一种提高狂犬病病毒耐热稳定性和免疫效果的融合基因、重组狂犬病病毒及其应用

1.本发明属于病毒技术领域，具体涉及一种提高狂犬病病毒耐热稳定性和免疫效果的融合基因、重组狂犬病病毒及其应用。


背景技术：

2.狂犬病(rabies)是由狂犬病病毒(rabies virus，rv)感染引起的一种古老的人兽共患传染病，至今没有特效治疗药物，疫苗接种仍然是预防和控制该病最主要的措施。狂犬病一旦发病，病死率几乎达100％。狂犬病病毒几乎可以感染所有的温血动物，包括家养动物和野生动物，家养动物如马、牛、羊、猪、犬、猫等，野生动物主要包括蝙蝠、狐狸、狼、豺、浣熊、獾等。狂犬病在动物与动物或人之间主要是通过动物咬伤时的唾液传播，另外动物的抓伤、划伤、接种未完全灭活的疫苗或带毒器官的移植等也可能导致感染病毒。在欧美发达国家，由于对家养动物实施严格的免疫接种政策，基本控制了家养动物狂犬病对人的感染，野生动物是狂犬病毒的主要传染源，因此对野生动物实施规模化口服免疫接种是发达国家控制狂犬病的主要措施。
3.目前，传统的狂犬病疫苗必须依赖严格的冷链运输，脱离冷链运输导致疫苗免疫效力降低进而影响免疫效果。因此研制一种具有耐热、高效的狂犬病新型疫苗对于预防和控制狂犬病显得非常必要，具有重要的现实意义。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种提高狂犬病病毒耐热稳定性和免疫效果的融合基因，使制备的重组狂犬病病毒具有耐热和高效免疫效果的特性，为制备新型狂犬病疫苗的潜力，具有广阔的应用前景。
5.本发明提供了一种提高狂犬病病毒耐热稳定性和免疫效果的融合基因，包括矿化基因w6和g基因；
6.所述矿化基因w6的核苷酸序列如seq id no：1所示；
7.所述g基因的核苷酸序列如seq id no：2所示。
8.优选的，所述融合基因包括w6g和gw6；
9.所述w6g的核苷酸序列如seq id no：3所示；
10.所述gw6的核苷酸序列如seq id no：4所示。
11.本发明提供了一种携带矿化基因重组狂犬病病毒，所述重组狂犬病病毒包含所述融合基因；
12.所述融合基因插入在骨架狂犬病病毒基因组的n和p基因之间。
13.优选的，所述融合基因通过bsiw
ꢀⅰ
和nhe
ꢀⅰ
酶切位点插到骨架狂犬病病毒基因组的n和p之间。
14.优选的，所述狂犬病病毒的毒株为狂犬病病毒sad-b19株。
15.优选的，所述重组狂犬病病毒包括rbnsp-rv-gw6和rbnsp-rv-w6g。
16.本发明提供了所述重组狂犬病病毒的构建方法，包括以下步骤：
17.1)将所述融合基因插入骨架狂犬病病毒全长cdna质粒的n基因和p 基因之间，得到重组质粒；
18.2)将所述重组质粒经反向遗传操作系统拯救，得到重组狂犬病病毒。
19.优选的，在所述拯救后还进行体外矿化处理；
20.所述体外矿化处理的方法包括用矿化a液处理重组狂犬病病毒后，再加入矿化b液处理；
21.所述矿化a液的处理时间为50～70min，温度为3～5℃；所述矿化a液为含na2hpo4 0.36g/l、nah2po
4 0.30g/l，ph值为8的水溶液；
22.所述矿化b液的处理时间为50～70min，温度为3～5℃；所述矿化b液为ph值为8的3.33g/l cacl2水溶液。
23.本发明提供了所述重组狂犬病病毒或所述构建方法获得的重组狂犬病病毒在制备防控狂犬病疫苗中的应用。
24.优选的，所述防控狂犬病疫苗的运输温度不超过38℃。
25.本发明提供了一种提高狂犬病病毒耐热稳定性和免疫效果的融合基因，包括矿化基因w6和g基因；所述矿化基因的核苷酸序列如seq id no：1 所示；所述g基因的核苷酸序列如seq id no：2所示。所述融合基因导入骨架狂犬病病毒中，提高了病毒中g蛋白的含量，有利于诱导产生较高水平的抗狂犬病病毒抗体，取得具有较好的免疫效果；同时矿化基因提高了病毒的耐热稳定性，便于后续制备的疫苗进行保存和运输。
26.进一步的，本发明具体限定了矿化基因w6和g基因的连接关系，其中 g基因的序列依次包括信号肽、胞外区、跨膜区和胞内区，gw6为矿化基因w6位于g基因的胞外区之后，跨膜区之前，而w6g为矿化基因w6位于g基因信号肽之后，胞外区之前。实验表明，矿化基因w6和g基因的连接关系是影响重组狂犬病病毒耐热稳定性的因素，gw6融合基因有利于提升重组狂犬病病毒的耐热稳定性。
27.本发明提供了一种携带矿化基因重组狂犬病病毒，所述重组狂犬病病毒包含所述融合基因；所述融合基因的编码序列插入在狂犬病病毒基因组的n 和p基因之间。本发明为评估重组狂犬病病毒作为狂犬病新型疫苗的效果，对重组病毒进行生长曲线、致病性、耐热特性、免疫原性和攻毒保护力以及遗传稳定性等生物学特性研究，重组狂犬病病毒与亲本株相比，生长特性基本一致，在bsr细胞上的滴度比亲本株bnsp-333稍低；作为弱毒疫苗致病性较低，不会对成鼠致死；由于重组狂犬病病毒携带双g基因，使制备的矿化疫苗具有良好的免疫原性，能诱导机体产生具有保护效力的狂犬病中和抗体；同时重组狂犬病病毒具有耐热稳定性，便于保存运输。
附图说明
28.图1为构建重组狂犬病病毒rbnsp-rv-gw6和rbnsp-rv-w6g的基因重组策略，其中a为融合基因的插入位点，b为gw6的序列结构示意图， c为w6g的序列结构示意图；
29.图2为pbnsp-rv-gw6和pbnsp-rv-w6g质粒用bsiwi和nhei双酶切酶切鉴定电泳图；m:γ-ecot14digest，1，2:pbnsp-rv-gw6质粒，3，4: pbnsp-rv-w6g质粒；
30.图3为重组狂犬病病毒pbnsp-rv-gw6和pbnsp-rv-w6g拯救后免疫荧光鉴定结果；蓝色为dapi核染，绿色荧光为狂犬病n蛋白抗体；
31.图4为western blotting检测目的蛋白的结果，m为蛋白marker，1：重组病毒rbnsp-rv-gw6；2为空白对照；3为重组病毒rbnsp-rv-w6g；
32.图5为rt-pcr检测重组狂犬病病毒rbnsp-rv-gw6和rbnsp-rv-w6g 基因的遗传稳定性，a.bnsp-gw6遗传稳定性鉴定结果，其中m：trans 2k marker；1：第5代；2：第10代；3：第15代；b.bnsp-w6g遗传稳定性鉴定结果，其中m：trans 2k marker；1：第5代；2：第10代；3：第15 代
33.图6为嵌合gw6和w6g基因的重组狂犬病病毒rbnsp-rv-gw6和 rbnsp-rv-w6g及构建的嵌合gfp基因和rv-g基因的重组病毒在vero上的生长曲线；
34.图7为嵌合gw6和w6g基因的重组狂犬病病毒rbnsp-rv-gw6和 rbnsp-rv-w6g制备的抗原在balb/c小鼠体内的狂犬病抗体水平，同时设立与gel佐剂制备的疫苗与pbs的阴性对照组在免疫后不同时期的抗体水平；
35.图8为重组狂犬病病毒rbnsp-rv-gw6和rbnsp-rv-w6g制备的抗原及与gel佐剂制备的疫苗与pbs的阴性对照在免疫小鼠28天后免疫小鼠存活率；
36.图9为狂化处理后的不同病毒株耐热稳定性实验结果。
具体实施方式
37.本发明提供了一种提高狂犬病病毒耐热稳定性和免疫效果的融合基因，包括矿化基因w6和g基因；所述矿化基因w6的核苷酸序列如seq id no： 1所示；所述g基因的核苷酸序列如seq id no：2所示。
38.在本发明中，所述融合基因包括g基因。g基因是狂犬病毒唯一能够产生中和抗体的蛋白，通过在融合基因中限定g基因，使重组狂犬病病毒中含有双g基因，提高免疫原的含量，有利于诱导更高水平的抗体，从而使制备的重组狂犬病病毒更适合制备疫苗候选株。
39.在本发明中，所述融合基因包括矿化基因w6。所述矿化基因w6具有耐热稳定性特性，便于保存运输。
40.在本发明中，根据矿化基因w6和g基因的连接关系不同，所述融合基因优选包括w6g和gw6；所述w6g为矿化基因w6位于g基因信号肽之后，胞外区之前。所述w6g的核苷酸序列如seq id no：3所示，其中第 7～122位为信号肽序列，第123～191位为w6序列，第192～1278bp膜外区序列，第1279～1464位为跨膜区序列，第1280～1650位胞内区序列；5'和3' 端分别为bsiw1和nhe1酶切位点。所述gw6为矿化基因w6位于g基因的胞外区之后，跨膜区之前。所述gw6的核苷酸序列如seqidno：4所示，其中第7～122位为信号肽序列，123～1210膜外区序列，第1210～1278 位为w6序列，第1279～1464位为跨膜区序列，第1465～1650位胞内区序列， 5'和3'端分别为bsiw1和nhe1酶切位点。实验表明，gw6融合基因比w6g 更有利于提升重组狂犬病病毒的耐热稳定性。
41.本发明提供了一种携带矿化基因重组狂犬病病毒，所述重组狂犬病病毒包含所述融合基因；所述融合基因的编码序列插入在狂犬病病毒基因组的n 和p基因之间。
42.在本发明中，所述融合基因优选通过bsiwⅰ和nheⅰ酶切位点插到狂犬病病毒基因组的n基因和p基因之间。所述狂犬病病毒的骨架毒株优选为狂犬病病毒sad-b19株。所述狂
犬病病毒sad-b19株为现有技术报道的已知病毒株，具体参见现有技术(genetic stability(in vivo)of the attenuated oralrabies virus vaccine sad b19.beckert a,geue l,vos a,neubert a,freuling c, m
ü
ller t.beckert a,et al.microbiol immunol.2009jan；53(1):16-21.)。
43.在本发明中，所述重组狂犬病病毒优选包括rbnsp-rv-gw6和 rbnsp-rv-w6g。以sad-b19株为基础病毒株，插入gw6融合基因后，得到rbnsp-rv-gw6。以sad-b19株为基础病毒株，插入w6g融合基因后，得到rbnsp-rv-w6g。
44.本发明提供了所述重组狂犬病病毒的构建方法，包括以下步骤：
45.1)将所述融合基因插入狂犬病病毒全长cdna质粒的n和p之间，得到重组质粒；
46.2)将所述重组质粒经反向遗传操作系统拯救，得到重组狂犬病病毒。
47.在本发明中，所述插入的方法优选在人工合成融合基因时，在两端引入插入酶切位点的序列，通过限制性内切酶酶切和连接实现插入融合基因。两端连接的酶切位点的限制性内切酶的种类优选为bsiwⅰ和nheⅰ。引入酶切位点的融合基因的核苷酸序列如seq id no：5(w6g')和seq id no： 6(gw6')所示。
48.在本发明中，狂犬病病毒全长cdna质粒优选为pbnsp。所述pbnsp 为本实验室构建并在现有技术(携带gfp基因的重组狂犬病病毒的拯救及其生物学特性研究，中国畜牧兽医，2018,45(7):1965-1971.)中公开报道。所述将融合基因插入在n和p之间有利于外源基因的表达，并与其他插入位点(g基因和l基因之间)相比，提高插入的外源基因的表达量。
49.在本发明中，所述所述重组质粒经经反向遗传操作系统拯救优选参照 matthias schnell方法进行即可。
50.在本发明中，在所述拯救后还进行体外矿化处理。所述体外矿化处理的方法包括用矿化a液处理重组狂犬病病毒后，再加入矿化b液处理；所述矿化a液的处理时间为50～70min，温度为3～5℃；所述矿化a液为含 na2hpo4 0.36g/l、nah2po
4 0.30g/l，ph值为8的水溶液；所述矿化b液的处理时间为50～70min，温度为3～5℃；所述矿化b液为ph值为8的3.33g/l cacl2水溶液。体外矿化处理有利于使重组狂犬病病毒表面结合钙磷等元素，进一步提高重组狂犬病毒的耐热稳定性。
51.在本发明中，将制备的重组狂犬病病毒进行传代和鉴定，经westernblotting鉴定g蛋白的表达情况表明重组病毒可以表达目的蛋白，分别检测传代1代、5代、10代、15代病毒的遗传稳定性，结果表明，各代病毒融合基因未发生突变，说明遗传稳定性良好。
52.所述重组狂犬病病毒在小鼠体内的致病性研究表明，重组狂犬病病毒对小鼠无致病性，证实以sad-b19为骨架的重组狂犬病病毒是弱毒病毒，可以制备疫苗对动物进行狂犬病的免疫。免疫攻毒实验表明，灭活病毒对小鼠的攻毒保护率为100％，而阴性对照小鼠全部发病死亡。
53.鉴于重组狂犬病病毒具有理想的耐热稳定性、遗传稳定性以及较高的免疫原性和生长性能，本发明提供了所述重组狂犬病病毒或所述构建方法获得的重组狂犬病病毒在制备防控狂犬病疫苗中的应用。
54.在本发明中，所述防控狂犬病疫苗的运输温度不高于38℃。
55.在本发明中，所述灭活疫苗的攻毒保护率为100％，说明所述灭活疫苗能抵抗狂犬病毒的攻击，在攻毒试验中符合国际要求的免疫攻毒保护率80％以上的标准。
ptit-l，1μl ptit-g plasmid，1.5μl pcaggs-t7在另一个 1.5ml离心管中混匀。
74.(4)将混匀的质粒加到转染试剂的管中，混匀后在室温静置15min。
75.(5)将质粒和转染试剂混合液加到6孔板中细胞中，100μl/孔，然后置于34℃5％co2培养箱中培养96h。
76.病毒筛选：
77.转染后第5天，将6孔板中的细胞分别转移到60mm的平皿中扩大培养。转染后第8天，收获病毒液，可进行免疫荧光试验鉴定重组病毒是否拯救成功。其方法如下：将收获的病毒液加到12孔板中长满单层细胞中，然后置于34℃、5％co2培养箱中培养24h，收获上清液，每孔加满80％预冷的丙酮，置4℃下保温30min。弃去丙酮，轻微空干，每孔添加500μl抗狂犬病病毒n蛋白荧光抗体以及抗cdv荧光抗体，37℃孵育1～2h，弃去溶解液，用去离子洗涤细胞3次，荧光显微镜下观察，均可见大量绿色荧光斑点，见图3，获得的病毒命名为：rbnsp-rv-gw6和rbnsp-rv-w6g。
78.实施例3
79.重组病毒rbnsp-rv-gw6和rbnsp-rv-w6g的传代和鉴定
80.1、测定拯救的重组狂犬病病毒rbnsp-rv-gw6和rbnsp-rv-w6g的毒价，按moi(multiplicity of infection)0.1接种长满单层veroe6的细胞，置于 34℃、5％co2培养箱中培养72h，收获病毒，补加培养液继续置于34℃、5％ co2培养箱中培养约72h，然后再收获病毒，这样连续收获病毒3次。分装
ꢀ‑
80℃保存备用。依次传代至第15次，并检测病毒滴度，两株重组病毒的滴度均可达1
×
107ffu/ml。
81.用western blotting鉴定g蛋白的表达情况，结果如图4所示，表明重组病毒可以表达目的蛋白。
82.用rt-pcr鉴定重组病毒中gw6和w6g基因的遗传稳定性。其中引物如下：上游引物：5
′‑
ggctgaactgacaaagactgac-3
′
(seq id no:5)；
83.下游引物：5
′‑
cagccatctcaagatcggccag-3
′
(seq id no:6)。
84.50μl反应体系：taq预混酶25μl，上、下游引物(50pmol/μl)各 1μl，cdna 2μl，无菌水21μl。反应程序：95℃，5min；{94℃，1min； 57℃，1min；72℃，2min；}35cycles；72℃，10min。
85.检测结果如图5所示，表明重组病毒可以稳定传代。
86.实施例4
87.重组病毒rbnsp-rv-gw6和rbnsp-rv-w6g在vero细胞上的体外生长曲线研究
88.1、将vero细胞在6孔板中按细胞数5
×
105/孔培养24h，然后将重组狂犬病病毒rbnsp-rv-gw6和rbnsp-rv-w6g按moi10感染细胞，置于 34℃、5％co2培养，病毒感染后分别在2h、24h、48h、72h和96h取样100μl 上清培养液，最后进行免疫荧光试验，测定并绘制病毒生长曲线。
89.结果图6显示，重组病毒rbnsp-rv-gw6和rbnsp-rv-w6g的滴度比本实验室构建的携带gfp基因的重组病毒滴度稍低一点，在感染后72h，病毒滴度达到最高水平见。
90.实施例5
91.重组病毒rbnsp-rv-gw6和rbnsp-rv-w6g在balb/c小鼠体内的致病性研究
92.1、将毒价达到1
×
107ffu/ml的重组病毒用2％fbs的pbs作10倍系列稀释，稀释度
的梯度为10-1
～10-5
，每个稀释度的病毒脑内接种6～8周龄 balb/c小鼠6只，每只接种0.03ml，逐日观察，3天内死亡的老鼠不是由于病毒感染引起，为非特异性死亡，不计入最后结果，观察14天。
93.结果显示，所有小鼠在观察期内均健康生长，没有肉眼可见的临床症状出现，表明重组病毒对小鼠无致病性，证实以sad-b19为骨架的重组狂犬病病毒是弱毒病毒，可以用于口服疫苗对野生动物进行狂犬病的免疫。
94.实施例6
95.重组病毒rbnsp-rv-gw6和rbnsp-rv-w6g灭活疫苗、免疫原性及攻毒保护研究
96.1、重组狂犬病病毒的灭活和疫苗的制备方法
97.(1)将重组病毒rbnsp-rv-gw6和rbnsp-rv-w6g，按0.025％的比例加入β-丙内脂，4℃振荡24h，再置于37℃下水解2h，完成病毒的灭活。
98.(2)灭活病毒的安全检验：将灭活后的病毒液、未灭活的狂犬病毒液分别与bsr细胞共同培养在96孔细胞培养板上，34℃，5％co2培养箱内培养4d后，进行免疫荧光试验检测是否有狂犬病毒生长，如果灭活的病毒样品能够检测到绿色荧光，说明灭活不彻底。结果灭活病毒无荧光斑点，未灭活病毒均有绿色荧光斑点。
99.(3)采用法国seppic公司的montanide gel佐剂，按5％～20％的比例与灭活抗原混合，以200转/分钟乳化低速搅拌10min即可，然后将疫苗分装于灭菌的疫苗瓶内，加盖密封，置于4℃保存备用。
100.2、疫苗免疫试验：
101.用rbnsp-rv-gw6、rbnsp-rv-w6g灭活抗原和其与montanide gel 佐剂制备的疫苗分别免疫balb/c小鼠，每只小鼠接种200μl，每组接种20 只，同时设置阴性对照小鼠(注射200μl pbs)。每组小鼠在0天和14天进行免疫，共免疫2次。于首次免疫后7d、21d和28d分别采血3只小鼠，用本实验室建立的间接elisa法测定抗狂犬病毒糖蛋白的抗体水平。
102.结果显示，灭活抗原与montanide gel制备的疫苗免疫小鼠后能够产生较高的抗狂犬病毒糖蛋白的抗体水平(见图7)。
103.为了验证小鼠获得高水平免疫力后是否具有对狂犬病毒攻击的免疫保护能力，在免疫后第28d对小鼠颅内接种50ld
50
的cvs-11 30μl，连续观察 14d，记录小鼠的发病及死亡情况。
104.结果如图8所示，免疫灭活抗原与montanide gel佐剂制备的疫苗的小鼠在狂犬病毒攻击后全部存活，单独用灭活抗原免疫的小鼠保护率为100％，阴性对照小鼠全部发病死亡。
105.上述结果表明，rbnsp-rv-gw6和rbnsp-rv-w6g制成的灭活疫苗免疫小鼠后能够抵抗狂犬病毒的攻击，在攻毒试验中符合国际要求的免疫攻毒保护率80％以上的标准。
106.实施例7
107.为了检验重组病毒rbnsp-rv-gw6和rbnsp-rv-w6g在携带矿化基后在不同温度下的耐热稳定性，将重组病毒rbnsp-rv-gw6和rbnsp-rv-w6g 以及没有携带矿化基因的重组病毒rbnsp-rv-hg和rbnsp-rv-g分别置于 4℃、25℃和37℃，放置7天后检测病毒滴度。
108.结果如下表3所示，表明在重组病毒在嵌合矿化基因后具有一定的耐热稳定特性。
109.表3热稳定性测试结果
[0110][0111]
实施例8
[0112]
体外矿化方法及耐热稳定性试验
[0113]
1)矿化溶液配制：分别配制a液和b液，其组成分别为：
[0114]
矿化a液：分别称取na2hpo40.36g，nah2po40.30g，溶解至1l无离子水中混匀，调节ph值8.0，并用0.45μm滤器过滤备用。
[0115]
矿化b液：称取cacl23.33g溶解至1l无离子水中混匀，调节ph值 8.0，并用0.45μm滤器过滤除菌备用。
[0116]
2)体外矿化方法：首先在15ml离心管中加入8ml矿化a液，然后加入重组狂犬病病毒2ml，并在4℃用磁力搅拌器搅拌1小时，然后加入1ml 矿化b液，置4℃磁力搅拌器搅拌2小时，完成病毒体外矿化处理。
[0117]
3)耐热稳定性试验：
[0118]
按上述体外矿化方法，分别矿化处理了重组狂犬病病毒rbnsp-rv-gw6 和rbnsp-rv-w6g，同时也矿化处理了没有插入矿化基因的重组狂犬病病毒 rbnsp-g(按照rbnsp-rv-gw6的构建方法仅插入g基因拯救获得的重组病毒)和rbnsp-hg(在rbnsp-g的基础上插入的g基因的信号肽替换为人 igg的信号肽)，作为对照比对矿化基因w6的耐热特性。矿化后的病毒 rbnsp-rv-gw6记为rbnsp-gw6，矿化后的病毒rbnsp-rv-w6g记为 rbnsp-w6g。将上述矿化处理的样品分别放置在4℃和37℃，测定了放置5 天的病毒滴度。
[0119]
结果如图9所示。试验表明，插入矿化基因后经体外矿化处理，重组病毒在37℃的条件下放置5天，病毒滴度基本没有降低，具有明显的耐热稳定特性。
[0120]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。