鸭胚原代肝细胞分离培养方法与流程

1.本发明涉及细胞培养领域，具体涉及鸭胚原代肝细胞分离培养方法。


背景技术：

2.肝脏是动物机体新陈代谢的重要内脏器官，是碳水化合物、脂肪和蛋白质代谢的主要场所，对调控机体代谢、维持机体代谢平衡具有重要的作用。肉鸭等禽类动物不同于哺乳动物，其脂肪细胞合成脂肪的能力有限，脂肪主要来源于肝脏合成和肠吸收，因而，肉鸭肝脏在脂质代谢调控中具有极其重要的作用，分离和培养鸭肝细胞为探究肉鸭脂质代谢及调控机制提供了良好的基础。
3.肝脏细胞分为肝实质细胞和肝非实质细胞，其中，肝实质细胞是行使肝功能的主要细胞类群，而如肝星状细胞、枯否细胞等肝非实质细胞主要辅佐肝实质细胞完成正常肝功能。有研究表明，在肝实质细胞的体外培养过程中，肝非实质细胞有利于肝实质细胞的生长，因而在肝细胞培养中，为了实现原代肝细胞的形态特征和生理功能的最大限度的维持，往往选择肝细胞与肝非实质细胞共培养的方式。此外，肝脏原代细胞可以很好的模拟宿主机体肝脏状态，是研究动物肝脏代谢机制的理想模型。分离鸭胚肝细胞，对其进行原代培养，可以实现在最接近体内状态下，探究肉鸭肝脏代谢机制及其调控作用。
4.1953年，anderson首次通过剪切法从肝脏中分离肝细胞，随后，在实际应用中分离方法也进行了多次改良，主要分为机械法和酶消化法，由于机械法对细胞造成的损伤较大，两步胶原酶灌注法一直是分离肝脏细胞的经典方法，至今仍被大多数实验室所采用。该方法效果好，细胞得率高，且纯度高，活力好，但是操作繁琐，灌流技术要求高，插管易失败，且需要恒流泵等特殊装置，消耗胶原酶量也大，一般实验室开展较困难。近些年来，很多实验室都在对该方法进行优化改良。另外，无论采用何种方法分离肝细胞，都存在肝细胞纯化的问题，主要目的是去除成纤维细胞，方法包括差速贴壁法、差速离心技术、percoll分离技术，后者分离技术的代价相对较大，应用中多采用前两者的方法进行分离纯化。


技术实现要素：

5.为了解决现有技术存在操作复杂、成本高、提取细胞成活率和纯度低等问题提出并完成了本发明。
6.根据本发明的鸭胚原代肝细胞分离培养方法包括以下步骤
7.s1：对鸭胚外壳进行消毒，在无菌条件下，取十三日龄～十五日龄鸭胚；
8.s2：分离鸭胚肝脏并去除胆囊，将得到的肝脏在缓冲液浸泡洗涤；
9.s3：去除肝脏周围粘连的疏松结缔组织和肝被膜，将得到的小块肝组织浸泡在缓冲液中；
10.s4：多步消化：
11.(4-1)将肝组织块在浓度为0.25％的胰酶-edta中浸泡15s～30s，待组织软化变白后，转移至细胞培养液中洗涤，
12.(4-2)将组织无菌切成1mm3小块，用细胞培养液洗涤，通过细胞和组织的自身沉降弃掉上清液，
13.(4-3)使用10ml 0.25％的胰酶-edta，在30s内，将组织块吹散至肉眼不可见组织块的细胞悬液，室温静置30s，然后用胎牛血清终止胰酶消化，
14.(4-4)离心弃掉上层液体，用细胞培养液洗涤细胞；
15.s5：用完全培养基重悬将获得的细胞，过70μm细胞筛，将细胞接种到培养瓶进行培养。
16.根据本发明的具体实施放水的鸭胚原代肝细胞分离培养方法包括以下步骤
17.s1：对鸭胚外壳进行消毒，在无菌条件下，取十三日龄～十五日龄鸭胚；
18.s2：分离鸭胚肝脏并去除胆囊，将得到的肝脏在d-hank’s缓冲液浸泡洗涤；
19.s3：去除肝脏周围粘连的疏松结缔组织和肝被膜，将得到的小块肝组织浸泡在 d-hank’s缓冲液液滴中，该浸泡洗涤过程重复三次；
20.s4：多步消化：
21.(4-1)将肝组织块在胰酶-edta(0.25％)浸泡15s～30s，待组织软化变白后，转移至细胞培养液中，洗三次，
22.(4-2)将组织无菌切成1mm3小块，用dmem洗涤两次，通过细胞和组织的自身沉降弃掉上清液，
23.(4-3)使用10ml胰酶-edta(0.25％)，在30s内，将组织块吹散至肉眼不可见组织块的细胞悬液，室温静置30s，然后胎牛血清终止胰酶消化，
24.(4-4)离心弃掉上层液体，dmem洗涤细胞，该过程重复两次；
25.s5：用完全培养基重悬将获得的细胞，过70μm细胞筛，将细胞接种到培养瓶进行培养。
26.根据本发明的鸭胚原代肝细胞分离培养方法，其中，所述细胞培养液为dmem。
27.根据本发明的鸭胚原代肝细胞分离培养方法，其中，完全培养基的配方为富含 10％胎牛血清的高糖培养基dmem、青霉素105u
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－1
、链霉素100mg
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。
28.本发明从鸭胚日龄的选择、对组织采用机械法与酶消化法的结合等方法，建立了一种简单、经济、快速的鸭胚原代肝细胞分离方法。
29.本发明的优点：
30.1.常规的鸭胚原代肝细胞分离及培养法为灌流法，此法仅适用于成鸭，处理需要大量胶原酶、蠕动泵等复杂装置的使用，同时还需要面临插管失败，外界环境污染的挑战，技术和环境要求严格，而本发明的方法选择鸭胚进行鸭肝原代细胞的分离可避免操作复杂性这一问题的发生，亦可轻易在超净工作台实现，减少了污染的风险，同时少量胰酶就可实现组织样品的充分消化，减少分离成本。
31.2.现有的胰酶酶解法分离肝脏细胞，由于消化过程不易把控，常常会发生消化过度而造成细胞损伤，使细胞存活率降低，在本发明的方法中选择多步消化的法，间接减少了组织样品与胰酶的接触时间和接触浓度，减少因胰酶过度消化造成的细胞损伤。
32.3.由于常规的灌流法和酶解法得到的原代肝细胞纯度不佳，往往需要差速贴壁法、差速离心技术、percoll分离技术来进行细胞纯化，后者纯化技术的代价相对较大，应用中多采用前两者的方法进行分离纯化，无疑增加了分离成本和操作复杂度，在本发明的方
法中，选择适龄鸭胚，同时在解剖阶段，去除肝脏周围黏连的疏松结缔组织和肝被膜，分别得到的小块肝组织，这些操作减少了肝非实质细胞的干扰，利于后续获得高纯度肝细胞。
33.4.在分离得到原代肝细胞后，往往会在培养基中添加胰岛素、氢化可的松琥珀酸钠等激素类药物，促进细胞贴壁等生长，本发明的方法简单、经济、快速分离，不需要添加这些激素类药物即可获得具备正常生长功能的原代肝细胞，既减少了细胞培养成本，也避免了糖脂代谢原代肝细胞模型研究中，激素类药物对细胞代谢产生的影响。
34.5.本发明的多步胰酶消化法具有损伤较小的特点，获得的细胞存活率高达95％以上。
附图说明
35.图1显示多步消化法分离鸭胚原代肝细胞；
36.图2显示不同日龄鸭胚制备的肝细胞，其中，a:11日龄b:14日龄c:20日龄，图中所示比例尺为50μm；
37.图3显示台盼蓝拒染法测定细胞存活率；
38.图4显示不同培养时间的鸭胚原代肝细胞；
39.图5显示mrna水平上鉴定alb和afp的结果，其中a:alb和afp核酸电泳，b：扩增的alb和afp的序列比对；
40.图6显示鸭原代肝细胞糖原染色的结果，其中，a：正常糖原染色，b：阴性对照(未入氧化剂)，图中所示比例尺为100μm；
41.图7显示间接免疫荧光结果；
42.图8为细胞生长曲线。
具体实施方式
43.实施例1鸭胚原代肝细胞分离及培养
44.一、分离及培养
45.1.用碘伏对鸭胚外壳进行擦拭消毒，用75％酒精对鸭胚外壳进行喷雾消毒；
46.2.在无菌条件下，从气室端敲碎外壳，用无菌镊子打开鸭胚卵壳膜，取出鸭胚；
47.3.手术剪和镊子合作，解剖鸭胚分离鸭胚肝脏并去除胆囊，将得到的肝脏 d-hank’s缓冲液浸泡洗涤；
48.4.手术刀和镊子合作，去除肝脏周围黏连的疏松结缔组织和肝被膜，将得到的小块肝组织浸泡在d-hank’s缓冲液液滴中，该浸泡洗涤过程重复三次；
49.5.多步消化，首先将肝组织块浸泡在胰酶-edta(0.25％)15s～30s，待组织软化变白后，转移至dmem液滴中，洗三次；
50.6.将组织转移至15ml无菌离心管中，用手术刀将其切成1mm3小块，用5ml dmem洗涤两次，该过程通过细胞和组织的自身沉降，来弃掉上清液；
51.7.向15ml无菌离心管中加入10ml胰酶-edta(0.25％)，在30s内，用5ml 移液枪将组织块吹散至肉眼不可见组织块的细胞悬液，室温静置30s，随之，加入 1/10体积的胎牛血清，终止胰酶消化；
52.8.离心力500g，时间5min，温度4℃离心，弃掉上层液体，10ml dmem洗涤细胞，该过
程重复两次；
53.9.用培养基重悬将获得的细胞(完全培养基：富含10％胎牛血清的高糖培养基dmem、青霉素105u
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－1
、链霉素100mg
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),过70μm细胞筛(corning)，并用血球计数板计数，随之将细胞接种到培养瓶中。
54.如图1所示，显示多步消化法分离培养鸭胚原代肝细胞的结果，结果显示本发明建立了一种简单、经济、快速的鸭胚原代肝细胞分离方法。
55.二、日龄选择
56.随着鸭胚日龄逐渐增加，鸭胚的肝脏随之逐渐增大，然而其在离体环境下的活性与适应性却各有差异。另外，随着日龄的增加，鸭胚肝脏表面的附着物也再增多，直接影响制备细胞的纯度。如图2所示，先后分别选择十一、十四、二十日龄鸭胚，从形态学上观察所得细胞的状态，发现14日龄较另外两组有明显优势，细胞呈现上皮型细胞状，细胞核位于细胞正中，可见双核肝细胞，符合肝细胞形态的典型特征。如图4所示，选择了十三、十四、十五、十六日龄的鸭胚，分别对其进行24h、48h、 72h、和96h的培养，观察结果显示，在鸭胚原代肝细胞的制备中，不宜选择过大日龄鸭胚，优先选择十三日龄～十五日龄鸭胚。
57.通过台盼蓝拒染法(索莱宝：c0040)鉴定细胞活力。其中，
58.1、细胞悬液与0.4％台盼蓝溶液以9:1比例混匀(终浓度0.04％)，染色3min；
59.2、吸取少量经过染色的细胞，用血细胞计数板计数。死细胞着蓝色并膨大，无光泽；活细胞不着色并保持正常形态，有光泽；
60.3、细胞存活率(％)＝活细胞总数/(活细胞总数 死细胞总数)
×
100％。
61.如图3所示，根据本发明的方法分离得到的细胞存活率》95％(图3中的上图)，高于谭光辉等酶解法分离得到的鸭胚原代肝细胞(图3中的下图)。
62.三、从mrna水平上对分离细胞进行初步鉴定
63.白蛋白(albumin,alb)由肝细胞分泌，甲胎蛋白(alpha fetoprotein,afp)正常情况下主要来源于胚胎的肝细胞，根据肝细胞这一特点，提取细胞rna，反转录获得cdna，通过pcr扩增这两个基因，随后对扩增得到的基因序列进行测序，确定反转录得到alb和afp，对分离得到的细胞进行了初步鉴定。alb位于第四染色体,基因组登录号nc_040049.1，于46869333位—46879914位，基因id:nm_001310394.1， cds序列长1848bp，引物设计alb-f:atgaagtgggtaacattaatttc，alb-r: ttaagcaccaattcctaatgt。afp位于第四染色体,基因组登录号nc_040049.1，于46836428位—46864918位，基因id:xm_021267672.2，cds序列长1809bp，引物设计afp-f:actgtagtcaaagccctgc，afp-r: ttggaatcaatcctctttcacaaa。如图5所示，测序结果显示本发明的方法得到了肝细胞。
64.四、细胞纯度及功能鉴定
65.在进行肝细胞形态观察的同时，还应对肝细胞的功能进行检测。肝糖原是人和动物体内的贮备多糖，又称肝淀粉。肝细胞赖以生存的能量来源于细胞内的无氧糖酵解，肝细胞内糖原可分解为葡萄糖，为无氧糖酵解提供底物。肝细胞生物能量缺乏是引起肝脏一系列病理改变的始动因素，因而，选择过碘酸-雪夫染色的方法，通过对细胞糖原含量的情况，评价原代肝细胞的生物学功能。如图6所示，镜检结果显示，肝细胞胞质内含有丰富的糖原，糖原被染成紫红色，呈均质或颗粒状分布，表明本发明分离得到的肝细胞具有正常的功能活性。
66.原代培养的肝细胞具有afp的分泌功能，但随着培养时间的延长，肝细胞分泌 afp浓度逐渐降低，经多次传代后的肝细胞基本丧失afp的分泌功能。另外，由于白蛋白由肝实质细胞表达分泌，白蛋白和甲胎蛋白的分泌情况也是肝细胞功能状态的常用检测指标，针对白蛋白，采用间接免疫荧光的方法，对分离细胞的肝细胞功能活性进行评价。另外，同时对细胞核进行dapi染色，对细胞纯度进行鉴定。荧光显微镜观察结果显示，分离所得细胞具备分泌白蛋白的能力，合并结果显示90％以上细胞是可分泌白蛋白能力的肝实质细胞，本发明从鸭胚分离的原代肝细胞具有较高纯度。
67.五、细胞生长曲线
68.细胞生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，是培养细胞生物学特性的基本参数之一。如图7所示采用mtt法绘制的细胞生长曲线显示分离得到的细胞具有典型的细胞生长特点，包括生长缓慢的潜伏期，斜率较大的指数生长期，呈平台状的平顶期及退化衰亡4个部分。
69.现有技术在使用鸭胚分离原代细胞过程中，面临诸如细胞纯度、细胞存活率等问题。本领域技术人员为提高细胞纯度，往往在分离得到细胞后，再对其进行进一步的纯化，比如差速贴壁法、差速离心技术、percoll分离技术等，出于对上述纯化技术的依赖，现有文献材料中鲜有组织前期处理的方法。再者，本领域技术人员一般选择鸭胚日龄偏大，肝脏周围的粘连及肝内的非肝细胞增多，加大了去除难度。本发明在试验过程中发现，不同日龄的鸭胚影响原代细胞培养的效果，本发明的技术方案选择十三日龄～十五日龄鸭胚，使用该胚龄的鸭胚，肝脏的肝非实质细胞较少，同时兼顾肝脏发育情况。
70.根据现有技术的角度，为了提高细胞存活率，本领域技术人员通常从培养基种类、激素添加情况、消化酶使用种类及浓度等繁琐的多条件摸索来确定合适的分离培养方法。本发明采用的多步消化的方法，利用胰酶消化效率高的优势的同时，间接降低了胰酶对细胞的损伤，从而提高了细胞存活率。