一种甘蔗花粉孢子的提取方法

1.本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种甘蔗花粉孢子的提取方法。


背景技术：

2.用组织培养或诱导系诱发单倍体，再通过染色体加倍产生纯合度为100％的双单倍体(doubled haploid,dh)，是一种快速创制纯系(即dh系)的途径。在此基础上发展形成的单倍体育种技术，只需2～3个世代即可创制自交系，能大幅缩短育种周期、提高育种效率。更为重要的是，单倍体育种技术的成熟发展，为作物基因组选择育种提供了重要支撑。在我国广泛应用的获得单倍体植株的方式之一则为花药培养。花药培养技术是应用植物组织培养技术，把发育到一定阶段的花药接种到人工培养基上，形成花粉胚或花粉愈伤组织，最后由胚状体直接发育为植株或使愈伤组织分化成植株。其是单倍体育种技术的典型代表，具有选择周期短、性状选择准确、创造变异和dh群体快等独特优势。近几年，油菜、水稻、小麦、玉米等作物的双单倍体材料推动了栽培品种的改良。但与小麦、玉米、水稻等农作物相比，甘蔗花药离体培养的特殊性较高，且由于甘蔗生长周期较长等限制因素，导致甘蔗花药培养的成功率普遍较低，在农业领域，甘蔗花药离体培养的理论研究相对较少，直至目前，国内只有陈正华等人(1980)曾报道过成功培育了花粉植株，但对甘蔗花培技术体系并无详细说明。在甘蔗花培技术体系中，如何高效地提取纯度高、活力强的花粉孢子，是甘蔗花培的第一步，也是影响甘蔗花培成功率的关键一步。
3.甘蔗花序属于大型圆锥花序，由许多小穗组成。小穗是禾本科的典型特征，由颖片、小花和小穗轴组成，小花从外到内依次是外稃、内稃、浆片、3个花药，甘蔗长柄腺毛着生在小花的基部。浓密的长柄腺毛、包裹紧实的颖片和内外稃是甘蔗花粉孢子提取的主要障碍。要想获得杂质少、纯度高、数量充足的甘蔗花粉孢子，单靠简单的研磨及过滤是不够的。如果只是进行简单的研磨，花药中的花粉孢子难以从包裹紧实的颖片内释放出来，且数量众多的长柄腺毛会对花粉孢子形成缠绕或者黏连效果，使得过滤后的滤液中的花粉孢子数量大大降低。因此，如何高效地提取纯度高、活力强的花粉孢子，是本领域亟待解决的技术问题。


技术实现要素：

4.本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种甘蔗花粉孢子的提取方法，能够高效地提取纯度高、活力强的花粉孢子，为提高甘蔗花培成功率打下基础。
5.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
6.一种甘蔗花粉孢子的提取方法，包括以下步骤：
7.(1)将消毒的甘蔗幼穗的小花对半剪开，在灭菌后的研钵中研磨至幼穗组织破碎；
8.(2)把研磨后的幼穗组织转移至离心管中；
9.(3)加入含5v/v％甘露醇的cpw缓冲液至步骤(2)的离心管中；
10.(4)使用旋涡混合器或振荡器振荡步骤(3)的离心管，得幼穗匀浆；
11.(5)使用100目细胞筛过滤振荡后的幼穗匀浆，弃掉残渣，保留滤液；
12.(6)使用400目细胞筛过滤上一步得到的滤液，弃掉组织碎片，得到过滤后的浆液；
13.(7)将过滤后的浆液装入离心管中；
14.(8)将步骤(7)的离心管放入离心机中进行第一次离心；
15.(9)第一次离心后弃掉上清液，加入含5v/v％甘露醇的cpw缓冲液，用细滴管轻轻吹打混匀花粉孢子；
16.(10)将步骤(9)的离心管进行第二次离心；
17.(11)第二次离心后弃掉上清液，加入含5v/v％甘露醇的cpw缓冲液，进行第三次离心；
18.(12)第三次离心后再次倒出上清液，收集沉在离心管底部的花粉孢子；
19.(13)往另一支空的离心管中加入质量分数为20％的麦芽糖溶液，将步骤(13)的花粉孢子重悬在麦芽糖溶液上，小心地再加入含5v/v％甘露醇的cpw缓冲液；
20.(14)将步骤(13)中的离心管放入离心机中，进行第四次离心或静置30min-90min，使花粉孢子在离心管中形成两条明显的环形带，即悬浮在上方的活细胞带和沉在底部的死细胞带；
21.(15)收集在界面上形成活细胞带的花粉孢子。
22.优选地，步骤(1)中所述的甘蔗幼穗采用75％的酒精进行表面消毒。
23.优选地，步骤(1)中，使用无菌镊子和剪刀将甘蔗幼穗的小花对半剪开。
24.优选地，步骤(4)中，振荡所述离心管的时间为1-2min。
25.优选地，步骤(8)中所述的第一次离心的转速为2000r/min，离心时间为5min，步骤(10)中所述的第二次离心的转速为2000r/min，离心时间为5min。
26.优选地，步骤(11)中所述的第三次离心的转速为2000r/min，离心时间为5min。
27.优选地，步骤(14)中所述另一支空的离心管为10ml离心管，加入的麦芽糖溶液体积为7ml，加入的含5v/v％甘露醇的cpw缓冲液的体积为2ml。
28.优选地，步骤(15)中第四次离心的转速为500r/min，离心时间为5min。
29.由于在简单的研磨下，甘蔗花药中的花粉孢子难以从包裹紧实的颖片内释放出来，且数量众多的长柄腺毛会对花粉孢子形成缠绕或者黏连效果，使得过滤后的滤液中的花粉孢子数量大大降低。为了获得大量的花粉孢子，本发明在研磨之前使用剪刀把小花及花药对半剪开至研钵中，目的是打开一个花粉孢子释放的出口，加入适量缓冲液后再进行研磨，研磨后使用振荡器或涡旋仪振荡一分钟，尽可能地使得花粉孢子最大程度地被释放出来。从而能获得数量更多的花粉孢子。
30.本发明随后将幼穗匀浆使用100目细胞筛进行第一次过滤，可以去除较大的杂质及组织碎片，然后通过400目细胞筛过滤进行第二次过滤，400目细胞筛孔径为38μm，甘蔗花粉孢子的直径在35μm左右，可以进一步提高甘蔗花粉孢子的纯度；但采用细胞筛进行二次过滤，纯化效果仍然不理想，无法去除研磨后产生的小颗粒组织碎片。为了提高甘蔗花粉孢子的纯度，本发明还进行了三次纯化离心，2000rpm离心5min；每次离心后去除上清液，再加入缓冲液后用枪头吹打混匀花粉孢子后进行下一次的离心，从而能提高花粉孢子的纯度。
31.经过上述过滤及离心步骤，在一定程度上能够获得纯度较高的花粉孢子，但是仍有少部分与甘蔗活花粉孢子体积、重量差不多的杂质未能除去，且过滤及离心步骤并不能
区分死细胞和活细胞。为了进一步去除杂质以及区别死细胞及活细胞，我们使用麦芽糖溶液做了环形带，具体步骤为：往一支空的10ml离心管中加入7ml 20％麦芽糖溶液，将花粉孢子重悬在麦芽糖溶液上，小心地在麦芽糖溶液上加入2ml含5v/v％甘露醇的cpw缓冲液，这时麦芽糖溶液及甘露醇溶液之间会出现一个非常明显的花粉孢子分界线。这时由于密度的不同，活细胞会在上层的cpw溶液中形成一条活细胞带，死细胞及杂质碎片会沉降到20％麦芽糖溶液的底部，形成死细胞带。而上层的cpw溶液中形成的活细胞带，既保证了花粉孢子的纯度，又保证了其活力，达到了提高提取质量的效果。
32.综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
33.1、本发明在研磨之前使用剪刀把小花及花药对半剪开至研钵中，打开一个花粉孢子释放的出口，解除甘蔗花粉孢子由于浓密的长柄腺毛、包裹紧实的颖片和内外稃造成的提取障碍，从而能获得数量更多的甘蔗花粉孢子。
34.2、本发明通过两次过滤，去除杂质及组织碎片，再经过3-4次离心进行纯化，能够获得纯度较高的花粉孢子，然后采用一定浓度的麦芽糖溶液做了环形带，将死细胞和活细胞区分开来，从而获得纯度高、活力强的花粉孢子，为提高甘蔗花培成功率打下基础。
35.3、通过本发明的方法获得的甘蔗花粉孢子杂质少、纯度高、数量充足，为甘蔗花培的成功率提供了更好的基础，同时也推进了甘蔗花药、花粉粒单倍体育种的进程，也为甘蔗单倍体育种的基因组测序、遗传图谱构建、分子育种等提供了基础。
附图说明
36.图1为甘蔗幼穗实物图；
37.图2为把甘蔗的小花对半剪开的操作；
38.图3是研磨幼穗组织；
39.图4是加入cpw缓冲液至离心管的示意图；
40.图5是进行振荡的示意图；
41.图6是细胞筛过滤后收集滤液；
42.图7是离心后收集花粉孢子；
43.图8是将花粉孢子重悬在麦芽糖溶液上，并加入cpw缓冲液；
44.图9是花粉孢子在离心管中形成两条明显的环形带，上方的方框范围内处为活细胞带，下方的方框范围内为沉在底部的死细胞带；
45.图10是提取并纯化后(离心、形成环形带)的甘蔗花粉孢子状态图；
46.图11是用血球细胞计数板对花粉孢子进行计数；
47.图12是对比例1中的甘蔗花粉孢子状态图；
48.图13是对比例2中用血球细胞计数板对花粉孢子进行计数；
49.图14是对比例3中将花粉孢子重悬在麦芽糖溶液上，并加入cpw缓冲液。
具体实施方式
50.为了使本技术领域的人员更好地理解本技术方案，下面对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提
下所获得的所有其他实施例，都应当属于本技术保护的范围。
51.实施例
52.一种甘蔗花粉孢子的提取方法，包括以下步骤：
53.1.取一根用75％酒精表面消毒的品种为gt42的甘蔗幼穗(参见图1)，使用无菌镊子和剪刀，把甘蔗的小花对半剪开入灭菌后的研钵，在研钵中进行研磨至幼穗组织破碎(参见图2、3)；
54.2.使用无菌镊子或勺子把研磨后的幼穗组织转移至50ml离心管中；
55.3.加入含5v/v％甘露醇的cpw缓冲液至步骤2的50ml离心管的35ml刻度线处(图4)；
56.4.使用旋涡混合器或振荡器振荡50ml离心管1min(图5)，得幼穗匀浆；
57.5.使用100目细胞筛过滤振荡后的幼穗匀浆，弃掉残渣，保留滤液；
58.6.使用400目细胞筛过滤上一步得到的滤液，弃掉组织碎片，得到过滤后的浆液(图6)；
59.7.将过滤后的浆液通过分装入两个10ml离心管中(图7)；
60.8.将两个10ml离心管放入离心机适合的转子中，进行第一次离心，转速为2000r/min，离心时间为5min；
61.9.第一次离心后弃掉上清液，加入3ml5v/v％甘露醇的cpw缓冲液，用细滴管轻轻吹打混匀花粉孢子；
62.10.将花粉孢子从两个10ml离心管中合并转移至同一个10ml离心管中；
63.11.向合并后的离心管中加入含5v/v％甘露醇的cpw缓冲液使液体上升至10ml，进行第二次离心，转速为2000r/min，离心时间为5min；
64.12.第二次离心后弃掉上清液，加入含5v/v％甘露醇的cpw缓冲液，进行第三次离心；
65.13.第三次离心后再次倒出上清液，收集沉在离心管底部的花粉孢子；
66.14.往另一支空的10ml离心管中加入7ml20％麦芽糖溶液，将花粉孢子重悬在麦芽糖溶液上，小心地在麦芽糖溶液上加入2ml cpw(含5％甘露醇)缓冲液，保持一个清晰的界面(图8)；
67.15.将上一步骤中的10ml离心管放入离心机适合的转子中，进行第四次离心或静置30min-90min，使花粉孢子在10ml离心管中形成两条明显的环形带(图9)，即悬浮在上方的活细胞带和沉在底部的死细胞带；
68.16.收集在界面上形成带的花粉孢子(图10)，上方方框范围内处为活细胞带，下方方框范围内沉在底部的为死细胞带，将活的小孢子转移到新的10ml的无菌离心管中；
69.17.用n6培养基将细胞稀释至5ml，用移液枪轻轻吹打细胞使其分散均匀；
70.18.取10μl细胞悬液，用血球细胞计数板计算得花粉孢子密度为2.35
×
106/ml(图l1)。
71.对比例1
72.一种甘蔗花粉孢子的提取方法，包括以下步骤：
73.1.取一根用75％酒精表面消毒的品种为gt42的甘蔗幼穗，使用无菌镊子和剪刀，把甘蔗的小花对半剪开入灭菌后的研钵，在研钵中进行研磨至幼穗组织破碎；
74.2.使用无菌镊子或勺子把研磨后的幼穗组织转移至50ml离心管中；
75.3.加入含5v/v％甘露醇的cpw缓冲液至步骤2的50ml离心管的35ml刻度线处；
76.4.使用旋涡混合器或振荡器振荡50ml离心管1min，得幼穗匀浆；
77.5.使用100目细胞筛过滤振荡后的幼穗匀浆，弃掉残渣，保留滤液；
78.6.使用400目细胞筛过滤上一步得到的滤液，弃掉组织碎片，得到过滤后的浆液。
79.过滤后的浆液涂片后在镜下观察，看到的甘蔗花粉孢子状态图见图12，可见仅仅提取和过滤，但未离心、未制作环形带来进行纯化，甘蔗花粉孢子中存在较多的杂质、组织碎片及死细胞，甘蔗花粉孢子的纯度很低。
80.对比例2
81.本对比例与实施例1的不同之处在于，步骤1中没有“使用使用无菌镊子和剪刀，把甘蔗的小花对半剪开入灭菌后的研钵”的步骤，而是直接将用75％酒精表面消毒的品种为gt42的甘蔗幼穗在研钵中进行研磨至幼穗组织破碎，其余步骤2-17与实施例相同。经过血球细胞计数板计算得花粉孢子密度为1.0
×
105/ml，参见图13。可以说明，简单的研磨难以使甘蔗花药中的花粉孢子从包裹紧实的颖片内释放出来，且数量众多的长柄腺毛会对花粉孢子形成缠绕或者黏连效果，使得过滤后的滤液中的花粉孢子数量大大降低，且含有较大量的杂质、组织碎片，最终获得的花粉孢子密度和纯度大大降低。
82.对比例3
83.本对比例与实施例1的不同之处在于，步骤14中的麦芽糖溶液浓度换成15％和25％。其余步骤2-17与实施例相同。当将花粉孢子重悬在麦芽糖溶液上，小心地在麦芽糖溶液上加入2ml cpw(含5％甘露醇)缓冲液时，发现花粉孢子上下跑动太大，不能形成清晰的条带(图14)，意味着麦芽糖溶液浓度不合适，不能形成有效的梯度密度。本发明采用浓度为20％的麦芽糖溶液，适宜的麦芽糖浓度能更有效地聚集花粉孢子，并形成一条清晰的花粉孢子带(图8)，20％的麦芽糖溶液对在分离活细胞及死细胞过程来说是一个合适的密度梯度差，无论是静置分离还是离心分离，都能较快地分离出活细胞带及死细胞带。
84.上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。