耐受农药酷拉斯的小麦纹枯病生防贝莱斯芽孢杆菌及应用的制作方法

1.本发明涉及农业微生物技术领域，更具体的说是涉及耐受农药酷拉斯的小麦纹枯病生防贝莱斯芽孢杆菌及应用。


背景技术：

2.小麦纹枯病也被称为立枯病、尖眼点病，是由小麦喙角担菌的侵染引起的病原性真菌感染病害。小麦的叶鞘及其茎杆容易沾染该疾病，随着时间的推移，沾染病菌的部位逐渐向外延伸，发病前缓后急。小麦在每个生育期都可能遭受该病害，造成倒伏、烂芽、枯孕穗、死苗等多种表现。
3.农药酷拉斯可高效防治小麦纹枯病，能够长久地对小麦进行保护，并促进小麦生长，在常规的基础上降低小麦播种量，提高产量。酷拉斯的有效成分是噻虫嗪、咯菌腈、苯醚甲环唑；其可抑制病原菌，有效促进农作物正常生长，提高作物产量。然而，随着农药滥用的问题日益严重，病原菌的耐药性逐渐增强，继续加大农药量的使用会影响农作物的生长，不但会造成农药污染，还会影响农作物的品质，因此，农药减量化已发展为必然趋势。
4.将生防菌与农药杀菌剂混合搭配施用，一方面可大大降低农药成本，减少农药残留、农药对植物的负面影响以及农药对人体的安全风险，另一方面又可以发挥生防菌防治病害的效用，保障防治病害的效果，解决病害耐药性增强的问题。因此，亟待提供能够与酷拉斯相容的病原菌拮抗菌，探索生防菌与化学农药混配的可能性，为提高生防菌的作用效果、降低种植户生产成本提供有效途径。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明提供了耐受农药酷拉斯的小麦纹枯病生防贝莱斯芽孢杆菌，其对农药酷拉斯具有良好的耐受性，并且对小麦纹枯病病原菌具有良好的拮抗作用，可与酷拉斯共用进行小麦纹枯病的防治，在保证防效的基础上实现农药减量。
6.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.耐受农药酷拉斯的小麦纹枯病生防贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)，命名为nw03，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.22694，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2021年06月11日。
8.上述耐受农药酷拉斯的小麦纹枯病生防贝莱斯芽孢杆菌在防治小麦纹枯病中的应用。
9.进一步地，防治小麦纹枯病时，对小麦施用农药酷拉斯并且接种上述贝莱斯芽孢杆菌。
10.由上述技术方案可知，本发明公开的贝莱斯芽孢杆菌nw03对酷拉斯具有较强的耐受作用；与酷拉斯共用，在酷拉斯减半的情况下即可达到与单独使用酷拉斯相似的防治效果，适于推广应用。
附图说明
11.图1所示为筛选获得的部分耐受农药酷拉斯的芽孢杆菌；
12.图2所示为部分筛选菌株对小麦纹枯病菌的拮抗效果；
13.图3所示为拮抗菌株在含有酷拉斯的培养基中的生长情况；
14.图4所示为nw03菌株菌落形态；
15.图5所示为nw03菌株系统发育树。
具体实施方式
16.下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
17.实施例1nw03的分离筛选及鉴定
18.1.试验材料
19.小麦植株样品取自河北农业大学农场小麦种植地，样品采集的时间是2019年4月份。小麦纹枯病病原菌由本实验室保存。试验用小麦品种为冀麦418，产地保定，无包衣。
20.2.培养基
21.pda培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，蒸馏水1000ml。将马铃薯去皮，切成小块，加水煮沸0.5h，用双层纱布过滤，取其滤液加糖，并加水补足1000ml。
22.na培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，nacl 5g，琼脂15～20g，蒸馏水1000ml，ph 7.0～7.2。
23.nb培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，nacl 5g，蒸馏水1000ml，ph 7.0～7.2。
24.3.小麦纹枯病病原菌的培养
25.将灭菌的pda培养基融化后倒平板，加入硫酸链霉素使其终浓度为40μg/100ml。将小麦纹枯病病原菌菌片接种于pda平板中央，26℃培养箱培养5-7d，待菌丝长满板备用。
26.4.耐受酷拉斯农药的芽孢杆菌的筛选
27.将小麦幼苗根部用清水洗净，用无菌滤纸将水吸干，用75.0％酒精对小麦根部进行表面消毒，在无菌研钵中碾碎，将研碎的幼苗根部组织放入灭菌的250ml锥形瓶中(锥形瓶里含100ml无菌水和玻璃珠)，震荡摇匀30min，水浴锅中80℃水浴加热5min，通过稀释涂布法在含有农药酷拉斯(终浓度为100μl/100ml)的na平板上分离筛选耐受酷拉斯的芽孢杆菌。37℃培养过夜，对筛选出的耐受酷拉斯的菌株进行统计编号。
28.经初步筛选，从小麦根部组织中筛选出了106株能够耐受酷拉斯农药的芽孢杆菌(图1)。
29.5.拮抗小麦纹枯病菌的芽孢杆菌的筛选
30.利用病原菌作为指示菌，采用对峙培养法进行拮抗试验，检测筛选的耐受酷拉斯的菌株生成抑菌带情况，筛选拮抗小麦纹枯病病原菌的菌株。
31.将小麦纹枯病病原菌菌片放置在pda平板中央，用无菌竹签挑取筛选的菌株接种到距离病原菌片2.5cm的位置，每个平板均匀接种4-5个单菌落，26℃培养箱倒置培养5-7d。将能够产生明显抑菌带的拮抗细菌接种到na斜面，37℃恒温培养过夜备用。
32.对小麦纹枯病病原菌有抑制作用的菌株有64株，部分结果如图2所示；其中6株拮抗效果显著，对小麦纹枯病病原菌的抑菌带宽度均达到1.5cm以上。
33.6.拮抗菌的生长特性检测
34.将筛选的对病原菌有显著拮抗活性的菌株在含有酷拉斯(终浓度为100μl/100ml)的nb培养基中37℃恒温震荡培养，每隔24h检测各菌株在600nm下的吸光值，培养时间为96h，并且设置不添加农药酷拉斯的对照组(选用菌株为实验室前期筛选的用于工业生产的芽孢杆菌菌株z-5)。记录好吸光值，绘制生长曲线。如图3所示，nw03菌株发酵液的浓度在培养72h达到最大值，高于不添加酷拉斯的对照组，表明该菌株对酷拉斯有很强的耐受能力，其生长不受酷拉斯的抑制，之后有所下降，在培养96h略低于对照组。而其余5株菌株在含有酷拉斯的培养基中生长受到显著抑制。
35.7.菌株鉴定
36.nw03菌株在na平板上生长的菌落成圆形或者椭圆形，乳白色，表面湿润光滑，中间凸起(图4)。依据《伯杰氏细菌鉴定手册》的方法对筛选的菌株进行种属鉴定。利用通用引物27f和1495r扩增筛选菌株的16s rdna序列。pcr产物测序结果在ncbi数据库中进行blast对比，并与模式菌株进行序列同源性比较，用mega6.0软件构建系统发育树。结果表明nw03菌株为贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)(图5)。
37.实施例2拮抗菌和农药混施对小麦纹枯病的防治作用
38.将在含有酷拉斯的培养基中生长状况良好的nw03菌株划线接种于na培养基，37℃恒温培养过夜，挑取单菌落于nb培养基中，37℃摇床振荡培养48h。将发酵液8000rpm离心5min回收菌体，用无菌水悬浮稀释到活菌浓度约为1
×
108cfu/ml，细菌计数采用细菌计数板进行。
39.将盆栽试验分为4组，分别为空白对照组ck0，病原菌组ck1，农药处理组ny和菌剂加农药组jy，每个组设置5个重复。取直径为12.9cm，高12.4cm的花盆，每盆均匀播种12粒小麦种子，种植小麦的土壤取自河北农业大学农场小麦种植地。空白对照组用水进行浇灌，不接种病原菌和拮抗菌。病原菌组接种小麦纹枯病病原菌，小麦种子放置在病原菌菌片(直径7mm)上，每个菌片放置1粒小麦种子。农药处理组和菌剂加农药组接种病原菌的方式与病原菌组相同。农药处理组按照100kg种子接入600ml酷拉斯的剂量对小麦种子进行拌种；菌剂加农药组采用农药减半施用，并浇灌nw03菌悬液20ml，室温培养，种植20d后进行防治效果调查。植株生长状况检测按株进行，每组取样量为20株，然后计算平均值。
40.小麦纹枯病发病分级标准：
41.0级：全株无病；
42.1级：外叶鞘1/2以下变褐；
43.2级：外叶鞘1/2以上变褐；
44.3级：茎基部产生明显眼状病斑。
45.病情指数＝[∑(各级病株数
×
代表数值)/调查总株数
×
发病最重级的代表数值]
×
100。
[0046]
防治效果＝[(对照组病情指数－处理组病情指数)/对照组病情指数]
×
100％。
[0047]
结果如表1所示。菌剂加农药组jy在根长、根重、地上高和地上重与农药处理组ny以及空白对照组ck0相比差异不显著，和病原菌组ck1差异显著。jy组对小麦纹枯病的防治
效果达到78.4％，略高于ny组，但两者之间差异不显著。表明在农药减半施用的情况下，nw03菌株发酵液的施用能够有效防治小麦纹枯病的发生，起到和足量施用酷拉斯相似的防治效果，达到了在减施农药的条件下，有效防治病害发生的目的。
[0048]
表1酷拉斯和nw03菌株混施对小麦纹枯病的防治效果
[0049][0050][0051]
ck0为空白对照组，ck1为病原菌组，ny为农药处理组，jy为菌剂加农药组。
[0052]
实施例3田间试验检测nw03菌株减少农药酷拉斯的使用防治小麦纹枯病的效果
[0053]
选择上一年发生小麦纹枯病严重且均匀的地块，地块面积约666.7m2，分为3小块，每小块约222.2m2，分别设为对照组，农药组和菌剂加农药组。农药组按照6ml酷拉斯农药：1kg种子的剂量拌种，将种子和农药加入结实的塑料袋中，把口绑紧，上下颠倒使农药和小麦种子混匀。菌剂加农药组按照农药减半施用，另外加入活菌含量约为1.0
×
10
10
cfu/ml的nw03菌剂拌种，接种量为10ml/kg种子。采用机械播种，管理方式同一般大田。
[0054]
在小麦乳熟期，采取5点取样法进行取样，每点取连续3行，每行取0.4m，调查统计株高、平均穗粒数(每个随机取样点30株，每组取样150株)，种子晾干后称千粒重，并单打单收测定每平方米的产量，结果参见表2。
[0055]
表2 nw03菌株和农药酷拉斯混合施用在小麦乳熟期对小麦纹枯病的防治效果
[0056][0057]
表中数据为平均数
±
标准差。同列数据后不同字母表示经lsd法检验在p《0.05水平差异显著。
[0058]
在小麦乳熟期对纹枯病防治效果调查显示，和对照组相比，菌剂加农药组株高和产量增加显著，小麦株高由76.24cm增加到87.03cm，小麦产量由603.2g/m2增加到778.96g/m2，效果显著，表明nw03菌株制备的菌剂的施用，能有效减少农药酷拉斯的使用，而对小麦纹枯病的防治效果并没有降低。菌剂加农药组和农药组比较，小麦株高和产量均有所增加，但差异不显著。
[0059]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的
一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。