一种黄芪甲苷的用途的制作方法

1.本发明涉及药物领域，具体涉及一种黄芪甲苷的用途。


背景技术：

2.肿瘤坏死因子α刺激基因-6(tumor necrosis factorαstimulated gene 6,tsg-6)是肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,tnf-α)刺激成纤维细胞时发现的一种具有开放阅读框架，编码为277个氨基酸的多肽，其编码大小为35kda。除了成纤维细胞外，tsg-6还可以由软骨细胞、间充质干细胞、单核细胞以及血管平滑肌等细胞在炎症介质刺激下分泌。在正常细胞或组织中，tsg-6几乎没有表达，但在炎症因子刺激下，上述细胞可通过分泌tsg-6抑制炎症反应。
3.间充质干细胞(mesenchymal stem cells,mscs)是一种低免疫原性多能干细胞，在炎症刺激下mscs通过分泌tsg-6发挥强大的免疫调节与抑制作用：mscs分泌的tsg-6可通过增加α-抑制剂抑制蛋白酶的炎症网络，抑制中性粒细胞浸润；与透明质酸片段结合减弱其促炎作用；抑制m1型巨噬细胞活性促进m2型巨噬细胞生成等不同途径发挥抗炎作用。
4.mscs的免疫调节功能在干细胞移植治疗疾病方面起着重要作用，tsg-6是发挥其免疫介导的重要因子。虽然目前对于mscs分泌tsg-6后免疫调控的研究很多，但关于何种药物可以促进炎症状态下mscs分泌tsg-6仍未见报导。
5.因此，本领域需要开发一种促进炎症状态下mscs分泌tsg-6的药物。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种黄芪甲苷在预防和/或治疗炎症方面中的用途。
7.本发明第一方面，提供一种黄芪甲苷的用途，用于(1)制备预防和/或治疗炎症的组合物；(2)用于制备tsg-6和/或inos促进剂的组合物；(3)用于制备促进间充质干细胞表达和/或分泌tsg-6和/或inos的组合物；和/或(4)用于制备促进间充质干细胞增殖的组合物。
8.优选地，所述的炎症包括炎症因子引起的炎症。
9.优选地，所述的炎症因子包括ifn-γ和tnf-α中的一种或多种。
10.优选地，所述的预防和/或治疗炎症包括通过提高tsg-6和/或inos的含量来预防和/或治疗炎症。
11.优选地，所述提高tsg-6和/或inos的含量包括促进间充质干细胞表达和/或分泌tsg-6和/或inos。
12.优选地，所述的预防和/或治疗炎症包括促进间充质干细胞表达和/或分泌tsg-6和/或inos来预防和/或治疗炎症。
13.优选地，所述的tsg-6和/或inos包括间充质干细胞的tsg-6和/或inos。
14.优选地，所述的tsg-6和/或inos包括间充质干细胞表达和/或分泌的tsg-6和/或inos。
15.优选地，所述的间充质干细胞包括骨髓间充质干细胞。
16.优选地，所述的间充质干细胞包括炎症条件下的间充质干细胞。
17.优选地，所述的黄芪甲苷通过inos信号通路提高tsg-6的含量。
18.优选地，所述的黄芪甲苷通过inos信号通路促进间充质干细胞表达和/或分泌tsg-6。
19.优选地，所述的黄芪甲苷通过inos信号通路促进间充质干细胞表达和/或分泌tsg-6来预防和/或治疗炎症
20.优选地，所述的表达为mrna或蛋白表达。
21.在另一优选例中，所述的炎症的对象为人或非人哺乳动物。
22.在另一优选例中，所述的tsg-6为人或非人哺乳动物的tsg-6。
23.在另一优选例中，所述的inos为人或非人哺乳动物的inos。
24.在另一优选例中，所述的间充质干细胞为人或非人哺乳动物的间充质干细胞。
25.在另一优选例中，所述的非人哺乳动物为猴、猩猩、牛、猪、狗、羊、鼠或兔。
26.在另一优选例中，所述的组合物包括药物组合物。
27.在另一优选例中，所述的组合物还包括药学上可接受的载体。
28.在另一优选例中，所述的组合物的剂型为口服制剂、外用制剂或注射制剂。
29.在另一优选例中，所述的注射制剂为静脉注射剂或肌肉注射剂。
30.在另一优选例中，所述组合物的剂型为固体剂型、半固体剂型、或液体剂型，如溶液、凝胶、膏霜、乳液、膏剂、霜剂、糊剂、饼、粉剂、贴剂等。
31.在另一优选例中，所述组合物的剂型为粉剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、酊剂、口服液、片剂或含片。
32.在另一优选例中，在所述组合物中，所述黄芪甲苷的重量百分比为0.01-99.9wt％，较佳地0.1-99wt％，更佳地10-90wt％，更佳地20-80wt％，以组合物的总重量计。
33.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
34.图1为1μm、10μm、50μm或100μm黄芪甲苷在24h或48h对bmscs细胞的相对活力影响影响(*p＜0.05，**p＜0.01与0μm组对比)。
35.图2为黄芪甲苷干预ifn-γ tnf-α炎症因子刺激下bmscs的inos和tsg-6mrna表达情况(
##
p＜0.01与blank组对比；*p＜0.05，**p＜0.01与control组对比)。
36.图3为黄芪甲苷干预ifn-γ tnf-α炎症因子刺激下inos si-rna转染的bmscs的inos与tsg-6的mrna表达(*p＜0.05，**p＜0.01与si-control组对比，
##
p＜0.01与si-control hq组对比)。
37.图4为黄芪甲苷干预ifn-γ tnf-α炎症因子刺激下inos si-rna转染的bmscs的inos和tsg-6的蛋白表达，其中，hq指si-control hq，si-hq指si-inos-hq(*p＜0.05，**p＜0.01与si-control组对比，
##
p＜0.01与si-control hq组对比)。
具体实施方式
38.本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了黄芪甲苷能够促进间充质干细胞增殖，促进炎症条件下的间充质干细胞表达和分泌tsg-6和inos，从而用于预防和治疗炎症。
39.术语
40.除非另有定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域普通技术人员普遍理解的含义相同。
41.如本文所用，术语“包括”、“包含”与“含有”可互换使用，不仅包括开放式定义，还包括半封闭式、和封闭式定义。换言之，所述术语包括了“由
……
构成”、“基本上由
……
构成”。
42.如文本所用，术语“inos”是指诱导型一氧化氮合酶，英文名为inducible nitric oxide synthase。
43.如文本所用，术语“黄芪甲苷”的cas号：83207-58-3。
44.如文本所用，术语“骨髓间充质干细胞”的英文为bone marrow mesenchymal stem cells，简写成bmscs。
45.如文本所用，术语“肿瘤坏死因子α刺激基因-6”的英文为tumor necrosis factorαstimulated gene 6,简写成tsg-6。
46.如文本所用，术语“ifn-γ”是指γ干扰素。
47.如文本所用，术语“tnf-α”是指肿瘤坏死因子α。
48.在本发明中，术语“预防”表示预防疾病和/或它的附随症状的发作或者保护对象免于获得疾病的方法
49.在本发明中，术语“治疗”包括延缓和终止疾病的进展，或消除疾病，并不需要100％抑制、消灭和逆转。在一些实施方案中，与不存在本发明所述的黄芪甲苷观相比，本发明所述黄芪甲苷减轻、抑制和/或逆转了炎症例如至少10％、至少约50％、至少约80％，或100％。
50.用途
51.本发明提供一种黄芪甲苷的用途，用于选自下组的一种或多种用途：(1)制备预防和/或治疗炎症的组合物；(2)用于制备tsg-6和/或inos促进剂的组合物；(3)用于制备促进间充质干细胞表达和/或分泌tsg-6和/或inos的组合物；和/或(4)用于制备促进间充质干细胞增殖的组合物。
52.本发明所述的黄芪甲苷能够用于促进间充质干细胞表达和分泌tsg-6和inos，通过提高tsg-6和inos含量用来预防和治疗炎症
53.在本发明的一个优选例中，所述的炎症包括(但不限于)炎症因子引起的炎症，所述的炎症因子(但不限于)ifn-γ和tnf-α中的一种或多种。
54.在本发明的一个优选例中，所述的预防和/或治疗炎症包括通过提高tsg-6和/或inos的含量来预防和/或治疗炎症。
55.优选地，所述提高tsg-6和/或inos的含量包括促进间充质干细胞表达和/或分泌tsg-6和/或inos。
56.在本发明的一个优选例中，所述的预防和/或治疗炎症包括促进间充质干细胞表达和/或分泌tsg-6和/或inos来预防和/或治疗炎症。
57.优选地，所述的tsg-6和/或inos包括间充质干细胞的tsg-6和/或inos。
58.优选地，所述的tsg-6和/或inos包括间充质干细胞表达和/或分泌的tsg-6和/或inos。
59.在本发明的一个优选例中，所述的间充质干细胞包括骨髓间充质干细胞。
60.在本发明的一个优选例中，所述的间充质干细胞包括炎症条件下的间充质干细胞。
61.在本发明的一个优选例中，所述的黄芪甲苷通过inos信号通路提高tsg-6的含量。
62.优选地，所述的黄芪甲苷通过促进inos信号通路来促进间充质干细胞表达和/或分泌tsg-6。
63.组合物和施用
64.本发明所述的组合物包括(但并不限于)药物组合物等。
65.代表性地，可将本发明的黄芪甲苷制备成药物组合物，诸如片剂、胶囊、粉剂、微粒剂、溶液剂、锭剂、胶冻、乳膏制剂、醑剂、悬液、酊、泥敷剂、搽剂、洗剂、和气雾剂之类的剂型。药物组合物能够由通常已知的制备技术来制备，并且合适的药物添加剂能够被添加到该药物中。
66.本发明的组合物还可以包括药学上可接受的载体。“药学上可接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上可接受的载体可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
67.本发明组合物施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、肠胃外(静脉内、肌肉内)、局部施用，优选的施用方式为口服施用和注射施用。
68.施用组合物时，是将安全有效量的本发明黄芪甲苷适用于需要治疗的人或非人动物(如大鼠、小鼠、狗、猫、牛、鸡、鸭等)，其中施用时剂量为药学上可接受认为的有效给药剂量。如本文所用，术语“安全有效量”，是指对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。本领域的普通技术人员应该理解，所述的“安全有效量”可随着药物组合物的形式、给药途径、所用药物的辅料、疾病的严重程度以及与其他药物联合用药等情况的不同而有所不同。例如，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为0.1～1000mg，优选1～600mg，更优选为2-300mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
69.本发明的主要技术效果包括：
70.本发明首次发现黄芪甲苷能够促进间充质干细胞增殖，促进炎症条件下的间充质干细胞表达和分泌tsg-6和inos，从而用于预防和治疗炎症。
71.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
72.实施例1
73.(一)实验方法
74.1.骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,bmscs)提取分离
75.(1)颈椎脱臼法处死c57小鼠，并放入75％的乙醇中浸泡10分钟。
76.(2)无菌条件下分离出小鼠股骨和胫骨，尽量去除骨表面结缔组织及表面血污，置于无菌双抗pbs缓冲液(含100u/ml青霉素和100mg/ml链霉素)的培养皿中，于酒精灯火焰周围移入超净工作台。
77.(3)用眼科剪，剪掉长骨两端的干骺端，取培养皿，加入15ml完全培养基(不完全dmem高糖培养基 10％胎牛血清 100u/ml青霉素 100mg/ml链霉素)，从股骨一端反复冲洗，另一端收集冲出的骨髓悬液。
78.(4)均匀混合后，用1ml注射器反复抽吸制成单细胞悬液，用巴氏吸管移至15ml离心管中，以1000r/min离心5min，弃上清。
79.(5)加入6ml完全培养基重悬后接种于培养皿中。
80.(6)将培养皿置于37℃、5％co2培养箱中静置培养。待细胞长至80％左右进行传代，取用3-5代骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,bmscs)用于后续实验。
81.2.黄芪甲苷药品制备
82.黄芪甲苷(cas号：83207-58-3)来自中国食品药品鉴定研究院(货号：110781)。制备溶解品前，轻轻敲打瓶底并简易离心，使瓶盖及瓶周的药品转移至瓶底，加入1.27ml的dmso溶解液，配置成浓度为20mm的黄芪甲苷存储液，封装保存至4℃。
83.黄芪甲苷的结构如下：
[0084][0085]
3.cck8检测试剂盒检测细胞增殖-毒性检测
[0086]
(1)干预：
[0087]
(1.1)选取3-5代骨髓间充质干细胞，以每孔1
×
104个细胞铺板96孔板，每孔加入100μl完全培养基，培养24h，待细胞密集度达到60％以上开始干预。
[0088]
(1.2)弃96孔板内上清，加入含对应浓度梯度黄芪甲苷的完全培养基100μl进行干预孵育。
[0089]
(1.3)在孵育24h和48h后进行cck8检测。
[0090]
(2)分组：
[0091]
选取黄芪甲苷浓度0、1μm、10μm、50μm、100μm五个浓度作为实验浓度。
[0092]
(3)cck-8检测：
[0093]
(3.1)待加入含对应浓度梯度黄芪甲苷的完全培养基干预处理24h和48h后。
[0094]
(3.2)向每孔加入10μl cck-8溶液。
[0095]
(3.3)将培养板在培养箱内孵育2h，等待培养可肉眼观察显色程度取出。
[0096]
(3.4)用酶标仪测定在450nm处的吸光度值。
[0097]
4.黄芪甲苷浓度梯度干预骨髓间充质干细胞
[0098]
(1)干预：
[0099]
(1.1)选取3-5代骨髓间充质干细胞，以每孔1
×
105个细胞铺板24孔板，加入500μl完全培养基培养24h，待细胞密集度达到60％以上开始干预。
[0100]
(1.2)弃24孔板内上清，加入含对应浓度梯度黄芪甲苷的无血清培养基(不完全dmem高糖培养基 100u/ml青霉素 100mg/ml链霉素)500μl进行干预孵育。
[0101]
(1.3)在孵育12h后，弃24孔板内上清。
[0102]
(1.4)将各10ng/ml浓度的tnf-α和ifn-γ加入含对应浓度梯度黄芪甲苷的完全培养基进行干预。
[0103]
(1.5)干预24h后收集细胞。
[0104]
(2)干预分组：
[0105]
根据处理不同，将骨髓间充质干细胞按表1方式进行分组：
[0106]
表1骨髓间充质干细胞分组
[0107][0108]
5.inos sirna转染
[0109]
(1)转染步骤：
[0110]
(1.1)骨髓间充质干细胞以每孔1
×
105个细胞铺板24孔板，每孔加入500μl完全培养基，培养24h，待细胞密集度达60％以上进行转染。
[0111]
(1.2)转染工作液配制：50μl不完全dmem高糖培养基 2μl santa沉默剂。
[0112]
(1.3)lipo2000工作液配置：50μl不完全dmem高糖培养基 1μl lipo2000转染剂。
[0113]
(1.4)转染工作液与lipo2000工作液配置后均室温静置5min。
[0114]
(1.5)将转染工作液和lip2000工作液以1:1比例混合室温静置20min。
[0115]
(1.6)弃24孔板内上清，每孔加入不完全dmem高糖培养基500μl，再每孔加入100ul混合工作液。
[0116]
(1.7)5h后弃上清，每孔加入500μl完全培养基。
[0117]
(2)干预分组：
[0118]
根据处理不同，将骨髓间充质干细胞按表2方式进行分组：
[0119]
表2骨髓间充质干细胞分组
[0120][0121]
6.黄芪甲苷药物干预si-inos转染下骨髓间充质干细胞
[0122]
(1)干预：
[0123]
(1.1)上述inos sirna转染完成的骨髓间充质干细胞，弃24孔板内上清，加入含10μm浓度黄芪甲苷的500μl无血清培养基进行干预孵育。
[0124]
(1.2)孵育12h后，弃24孔板内上清。
[0125]
(1.3)将各10ng/ml浓度的tnf-α和ifn-γ加入含10μm浓度黄芪甲苷的完全培养基500μl进行干预。
[0126]
(1.4)孵育24h后收集细胞。
[0127]
(2)干预分组：
[0128]
根据处理不同，将骨髓间充质干细胞按表3方式进行分组：
[0129]
表3骨髓间充质干细胞分组
[0130][0131][0132]
7.real-time pcr法检测
[0133]
(1)样本处理及rna提取
[0134]
(1.1)洗涤细胞
[0135]
吸去孔板内上清，1ml pbs冲洗2次。
[0136]
(1.2)抽提rna
[0137]
(1.2.1)在每孔内加入1ml trizol，吹打裂解细胞，室温静置10min，随后将每孔trizol移入ep管；
[0138]
(1.2.2)每个ep管加入200ul氯仿，剧烈震荡15s后，静置3min；
[0139]
(1.2.3)将ep管放入离心机，4℃，12000rpm，离心15min；
[0140]
(1.2.4)得到混合物下层为红色苯酚-氯仿相，中间为蛋白质沉淀，上层为无水相，用pcr专用枪头，小心吸取上清液，移入pcr专用ep管，加入500μl异丙醇，颠倒混匀，室温静置10-30min；
[0141]
(1.2.5)将ep管放入离心机，4℃，12000rpm，离心10min，倒去上清液，沉淀斑即为rna；
[0142]
(1.2.6)在ep管内加入1ml 70％乙醇；
[0143]
(1.2.7)将ep管放入离心机，4℃，7500rpm，离心5min，去除乙醇，晾干，约需10min；
[0144]
(1.2.8)在ep管内加入1ml无水乙醇；
[0145]
(1.2.9)每个ep管加入10μl depc水，简易离心，室温放置15min，使rna充分溶解，测rna浓度。
[0146]
(2)逆转录
[0147]
(2.1)每组取1μg的rna，按照说明书要求，每10μl体系：
[0148]
5x primescript rt master mis(perefect real time)
ꢀꢀ
2μl
[0149]
totalrna h2o
ꢀꢀ
8μl
[0150]
(2.2)反应温度：
[0151]
37℃15min；85℃5sec；4℃
[0152]
(3)定量pcr检测
[0153]
(3.1)逆转录的cdna进行10倍稀释，即20μl逆转录产物加180μl水进行稀释，按照定量pcr的试剂盒的说明，分别加以下试剂：
[0154]
tb green premix ex taq(tli rnaseh plus)(2x)
ꢀꢀ
12.5μl
[0155]
cdna
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
2μl
[0156]
上下游引物
ꢀꢀꢀꢀ
1μl
[0157]
h2o
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
ꢀꢀ
ꢀꢀ
8.5μl
[0158]
反应程序如下:
[0159]
变性阶段:95℃，30s
[0160]
pcr反应阶段40个循环:95℃，5s；60℃，30s；
[0161]
解离曲线阶段；95℃，10s；60℃，5s；95℃；
[0162]
(3.2)2-△△
ct法分析基因相对表达量：2-△△
ct法可用于定量pcr实验来计算基因表达的相对变化
[0163]
△
ct＝
△
ct(试验样品)
‑△
ct(基准样品)
[0164]
△
ct(试验样品)＝ct(试验样品，目的基因)-ct(试验样品，内参基因)
[0165]
△
ct(基准样品)＝ct(基准样品，目的基因)-ct(基准样品，内参基因)
[0166]
目的基因的相对表达量＝2-△△
ct
[0167]
(3.3)引物列表如表4所示：
[0168]
表4引物列表
[0169][0170]
8.western blot检测蛋白
[0171]
(1)提取细胞总蛋白
[0172]
(1.1)弃培养液，在每个培养皿细胞加入4℃预冷的无菌pbs，平放轻轻摇动洗涤细胞，然后弃pbs，重复两次操作；
[0173]
(1.2)加入60μl含10％pmsf的ripa裂解液，于冰上裂解30min；
[0174]
(1.3)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养皿的一侧，然后用移液器将细胞碎片和裂解液移至ep管中；
[0175]
(1.4)将ep管置于离心机中，12000-13000rpm，离心15min；
[0176]
(1.5)将离心后的细胞液放于-80℃保存；
[0177]
(2)总蛋白的测定
[0178]
(2.1)bca标准品稀释：在96孔板中分别加入0，1，2，4，8，16，20μl稀释后的标准品(0.5mg/ml)，加入蛋白裂解液将溶液补至20μl，每种浓度做2个复孔；
[0179]
(2.2)bca工作液准备：(标准曲线 样品个数)
×
(重复次数)
×
(每个样品所需的bca工作液体积)＝所需要bca工作液的总体积；
[0180]
(2.3)将50份a液与1份b液混合后得到工作液；
[0181]
(2.4)在96孔板中加入2μl体积的样品，用蛋白裂解液将样品体积补至20μl；
[0182]
(2.5)在各孔中分别加入200μl bca工作液，37℃孵育30min；
[0183]
(2.6)在562nm处测其吸光度值，绘制标准曲线；
[0184]
(2.7)根据标准曲线计算蛋白浓度；
[0185]
(3)蛋白样品变性：按照体积比加入1:5加入蛋白上样缓冲液(6x)，100℃沸水中煮10min，置于-20℃冰箱备用；
[0186]
(4)蛋白电泳
[0187]
(4.1)配置sds-page胶；
[0188]
(4.2)加样
[0189]
(4.3)跑电泳：调节电压300v，电流140ma，时间20min，及时观察防止条带跑出胶；
[0190]
(5)转膜：
[0191]
(5.1)pvdf膜浸泡于甲醇中1-2min，取出浸泡于转膜缓冲液中；
[0192]
(5.2)滤纸浸泡于转膜缓冲液中，按照所需蛋白的分子量大小进行割胶，浸泡于转膜缓冲液；
[0193]
(5.3)分别按照正极至负极的顺序叠加海绵垫，滤纸，膜，胶，滤纸，海绵垫，在冰浴中，进行恒压100v，转膜90min。
[0194]
(6)封闭：拆下转移装置，将转移好的膜，移至含有封闭液的平皿中，室温摇床上封闭30min；
[0195]
(7)孵育一抗：将一抗用一抗稀释液按比列稀释，actin(1:1000)、nf-κb p65(1:1000)、nf-κb p-p65(1:1000)、inos(1:500)、tsg-6(1:500)，将蛋白面的膜向上滴入一抗覆盖过膜，4℃孵育膜过夜；
[0196]
(8)pbst洗膜3次，10min/次；
[0197]
(9)孵育二抗：按比例稀释二抗，室温孵育膜1h；
[0198]
(10)pbst洗膜3次，10min/次；
[0199]
(11)化学发光：将pvdf膜平铺在保鲜膜上，移液器取ecl超敏发光液a、b以1:1混合，均匀滴到pvdf膜上，1min后，去尽残液，覆盖保鲜膜，将pvdf膜包好；
[0200]
(12)使用chemidocxrs 凝胶成像系统拍照，用imagelab软件进行分析处理。
[0201]
9.统计方法
[0202]
所有数据以表示，应用spss20.0统计软件做统计分析，符合正态分布，多组间两两比较采用单因素方差分析(anova)，方差齐采用lsd方法检验，方差不齐则用dunnett’st3方法检验，p＜0.05表示差异具有统计学意义。不符合正态分布时则采用非参数检验方法进行数据分析。
[0203]
(二)实验结果
[0204]
1.黄芪甲苷促进骨髓间充质干细胞增殖
[0205]
根据不同浓度黄芪甲苷对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,bmscs)进行药物干预，用cck-8法检测黄芪甲苷对bmscs的细胞增殖影响，结果如图1所示。从图1中可以看出，在24h药物干预下，1-100μm浓度下黄芪甲苷对于bmscs具有促进增殖作用，且在黄芪甲苷浓度为10μm、50μm和100μm时与0μm相比存在显著差异(p《0.05)。在48h药物干预条件下，1μm、10μm、50μm和100μm浓度下黄芪甲苷对于bmscs均具有促进增殖作用，且均与0μm相比存在显著差异(p《0.05)，此时10μm浓度的黄芪甲苷为最佳促进浓度。
[0206]
2.黄芪甲苷呈浓度依赖性促进炎症条件下bmscs的inos和tsg-6表达
[0207]
如表1所示的通过以5μm、10μm、20μm的黄芪甲苷浓度梯度干预ifn-γ tnf-α炎症条件下bmscs的inos与tsg-6的mrna表达情况如图2所示。从图2中可以看出，bmscs中inos与tsg-6mrna表达呈黄芪甲苷浓度依赖性上升，提示黄芪甲苷促进炎症条件下bmscs中inos与tsg-6的表达。
[0208]
3黄芪甲苷通过inos信号通路促进炎症条件下bmscs表达tsg-6
[0209]
如表3所示的通过黄芪甲苷干预ifn-γ tnf-α炎症因子刺激下inos si-rna转染的bmscs的inos与tsg-6的mrna表达如3所示的，从图3中可以看出，inos si-rna可以抑制黄芪甲苷促进炎症条件下bmscs中tsg-6mrna表达，从而表明黄芪甲苷通过inos信号通路促进炎症条件下bmscs表达tsg-6。
[0210]
根据rt-pcr的结果，通过western blot进行蛋白层面的验证(如图4所示)，其结果与inos与tsg-6基因表达结果一致，表明黄芪甲苷通过inos信号通路促进炎症条件下bmscs表达tsg-6。
[0211]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。