液，成份为：20mm edta(ph 8.0)，350mm山梨糖醇，100mm tris-hcl(ph 8.0)；所述的裂解液，成份为：50mm edta(ph 8.0)，2m氯化钠，2％ctab，200mm tris-hcl(ph 8.0))，盖好管盖，放入震荡磨样机，震荡15min得均浆组织；
36.2)取800ul均浆组织，转移入另一新的2ml无菌离心管中，加入800ul酚/氯仿/异戊醇混合液(tris饱和酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1的体积比)，涡旋混匀，离心，14000rpm，25℃，10min，保留上清液；其中的tris饱和酚，ph》7.8；
37.3)将上步骤得到的700ul上清液转移到一新的无菌2ml离心管中，加入700ul氯仿/异戊醇混合液(氯仿:异戊醇＝24:1的体积比)，涡旋混匀，离心，14000rpm，25℃，10min，保留上清液；
38.4)取上步骤得到的600ul上清液转移到一新的2ml无菌离心管中，盖好管盖后置于-20℃冷却5min，加入2倍体积(即1200ul)的冰冻100％乙醇和1/10体积(即60ul)的醋酸钠，轻轻翻转离心管10次，混匀液体；
39.5)将上步骤得到的液体离心，14000rpm，4℃，15min，保留滤渣；
40.6)向上步骤得到的滤渣中，加入1ml冰冻70％乙醇，轻轻翻转10次，离心，14000rpm，4℃，5min；
41.7)重复步骤6)；
42.8)在室温下，将离心管晾干；
43.9)向步骤8)的离心管中加入50ul 1
×
te溶解dna(置于4℃过夜溶解)。
44.对比实验
45.1、ctab水浴法提取柑橘dna
46.参考下述文献中描述的方法(以下简称lin h法)提取柑橘叶片组织dna：lin，h.，
walker，m.a.extracting dna from cambium tissue for analysis of grape rootstocks.hort science，1997，32(7):1264-1266.实验设置重复，每次重复的实验方法如下：
47.1)取0.1-0.2cm2植物组织用刀切碎放入无菌研磨皿中，加入液氮研磨至粉状；
48.2)取2ml无菌离心管1/6体积的研碎植物到2ml无菌离心管中，立即加入1m含2.5％pvp的dna提取缓冲液，立即涡旋混匀，置于冰上；
49.3)将上述一批样品涡旋混匀，14000rpm，25℃，离心5min，倒掉上清液；
50.4)向离心管加入1ml不含pvp的dna提取缓冲液，重新悬浮，涡旋混匀，14000rpm，25℃，离心5min，倒掉上清液；
51.5)加入不含pvp的dna提取缓冲液300ul重新悬浮植物组织，加入300ul裂解液，200ul5％十二烷基肌氨酸钠，涡旋混匀；
52.6)65℃水浴45min，水浴期间每个15分钟涡旋一下；
53.7)加入800ul酚/氯仿/异戊醇混合液(tris饱和酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1的体积比)，涡旋混匀，离心，14000rpm，25℃，10min，保留上清液；其中的tris饱和酚，ph》7.8；
54.8)将上步骤得到的700ul上清液转移到一新的无菌2ml离心管中，加入700ul氯仿/异戊醇混合液(氯仿:异戊醇＝24:1的体积比)，涡旋混匀，离心，14000rpm，25℃，10min，保留上清液；
55.9)取上步骤得到的600ul上清液转移到一新的2ml无菌离心管中，盖好管盖后置于-20℃冷却5min，加入2倍体积(即1200ul)的冰冻100％乙醇和1/10体积(即60ul)的醋酸钠，轻轻翻转离心管10次，混匀液体；
56.10)将上步骤得到的液体离心，14000rpm，4℃，15min，保留滤渣；
57.11)向上步骤得到的滤渣中，加入1ml冰冻70％乙醇，轻轻翻转10次，14000rpm，4℃，离心5min；
58.12)重复步骤11)
59.13)在室温下，将离心管晾干；
60.14)向步骤13)的离心管中加入50ul 1
×
te溶解dna
61.本对比实验中：
62.步骤7)所述的酚混合液的酚，其中的tris饱和酚，ph》7.8。
63.步骤13)所述的将离心管晾干，是为了完全移除乙醇。
64.步骤14)所述的溶解dna，是置于4℃过夜溶解。
65.2、结果与分析：
66.表1.本发明所述方法与lin h法提取所得dna质量独立样本t检验结果
[0067][0068]
a260是核酸的最高吸收峰的波长，a280是蛋白质最高吸收峰的波长，a230是碳水化合物的最高吸收峰的波长。a260/a280、a260/a230均是核酸纯度的指示值。纯净的dna样品a260/a280大于1.8，一般在1.8～2.0之间，比值低于1.8，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。a260/a230指示样品中存在一些有机污染物，如碳水化合物、盐(胍盐)等，较纯净的核酸a260/a230的比值大于2.0。
[0069]
实施实例和对比实验所得dna用赛默飞超微量紫外分光光度计(nanodrop onec)检测其浓度和纯度，得到的数据用r 3.6.2计算标准差和独立样本t检验分析。结果如表1所示，用本发明所述的方法提取的柑橘dna浓度和质量均显著高于对比实验lin h法。本发明所述方法提取的柑橘dna跟用lin h法的相比：在提取浓度上，本发明所述方法提取的柑橘dna平均浓度达2513.32ng/ul，约是lin h法的3倍，独立样本t检验分析结果也表明，两者提取的dna浓度存在显著性差异(p＝2.2e-16《0.05)；在a260/a280比值上，本发明所述方法提取的柑橘dna的a260/a280平均值为2.05，相对于lin h法的2.15比值，表明本发明所述方法的rna污染显著减少(p＝1.002e-07《0.05)；在a260/a230比值上，本发明所述方法提取的柑橘dna的a260/a230平均值为1.96，更接近纯净核酸大于2.0比值的要求，而用lin h法提取的柑橘dna的a260/a230比值只有1.28，表明存在较多的盐类等有机物污染，独立样本t检验分析结果进一步明确，本发明所述方法提取的柑橘dna在盐类等有机物污染上显著少于lin h法(p＝2.555e-11《0.05)。
[0070]
图1是实施例和对比实验提取dna的电泳检测图(注：m:100bp dna ladder；1-5:实施例提取的柑橘dna；6-7：对比实验提取的柑橘dna)。
[0071]
如图1的dna琼脂糖凝胶电泳检测图谱所示，尽管实施实例大幅缩短了dna提取时间，减少了提取步骤，但其提取的dna质量总体上并未有下降，其提取得到的dna电泳条带仍旧比较清晰、整齐、基本无拖尾，dna完整性好、无多糖、多酚等次生代谢物污染。在琼脂糖凝胶电泳中dna条带亮度和宽度取决于其dna分子量的大小和dna浓度的高低。dna分子量越大浓度越高，条带越宽亮，实施实例提取dna条带更宽厚，是因其dna浓度显著高于对比实验提取的dna，故而实施实例中的dna电泳条带比对比实验的宽厚。
[0072]
综上所述，本发明所述的一种柑橘dna快速提取方法，直接用两颗钢珠之间摩擦所得热量加热植物组织匀浆代替65℃、45min水浴过程。在质量更好的同时，本发明所述的方法用时更少，抽提出浓度较高、纯度比较好柑橘基因组dna，在科研实践中具有很强的实用
性。
[0073]
以上所述仅为本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，做出若干改进和变化，这些都属于本发明的保护范围。