利用猪胆提取胆红素后的下料合成熊去氧胆酸的方法与流程

7k-lca，t-hca氧化成t-7k-hca；并通过hplc和tlc检验，上述氧化底物残留小于1%，总转化率大于95%，备用。
7.二、在步骤一的备用氧化产物中，加入7β-胆烷酸加氢酶和辅酶nadp

，所述7β-胆烷酸加氢酶的添加量为步骤一中猪胆汁量的0.01-0.03%，所述辅酶nadp

的添加量为步骤一中猪胆汁量的0.001-0.003%，温度控制在35-38℃之间，添加步骤一中猪胆汁量1-2%的异丙醇，由异丙醇氧化成丙酮提供h源，搅拌下抽真空回收丙酮，使t-7k-lca转变成t-udca，t-7k-hca转变成t-3α、6α、7β三羟基-胆烷酸，备用。
8.三、在步骤二的体系中，加入30g丙酮吸收“h”，加入步骤一中猪胆汁量0.01-0.03%的6α-胆烷酸羟基氧化酶，使其中的t-hdca转变成t-6k-lca，t-3α、6α、7β-三羟基-胆烷酸转变成t-6k-3α、7β-二羟基-胆烷酸。
9.四、在步骤三反应完成后，加入5%浓度的hcl调溶液的ph值，使ph=5-6，采用离心或压滤的方式去掉溶液中析出的酶絮状物，再在清液中加入hcl，继续调ph=2-3，此时所有胆汁酸结晶沉淀，离心或过滤得到中间体混合固体。
10.五、在步骤四中的产物中加入相当于步骤一中猪胆汁量15%的高沸点醇，包含不限于乙二醇、二乙二醇，再加入步骤一中猪胆汁量1%的氢氧化钠，回收至温度95-100℃后，加入步骤一中猪胆汁量1%的水合肼，边回收边反应，多余的水合肼回收后可用于后期重复使用；直到温度升至198℃以上，继续升温反应30-45分钟，t-udca转变成udca，t-6k-3α、7β-二羟基-胆烷酸转变成udca，t-6k-lca转变成石胆酸（lca）。
11.六、待步骤五的反应完成后，冷却至50℃-60℃，加入体系1-2倍的水，调ph=8，加入疏水性溶剂，所述疏水性溶剂包含不限于氯仿，常见低沸点脂类如乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸异丙酯和甲酸丙脂等；萃取到ph=5-6，lca与残留的微量cdca会溶于疏水性溶剂中，而udca属于水溶性胆汁酸，溶于醇与水混合相之中，加入碱水使ph 》10后减压旋蒸回收水相中的溶剂，再加入盐酸调ph=2-3后结晶抽滤，干燥后得到纯度为95-98%的udca干品。
12.七、将步骤六的疏水性溶剂中的lca，加入步骤一中猪胆汁量0.01-0.03%的7β-羟基加成酶、步骤一中猪胆汁量0.01-0.03%的乙酰辅酶作为辅酶进行反应，使lca转变成7-乙酰-udca酯，加0.05倍步骤一中猪胆汁量的氢氧化钠溶液皂化后生成udca。
13.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：1、目前由lca转变成udca的酶工艺方法报道虽然较多，但受lca原料来源的限制，不易形成规模化的生产；本发明方法能够在第六步得到总胆汁酸量50%左右的lca，从而解决了lca原料来源不足的问题，为实现lca向udca转变的工业化生产可行性。
14.2、猪胆中的hdca占总胆酸的12-15
‰
左右，cdca占6-8
‰
左右，hca占2-4
‰
，余下的为udca和胆汁酸氧化物，现有工艺生产利用cdca和hdca分别提纯后合成udca，其中cdca提取后收率为胆汁的4-5
‰
，cdca转化成udca后的收率为胆汁的3
‰
左右；hdca提纯后合成udca的最大收率约为3
‰
左右，总收率约为6
‰
，本发明工艺实施后能将猪胆汁内所含的20-25
‰
的胆汁酸转变成udca，最终经过纯化后一次性收率约17-20
‰
，可让udca的转化收率大大提高。
附图说明
15.图1为本发明的工艺路线图。
具体实施方式
16.为使本发明的目的、技术方案更加清楚明白，以下结合附图1和具体实施例，对本发明的工艺步骤作进一步详细说明。
17.实施例1一种利用猪胆提取胆红素后的下料合成熊去氧胆酸的方法，其工艺步骤如下：一、取提取了胆红素后的猪胆汁1000g，在1000g猪胆汁中，加入0.1g7α-胆烷酸脱氢酶，加入0.01g辅酶nad

，加入0.2g丙酮还原酶，采用丙酮还原酶将丙酮还原成异丙醇接受h源，反应过程中的温度控制为25℃，将t-cdca氧化成t-7k-lca，t-hca氧化成t-7k-hca，通过hplc和tlc检验，t-cdca和t-hca残留小于1%后终止反应，总转化率大于95%，备用。
18.二、在步骤一备用的氧化产物中，加入0.1g 7β-胆烷酸加氢酶和0.01g辅酶nadp

，温度控制为35℃，添加10g异丙醇，由异丙醇氧化成丙酮提供h源，搅拌下抽真空回收丙酮，使t-7k-lca转变成t-udca，t-7k-hca转变成t-3α、6α、7β三羟基-胆烷酸，备用。
19.三、在步骤二的体系中，加入30g丙酮吸收“h”，加入0.1g6α-胆烷酸羟基氧化酶，使其中的t-hdca转变成t-6k-lca，t-3α、6α、7β-三羟基-胆烷酸转变成t-6k-3α、7β-二羟基-胆烷酸。
20.四、在步骤三反应完成后，加入5%浓度的hcl调溶液的ph值，使溶液的ph值=5，采用离心的方式去掉溶液中析出的酶絮状物，再在清液中加入hcl，继续调ph值=2，此时所有胆汁酸结晶沉淀，离心得到65g中间体混合固体。
21.五、在步骤四中的产物中加入150g乙二醇，再加入10g氢氧化钠，回收至温度为95℃后，加入10g水合肼，边回收边反应，多余的水合肼回收后可用于后期重复使用；将溶液温度升至200℃，继续反应30分钟，t-udca转变成udca，t-6k-3α、7β-二羟基-胆烷酸转变成udca，t-6k-lca转变成石胆酸（lca），hplc检验无底物残留。
22.六、待步骤五的反应完成后，将溶液温度冷却至50℃，加入体系1-2倍的水，使溶液的ph值=8，加入600g氯仿，萃取到溶液的ph值=5，此时lca与残留的微量cdca会溶于氯仿溶剂中，而udca属于水溶性胆汁酸，溶于醇与水混合相之中，加入碱水使ph值》10后减压旋蒸回收水相中的溶剂，再加入盐酸使ph值=2-3后结晶抽滤，干燥后得到纯度为95-98%的udca结晶干品10g，进一步纯化结晶得到udca成品。
23.七、将步骤六的疏水性溶剂加水回收，后期加入碱水溶解lca，回收完全溶剂后补水到600ml，调ph=7-8，加入0.1g7β-羟基加成酶，和0.1g乙酰辅酶作为辅酶进行反应，使lca转变成7-乙酰-udca酯，加50g氢氧化钠溶液，煮沸皂化2小时除杂，皂化后冷却到室温，加入盐酸调ph=2-3，结晶得udca，抽滤后干燥得13gudca。
24.实施例2一种利用猪胆提取胆红素后的下料合成熊去氧胆酸的方法，其工艺步骤如下：一、取提取了胆红素后的猪胆汁1000g，在1000g猪胆汁中，加入0.2g7α-胆烷酸脱氢酶，加入0.02g辅酶nad

，加入0.3g丙酮还原酶，采用丙酮还原酶将丙酮还原成异丙醇接受h源，反应过程中的温度控制为28℃，将t-cdca氧化成t-7k-lca，t-hca氧化成t-7k-hca，通过hplc和tlc检验，t-cdca和t-hca残留小于1%后终止反应，总转化率大于95%，备用。
25.二、在步骤一备用的氧化产物中，加入0.2g 7β-胆烷酸加氢酶和0.02g辅酶nadp

，温度控制为37℃，添加15g异丙醇，由异丙醇氧化成丙酮提供h源，搅拌下抽真空回收丙酮，
使t-7k-lca转变成t-udca，t-7k-hca转变成t-3α、6α、7β三羟基-胆烷酸，备用。
26.三、在步骤二的体系中，加入30g丙酮吸收“h”，加入0.2g6α-胆烷酸羟基氧化酶，使其中的t-hdca转变成t-6k-lca，t-3α、6α、7β-三羟基-胆烷酸转变成t-6k-3α、7β-二羟基-胆烷酸。
27.四、在步骤三反应完成后，加入5%浓度的hcl调溶液的ph值，使溶液的ph值=5，采用压滤的方式去掉溶液中析出的酶絮状物，再在清液中加入hcl，继续调ph值=2，此时所有胆汁酸结晶沉淀，压滤得到70g中间体混合固体。
28.五、在步骤四中的产物中加入150g二乙二醇，再加入10g氢氧化钠，回收至温度为98℃后，加入10g水合肼，边回收边反应，多余的水合肼回收后可用于后期重复使用；将溶液温度升至205℃，继续反应40分钟，t-udca转变成udca，t-6k-3α、7β-二羟基-胆烷酸转变成udca，t-6k-lca转变成石胆酸（lca），hplc检验几乎无底物残留。
29.六、待步骤五的反应完成后，将溶液温度冷却至55℃，加入体系1-2倍的水，使溶液的ph值=8，加入500g乙酸乙酯，萃取到溶液的ph值=5，此时lca与残留的微量cdca会溶于乙酸乙酯溶剂中，而udca属于水溶性胆汁酸，溶于醇与水混合相之中，加入碱水使ph值》10后减压旋蒸回收水相中的溶剂，再加入盐酸使ph值=2-3后结晶抽滤，干燥后得到纯度为95-98%的udca结晶干品9.5g，进一步纯化结晶得到udca成品。
30.七、将步骤六的疏水性溶剂加水回收，后期加入碱水溶解lca，回收完全溶剂后补水到600ml，调ph=7-8，加入0.2g7β-羟基加成酶，和0.2g乙酰辅酶作为辅酶进行反应，使lca转变成7-乙酰-udca酯，加50g氢氧化钠溶液，煮沸皂化3小时除杂，皂化后冷却到室温，加入盐酸调ph=2-3，结晶得udca，抽滤后干燥得12.5gudca。
31.实施例3一种利用猪胆提取胆红素后的下料合成熊去氧胆酸的方法，其工艺步骤如下：一、取提取了胆红素后的猪胆汁1000g，在1000g猪胆汁中，加入0.3g7α-胆烷酸脱氢酶，加入0.03g辅酶nad

，加入0.4g丙酮还原酶，采用丙酮还原酶将丙酮还原成异丙醇接受h源，反应过程中的温度控制为30℃，将t-cdca氧化成t-7k-lca，t-hca氧化成t-7k-hca，通过hplc和tlc检验，t-cdca和t-hca残留小于1%后终止反应，总转化率大于95%，备用。
32.二、在步骤一备用的氧化产物中，加入0.3g 7β-胆烷酸加氢酶和0.03g辅酶nadp

，温度控制为38℃，添加20g异丙醇，由异丙醇氧化成丙酮提供h源，搅拌下抽真空回收丙酮，使t-7k-lca转变成t-udca，t-7k-hca转变成t-3α、6α、7β三羟基-胆烷酸，备用。
33.三、在步骤二的体系中，加入30g丙酮吸收“h”，加入0.3g6α-胆烷酸羟基氧化酶，使其中的t-hdca转变成t-6k-lca，t-3α、6α、7β-三羟基-胆烷酸转变成t-6k-3α、7β-二羟基-胆烷酸。
34.四、在步骤三反应完成后，加入5%浓度的hcl调溶液的ph值，使溶液的ph值=6，采用离心的方式去掉溶液中析出的酶絮状物，再在清液中加入hcl，继续调ph值=3，此时所有胆汁酸结晶沉淀，离心得到60g中间体混合固体。
35.五、在步骤四中的产物中加入150g二乙二醇，再加入10g氢氧化钠，回收至温度为100℃后，加入10g水合肼，边回收边反应，多余的水合肼回收后可用于后期重复使用；将溶液温度升至208℃，继续反应45分钟，t-udca转变成udca，t-6k-3α、7β-二羟基-胆烷酸转变成udca，t-6k-lca转变成石胆酸（lca），hplc检验无底物残留。
36.六、待步骤五的反应完成后，将溶液温度冷却至60℃，加入体系1-2倍的水，使溶液的ph值=8，加入乙酸异丙酯500g，萃取到溶液的ph值=6，此时lca与残留的微量cdca会溶于乙酸异丙酯溶剂中，而udca属于水溶性胆汁酸，溶于醇与水混合相之中，加入碱水使ph值》10后减压旋蒸回收水相中的溶剂，再加入盐酸使ph值=2-3后结晶抽滤，干燥后得到纯度为95-98%的udca结晶干品10.8g，进一步纯化结晶得到udca成品。
37.七、将步骤六的疏水性溶剂加水回收，后期加入碱水溶解lca，回收完全溶剂后补水到600ml，调ph=7-8，加入0.3g7β-羟基加成酶，和0.3g乙酰辅酶作为辅酶进行反应，使lca转变成7-乙酰-udca酯，加50g氢氧化钠溶液，煮沸皂化4小时除杂，皂化后冷却到室温，加入盐酸调ph=2-3，结晶得udca，抽滤后干燥得13.2gudca。
38.经测试，上述实施例中udca产物的转化率如下表所示：实例收率数据统计表试验序号胆汁投料量步骤6数量步骤7数量udca总数udca收率实例11000g10g13g23g23
‰
实例21000g9.5g12.5g22g22
‰
实例31000g10.8g13.2g24g24
‰
39.从上表可知，通过本发明方法合成熊去氧胆酸的收率远远高于传统合成方法的6
‰
，且不需要将鹅去氧胆酸、猪胆酸和猪去氧胆酸等进行相互分离和纯化，工艺路线简单，收率高。