一种海带中可溶性膳食纤维在制备用于改善溃疡性结肠炎的药物和功能性食品中的应用的制作方法

1.本发明属于食品保健领域，特别涉及一种海带中可溶性膳食纤维在制备用于改善溃疡性结肠炎的药物和功能性食品中的应用。


背景技术：

2.炎症性肠病（inflammatory bowel disease, ibd）是一组以慢性炎症和肠道菌群失调为特征的胃肠道疾病，包括克罗恩病（crohn's disease，cd）和溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, uc）。研究表明，遗传、环境、微生物因素、免疫反应以及饮食因素参与了ibd的发病机制。流行病学研究表明，饮食结构不合理、膳食成分缺乏是导致ibd的主要危险因素。目前，ibd在全球范围内的发病率明显增高，炎症药物、免疫抑制剂、生物药物均可用于ibd的治疗，但其具有较大的副作用。因此，采用营养干预辅助治疗ibd已成为安全有效的手段之一。
3.膳食纤维作为一种益生元，能调节菌群丰度，介导多个肠内代谢信号发挥抗炎、抗氧化等作用，常被作为肠道疾病的辅助治疗剂。海藻中含有大量多糖，其含量远远超过陆生植物，但由于胃肠道中缺乏必需的酶，大部分多糖无法被人体消化，被视为膳食纤维，包括褐藻胶、卡拉胶等可溶性膳食纤维（sdf）和纤维素、半纤维素等不溶性膳食纤维（idf）。大多数食用海藻的sdf含量高于idf，且总膳食纤维含量通常为33
‑
50 g/100 g干物质，远高于其他陆生植物。这些特性使得海藻df的物理化学性质异于陆地植物，赋予了海藻df更独特的生理功能，使其逐渐成为基于饮食干预预防和缓解ibd保健食品的重要原料。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供了一种海带中可溶性膳食纤维在制备用于改善溃疡性结肠炎的药物和功能性食品中的应用，所述可溶性膳食纤维提取自分离褐藻胶后的海带残渣，来源丰富，安全性高，改善溃疡性结肠炎效果明显。
5.为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种海带中可溶性膳食纤维在制备用于改善溃疡性结肠炎的药物和功能性食品中的应用，所述可溶性膳食纤维中单糖组成包括岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖、半乳糖醛酸、阿拉伯糖、核糖。
6.进一步的，所述可溶性膳食纤维的提取方法包括以下步骤：（1）向海带残渣中以1:20
‑
40的料液比加入4
‑
6% nacl溶液，80
‑
100℃加热6
‑
8 h进行脱钙处理，离心收集沉淀，将沉淀加入纯水加热煮沸30 min；（2）向步骤（1）的沉淀中以1:20
‑
40的料液比加入5 mol/l naoh溶液，调节ph至碱性，80
‑
100℃加热6
‑
8 h，离心收集沉淀；（3）将步骤（2）的沉淀利用hcl调ph至中性，经浓缩、透析，超低温放置后冷冻干燥，得到可溶性膳食纤维。
7.进一步的，所述步骤（1）中海带残渣为提取褐藻胶后的海带残渣。
8.进一步的，所述步骤（2）中ph调节至13；90℃加热6 h，离心分离沉淀，沉淀即为可溶性膳食纤维。
9.进一步的，所述步骤（3）中调节ph至中性的沉淀经旋蒸浓缩后，于1500 da透析袋中透析10
‑
12 h，
‑
80℃冰箱中放置12 h后冷冻干燥36 h，得到干燥的可溶性膳食纤维。
10.进一步的，所述料液比的单位为mg/ml。
11.进一步的，所述可溶性膳食纤维改善溃疡性结肠炎的有效剂量为0.5 g/kg
‑
3.5 g/kg。
12.进一步的，所述可溶性膳食纤维改善溃疡性结肠炎的的最有效剂量为1.5 g/kg。
13.进一步的，所述可溶性膳食纤维能够抑制由溃疡性结肠炎引起的小鼠体重下降并降低小鼠的疾病活动指数。
14.进一步的，所述可溶性膳食纤维能够抑制通过明显改善小鼠的结肠黏膜上皮完整性、减轻杯状细胞和隐窝破坏程度、减少中性粒细胞浸润以及抑制结肠病变、缩短和肿胀程度来恢复结肠的健康状况进一步的，所述可溶性膳食纤维能够降低小鼠结肠组织中的髓过氧化物酶mpo和丙二醛mda含量以及增加超氧化物歧化酶酶sod含量来改善小鼠结肠的氧化应激水平，并且提高小鼠体内短链脂肪酸的含量。
15.进一步的，所述短链脂肪酸包括乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、己酸。
16.进一步的，所述可溶性膳食纤维能够下调小鼠结肠组织中促炎因子nf
‑
κb、tnf
‑
α的表达水平以及上调抑炎因子ppar
‑
γ、il
‑
10和肠道紧密连接蛋白zo
‑
1、occludin、claudin
‑
1的表达水平。
17.进一步的，所述可溶性膳食纤维能够通过上调拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门的丰度以及抑制疣微菌门的丰度来恢复小鼠肠道菌群的多样性和丰度。
18.进一步的，所述可溶性膳食纤维能够增加科水平上muribaculaceae的占比，减少erysipelotrichaceae占比。
19.进一步的，所述可溶性膳食纤维能够增加属水平norank_f__muribaculaceae、helicobacter、lactobacillus、prevotellaceae_ucg
‑
001、lactococcus、bacteroides、odoribacter短链脂肪酸产生菌的丰度。
20.与现有的技术相比，本发明的有益效果和优点在于：本发明提取的可溶性膳食纤维的原料是分离褐藻胶后的海带残渣，其来源丰富，使用安全。本发明提取的可溶性膳食纤维属于天然活性物质，其中包含多种单糖种类，且经过验证可溶性海带膳食纤维的表面凹凸不平，褶皱增多，不仅能促进吸水膨胀功能，增加膳食纤维在胃肠道中吸收葡萄糖、胆固醇和有害物质的能力，还提高了海带的高附加利用价值，且安全性高、价格低。
21.本发明对海带可溶性膳食纤维改善溃疡性结肠炎的作用和机制进行探究，重点研究了肠道菌群及其代谢产物介导的机制，其改善溃疡性结肠炎效果明显，不仅能够缓解结肠的组织病理学情况，还能抑制结肠内促炎因子等的表达。所述可溶性膳食纤维进一步丰富了膳食纤维的来源和类型，改变了目前对df的研究多集中在陆生植物的sdf的现状，而且为海带sdf以调节肠道菌群为靶点治疗胃肠道疾病提供参考，为生产具有特定功能的膳食
hcl溶液后，加0.5 ml氯仿，振荡摇匀后静置20 min，弃去下层，萃取三次，取水层过膜上机。
27.仪器方法：色谱柱：shiseido c18柱（4.6 mm
×
250 mm, 5 μm），流动相：a: 0.1 mol/l 0.1m kh2po4（ph 6.8），b：乙腈，a：b=82：18，流速：1.0 ml/min，柱温为25℃，进样量10 μl，波长为245 nm。
28.计算公式：x=v
×
n
×ꢀ
(cx
‑
co)/m；式中，v
‑
定容体积、n
‑
稀释倍数、cx
‑
检测浓度、co
‑
空白、m
‑
称样量、x
‑
样品浓度。
29.结果如表1所示，海带可溶性膳食的10种单糖组成为：岩藻糖（39.495%）、半乳糖（17.572%）、葡萄糖（11.897%）、甘露糖（10.088%）、木糖（5.700%）、葡萄糖醛酸（8.892%）、鼠李糖（5.780%）、半乳糖醛酸（0.575%）、阿拉伯糖（<0.001%）、核糖（<0.001%）。
30.表1：海带可溶性膳食的分子量分布2、可溶性海带膳食纤维的电镜扫描在带有双面胶的载物台上均匀放置适量的干燥可溶性海带膳食纤维样本，使用离子溅射镀膜的方法在表面镀金后取出放置于扫描电子显微镜下进行扫描观察，将电压设为5kv，放大倍数为150x。
31.可溶性海带膳食纤维的电镜扫描结果如图1所示，左列为可溶性海带膳食纤维，右列为原料海带渣，从150倍到500倍的图中可知可溶性海带膳食纤维的表面凹凸不平，褶皱增多，粒度明显低于海带渣。膳食纤维的粒度决定比表面积，比表面积大增加与水亲和能力，促进吸水膨胀功能，凹凸不平表面增加膳食纤维在胃肠道中吸收葡萄糖、胆固醇和有害物质的能力。
32.3、可溶性海带膳食纤维的红外光谱取干燥样品2 mg和kbr（光谱级）100 mg研磨，研磨后压成透明的薄片，使用空白kbr作为背景，扫描次数为20次和分辨率为4 cm
‑1，扫描范围4000
‑
400 cm
‑1。
33.结果如图2所示，红外谱图中3431.09处出现强峰，说明有o
‑
h键的伸缩震动，并且该峰较圆润说明存在分子间和分子内的氢键作用，在1631.62处的强峰表明有c=o的伸缩震动，2920.12和2850.67出现峰说明该峰表明有甲基的c
‑
h的伸缩震动，1261.56处的峰表明有c
‑
h的变角运动，这些都是典型的糖类特征吸收峰。
34.实施例3
选取c57bl/6小鼠（雄性），7
‑
8周龄，体重25
‑
28g，饲养温度20
‑
24℃，湿度40%
‑
60%，期间自由饮水，摄食。实验分组如下：72只雄性c57bl/6小鼠适应性喂养7天后按照体重随机分成9组，每组12只，分别为正常组（nc）、模型组（mc）、阳性药组（pc）、低、中、高剂量sdf组（l
‑
sdf、m
‑
sdf、h
‑
sdf）。适应性喂养结束进行受试物灌胃。每天上午9:00对各组小鼠进行受试物灌胃，持续7天。于第8天采用葡聚糖硫酸钠（dss）建立溃疡性结肠炎模型，末次进食后，于第14天禁食不禁水过夜，隔天采取眼窝取血后脱颈椎方式处死小鼠，干预方案见表2。干预造模期间每日记录小鼠的摄食量、摄水量及体重，观察小鼠粪便状态及便血情况。
35.表2：sdf对溃疡性结肠炎小鼠模型的干预方案实验结果如图3显示：海带sdf能有效抑制dss所致模型小鼠体重的下降及疾病活动指数的升高，且以中剂量效果最好。
36.实施例4实验分组与灌胃剂量同实施例3，实验结束后，切除整个结肠观察溃疡程度并准确量取长度、重量。
37.实验结果如图4显示：与nc组相比，mc组小鼠结肠明显缩短且重量减轻，从盲肠至结肠的整个肠道黏膜严重充血肿胀，肠腔内有大量血性内容物，严重处呈现紫红色。美沙拉嗪和低、中、高剂量sdf干预后结肠虽然出现不同程度的肿胀和缩短，但其病变程度较mc组有所改善，能够抑制uc小鼠结肠病变和缩短。
38.实施例5实验分组与灌胃剂量同实施例3。实验结束后，取小鼠远端结肠约0.5 cm转移至4%多聚甲醛固定液中。经过脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与粘片、脱蜡、染色等步骤染色，使用切片机生成5μm横断面图，通过显微镜观察并记录组织学改变程度，评分标准如表3所示。
39.表3：结肠组织病理学评分标准评分组织学变化0没有炎症1炎症水平较低，黏膜下组织无损伤2中等炎症水平，黏膜下组织破坏3明显炎症细胞浸润，黏膜下组织破坏，肠壁增厚4严重炎症细胞浸润，严重结肠组织损伤实验结果如图5显示：摄入sdf后，肠炎小鼠结肠黏膜溃疡面积缩小，肠壁恢复，黏
膜下层肿胀的程度减轻。对结肠炎症程度进行评分，结果表明mc组评分最高，说明炎症程度最为严重，m
‑
sdf组评分最低，说明该剂量的sdf对炎症的保护作用较好。
40.实施例6实验分组与灌胃剂量同实施例3。实验结束后，准确称取结肠组织0.1 g进行匀浆处理。2500~3000 r/min，离心10 min，取上清即10%匀浆上清液待测。根据bca蛋白浓度测定试剂盒、丙二醛（mda）、髓过氧化物酶（mpo）、超氧化物歧化酶（sod）试剂盒说明书测定相关指标，分析肠道氧化应激水平。
41.实验结果如图6显示：sdf能够调节免疫细胞活性并抑制其在肠道中大量积聚，降低结肠mpo和mda含量，上调sod含量，进而改善肠道氧化应激水平。
42.实施例7实验分组与灌胃剂量同实施例3。实验结束后，准确称取结肠组织0.1 g按照transzol的方法说明提取总rna，按照one
‑
step gdna removal试剂盒将rna反转录为cdna，按照transstart
®ꢀ
top green qpcr supermix（ dye ii）试剂盒进行实时荧光定量pcr检测炎症因子nf
‑
κb、ppar
‑
γ、il
‑
10、tnf
‑
α 的mrna表达量。
43.实验结果如图7显示：sdf抑制促炎因子nf
‑
κb和tnf
‑
α的mrna表达，促进抑炎因子ppar
‑
γ和il
‑
10的表达，m
‑
sdf的效果更好一些。
44.实施例8实验分组与灌胃剂量同实施例3。实验结束后，分别取出0.1 g结肠组织提取蛋白，western blot检测炎症因子nf
‑
κb、ppar
‑
γ、il
‑
10、tnf
‑
α的蛋白表达水平。
45.实验结果如图8显示：sdf下调促炎因子nf
‑
κb和tnf
‑
α的蛋白表达量，上调抑炎因子ppar
‑
γ和il
‑
10的蛋白表达量，m
‑
sdf的效果相对更好一些。
46.实施例9实验分组与灌胃剂量同实施例3。实验结束后，准确称取结肠组织0.1 g按照transzol的方法说明提取总rna，按照one
‑
step gdna removal试剂盒将rna反转录为cdna，按照transstart
®ꢀ
top green qpcr supermix（ dye ii）试剂盒进行实时荧光定量pcr检测肠道紧密连接蛋白occludin、zo
‑
1、claudin
‑
1 mrna表达量。
47.实验结果如图9显示：sdf上调occludin、zo
‑
1和claudin
‑
1的mrna表达量，说明sdf可维持肠道黏膜结构和功能的完整性。
48.实施例10实验分组与灌胃剂量同实施例3。实验结束后，分别取出0.1 g结肠组织提取蛋白，western blot检测肠道紧密连接蛋白occludin、zo
‑
1、claudin
‑
1的蛋白表达水平。
49.实验结果如图10显示：sdf上调occludin、zo
‑
1、claudin
‑
1的蛋白表达水平。
50.实施例11实验分组与灌胃剂量同实施例3。实验结束前一天，将小鼠分别放入干净无菌的鼠笼中，收集小鼠粪便，通过dna抽提、设计合成引物接头、pcr扩增与产物纯化、pcr产物定量与均一化、构建pe文库等流程进行16s rrna v3
‑
v4区扩增，测序平台为illumina。按照97%相似性对非重复序列进行otu聚类，采用rdp classifier贝叶斯算法对97%相似水平的otu代表序列进行物种组成分析。
51.实验结果如图11
‑
13显示：venn图结果显示，mc组、sdf组分别与nc组共有378、396
个out。门水平柱形图显示sdf增加bacteroidota的丰度至45.8%，下调firmicutes的丰度至42.9%，下调firmicutes/bacteroidota比值。科水平柱形图显示sdf使有益菌muribaculaceae占比增加，是有害菌erysipelotrichaceae占比降低。属水平显示sdf增加了norank_f__muribaculaceae、helicobacter、lactobacillus、prevotellaceae_ucg
‑
001、lactococcus、bacteroides、odoribacter等短链脂肪酸产生菌的丰度。
52.实施例12实验分组与灌胃剂量同实施例3。实验结束前一天，将小鼠分别放入干净无菌的鼠笼中，收集小鼠粪便。首先精确称取一定质量的样本，于低温环境下加入提取液进行代谢物萃取处理。配制不同浓度的标准溶液，在同一条件下对标准溶液和待测样品进行gc
‑
ms上机检测，根据标准曲线计算出检测样品的目标物质的浓度，最终换算得到样品。
53.实验结果如图14显示：sdf干预，总scfas及乙酸（ace）、丙酸（pro）、丁酸（but）、异丁酸（isobut）、戊酸、异戊酸、己酸等各类scfas含量都得到上调。
54.以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。