一种酿酒酵母PL-J、其发酵液及制备方法和应用与流程

一种酿酒酵母pl-j、其发酵液及制备方法和应用
技术领域
1.本技术涉及微生物技术领域，具体涉及一种酿酒酵母pl-j、其发酵液及制备方法和应用。


背景技术：

2.酵母菌作为蛋白质补充材料，在饲料工业中被广泛应用于畜牧生产，尤其是反刍动物的生产。根据农业部2003年公布的饲料添加剂品种目录，目前可直接作为微生物饲料添加剂的酵母菌有酿酒酵母和产朊假丝酵母。酿酒酵母类产品具有能提供丰富的营养物质、增强机体免疫力、增强抗氧化能力、改善微生物区系、防治胃肠道疾病，增加肌肉品质、提高饲料消化率和提高动物生产性能等作用，且无毒、无副作用、无污染、不产生抗药性等特点，是一种绿色的饲料添加剂。
3.酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)是单细胞真菌，兼性厌氧菌。酵母细胞中含有氨基酸、矿物质、维生素及微量元素，其中蛋白质含量占细胞干重的30-50％。酵母细胞壁的组成成分主要为酵母多糖即甘露寡糖和β-葡聚糖，对细菌、病毒引起的疾病及环境因素引起的应激反应产生非特异性免疫。酵母细胞中还富含多种消化酶，能促进动物体各种营养物质的消化吸收。此外酵母细胞还含有多种色素和未知的生长因子，是养殖动物的一种很好的营养源。
4.但相关的酿酒酵母应用在生物饲料当中时，由于酿酒酵母的抗酸能力、促消化作用、耐高糖性和抗菌性能较差，故而在酿酒酵母应用在生物饲料时，无法获得良好的饲喂效果。


技术实现要素：

5.为了提高生物饲料的饲喂效果，本技术提供一种酿酒酵母pl-j、其发酵液及制备方法和应用。
6.第一方面，本技术提供一种酿酒酵母pl-j，采用如下的技术方案：一种酿酒酵母pl-j，其特征在于，所述菌株为酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)，命名为酿酒酵母pl-j，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.24059，保藏时间为：2021年12月8日。
7.本技术提供的酿酒酵母pl-j从蜂蜜样品中分离筛选获得，该酿酒酵母pl-j具有耐低ph性，酿酒酵母pl-j在ph为1.0的培养基中，仍有万级活菌；所述酿酒酵母pl-j具有耐高糖性，酿酒酵母pl-j在葡萄糖浓度700g/l下仍可生长；所述酿酒酵母pl-j具有抑菌性，酿酒酵母pl-j对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌率均大于50％；所述酿酒酵母pl-j具有耐胆盐性，酿酒酵母pl-j在胆盐浓度0.03％-0.5％条件下均可正常生长。
8.综上所述，本技术获得的酿酒酵母pl-j具有良好的抗酸能力、促消化作用、较好的耐高糖性和一定的抗菌性能，所以，酿酒酵母pl-j作为生物制剂应用于饲料中，具有良好的
饲喂效果。
9.酿酒酵母pl-j的分离筛选方法，采用如下的技术方案：采集蜂蜜为样品筛选酵母菌，取1g样品于100ml富集培养基中，30℃、200r/min培养，挑取培养液划线，然后挑取单菌落进行3次平板划线纯化，得到pl-j菌株。
10.富集培养基的成分如下：麦芽浸粉130.0g/l。
11.根据《酵母菌的特征与鉴定手册》，对分离菌株进行初步鉴定。菌株pl-j生物学特性：兼性厌氧菌，菌落呈圆形凸起且边缘整齐，乳白色，出芽生殖。
12.采用26s rdna序列测定的方法对pl-j菌株测序，将所得序列与genbank中序列进行blast分析比较，用mega6.0软件构建系统发育树。系统发育树的结果显示该菌与ncbi公布的酿酒酵母的同源性达到100％。
13.结合系统发育树的结果将该分离菌鉴定为酿酒酵母，并于2021年12月8日将获得的酿酒酵母pl-j保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmcc no.24059。
14.酿酒酵母pl-j从蜂蜜中分离提取得到，来源安全可靠，更适合动物肠道消化吸收，有利于应用于畜禽饲料中且具有较好的应用前景。
15.第二方面，本技术提供一种发酵液，由上述酿酒酵母pl-j发酵得到。
16.第三方面，本技术提供一种发酵液的制备方法，采用如下的技术方案：一种发酵液的制备方法，所述发酵液由酿酒酵母pl-j通过以下步骤培养发酵得到：酿酒酵母pl-j接种于麦芽汁种子培养基中，在30℃、200r/min下培养18h，获得种子液；然后按3％接种量转接至发酵培养基，在30℃、转速150～400r/min，通气量为0.12～0.5m3/h条件下培养16h，制得发酵液。
17.优选的，所述发酵液由酿酒酵母pl-j通过以下步骤培养发酵得到：酿酒酵母pl-j接种于麦芽汁种子培养基中，在30℃、200r/min下培养18h，获得种子液；然后按3％接种量转接至发酵培养基，在30℃、转速150～400r/min，通气量为0.12～0.5m3/h条件下培养16h，制得发酵液。
18.优选的，麦芽汁种子培养基的成分如下：麦芽浸粉130.0g/l。
19.优选的，所述发酵培养基由碳源、氮源和无机盐组成；所述碳源为红糖，所述红糖按糖浓度计在所述发酵培养基中的浓度为30.0g/l；所述氮源为硫酸铵和玉米浆干粉；所述硫酸铵和玉米浆干粉在所述发酵培养基中的浓度分别为10.0g/l和4.0g/l；所述无机盐为硫酸镁、硫酸锰和磷酸二氢钾，所述硫酸镁、硫酸锰和磷酸二氢钾在所述发酵培养基中的浓度分别为0.1g/l、0.1g/l和2.0g/l。
20.通过采用上述技术方案制备发酵液，发酵液的制备时间较短；且在较短的时间内，菌量可达到2.0
×
109cfu/ml。由此可见，采用本技术的培养方法培养酿酒酵母pl-j(制备发酵液)，培养效率高。
21.此外，发明人发现，酿酒酵母pl-j在发酵过程中，ph由最初的6.02降至3.88，也就是说，酿酒酵母pl-j在发酵过程中产有机酸。将酿酒酵母pl-j作为益生菌株应用于饲料中，可以起到抑制致病菌作用。
22.第四方面，本技术提供一种生物制剂，采用如下的技术方案：一种生物制剂，包括酿酒酵母pl-j和发酵液中的至少一种。
23.优选的，生物制剂包括酿酒酵母pl-j、发酵液和由上述制备方法制得的发酵液中的至少一种。
24.第五方面，本技术提供的一种酿酒酵母pl-j在饲料中的应用。
25.第六方面，本技术提供的一种发酵液在饲料中的应用。
26.综上所述，本技术具有以下有益效果：1、本技术获得的酿酒酵母pl-j具有良好的抗酸能力、促消化作用、较好的耐高糖性和一定的抗菌性能，所以，酿酒酵母pl-j作为生物制剂应用于饲料中，具有良好的饲喂效果。
27.2、酿酒酵母pl-j从蜂蜜中分离提取得到，来源安全可靠，更适合动物肠道消化吸收，有利于应用于畜禽饲料中且具有较好的应用前景。
28.3、采用本技术的培养方法培养酿酒酵母pl-j(制备发酵液)，培养效率高。
附图说明
29.图1是本技术提供酿酒酵母pl-j菌株的26s rdna系统发育树。
30.图2是本技术提供酿酒酵母pl-j的生长曲线及ph曲线。
具体实施方式
31.以下结合附图1-2和实施例对本技术作进一步详细说明。予以特别说明的是：以下实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行，以下实施例中所用原料除特殊说明外均可来源于普通市售。
32.本技术提供了保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmccno.24059的酿酒酵母pl-j，并提供了该菌株的分离、纯化及培养方法，还提供了利用该菌株发酵制得的发酵液以及酿酒酵母pl-j、发酵液在饲料中的应用。
33.本技术提供的酿酒酵母pl-j从蜂蜜中分离提取得到，采用26s rdna以及系统发育树进行鉴定，结果判定该粉料菌株鉴定为酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)，命名为酿酒酵母pl-j，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.24059，保藏时间为：2021年12月8日。
34.以下实施例中涉及到的培养成分如下：富集培养基的成分:麦芽浸粉130.0g/l。
35.种子培养基的成分：麦芽浸粉130.0g/l。
36.发酵培养基的成分：红糖30.0g/l、玉米浆干粉4.0g/l、硫酸铵10.0g/l、硫酸镁0.1g/l、硫酸锰0.1g/l、磷酸二氢钾2.0g/l。
37.以下实施例中涉及的指示菌大肠杆菌(型号为atcc35401)和金黄色葡萄球菌(型号为atcc29213)来源于普通市售。实施例
38.实施例1
酿酒酵母pl-j的分离筛选2021年3月，从沈阳蜂场购买天然蜂蜜为样品筛选酵母菌。取1g样品于100ml富集培养基中，挑取单菌落进行3次平板划线纯化，得到菌株。
39.根据《酵母菌的特征与鉴定手册》，对分离菌株进行初步鉴定。
40.菌株pl-j生物学特性：兼性厌氧菌，菌落呈圆形凸起且边缘整齐，乳白色，出芽生殖。
41.实施例2对实施例1获得的酿酒酵母pl-j进行26s rdna序列测定细菌基因组提取试剂盒提取细菌总dna，采用引物nl1和nl4进行pcr扩增，酶选用super mix。引物序列如下：引物nl1：5'-gcatatcaataagcggaggaaaag-3引物nl4：5'-ggtccgtgtttcaagacgg-3'。
42.26s rdna的pcr扩增体系(30μl)：super mix 15μl、上游引物1μl、下游引物1μl、模板dna(ng/μl)1μl、ddh2o 12μl。pcr反应程序：96℃5min；96℃20s，56℃20s，72℃30s共35个循环；72℃10min；16℃forever；pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，将有目的条带的pcr产物送北京六合华大基因科技有限公司进行测序。
43.将所得序列与genbank中序列进行blast分析比较，以26s rdna基因序列同源性a》99％为鉴定标准，采用mega6.0软件构建系统发育树，如图1。图1结果显示该菌与ncbi公布的酿酒酵母的同源性达到100％，将该分离菌鉴定为酿酒酵母。
44.将酿酒酵母pl-j保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号：cgmcc no.24059，保藏日期：2021年12月8日，分类命名为酿酒酵母saccharomyces cerevisiae。
45.实施例3酿酒酵母pl-j的培养酿酒酵母pl-j接种于麦芽汁种子培养基中，30℃、200r/min培养18h，按3％接种量转接至发酵培养基，30℃、200r/min培养24h，制得发酵液。
46.酿酒酵母pl-j在培养期间每隔2h取一次样，测定660nm处吸光度值及ph。绘制24h生长曲线及ph曲线，结果如图2。
47.由图2可知，pl-j菌株在4h进入对数生长期，18h进入平台期，ph在24h时由最初的6.02降至3.88，表明酿酒酵母pl-j在发酵过程中产有机酸。pl-j发酵过程中产酸及其他有机物质，将酿酒酵母pl-j作为益生菌株应用于饲料中，可以起到抑制致病菌作用。
48.实施例4酿酒酵母pl-j的高糖耐受性试验将菌株按3％接种量分别加入含有葡萄糖含量在0、100g/l、200g/l、300g/l、400g/l、500g/l、600g/l和700g/l的麦芽汁培养基中，30℃、200r/min培养24h后，取发酵液按10倍逐级稀释至所需稀释度，选取2个适当稀释度，每个稀释度3个重复，吸取不同稀释度菌悬液100μl，涂布于麦芽汁琼脂平板培养，30℃培养24h后计数，选取菌落数在30-300之间的平板进行计数，计算活菌数，结果见表1。
49.表1 酿酒酵母pl-j的耐高糖实验结果
由表1可知，酿酒酵母pl-j在葡萄糖含量100g/l-700g/l范围内均可生长。酿酒酵母pl-j在葡萄糖含量＜300g/l，可正常生长，在葡萄糖含量为700g/l，活菌数仍有104cfu/ml，说明酿酒酵母pl-j具有较好的耐高糖性能。
50.实施例5酿酒酵母pl-j的耐低ph试验将菌株按3％接种量分别加入ph为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0的麦芽汁培养基中，空白组为培养基自然ph 6.0
±
0.2，30℃、200r/min培养24h后，取发酵液按10倍逐级稀释至所需稀释度，选取2个适当稀释度，每个稀释度3个重复，吸取不同稀释度菌悬液100μl，涂布于麦芽汁琼脂平板培养，30℃培养24h后计数，选取菌落数在30-300之间的平板进行计数，计算活菌数，结果见表2。
51.表2 酿酒酵母pl-j的耐低ph实验结果phpl-j活菌数(cfu/ml)自然ph(2.35
±
0.07)*1081(1.40
±
0.28)*1041.5(5.50
±
0.71)*1042(3.20
±
0.28)*1062.5(7.90
±
0.14)*1063(1.93
±
0.18)*1084(3.10
±
0.57)*1085(2.25
±
0.07)*108由表2可知，酿酒酵母pl-j在ph值1-5范围内均可生长，ph值3-5之间活菌数不受影响；在ph＝1条件下仍有万级的活菌数，说明酿酒酵母pl-j具有较好的耐低ph性。
52.实施例6酿酒酵母pl-j的抑菌性试验取发酵液在10000r/min的速率下离心5min，取上清液，用0.45μm滤膜过滤备用。
53.指示菌液的调整：调整指示菌大肠杆菌和金黄色葡萄球菌细菌浓度吸光值约为
0.05，测定600nm处吸光度。
54.实验组试管：4ml指示菌液 1ml实验菌液；对照组试管：4ml指示菌液 1ml生理盐水。
55.将实验组试管和对照组试管在37℃、200r/min充分振荡共培养3h，然后分别测定各试管液体在600nm处吸光度值，计算抑菌率，结果见表3。
56.抑菌率(％)＝[(a
空-a
空0
)-(a
样-a
样0
)]/(a
空-a
空0
)
×
100％其中，a
空
：对照组振荡培养3小时后的吸光度；a
空0
：对照组初始的吸光度；a
样
：实验组振荡培养3小时后的吸光度；a
样0
：实验组初始的吸光度。
[0057]
表3 酿酒酵母pl-j的抑菌活性根据表3结果显示，pl-j菌株对共培养的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率分别是57.3％和68.4％，pl-j菌株对共培养的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌率均超过50％以上，说明酿酒酵母pl-j具有一定的抑菌作用。
[0058]
将酿酒酵母pl-j作为益生菌株应用于饲料中，能有效抑制肠胃中的有害细菌，例如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等等，进而防治动物胃肠道疾病。
[0059]
实施例7酿酒酵母pl-j的耐胆盐试验将菌株按3％接种量分别加入含有0％、0.03％、0.1％、0.3％、0.5％、1％胆盐浓度的麦芽汁培养液中，30℃、200r/min培养24h后，取发酵液按10倍逐级稀释至所需稀释度，选取2个适当稀释度，每个稀释度3个重复，吸取不同稀释度菌悬液100μl，涂布于麦芽汁琼脂平板培养，30℃培养24h后计数，选取菌落数在30-300之间的平板进行计数，计算活菌数，结果见表4。
[0060]
表4 酿酒酵母pl-j的耐胆盐实验结果胆盐浓度pl-j活菌数(cfu/ml)0(3.10
±
0.57)*1080.03％(8.00
±
0.00)*1080.1％(6.50
±
0.71)*1080.3％(8.50
±
0.71)*1080.5％(2.10
±
0.42)*1081％(6.50
±
0.21)*107由表4可知，酿酒酵母pl-j在胆盐浓度0.03％-0.3％范围内可正常生长，实验组活菌数是对照组的2倍左右，在0.5％的胆盐浓度下仍有很高的活性。动物小肠内正常胆盐含量是在0.03％-0.3％之间，实验结果说明酿酒酵母pl-j有很强的耐胆盐能力。
[0061]
实施例820升发酵罐优选发酵方案的实验结果将菌株按3％接种量接入含种子培养基的三角瓶中，30℃、200r/min培养18h获得种子液；按照体积比为3％的接种量取种子液接种于发酵培养基的20升发酵罐中进行发酵培养，每隔2h监测发酵液的ph、溶氧和od值，发酵16h。
[0062]
发酵培养基：溶剂为水，溶质及其在所述发酵培养基中的浓度为红糖30.0g/l、玉米浆干粉4.0g/l、硫酸铵10.0g/l、硫酸镁0.1g/l、硫酸锰0.1g/l、磷酸二氢钾2.0g/l。
[0063]
发酵罐设定：30℃、转速150～400r/min，初期转速为150r/min，待溶氧下降至15％以下，增加转速，使溶氧量迅速达到15％以上，通气量0.12～0.5m3/h，培养16h，制得发酵液，实验结果如表5所示。
[0064]
表5 酿酒酵母pl-j 20升发酵罐发酵的实验结果发酵时间(h)046810121416od
660
0.951.723.857.0114.017.017.217.5ph5.945.705.484.824.774.543.883.53溶氧(％)26.412.413.014.014.623.419.519.0转速(r/min)150150300350400400400400气流量(m3/h)0.120.120.120.300.400.500.500.50罐压(mpa)0.050.050.050.050.050.050.050.05发酵过程中镜检观察细胞形态，细胞个体较大，呈现圆形或椭圆形，可明显看到出芽生殖，发酵结束后采用平板计数法记录菌数，结果显示菌量可达到2.0
×
109cfu/ml。
[0065]
应用例酿酒酵母pl-j的饲喂效果试验试验材料和方法选择优良荷斯坦奶牛100头，按照胎次、产奶日龄、泌乳量、体重等相似的原则，随机分成2组，1个对照组，1个实验组，每组50头产奶牛。
[0066]
各组基础日粮维持原有日粮水平不变，管理水平一致，对照组中采用的日粮组成为：玉米2.8kg/天
·
头，大麦3.0kg/天
·
头，棉饼2.9kg/天
·
头，麦麸10kg/天
·
头，芝麻饼4.4kg/天
·
头。
[0067]
实验组与对照组的饲喂不同之处在于，实验组按照每天每头0.2kg/天
·
头由实施例3中酿酒酵母pl-j制得的发酵液与其他饲料投入到tmr饲料搅拌机中直接饲喂。实验期60天。
[0068]
试验开展前，首先对试验牛群的基础数据进行了调查，记录了每头牛的产奶日龄、胎次、每日产奶量指标，基础数据参见表6，经比较以上指标无显著性差异。
[0069]
表6 试验前牛群基础数据统计表组别平均泌乳天数胎次产奶量(kg/d
·
头)实验组112222对照组113222注：以上数据均为每组平均数。
[0070]
发酵液对奶牛产奶量(kg/d)的影响的结果见表7。
[0071]
表7 不同试验日期各组产奶量组别0d20d40d60d实验组2225.52727.5对照组222323.523注：以上数据均为每组平均数。
[0072]
由表7可以看出，在奶牛日粮中添加本技术酿酒酵母pl-j制备的发酵液后，能够有效提升奶牛的日平均产奶量，说明酿酒酵母pl-j的发酵液可作为生物制剂应用于饲料中，可提高饲料的饲喂效果。
[0073]
综上所述，本技术获得的酿酒酵母pl-j具有良好的耐高糖性能、优良的抗菌性能、优良的耐低ph能力和较好的耐胆盐能力，所以，酿酒酵母pl-j可作为生物制剂应用于饲料中，可提高饲料的饲喂效果。
[0074]
将本技术中得到的酿酒酵母pl-j应用于生物制剂(如饲料)的时候，可以将其制成菌株干粉直接添加于生物制剂中，也可以将酿酒酵母pl-j按照本技术中提供的发酵方法发酵后得到的发酵液应用在生物制剂中。
[0075]
可以理解的是，以上实施方式仅仅是为了说明本发明的原理而采用的示例性实施方式，然而本发明并不局限于此。对于本领域内的普通技术人员而言，在不脱离本发明的精神和实质的情况下，可以做出各种变型和改进，这些变型和改进也视为本发明的保护范围。