一种可以分泌漆酶的工程菌株及其构建方法与应用与流程

1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种可以分泌漆酶的工程菌株及其构建方法 与应用。


背景技术：

2.木质纤维素是一类分布广泛、数量庞大、处理困难的可再生资源，将其转化成可再生 能源具有重要意义。木质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，纤维素是一种高 度有序、结合紧密的晶体结构，它与半纤维素紧密相连，外周由木质素包围。木质素通常 被认为是限制木质纤维素降解的最重要的因素，木质素通过与细胞壁其他成分的共价连接 进一步巩固了细胞壁结构，增加了空间阻力，从而对酶水解起到限制作用，且木质素对酶 具有吸附能力，可以通过对纤维素酶的非特异性或非生产性吸附来影响酶水解的效率，因 此要将纤维素直接水解成可利用的葡萄糖相当困难。
3.目前，木质纤维素的酶水解大多使用来源于丝状真菌的纤维素酶，比较典型的有木霉 属、曲霉属和青霉属等，但酶解过程中耗酶量高、活性极易受到产物的抑制，且这些酶蛋 白不耐高温，不耐酸碱，制约了其大规模应用。
4.嗜热纤维梭菌是目前自然界中已知的降解纤维素最高效的微生物之一，分泌的纤维小 体具有极强的纤维素降解能力。纤维小体降解纤维素的能力大约是木霉属的50倍，这种高 效性取决于纤维小体的特殊结构。热纤梭菌本身是一种严格厌氧的嗜热微生物，特殊的生 长条件，使得分泌的木质纤维素水解酶具有较好的耐热性、杂菌污染的风险极小。
5.漆酶是一种含铜多酚氧化酶，能选择性的催化木质素降解而不产生有毒害的物质，而 木质素是影响木质纤维素水解最重要的原因之一，因此将漆酶应用于木质纤维素酶水解中 不仅可以有效提高水解效率，还能有效减少水解液中木质素的含量，为水解液的进一步利 用提供了较好的基础。


技术实现要素：

6.为了克服上述现有技术的不足，本发明提供一种可以分泌漆酶的工程菌株及其构建方 法与应用，通过漆酶的协同作用不仅增强了该热纤梭菌的酶水解效率，经该热纤梭菌水解 后获得的糖液在没有加入活性炭脱色的条件下，其糖液中可溶性木质素的含量与经过活性 炭脱色的糖液相当。
7.为了实现上述目的，本发明一方面提供了一种可以分泌漆酶的工程菌株，所述工程菌 株为带有用于重组表达漆酶基因tfu_1114的热纤梭菌工程菌株。
8.所述菌株为将热纤梭菌cel9k中seq id no:1的核苷酸序列替换为漆酶基因tfu_1114 重组得到的工程菌。
9.所述漆酶基因tfu_1114的核苷酸序列为seq id no:2。
10.所述热纤梭菌工程菌株包括如seq id no:2所示的核苷酸序列。
11.所述漆酶基因tfu_1114来源于褐色高温双岐菌(thermobifida fusca)yx的漆酶
基因 tfu_1114。
12.本发明另一方面提供了一种可以分泌漆酶的工程菌株的构建方法，将漆酶基因 tfu_1114导入热纤梭菌基因组上，构建重组表达该基因的热纤梭菌工程菌，得到可以分泌 纤维膨胀蛋白的工程菌株。
13.以热纤梭菌野生菌株为出发菌株，通过替换热纤梭菌基因组上cel9k基因的部分序列 构建融合蛋白来表达漆酶基因tfu_1114，其中cel9k基因中被替换的基因序列如seq idno:1所示，漆酶基因tfu_1114的基因序列如seq id no:2所示。
14.所述热纤梭菌为热纤梭菌(clostridium thermocellum)pn2102，保藏日期为2021年07 月09日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市 朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.22869。
15.进一步优选的，上述构建方法，包括如下步骤：(1)以褐色高温双岐菌(thermobifidafusca)yx基因组为模板、以puc19为表达载体进行pcr扩增；(2)通过gibson assembly 连接tfu_1114基因，构建重组质粒ppn01；(3)将重组质粒ppn01转入热纤梭菌，从而 将目的基因tfu_1114序列插入热纤梭菌的基因组；(4)挑选阳性单克隆并pcr验证后培 养得到阳性转化菌株。
16.本发明还提供了可以分泌漆酶的工程菌株在木质纤维素水解中的应用，将热纤梭菌工 程菌厌氧发酵的发酵液复配其它纤维素酶对秸秆纤维进行水解。具体包括如下步骤：
17.(1)木质纤维素的预处理：以常见农业秸秆为原料，通过物理、化学法中的一种或两 种进行预处理，脱除木质素并提取秸秆纤维；(2)热纤梭菌工程菌的厌氧发酵：将热纤梭 菌工程菌依次进行种子培养、厌氧发酵，得到发酵液；(3)纤维水解：将步骤(2)中所 得发酵液复配其他纤维素酶对步骤(1)处理得到的纤维进行水解。
18.优选的，所述步骤(1)中，木质纤维素的预处理具体步骤为：将秸秆原料洗净切碎， 在碱性条件下进行水热反应，充分脱除木质素后，提取秸秆纤维，脱水并充分洗去残留碱 液；所述碱为氢氧化钠与亚硫酸钠；所述氢氧化钠重量：秸秆原料绝干重为1:(4-6)，亚硫 酸钠：氢氧化钠重量比为1:(3-5)；处理条件为：反应温度为150-160℃，时间为1-3h。
19.优选的，所述步骤(2)中，种子培养和厌氧发酵的过程为：a.种子培养：将从-80℃保 藏的热纤梭菌工程菌菌种置于4℃冰箱解冻，无菌条件下吸取1ml菌种注入种子培养基中， 55℃、200rpm条件下培养16-24h；b.厌氧发酵：随后以5％-10％(v/v)的接种量接入发 酵培养基中，55℃、200rpm下培养16-24h。
20.进一步优选的，所述步骤(2)的培养基采用mtc培养基，包括体积比为40:2:1:1:1的 a液、b液、c液、d液和e液，其中，a液为5g/l碳源(微晶纤维素或秸秆纤维)与 10.00g/l mops；b液为50.00g/l柠檬酸三钾、31.25g/l一水合柠檬酸、25.00g/l na2so4、 25.00g/l kh2po4、62.50g/l nahco3；c液为250.00g/l尿素、d液为50.00g/lmgcl2·
6h2o、10.00g/l cacl2·
2h2o、5.00g/l fecl2·
4h2o、50.00g/l l-半胱氨酸盐酸盐； e液为1.00g/l吡哆胺二盐酸盐、0.20g/l对氨基苯甲酸、0.10g/l生物素、0.10g/l vb
12
。
21.进一步优选的，所述步骤(2)中，种子培养基中a液的碳源为5.00g/l微晶纤维素， 更有选为微晶纤维素avicel ph 105；发酵培养基中的碳源为的5.00g/l的秸秆纤维，更优 选为步骤(1)制得秸秆纤维。
22.优选的，所述步骤(3)中，纤维水解的具体步骤为：ph 4.5-5.5，固(秸秆纤维绝干
重) 液比1:(10-30)，反应温度45-55℃，单位质量秸秆纤维投加上述热纤梭菌发酵液10-20ml、 纤维素酶0-10fpu、木聚糖酶4mg；水解时间12-48h，搅拌速率为200rpm。
23.本发明的有益效果为：本发明经过基因工程改造，将热纤梭菌基因组上cel9k基因的 部分序列替换为来自褐色高温双岐菌(thermobifida fusca)yx的漆酶tfu_1114基因，从而 构建了具有漆酶生物活性的融合蛋白。该热纤梭菌工程菌可以高效应用在木质纤维素的水 解中，通过漆酶的协同作用不仅增强了该热纤梭菌的酶水解效率，经该热纤梭菌水解后获 得的糖液在没有加入活性炭脱色的条件下，其糖液中可溶性木质素的含量与经过活性炭脱 色的糖液相当，后期进一步利用该糖液时，也完全适用于如小球藻(木质素耐受浓度110 mg/l)等微生物的发酵培养。
附图说明
24.图1为在热纤梭菌pn2102插入tfu_1114基因的重组质粒ppn01图谱；
具体实施方式
25.为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例对本发明作进一 步地详细描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。 基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有 其它实施例，都属于本发明保护的范围。
26.本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如molecularcloning:a laboratory manual,3nd ed.(sambrook,2001)和 currentprotocols in molecular biology(ausubel,2003)中所记载的方法。这 些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，这并不意味着将本发 明限定于所述的任何具体方法、实验方案和试剂，因为它们可以改变。
27.为了更好的理解上述技术方案，下面将结合具体实施例对上述的技术方案进行详细的 说明。
28.实施例1热纤梭菌工程菌株的构建
29.实施例中使用的培养基为：ctfud培养基(g/l)：3.00二水柠檬酸钠、1.30 (nh4)2so4、 1.50 kh2po4、0.13 cacl2·
2h2o、0.5 l-半胱氨酸盐酸盐、11.56 mops-na、2.60 mgcl2·
6h2o、 0.001 feso4·
7h2o、5.00 avicel ph 105、4.50 ye，若配制固体培养基则加入10g/l琼脂。 实施例所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。实施例中 的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
30.本发明通过将热纤梭菌基因组上cel9k基因的部分序列替换为漆酶基因tfu_1114，得 到重组表达漆酶基因tfu_1114的热纤梭菌工程菌株。
31.替换前cel9k基因中部分基因序列如seq id no:1所示：
32.agaaccggaggttatttatggtgactgcaatggcgacggaaaagttaattcaac tgacgctgtggcattgaagagatatatcttgagatcaggtataagcatcaacactga taatgctgatgtaaatgctgatggcagagtta
33.漆酶基因的基因序列如seq id no:2所示：
34.gttaccggaacagttgttgagctcgcaccgggtatccatgcaggctttacagga cgtgcaggcggcgttagcggtgagccgtacgcaacacttaaccttggagatcatgtt ggggatgatccagcggcagttgcagagaaca
gacgaagagcagcacttggttttgg tattagcccggatagagttgtttggatgaaccaggttcatggagcaacagcagttac agttacaggcagcggacaggcaggtgatgttgatgcggttgttacaccggaggcgg gacttgcactcgcagttcttgttgcagattgccttccgcttcttgttgcagatgcagc ggcaggtgttattggagcagcacatgcaggcagaccgggaatggcagcaggcgttg ttccagcacttgttgcagagatggcaagacatggtgcaagaccggagagatgtgtcg cacttcttggtccggcaatttgcggaagatgctacgaggttccgagagatcttcagg atcgagttgcaagaaccgtcccagaggcaagatgcacgacagcagagggaacgcca ggcctagatatccgggcaggcgttacagcgcagctcaccaacctcggagttaccaac attacgcacgattcgagatgtacgagagagagcgcagatctctttagctacagacga gatgcaacaacaggcagatttgcaggctacgtttggcgagttccataa
35.具体实施方法步骤为：
36.(1)重组质粒ppn01的设计及构建
37.漆酶基因tfu_1114来源于褐色高温双岐菌(thermobifida fusca)yx。从ncbi及文献 获得高温褐色双岐菌(thermobifida fusca)yx漆酶基因的gene id号为gene id：3579296， 通过南京金斯瑞生物科技有限公司合成了该漆酶基因，命名为tfu_1114，并进行了密码子 优化，tfu_1114的序列为seq id no:2。
38.模板质粒为puc19，可以市售购买或由基因设计公司合成。包含gapdh启动子、甲砜 霉素抗性基因、hpt基因、puc19起始区、tdk基因、复制蛋白和氨苄抗性基因。模板质粒 puc19实验室保存。
39.通过gibson assembly连接构建ppn01重组质粒，然后转入bl21并在含氨苄的胶板上 涂布筛选确认。具体如下：
40.a.pcr扩增
41.以褐色高温双岐菌yx基因组和puc19质粒为模板，在启动子gapdh前端插入被替换 dna的上游重组片段1，在hpt基因后端插入被替换dna的上游重组片段2、tfu_1114基 因和被替换dna的下游重组片段。用于基因插入质粒构建的被替换dna的三段重组片段 由下面三对引物加上20-25bp模板质粒首尾连接片段经pcr获得。
42.上游片段1引物1：gcggctcaatgtttggaa，
43.上游片段1引物2：tctgggtctactcctcct；
44.上游片段2引物1：atcttgacggaatgcagg，
45.上游片段2引物2：tctgggtctactcctcct；
46.下游片段引物1：actctacagacttggcaat，
47.下游片段引物2：tccatctgttttgcccttt。
48.pcr反应体系为：上游片段1、上游片段2、下游片段引物1各0.4μl，上游片段1、 上游片段2、下游片段引物2各0.4μl，菌液或质粒1μl，prime star 5μl(效率10s/kb)， 无菌水3.2μl。其中各引物浓度均为10μm。
49.pcr反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸30s到 2min 30s，循环数30；72℃再延伸2min，12℃保温20min。
50.b.目的基因tfu_1114与线性化模板质粒puc19的连接
51.将模板质粒puc19线性化，使用的引物及pcr条件如下：
52.引物1：cttactctagcagacttggcaatg，
53.引物2：tccatctgtttcgtttgccctttcc。
54.pcr反应体系为：引物1 0.4μl，引物2 0.4μl，菌液或质粒1μl，prime star 5μl(效 率10s/kb)，无菌水3.2μl。其中各引物浓度均为10μm。
55.pcr反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸30s到 2min 30s，循环数30；72℃再延伸2min，12℃保温20min。
56.将三段重组片段和tfu_1114与线性化后的模板质粒puc19用gibson assembly(三段 重组片段和tfu_1114各30ng，线性化后的模板质粒puc19 30ng，gibson assembly 5μl， 无菌水补足至10μl，50℃保温1h)连接，得到重组质粒ppn01；然后将重组质粒ppn01 转入大肠杆菌感受态细胞bl21并在含氨苄的胶板上涂布，长出菌落后用下面的一对引物做 pcr筛选确认。
57.引物1：agcggtaaaagtgaagaac；引物2：tgggcccctactaaaatga。
58.pcr反应体系为：引物1用量0.4μl，引物2用量0.4μl，菌液或质粒用量1μl，prime star用量5μl(效率10s/kb)，无菌水用量3.2μl，其中各引物浓度均为10μm。
59.pcr反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸30s到 2min 30s，循环数30；72℃再延伸2min，12℃保温20min。
60.c.凝胶电泳及pcr产物的回收
61.将pcr扩增之后的反应液进行琼脂糖凝胶电泳实验(2％琼脂糖，110v，30min)， dna回收片段tfu_1114基因，阳性验证胶图条带大小为473bp，说明tfu_1114基因成功 插入模板质粒puc19。
62.插入tfu_1114基因的重组质粒ppn01图谱如图1所示，其中上游片段1为923bp，上 游片段2为370bp，下游片段为877bp。
63.(2)重组质粒ppn01的转入
64.利用电转化将重组质粒ppn01转入热纤梭菌pn2102，经过同源重组和抗性筛选将目的 基因序列插入热纤梭菌基因组。其操作步骤如下：
65.1)细胞生长
66.将50ml的菌液培养至od600＝0.6-1后，将其置于冰上放置20分钟。
67.2)细胞收集与洗涤
68.在6500g、4℃条件下离心10分钟收集热纤梭菌pn2102细胞，离心完成后小心倒掉上 清液，再向离心管或离心瓶中小心加入洗涤缓冲液(经蒸汽灭菌过的反渗透纯化水)，加 的过程中不要搅动沉淀，然后再次在6500g、4℃条件下离心10分钟，小心倒掉上清液，重 复上述步骤两次。
69.3)电转化
70.将收集到的细胞放进厌氧室中，用100μl厌氧的洗涤缓冲液将其轻轻重悬。随后在标 准的1mm电转杯中，加入20μl细胞悬液和1μg dna，充分混匀。设置电转条件为电 压1500v、持续时间1.5ms进行电转化。
71.4)孵育电转化细胞
72.用1ml ctfud培养基将电转后细胞重新混合，在51℃下孵育16小时。
73.(2)阳性单克隆挑选及验证
74.1)筛选转化细胞
75.ctfud固体培养基融化并冷却至55℃，将6mg/ml的甲砜霉素1ml与50μl孵育 后的
电转化细胞加入到20ml ctfud固体培养基中倒入平板，室温下让平板中的培养基 凝固30分钟，随后将平板放置在55℃下培养3-5天。
76.2)挑选单克隆菌落，用下面一对引物做pcr验证重组质粒ppn01是否已经转入热纤 梭菌pn2102感受态细胞。
77.引物1：agcggtaaaagtgaagaac；引物2：tgggcccctactaaaatga。
78.pcr反应体系为：引物1用量0.4μl，引物2用量0.4μl，菌液或质粒用量1μl，primestar用量5μl(效率10s/kb)，无菌水用量3.2μl，其中各引物浓度均为10μm。
79.pcr反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸30s到 2min 30s，循环数30；72℃再延伸2min，12℃保温20min。
80.将pcr扩增之后的反应液进行琼脂糖凝胶电泳检测实验(2％琼脂糖，110v，30min)， 阳性验证胶图条带大小为473bp，说明重组质粒ppn01成功转入热纤梭菌感受态细胞中。
81.把经过验证的单克隆细胞菌落接入含有甲砜霉素(6mg/ml)的ctfud液体培养基在 55℃培养1-2天。
82.3)取10μl到1ml培养液加入到20ml含有甲砜霉素(6mg/l)和fudr(10mg/l) 的ctfud固体培养基中倒入平板，室温下让平板中的培养基凝固30分钟，随后将平板放 置在55℃下培养2-5天。
83.4)挑选单克隆菌落，用下面一对引物做pcr验证重组质粒ppn01中的上游片段1和 下游片段是否已重组到热纤梭菌基因组上。
84.引物1：gcggctcaatgtttggaa；引物2：tccatctgttttgcccttt。
85.pcr反应体系为：引物1用量0.4μl，引物2用量0.4μl，菌液或质粒用量1μl，primestar用量5μl(效率10s/kb)，无菌水用量3.2μl。其中各引物浓度均为10μm。
86.pcr反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸30s到 2min 30s，循环数30；72℃再延伸2min，12℃保温20min。
87.将pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳实验(2％琼脂糖，110v，30min)，阳性验证 胶图条带大小为4756bp，说明质粒ppn01中的上游片段1和下游片段已重组到热纤梭菌基 因组上。
88.把经过验证的单克隆细胞菌落加入到20ml含有8azh(500mg/l)的ctfud固体培 养基中倒入平板，室温下让平板中的培养基凝固30分钟，随后将平板放置在55℃下培养 2-5天。
89.5)挑选单克隆菌落，用下面一对引物做pcr验证基因组上两个上游片段2是否已重 组。
90.引物1：gcggctcaatgtttggaa；引物2：tccatctgttttgcccttt。
91.pcr反应体系为：引物1用量0.4μl，引物2用量0.4μl，菌液或质粒用量1μl，primestar用量5μl(效率10s/kb)，无菌水用量3.2μl。其中各引物浓度均为10μm。
92.pcr反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸30s到 2min 30s，循环数30；72℃再延伸2min，12℃保温20min。
93.将pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳实验(2％琼脂糖，110v，30min)，阳性验证 胶图条带大小为2526bp，说明基因组上两个上游片段2已重组。
下培养16h，得到发酵液。发酵培养基的配方如表1所示，碳源为5.00g/l的秸秆纤维， 秸秆纤维可通过对农业秸秆为预处理提取得到，参见实施例4步骤(1)。
102.实施例4热纤梭菌工程菌在木质纤维素水解中的应用
103.(1)小麦秸秆纤维的制备：
104.将小麦秸秆原料洗净切碎，采用氢氧化钠和亚硫酸钠进行处理，氢氧化钠重量：小麦 秸秆原料绝干重为1:6，亚硫酸钠：氢氧化钠重量比为1:3，处理条件为：反应温度为150℃， 时间为2h。充分脱除木质素后，提取小麦秸秆纤维，脱水并充分洗去残留碱液。
105.(2)小麦秸秆纤维的水解：
106.将秸秆纤维浸泡在乙酸-乙酸钠(或同类具备缓冲效应的缓冲对)缓冲液中，投加热纤梭 菌发酵液，进行秸秆纤维的水解。水解条件如下：ph 5，固液比1:10，单位质量纤维的热纤 梭菌发酵液投加量为20ml、纤维素酶10fpu、木聚糖酶为4mg，反应温度为50℃、反应 时间48h，震荡速率为200转/分钟。
107.水解结束后，获得的水解液中可溶性木质素含量低于30mg/l。相同条件下，使用热纤 梭菌(clostridium thermocellum)pn2102发酵液进行水解时，水解液中可溶性木质素含量 约为160～183mg/l，活性炭处理后可去除80％的木质素，其水解液木质素水平与使用本发 明工程菌获得水解液中木质素水平相当。
108.以上对本发明的实例进行了详细说明，但内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为 用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属 于本发明的专利涵盖范围之内。