Fbxl16蛋白及基因重组载体在制备抗炎药物中的应用

fbxl16蛋白及基因重组载体在制备抗炎药物中的应用
技术领域
1.本发明属于蛋白药物技术领域，尤其涉及fbxl16蛋白及基因重组载体在制备抗炎药物中的应用。


背景技术：

2.ra(类风湿性关节炎)是最常见的慢性炎症之一，其特点是自身免疫、严重的滑膜和全身炎症、细胞增生、软组织肿胀、僵硬和关节上的骨侵蚀。这些炎症最终可能导致严重残疾和过早死亡。尽管最近ra的临床治疗有了很大的发展，但药物治疗的毒性仍然是一个巨大的挑战。在目前的临床中，治疗方法或使用的治疗组合因关节炎的类型而异。最广泛使用的药物，如改变病情的抗风湿药mtx和羟氯喹(plaquenil)，可以减缓或阻止免疫系统对人体自身关节组织的攻击。然而，长期全身用药往往会导致耐药性并导致脱靶。此外，物理治疗对缓解关节炎的疼痛也有帮助，而一旦保守措施不再奏效，患者也需要接受手术治疗，如关节修复、融合甚至置换。
3.因此，开发更多具有高效和特异性靶向特点的抗炎药物，这对于如ra(类风湿性关节炎) 等炎症疾病的治疗是至关重要的。


技术实现要素：

4.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出fbxl16蛋白及基因重组载体在制备抗炎药物中的应用。本发明指出fbxl16蛋白可有效改善炎症状况，起到抗炎的功效，可作为抗炎类药物应用于如类风湿性关节炎等炎症疾病的治疗。同时，通过构建含fbxl16基因的基因重组载体，可开发得到相应的基因药物。此外，本发明还提出甘草查尔酮b(lcb)可作为fbxl16靶向激活剂起到增强抗炎功效的作用。
5.本发明提供了fbxl16蛋白在制备抗炎药物中的应用。
6.本发明指出，相比于健康个体，在类风湿性关节炎(ra)患者和佐剂诱导关节炎(aia) 大鼠的血液中fbxl16(f-box and leucine rich repeat protein 16)的mrna水平发生明显下调。进一步试验还显示，fbxl16蛋白还可抑制促炎细胞因子的产生并促进抗炎因子的表达，起到抗炎的作用。因此，fbxl16蛋白具有制备抗炎药物的突出潜力。
7.本发明还提供了fbxl16蛋白在制备治疗关节炎药物中的应用。
8.优选地，所述关节炎为类风湿性关节炎。
9.fbxl16蛋白可以降低佐剂诱导关节炎大鼠模型(aia大鼠)的足肿胀程度和关节炎评分，缓解骨质破坏，抑制滑膜增生，因此可用于制备治疗类风湿性关节炎的药物。
10.本发明还提供了含fbxl16基因的基因重组载体在制备抗炎药物中的应用。所述基因重组载体由表达载体和fbxl16基因构建而成。fbxl16基因序列参考ncbi的序列号nm_153350。所述基因重组载体可通过fbxl16的过表达发挥抗炎症的作用，具备作为基因药物的突出潜力。
11.优选地，所述表达载体为质粒dna或腺相关病毒。
12.本发明还提供了含fbxl16基因的基因重组载体在制备治疗关节炎药物中的应用。
13.本发明还提供了fbxl16靶向激活剂在制备治疗关节炎药物中的应用。
14.优选地，所述fbxl16靶向激活剂为甘草查尔酮b。
15.甘草查尔酮blcb是存在于甘草根中的一种查尔酮，其通常认为具有对于心脏保护，抗阿尔茨海默氏病(ad)，抗氧化和自由基以及诱导癌细胞凋亡具有一定疗效。而本发明指出，甘草查尔酮b(lcb)能激活及增加fbxl16的转录、上调基因和蛋白水平，因此可作为fbxl16 靶向激活剂得到应用。此外，甘草查尔酮b还可抑制细胞侵袭并促进细胞凋亡，改善滑膜中炎症指标，降低脾脏中il-17/cd4表达，具有免疫调节和抗炎特性。
16.相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
17.本发明提出fbxl16的基因水平在ra患者和佐剂诱导的关节炎大鼠中均显著下调，而对其进行过表达可显着抑制lps诱导的滑膜细胞分泌的促炎因子水平，表明fbxl16蛋白具有抗炎作用。本发明还提供了将包含fbxl16基因的基因重组载体注入膝关节能显著抑制佐剂诱导的关节炎大鼠足肿胀体积、关节炎评分和促炎细胞因子产生的证据。此外，本发明还成功发现甘草查尔酮b(lcb)可作为fbxl16的靶向激活剂，起到激活及增加fbxl16的转录、上调基因表达和蛋白水平的作用。
附图说明
18.图1为ra患者(a)和aia大鼠(b)血液中各基因的归一化表达散点图。
19.图2为经tnf-α处理后rafls细胞中fbxl16的mrna(a)和蛋白水平(b)，fbxl16 在lps、pam3、poly(i：c)、il-1β和tnf-α刺激下的转录活性以及在有tnf-α的情况下，加入lef、chlo、tet或nab的转录活性(c)。
20.图3为在tnf-α存在情况下，过表达fbxl16的mh7a细胞中炎症因子的表达情况。
21.图4为经腺病毒ad-fbxl16处理后aia大鼠模型的关节炎评分(a)和足肿胀体积(b)。
22.图5为经腺病毒ad-fbxl16处理后aia大鼠模型中micro-ct放射图像(a)，以及bv、 bs、tmd、tmd和micro-ct评分情况(b)。
23.图6为各试验组大鼠膝关节矢状面切片h&e染色情况(a)，滑膜组织的免疫荧光图像(b)，血清细胞因子含量(c)。
24.图7为经lcb处理后的rafls细胞中fbxl16的mrna(a)和蛋白水平(b)，以及在 hek293细胞fbxl16转录活性(c)。
25.图8为lps或tnf-α存在时rafls细胞中il-6和il-1β的相对mrna表达水平。
26.图9为有lps存在下，经lcb处理后的rasfs细胞的侵袭和凋亡情况(a)，以及敲除 fbxl16和经lcb处理后il-1β和il-6的表达量(b)。
27.图10为口服lcb后aia大鼠的关节炎评分(a)和足肿胀体积(b)。
28.图11为口服lcb后aia大鼠的红细胞沉降率(a)和滑膜组织内il-6和il-1β的表达量(b)。
29.图12为lcb治疗组大鼠的骨侵蚀和骨小梁的micro-ct放射影像(a)，脾脏单细胞的免疫相关指标(b)。
具体实施方式
30.为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例仅为本发明的优选实施例，对本发明要求的保护范围不构成限制作用，任何未违背本发明的精神实质和原理下所做出的修改、替代、组合，均包含在本发明的保护范围内。
31.以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
32.实施例1：fbxl16蛋白的抗炎作用
33.1.血液样本总rna提取
34.在签署知情和自愿同意书的前提下，在广州(中国)广东省医学科学院广东总医院采集 ra患者以及健康志愿者的血样，并经研究伦理委员会批准(gdrec 2015391h)。所有来自志愿者的流行病学调查和分类都是按照美国风湿病学会的标准进行的。野生型雄性 sprague-dawley(sd)大鼠，体重80-120克，购自中国香港中文大学实验动物服务中心。动物护理和处理程序符合机构指南和动物条例(中国香港特别行政区卫生署)的规定。
35.使用favorpreptm blood/cultured cell total rna mini kit(favorgen biotech)分离血液的总rna。在微量离心管中加入200-300μl抗凝血剂保存的新鲜全血，将5体积的rl缓冲液与1体积的样品混合，倒置搅拌均匀后于冰上孵育10分钟，其间短暂地涡旋2次。以4500rpm 离心1分钟形成细胞颗粒。弃上清液，加入600μl rl缓冲液，短暂的涡旋重新悬浮细胞颗粒，在4500rpm下离心1分钟，再次形成细胞颗粒，并将上清液完全丢弃。将350μl farb 缓冲液和3.5μlβ-巯基乙醇加入细胞颗粒中，剧烈涡旋1分钟，以完全重悬细胞。将过滤柱放到收集管中，将样品混合物转移到过滤柱中，最大转速离心2分钟。将澄清的上清液从收集管中转移到一个新的微型离心管中，并测量上清液的体积，加入1体积的70％乙醇，涡旋混合均匀。将farb柱放入收集管中，将加入乙醇的样品混合物(包括任何沉淀物)转移到 farb柱上，全速离心1分钟，丢弃流过的样品，将farb柱放回原处。将farb柱放回收集管中，在farb柱上加入500μl的wash buffer 1，全速离心1分钟，丢弃流过的液体，将 farb柱放回收集管中。在farb柱中加入750μl wash buffer 2，全速离心1分钟，丢弃流过的液体，将farb迷你柱放回收集管，重复1次。全速离心farb柱3分钟。将farb柱放入洗脱管在farb柱的膜中心加入40-100μl无rnase的ddh2o。采用紫外分光亮度法 (nanodrop technologies,usa)用于测量rna的质量和浓度。用maxima h minus cdna synthesis master mix(thermo，美国)对1μg rna进行逆转录。混合物在25℃下孵育10分钟，然后在50℃下孵育15分钟，在85℃下加热5分钟终止反应。20μl pcr混合物由0.5μl 模板、0.5μl f引物(5
’‑
ctgccatctcacaacttcta-3’(seq id no：1))和r引物 (5
’‑
acatactccagtgccatatc-3’(seq id no：2))、0.5μl模板、10μl sybr master mix和8.5μl ddh2o组成，共20μl。基因表达的定量由viia 7实时pcr系统(applied biosystems)进行。所有的mrna数据都通过参考基因β-actin进行归一化，使用δδct方法进行相对定量。
36.图1为ra患者(如图1中(a)所示)和aia大鼠(如图1中(b)所示)血液中各基因的归一化表达散点图，中心线表示未改变的基因表达，虚线表示3倍调节阈值，虚线以外的数据点和右下部分的数据点符合选定的调节阈值。图1的结果显示，与健康对照组相比， fbxl16的mrna水平在ra患者和aia(佐剂诱导的关节炎)大鼠的血液中都明显下调。
37.2.tnf-ɑ
诱导fbxl16基因、蛋白和转录水平的下降
38.将rasfs(类风湿性关节炎滑膜纤维细胞)细胞种到6孔板中，在第二天分别用10、20 ng/ml tnf-ɑ
进行刺激24小时，用fbxl16特异性引物(f引物:5
’‑
ctgccatctcacaacttcta-3’(seq id no：1)；r引物:5
’‑
acatactccagtgccatatc-3’(seq idno：2))和抗体(fbxl16 polyclonal antibody(thermofisher,pa5-21094))检测基因和蛋白表达量。样品用蛋白质提取缓冲液(ab156034)冰上裂解15分钟，在4℃、13000g下离心 15分钟后，收集上清并用protein assay dye reagent(bio-rad)定量，分光亮度计在595μ m的波长下测定这些蛋白质的浓度。20μg的蛋白质样品经12％的sds-page检测，然后转移到pvdf膜上(bio-rad公司)，用5％的bsa封闭1小时，膜在4℃下用抗fbxl16抗体 (thermofisher；抗体:pbst＝1:1000)和抗gapdh抗体(santa cruz biotechnology，抗体: pbst＝1:2000)结合过夜，在tbst洗涤后，用抗兔和抗鼠二抗(santa cruz biotechnology，抗体:pbst＝1:2000)在室温下孵育2小时。超敏ecl化学发光液试剂盒(beijing 4a biotech co.,ltd)用于在amersham imager 600(ge)成像系统下检测条带，目的条带的灰度利用imagej软件分析。
39.pezx-pl01-fbxl16质粒构建
40.以phbaav-cmv-mcs-3flag-t2a-zsgreen质粒作为基因载体，根据表1中顺序依次加入每种试剂，轻轻吸打混匀，置于37℃水浴锅中反应1-2h；酶切结束之后进行琼脂糖凝胶电泳，回收线性化载体；
41.表1载体酶切体系
[0042][0043][0044]
pcr扩增目的基因片段
[0045]
采用表2内容配制扩增体系，轻轻混匀，置于pcr仪中采用表3所示pcr程序进行扩增，扩增得到目的基因片段(fbxl16基因，其序列参考ncbi的序列号nm_153350)。
[0046]
表2 pcr扩增体系
[0047][0048]
表3 pcr程序
[0049][0050]
目的基因片段与线性化载体连接
[0051]
于冰水浴中配制如下表4反应体系，在50℃反应30min后，置于冰上5min，得到连接产物，立即进行后续转化。
[0052]
表4反应体系
[0053][0054]
转化
[0055]
1)将dh5α感受态细胞从-80℃冰箱取出，立刻放到冰上融化，感受态分装过程操作轻柔，减轻对其机械破坏；
[0056]
2)待感受态融化后，以每管50μl的体积分装，分装之后以不超过感受态体积1/10的量加入连接产物，冰上放置20-30min；
[0057]
3)42℃热激90s，热激完之后立刻插入冰上冰育2-3min；
[0058]
在超净台中，加入500μl lb培养基，轻柔的上下颠倒3-5次；
[0059]
5)37℃、230rpm震荡培养45-60min；
[0060]
6)将菌液涂到相应抗性的固体平板上，涂布均匀，然后将板子倒放37℃恒温箱培养 12-16h，完成pezx-pl01-fbxl16质粒的构建。
[0061]
使用脂质体(3000，invitrogen)转染试剂将pezx-pl01-fbxl16重组质粒转入hek293细胞并接种在24孔板中，每孔hek293细胞为2
×
105个。按以下2种方式处理：
①
将lps，tnf-α，il-1β，pam3csk4(pam3)和poly(i：c)hmw添加到每个孔中，并将细胞在37℃下孵育24小时。
②
来氟米特(lef)、金霉素(chlo)、四环素(tet)和纳布酮(nab)预处理2小时后，加入tnf-α继续孵育24小时。去除培养基，在1
×
pbs中冲洗培养的细胞，清除所有的冲洗液，加入1
×
plb，室温裂解细胞15min，向100μl的lar ii 中加入10μl细胞裂解液，吹打混匀后，检测读数，即为firefly luciferase的值。加入100μlstop&glo，再次读数，即为renilla luciferase的值。数据处理：首先计算出每管的fireflyluciferase/renillaluciferase的比值，再以control组的比值为单位1，即可得到不同处理组的相对luciferase活性，也就是该处理组基因转录的调控活性。
[0062]
由图2中(a)和(b)所示，在tnf-α刺激下，rafls(类风湿关节炎成纤维细胞样滑膜细胞)细胞中fbxl16的mrna和蛋白水平都明显降低。双荧光素酶报告实验证实了 hek293细胞中fbxl16的转录活性在toll样受体配体如脂多糖(lps)、pam3csk4(pam3)、聚(i：c)hmw(聚(i：c))和促炎症细胞因子(tnf-α和il-1β)存在时被明显抑制。相反，由图2中(c)所示，在tnf-α存在的情况下，加入dmards或抗炎药物，如来氟米特(lef)、金霉素(chlo)、四环素(tet)和纳布酮(nab)，fbxl16的转录活性会增强。
[0063]
3.实时定量pcr检测fbxl16过表达后抑制炎症因子表达
[0064]
将mh7a细胞(2
×
106个细胞/孔)接种在6孔板上，培养过夜使其贴壁。使用脂质体 (3000，invitrogen)转染试剂将pezx-pl01-fbxl16重组质粒转入mh7a细胞中，37℃下孵育24小时，与tnf-α在6孔板中继续培养24小时。使用favorprep totalrna purification mini kit(favorgen，pingtung，taiwan)提取总rna，vilomaster mix(invitrogen，scotland，uk)用于通过逆转录合成cdna，实时定量pcr检测炎症因子il-6，il-1β和tnf-α基因表达量。
[0065]
如图3所示，在过量表达fbxl16后，在tnf-α诱导的mh7a细胞中观察到il-6和tnf-α的mrna水平发生减弱，证实了fbxl16蛋白的抗炎作用。
[0066]
实施例2：过度表达fbxl16可抑制aia大鼠的炎症反应和骨质破坏
[0067]
1.在aia大鼠模型实现腺病毒介导的fbxl16高表达
[0068]
本试验采用4-6周龄雄性sd大鼠，购买自广东省医学实验动物中心，体重80-120g。这些动物被安置于一个配备有温度控制和自动通风系统的房间里，房间内12小时的光/暗循环，并且可以随意取食和饮水。本研究是由中国澳门特区卫生局动物伦理委员会批准的，根据澳门科技大学《动物护理与用户委员会指南》进行。取含2.5mg/ml的非活性结核分枝杆
菌的矿物油(sigma，美国)，经过长时间的研磨使完全弗氏佐剂乳化，在大鼠尾根皮内注射100μl 乳化油。第一次发炎在佐剂注射后约第9天出现，对大鼠足体积每三天进行一次测量和记录，构建得到佐剂诱导关节炎大鼠模型(aia大鼠)。
[0069]
取32只雄性大鼠，随机分为5个试验组：(1)健康大鼠对照组(n＝6)，不进行治疗；(2)佐剂诱导关节炎模型对照组(n＝6)；(3)mtx(甲氨蝶呤)阳性对照组(n＝6)，给aia大鼠灌胃 mtx 7.6mg/kg/周；(4)腺病毒ad-gfp(绿色荧光蛋白)组(n＝6)，使用微量注射器将100μl 的腺病毒ad-gfp注射入aia大鼠关节腔内；(5)腺病毒ad-fbxl16组(n＝8)，使用微量注射器将100μl的腺病毒ad-fbxl16注射入aia大鼠关节腔内。试验组设置完成后，每天持续进行观察，获取各试验组关节炎评分和足肿胀体积信息。疗程结束时将大鼠处死，收集大鼠血液及部分脏器，右后脚拍照冻存，左后脚被截肢并固定在4％pfa内。
[0070]
腺病毒ad-gfp和腺病毒ad-fbxl16的主要构建方法为：
[0071]
1)第一天：将aav-293细胞传代到100mm平皿中用于转染。操作完毕后置于37℃、 5％co2和95％相对湿度的培养箱中。
[0072]
2)第三天：待细胞密度达到约80-90％汇合率即可进行转染。
[0073]
脂质体转染：opti mem需在37℃水浴中预热，lipofitertm转染试剂需恢复至室温方可使用，使用前需摇匀。转染复合物成分如下表5所示。
[0074]
表5转染复合物
[0075][0076]
3)换液：转染后6h更换含10％胎牛血清fbs的新鲜完全培养基。
[0077]
4)细胞收集：转染后72h，将含aav颗粒的细胞用细胞刮轻轻刮下，收集于15ml离心管中，150
×
g离心3min收集细胞，去除培养上清，用pbs洗一次，最后再用300μl pbs 重悬细胞。
[0078]
5)细胞破碎：准备37℃恒温水浴锅和液氮，将装有细胞的离心管在液氮及37℃水浴反复冻融三次。4℃，2000
×
g离心5min，去除细胞碎片，收集含aav颗粒的裂解上清。
[0079]
6)纯化：每1ml裂解上清中加入0.1μl benonase酶，37℃水浴1h，除去病毒液中的细胞基因组及残留的质粒dna。600
×
g，4℃，离心10min，取上清。根据biomiga腺相关病毒纯化试剂盒v1469-01进行柱纯化。将柱纯化得到的4ml aav病毒样品液体，加入到超滤管中，1400
×
g离心30min，得到约200μl aav。收集最终得到的纯化后的病毒，于-80℃保存。
[0080]
由图4可知，将腺病毒ad-fbxl16注射到aia大鼠的膝关节中，进一步验证了fbxl16蛋白的抗炎作用。虽然注射腺病毒ad-gfp的aia大鼠出现了关节僵硬和足严重肿胀，但注射 ad-fbxl16(1
×
10
11
pfu/ml)的aia大鼠的关节炎评分和足肿胀体积却得到明显减弱。
[0081]
2.微电脑断层扫描(microct)分析大鼠足部骨破坏
[0082]
取右后脚冰上解冻，对右后脚使用micro-ct扫描仪(skyscan1176，bruker，比利时)。扫描参数是在35微米分辨率，62kv，385μa，98ms曝光时间，角速度0.70，以及al 1mm滤片。扫描结束后利用nrecon软件(比利时bruker-micro ct)重建图像、ctvox软件用于打开重建的数据文件，并生成可观察的三维图片、ctan软件对扫描数据进行分析。
[0083]
microct评分来自跟微电脑断层扫描microct检查的五项疾病相关指标，包括骨矿物质密度、骨体积分数、皮质矿物密度、小梁数目和总孔隙率。计算microct评分的公式如下：每项指标的(获取值-最小值)/(最大值-最小值)或1-(获得值-最小值)/(最大值-最小值)。最终 microct得分为以上处理后五项指标之和的平均值。
[0084]
由图5可知，正如5个与疾病相关的微型计算机断层扫描(micro-ct)分析指标(包括 bv、bs、tmd、tmd和micro-ct)的评分所示，腺病毒ad-fbxl16组大鼠的骨破坏得到了缓解。
[0085]
3.he染色和免疫荧光分析病理和波形蛋白表达
[0086]
将固定在4％pfa的左后脚更换新鲜固定液，送武汉赛维尔生物科技有限公司脱钙，脱水，包埋，切片，he染色，常温避光备用。
[0087]
免疫荧光包括
①
石蜡切片脱蜡：石蜡切片染色前应置于60℃1小时，二甲苯i、ii各浸泡10分钟，梯度酒精：100％，2分钟；95％，2分钟；80％，2分钟；70％，2分钟；蒸馏水洗：5分钟，2次。
②
抗原修复：枸橼酸钠缓冲液(10mm，ph6.0)，淹没切片，盖上锅盖，高压锅内煮沸，3分钟后缓慢冷却，抗原修复液(10mm ph6.0的枸橼酸钠缓冲液)的配制：储备液的配制：a液：枸橼酸三钠29.41g 蒸馏水1000ml；b液：枸橼酸21g 蒸馏水1000ml；
③
bsa封闭：从染片缸中取出切片，擦净切片背面水分及切片正面组织周围的水分(保持组织呈湿润状态)，滴加5％bsa，室温处理60分钟。
④
孵育一抗：用滤纸吸去封闭液，直接滴加第一抗体(fbxl16 polyclonal antibody(thermofisher，pa5-21094),抗体:pbst＝1:250； vimentin(abcam，ab8978)，抗体:pbst＝1:250)，4℃摇床过夜。
⑤
孵育二抗：回收一抗，pbst 洗3次，滴加荧光二抗(alexa fluor 488标记山羊抗兔igg(h l)，抗体:pbst＝1:250；alexa fluor 555标记驴抗小鼠igg(h l)，抗体:pbst＝1:250)，室温避光孵育1-2h。
⑥
回收二抗，pbst 洗3次，晾干，封片。
[0088]
由图6中(a)和(b)可知，通过组织病理学分析评估各试验组大鼠的关节组织肿胀、骨质破坏、滑膜增生等典型症状，证实了fbxl16的抗关节炎作用。此外，滑膜组织的免疫荧光染色显示fbxl16的表达有增加的趋势，而波形蛋白的水平却降低，这说明注射腺病毒 ad-fbxl16减轻了滑膜成纤维细胞的增殖率。
[0089]
4.大鼠血清的流式多因子检测
[0090]
将所需beads磁珠剧烈涡旋1min使其充分混匀。取血清血浆样本，使用assay buffer稀释一倍(50μl样本 50μl assay buffer)。加25μl assay buffer到各样品管，25μl mitrix b到各标准品管，25μl各标准品到相应标准品管，25μl各样品到相应样品管，25μl beads到各管，加25μl检测抗体到各管。避光，以1000rpm震荡ep管，室温孵育2h，加25μl sa-pe到各管，避光；以1000rpm震荡ep管，置于室温30min，1000
×
g离心5min。用枪头小心吸弃上清125μl。每管加200μl 1
×
wash buffer，涡旋beads，1000
×
g离心5min，弃上清，每管加 300μl 1
×
wash buffer，涡旋beads，将beads转移至流式管，准备流式上机。
[0091]
由图6中(c)可知，使用基于磁珠的多重检测试剂盒评估大鼠血清中13种细胞因
子，发现腺病毒ad-fbxl16抑制了mcp-1、il-6和il-1β的蛋白水平，并提高了大鼠血清中抗炎因子il-10的表达水平。这些数据证实fbxl16抑制了tnf-α诱导的炎症，改善了aia大鼠的关节炎状况。
[0092]
实施例3：fbxl16激活剂-lcb(甘草查尔酮b)
[0093]
1.利用luciferase实验高效筛选fbxl16的激活剂
[0094]
建立药物筛选细胞模型，筛选目的药物。通过构建包含人fbxl16启动子序列(其序列如 seq id no：3所示)的luciferase报告质粒，并稳定高效的将重组质粒转染入hek293细胞建立能够筛选出具有上调fbxl16启动子表达效果的药物的模型，并利用该模型筛选出目的药物。重组的质粒经扩增后通过脂质体瞬时转染入hek293细胞，并加入适宜浓度的药物进行刺激，24h后检测细胞裂解液中荧光素酶的含量。对于能够提高荧光素酶含量的药物，继续在rafls细胞的基因和蛋白水平进行验证，即获得能够上调fbxl16表达的目的药物。
[0095]
由图7可知，经lcb处理后，fbxl16的mrna表达水平和蛋白水平得到提高，荧光强度得到上升，表明lcb具有激活fbxl16的作用。
[0096]
2.lcb抑制lps诱导rafls细胞炎症，侵袭和凋亡
[0097]
分别用10μm，20μm，40μm的lcb处理rafls细胞2h后，再与lps或tnf-α共同孵育24h，rt-pcr实验检测炎症因子il-6和il-1β。同样的方法，用流式细胞术检测lcb 对rafls细胞凋亡的影响，具体步骤如下：收集处理后的细胞上清和贴壁细胞，1ml pbs 重悬，1000rpm，4℃离心10min，将细胞重悬于500μl 1binding buffer，1000rpm，4℃离心 10min，弃上清，用100μl 1binding buffer 2μl pi 2μl annexin v-fitc室温染色30min，上机检测。transwell实验用来研究rafls细胞的侵袭迁移情况，具体步骤：用matrigel 1：6 稀释(可以直接用无血清的培养基稀释)，包被transwell小室底部膜的上室面，置于37℃孵箱1-4h使matrigel聚合成凝胶。在transwell小室中加入200μl细胞悬液，24孔板下室加入600μl含15％fbs的培养基，常规培养12－48h。取出transwell小室，弃去孔中培养液，用无钙的pbs洗2遍，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，甲醇或者甲醛固定30分钟，将小室适当风干。用0.1％结晶紫染色30-60min，用pbs洗3遍。用棉签轻轻擦掉上室水分。为进一步研究lcb是否通过调控fbxl16抑制炎症，sirna敲低fbxl16后再给药lcb处理24h，检测炎症因子il-6和il-1β。
[0098]
由图8可知，有lps或tnf-α存在时，加入lcb处理的rafls细胞中il-6和il-1β的相对mrna表达水平发生下降，表明lcb可以抑制炎症因子的表达。
[0099]
由图9可知，在lps存在的条件下，经lcb处理后的rasfs细胞的侵袭率下降、凋亡率上升，且lcb通过促进fbxl16的表达实现炎症抑制的作用，使得促炎因子il-1β和il-6 的基因水平下降。
[0100]
3.lcb靶向fbxl16实现抗关节炎作用
[0101]
购买sd大鼠，尾根皮内注射100μl乳化油。第一次发炎在佐剂注射后约第9天出现。对大鼠足体积每三天进行一次测量和记录。取30只雄性大鼠，随机分为5个实验组：(1)健康对照组(n＝6)，不进行治疗；(2)关节炎模型对照组(n＝6)，aia大鼠实验组接受与药物相同赋形剂；(3)mtx阳性对照组(n＝6)，给aia大鼠灌胃mtx 7.6mg/kg/week；(4)低剂量lcb治疗组(n＝6)，按照5mg/kg/day的剂量，灌胃给予aia大鼠lcb；(5)高剂量lcb治疗组(n＝6)，按
照10mg/kg/day的剂量，灌胃给予aia大鼠lcb。疗程结束时将大鼠处死，收集大鼠血液及部分脏器，右后脚拍照冻存，左后脚被截肢并固定在4％的pfa内。记录血沉，检测关节滑膜中炎症因子il-6和il-1β基因表达量。大鼠脾脏组织经过生理盐水多次洗涤后，通过细胞过滤器去除没有充分分散的细胞团、组织块或杂质等，从而快速分离出均一的单细胞或多细胞悬液，表面抗体染色100μl cell staining buffer 0.5μl表面抗体，包括cd45，cd3，cd4， cd8；重悬4℃孵育1h，2800rcf，4℃离心2min，弃上清，100μl true nuclear fix dilution破膜重悬，4℃孵育1h，cell activation cocktail(with brefeldin a)刺激4-8h，炎症抗体染色100μltrue nuclear fix dilution 0.5μl il-17重悬，4℃孵育1h，流式细胞仪进行检测。
[0102]
由图10可知，通过lcb的治疗可使aia大鼠的关节炎评分和足肿胀体积都明显减弱。
[0103]
由图11可知，在lcb喂养的大鼠组中，红细胞沉降率和滑膜组织内il-6和il-1β的mrna 水平明显减少。
[0104]
由图12中a可知，所有lcb治疗组的骨侵蚀和骨小梁数量也得到改善，达到与mtx 阳性对照组相当的水平，而没有在其他器官中造成可观察到的毒性影响。由图12中b可知，通过流式细胞仪分析，结果证实aia模型组的脾脏细胞中cd3的表达明显较高。然而，与aia组相比，lcb给药组内cd3的水平有所减弱。没有观察到cd4/cd8水平的明显变化。此外，在类风湿性关节炎的发病机制中起重要作用的il-17水平在lcb给药组中明显下降。
[0105]
综上所述，本发明提出和确定了fbxl16基因在体外和体内的新型抗关节炎作用。此外，新的fbxl16激活剂lcb通过其免疫调节和抗炎特性，针对fbxl16在关节炎中的新功能，被确定为一种潜在的抗关节炎的天然化合物。
[0106]
上面结合附图对本技术实施例作了详细说明，但是本技术不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本技术宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本技术的实施例及实施例中的特征可以相互组合。