经改造HCVE2免疫原和相关疫苗组合物

经改造hcv e2免疫原和相关疫苗组合物
1.相关申请的交叉引用
2.本专利申请要求美国临时专利申请号62/879,100(2019年7月26日提交；目前未决)的优先权权益。优先权申请的全部公开内容通过引用整体地并出于所有目的并入本文。
3.政府支持声明
4.本发明是在由国立卫生研究院(national institutes of health)授予的合同ai129698、ai125078、ai123861、ai079031和ai106005下的政府支持下完成的。政府享有本发明中的某些权利。


背景技术：

5.丙型肝炎病毒(hepatitis c virus，hcv)感染世界人口的1％至2％，并造成主要的健康负担，导致每年约500,000例死亡和每年估计1.5至2百万例新感染。仅在2017年，阿片类药物的流行就导致超过70,000例与过量用药相关的死亡，这直接促使了北美hcv感染的快速上升。大多数hcv患者(75至85％)会发生慢性感染，导致肝细胞癌、肝硬化和其他严重肝病。尽管预期直接作用抗病毒(direct-acting antiviral，daa)治疗会提高hcv治愈率，但仍然存在挑战，因为诊断通常在肝损伤之后的晚期。daa治疗不能防止hcv再感染，也不能降低晚期肝病的肝癌风险，并且可能出现抗性。事实上，注射药物使用者(injection drug user，idu)中hcv相关死亡率和新感染的提高突显了开发有效预防性疫苗以对抗hcv的紧迫性。
6.hcv疫苗开发中的主要挑战是如何激发广泛的保护性免疫应答，以克服七种主要hcv基因型和多于86种亚型的高遗传多样性。此外，快速突变导致受感染个体中的病毒准种，导致免疫逃逸。尽管如此，在20％至30％的急性感染患者中的自发病毒清除表明，如果可通过疫苗接种诱导有效免疫应答，则慢性hcv感染是可预防的。
7.尽管在疫苗设计中取得了显著性进展，但在医学领域中仍然需要更有效和强效的疫苗免疫原，例如以用于预防来自非病毒或病毒病原体的感染(例如，hcv感染)。本发明解决了本领域中未满足的需求。


技术实现要素：

8.在一个方面中，本发明提供了经修饰hcv e2胞外结构域多肽。这些多肽包含经改造e2胞外结构域序列，该序列通过以下中的至少一种方式重新设计(即，另外的修饰)：(a)vr2无序区的截短，和(b)将β-夹心结构域的β片层6和7连接的β-夹心环的缺失。在一些实施方案中，另外的修饰之前的经改造e2胞外结构域序列包含seq id no：4、其经保守修饰变体或实质上相同的序列。在这些经修饰hcv e2胞外结构域多肽中的一些中，vr2无序区的截短包括用cperasghyprpc(seq id no：10)替换seq id no：4的第41至61位残基cperlascgssgcwhypprpc(seq id no：6)。在一些经修饰hcv e2胞外结构域多肽中，vr2无序区的截短包括用cxxxxxxhyprpc(seq id no：8)或cxxxxxhyprpc(seq id no：9)中所示的序列替换seq id no：4的第41至61位残基cperlascgssgcwhypprpc(seq id no：6)，其中x是任
意氨基酸残基。在这些实施方案中的一些中，seq id no：8中的xxxxxx(seq id no：75)是qnwdep(seq id no：11)、kvnidp(seq id no：12)、ekveel(seq id no：13)、pdenmk(seq id no：14)或kreekm(seq id no：15)。在一些其他实施方案中，seq id no：9中的xxxxx(seq id no：76)是pktev(seq id no：16)、krvdi(seq id no：17)、psdmv(seq id no：18)、pneee(seq id no：19)或kkeir(seq id no：20)。
9.在本发明的一些经修饰hcv e2胞外结构域多肽中，从经改造e2胞外结构域序列seq id no：4中缺失β-夹心环序列(sew id no：21)包括形成β-夹心环的尖端的一个或更多个残基的缺失。在这些实施方案中的一些中，形成所述β-夹心环的尖端的残基是来自seq id no：4的第543至546位残基。在这些实施方案中的一些中，来自seq id no：4的第543至546位残基rrpl(seq id no：22)缺失。
10.本发明的一些经修饰hcv e2胞外结构域多肽包含vr2无序区的截短和β-夹心环的缺失二者。在这些实施方案的一些中，经修饰hcv e2胞外结构域多肽包含如seq id no：26至38中任一项所示的氨基酸序列、其经保守修饰变体或实质上相同的序列。
11.在一些相关方面中，本发明提供了编码本文中所述的经修饰hcv e2胞外结构域多肽(seq id no：26至38中所示的多肽)的多核苷酸、含有这样的多核苷酸序列的载体或表达构建体，以及包含本发明的经修饰hcv e2胞外结构域多肽的药物组合物。
12.在另一方面中，本发明提供了疫苗组合物，其包含展示在自组装纳米粒的表面上的本文中所述的经修饰hcv e2胞外结构域多肽。在一些实施方案中，经修饰hcv e2胞外结构域多肽的c端通过接头序列与自组装纳米粒的亚基的n端融合。在这些纳米粒疫苗中的一些中，将经修饰hcv e2胞外结构域多肽与纳米粒亚基连接的接头序列包含(ggggs)2(seq id no：42)。在多个实施方案中，展示在纳米粒上的经修饰hcv e2胞外结构域多肽包含如seq id no：26至38中任一项所示的氨基酸序列、其经保守修饰变体或实质上相同的序列。在这些实施方案中的任一个中，所使用的自组装纳米粒可具有如seq id no：39(e2p)、seq id no：40(i3-01)、seq id no：41(铁蛋白)所示的亚基序列，其经保守修饰变体或实质上相同的序列。
13.在另一个相关方面中，本发明提供了多核苷酸序列，其编码包含本文中所述的经修饰hcv e2胞外结构域多肽和自组装纳米粒亚基的融合蛋白。在所编码的融合蛋白中，经修饰hcv e2胞外结构域多肽通常在其c端与自组装纳米粒亚基的n端融合。本发明的另一相关方面涉及含有这样的多核苷酸序列的载体或表达构建体。在另一个方面中，本发明提供了药物组合物，其包含展示本文中所述的经修饰hcv e2胞外结构域多肽的纳米粒颗粒以及任选地可药用载体。
14.在又一个方面中，本发明提供了用于在患有hcv感染或处于发生hcv感染的风险之中的对象中治疗或预防hcv感染的方法。本发明的这些方法包括向对象施用包含本文中所述的经修饰hcv e2胞外结构域多肽或含有该多肽的纳米粒疫苗的药物组合物。
15.通过参考说明书的其余部分和权利要求书，可实现对本发明的本质和优点的进一步理解。
附图说明
16.图1示出了hcv e2核芯的合理设计。(a)hcv e2(第384至746位氨基酸)的示意图，
其示出了结构组分：可变区(variable region，vr)、抗原位点412(as412)、前层(front layer)、β-夹心、cd81结合环、后层(back layer)、茎跨膜(trans-membrane，tm)区以及n-连接的聚糖和保守二硫键。示出了e2和e2mc3(参见下文)之间设计区域的序列比对。示出了hcv h77分离株的vr2无序区的序列(第452至494位残基)(seq id no：5)和β-夹心环的序列(第540至550位残基)(seq id no：21)。(b)基于结构的最小e2核芯设计。左：h77 e2c(pdb id：4mwf)的结构，其具有由loopy环预测程序建模的缩短的vr2环。重新设计的β-夹心环和缩短的vr2无序区用洋红色着色。示出了将vr2锚定至后层的二硫键c494-c564和c452-c620。前层、cd81结合环和后层也被标记。中1：h77 e2mc3的结构，其具有尖端截短的β-夹心环和进一步截短的vr2无序区(tvr2)。中2：示出了重新设计的tvr2系综(ensemble)的均方根波动(root-mean-square fluctuation，rmsf)图，并且在下面示出了基于系综的从头蛋白质设计中涉及的主要步骤。右：h77 e2mc3的结构，其中排名前五的(five top-ranking)tvr2设计变体(e2mc3 v1-v5)在透明分子表面突出显示。(c)e2mc3及变体的sec谱。左：h77 e2mc3、v1-v5和v6-v10。右：hk6a e2mc3和v1。(d)sds-page e2mc3及变体(左：h77；右：hk6a)。(e)h77(上图)和hk6a(下图)e2核芯与12种hcv抗体结合的ec
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值，该12种hcv抗体包括八种bnab(hcv1、hc33、hc84.1、ar3c、hepc3、hepc74、212.1.1和hc1am)、一种nab(ar2a)和三种非nab(ar1a、ar1b和e1)。这里受试的e2核芯包括e2c3、e2mc3和e2c3变体(10种用于h77以及1种用于hk6a)。(f)对于六种选定的hcv抗体的h77和hk6a e2mc3变体的结合亲和力(kd)。(g)通过dsc测量的h77和hk6a e2c3和e2mc3变体的热稳定性。列出了四种h77 e2核芯和三种hk6a e2核芯的两个热参数tm和δt
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。
17.图2示出了合理设计的hcv e2核芯的结构。(a)h77/hk6a e2mc3的晶体结构显示出与h77 e2c和hk6a e2c3(pdb：4mwf和6bkb)整体相似的折叠。(b)来自h77 e2mc3-v1结构的β-夹心环在hk6a e2c3-fab e1复合物上的叠加，其证实了e2mc3与fab e1结合的丧失是由β-夹心环截短引起的。(c)hk6a e2c3(pdb 6bkb)、h77 e2mc3-v1、h77 e2mc3-v6和hk6a e2mc3-v1的e2在h77 e2c(pdb 4mwf)结构上的叠加，其示出了重新设计的tvr2(a.a.452至494)的构象。h77 e2mc3-v1和hk6a e2mc3-v1结构的重新设计的tvr2区已完全建模，但在h77 e2mc3-v6结构中仅部分建模。(d)h77/hk6a e2mc3结构与h77 e2c和hk6a e2c3的叠加，其显示中和面的构象相似，仅重新设计的vr2 e2有局部构象变化。
18.图3示出了自组装e2核芯纳米粒的合理设计。(a)hcv病毒体(上)和基于e2核芯的纳米粒疫苗(下)的示意图。对于hcv病毒体，标记了单链(single-stranded，ss)-rna、衣壳、膜和包膜糖蛋白e1和e2，而对于疫苗，标记了经优化的e2核芯和纳米粒载体。(b)纳米粒载体的着色表面模型(上)和基于e2核芯的纳米粒疫苗(下)。这里示出的三种纳米粒载体是24-聚体铁蛋白(ferritin，fr)和60-聚体e2p和i3-01。纳米粒尺寸由直径(以纳米计)表示。(c)从superose 6 10/300gl柱获得的h77 e2mc3-v1纳米粒的sec谱。颗粒分数由虚线框指示。虽然fr和i3-01纳米粒均在expicho细胞中产生，但e2p纳米粒在hek293f细胞中表达。(d)经sec纯化的h77 e2mc3-v1纳米粒的bn-page。(e)经sec纯化的h77 e2mc3-v1纳米粒的负染色em图像。(f)h77(上图)和hk6a(下图)e2mc3-v1纳米粒与图7c中列出的12种hcv抗体结合的ec
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值。(g)h77(左)和hk6a(右)e2mc3-v1及三种纳米粒针对六种hcv抗体的抗原谱。传感图使用六种浓度(对于e2mc3-v1为通过两倍稀释的3.57至0.11μm，以及对于纳米粒为通过两倍稀释的52.08至1.63nm)的抗原滴定系列和定量生物传感器从octet red96获得，
夹心环的区域用线标出。标记e2c和e2c3突变，并用箭头标注e2mc3突变。(b)h77 e2c(pdb：4mwf)和1b09截短e2胞外结构域(pdb：6mei)的结构。蛋白质链表示为具有如图1a中的分子表面颜色编码的管。(c)与e1和ar3a结合的hk6a e2c3的结构。示出了hk6a e2c3、e1和ar3a的分子表面。β-夹心环尖端处的四个e1相互作用氨基酸的特写视图作为插图示出。(d)e1表位在e2c3结构上的投射。左：后层，β-夹心环和cd81结合环显示为透明分子表面内的管。β-夹心环的尖端用矩形标记；右：将e1相互作用氨基酸标记在e2的固体分子表面。(e)e1mab hc和lc cdr(分别为seq id no：44至49)与e2之间相互作用的示意图概述。突出显示(氢键和疏水相互作用的e2相互作用残基。(f)重新设计的e2mc3 tvr2环的构象系综。e2mc3结构以带状示出，并且示出了1000个建模环。左：环长度#1(13a-a.)(seq id no：50)；右：环长度#2(12a.a.)(seq id no：51)。(g)对两个重新设计的tvr2环系综绘制的cα均方根(rms)波动分布。(h)对于两个环系综的排名前五的设计及其能量评分。所示序列为e2mc3的tvr2序列(seq id no：10)和10个片段序列(分别为seq id no：11至20)，其替换了tvr2序列中的perasg(seq id no：52)基序。(i)h77 e2、h77 e2c和hk6a e2c3(分别为seq id no：53至55)的序列比对。注意到在h77 e2c-ar3c(pdb：4mwf)和hk6a e2c3-ar3a(pdb：6bkb)复合物晶体结构中无序的氨基酸。
22.图7示出了来源于h77(1a)和hk6a(6a)的e2核芯的生物化学、生物物理和抗原表征。(a)免疫亲和(ar3a)纯化之后从superdex 200 10/300柱获得的e2c3蛋白的sec谱。(b)免疫亲和(ar3a)和sec纯化之后e2c3和e2mc3蛋白的sds-page。(c)定位到h77 e2c表面上的抗原位点和表位(列出了出版物)。(d)h77 e2c3和e2mc3变体与12种hcv特异性抗体的elisa结合。(e)h77 e2核芯构建体与12种hcv特异性抗体结合的ec
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值。(f)hk6a e2 e2c3和e2mc3变体与12种hcv特异性抗体的elisa结合。(g)hk6a e2核芯构建体与12种hcv特异性抗体的ec
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值。在(e)和(g)中，在prism中计算所有elisa图的ec
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值，除非其中最高od
450
值低于0.1或数据拟合不明确。(h)h77 e2mc3变体与六种hcv特异性抗体的octet结合。(i)hk6a e2mc3变体与六种hcv特异性抗体的octet结合。在(h)和(i)中，使用六种浓度(对于所有e2mc3变体为通过两倍稀释的3.57至0.11μm)的滴定系列和动力学生物传感器从octet red96仪器获得传感图(参见方法)。(j)通过octet测量的h77和hk6a e2mc3变体的kd值。(k)选定的e2核芯构建体的差示扫描量热法(differential scanning calorimetry，dsc)曲线。在dsc谱上标记了两个热参数tm和t
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23.图8示出了h77 e2mc3和hk6a e2mc3的晶体结构。(a)前层430-438环的构象灵活性。h77和hk6a e2c结构中的430-438环获得不同的构象，但与fab cdrh3环保持相似的相互作用，表明该区域的灵活性高。(b)h77 e2c、hk6a e2c3和h77/hk6a e2mc3中β-夹心环区(a.a.540至550)的构象。
24.图9示出了重新设计的tvr2区的结构分析。(a)重新设计的vr2区的2f
o-fc和无偏省略(unbiased omit)电子密度图(分别为1σ或0.9σ)。(b)h77 e2mc3-v1、h77 e2mc3-v6和hk6a e2mc3-v1的重新设计的tvr2区与vr3和后vr3区(a.a.570至597)的内在相互作用。(c)h77 e2mc3-v1和hk6a e2mc3-v1的比较，其显示出重新设计的vr2和相邻vr3后层区(a.a.565至608)的构象变化。(d)在截短的1b09 e2胞外结构域(左)的晶体结构中，全长vr2环绕vr3以形成可变面。h77 e2mc3-v1结构在1b09 e2上的叠加显示vr2重新设计对e2整体折叠只有较小的影响(如通过比对c452和c494所示)。
25.图10示出了来源于h77(1a)和hk6a(6a)的e2核芯纳米粒的生物化学、生物物理和抗原表征。(a)免疫亲和(ar3a)纯化之后，从superose 6 200 increase 10/300柱获得的基于fr、e2p和i3-01的hk6a e2mc3-v1纳米粒的sec谱。(b)基于fr、e2p和i3-01的hk6a e2mc3-v1纳米粒的bn-page。(c)基于fr、e2p和i3-01的hk6a e2mc3-v1纳米粒的负染色em图像。(d)h77 e2c3-v1纳米粒与12种hcv特异性抗体的elisa结合。(e)h77 e2 e2c3-v1纳米粒与12种hcv特异性抗体结合的ec
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值。(f)hk6a e2mc3-v1纳米粒与12种hcv特异性抗体的elisa结合。(g)hk6a e2mc3-v1纳米粒与12种hcv特异性抗体的ec
50
值。在(e)和(g)中，在prism中计算所有elisa图的ec
50
值，除非其中最高od
450
值低于0.1或数据拟合不明确。(h)h77 e2mc3-v1纳米粒与六种hcv特异性抗体的octet结合。(i)hk7a e2mc3-v1纳米粒与六种hcv特异性抗体的octet结合。在(h)和(i)中，使用六种浓度(对于e2mc3-v1为通过两倍稀释的3.57至0.11μm，以及对于e2mc3-v1纳米粒为通过两倍稀释的52.08至1.63nm)的滴定系列和定量生物传感器从octet red96仪器获得传感图。
26.图11示出了在第2周、第5周、第8周和第11周免疫接种期间的鼠抗体应答。(a)h77 e2mc3-v1与来自研究#1中第1、2和3组的在四个时间点分别用h77 e2mc3-v1、e2mc3-v1-10gs-fr和e2mc3-v1-10gs-e2p进行免疫接种的小鼠血清的elisa结合。(b)研究#1的小鼠血清在四个时间点与h77 e2mc3-v1结合的ec
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值。(c)hk6a e2mc3-v1或h77 e2mc3-v1与来自研究#2中第1、2和3组的在四个时间点分别用hk6a e2mc3-v1、hk6a e2mc3-v1-10gs-e2p和h77/hk6a e2mc3-v1-10gs-e2p混合物进行免疫接种的小鼠血清的elisa结合。第1和2栏：对来自用hk6a e2mc3-v1(第1组)和hk6a e2mc3-v1-10gs-e2p(第2组)进行免疫接种的小鼠的血清针对hk6a e2mc3-v1进行测试。第3和4栏：对来自用h77/hk6a e2mc3-v1-10gs-e2p混合物(第3组)进行免疫接种的小鼠的血清针对h77 e2mc3-v1(第3组)和hk6a e2mc3-v1(第4组)进行测试。(d)在四个时间点研究#2小鼠血清与hk6a或h77 e2mc3-v1结合的ec
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值。
27.图12示出了大量分选的e2mc3特异性小鼠脾b细胞的下一代测序(ngs)分析。(a)获自superdex 200 10/300柱的称为e2mc3-v1-avi-biot的生物素化avi标记的h77 e2mc3-v1的sec谱，其中峰对应于在谱上标记的生物素连接酶。(b)来自研究#1第1组和第3组的小鼠脾b细胞的h77 e2mc3-v1特异性大量分选的总结。(c)针对e2mc3-v1分选的小鼠脾b细胞获得的ngs数据的抗体组学分析。分析了来自第1组和第3组共10只小鼠的ngs数据。
28.图13示出了小鼠多克隆血清抗体应答的分析。(a)从研究#1中h77 e2mc3-v1-10gs-fr组纯化的小鼠igg对hcv h77和sa13分离株的中和。用100μg/ml的起始igg浓度和一系列三倍稀释液进行hcvpp中和测定。创建完整的中和曲线以促进不同组之间的比较。(b)前层(fl)(seq id no：56至58)和as412(seq id no：59至61)的表位特异性探针的设计。左：表位-支架设计，其显示从数据库检索获得的表位、设计的表位-支架和原始支架的序列比对(*-匹配和
·-与经改造二硫键类似)；中：设计的表位-支架的结构模型，其具有以棕褐色显示的支架骨架以及fl和as412表位。右：纳米探针的分子模型，其具有fl和as412表位。(c)来自研究#1中第1组和第3组的分别用h77 e2mc3-v1和e2mc3-v1-10gs-e2p进行免疫接种的小鼠血清与两种表位探针的elisa结合。左：elisa曲线；右：ec
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滴度总结。
具体实施方式
29.i概述
cloning techniques第152卷，s.l berger和a.r.kimmerl eds.，academic press inc.，san diego，usa(1987)；current protocols in protein science(cpps)(john e.coligan，et.al.，ed.，john wiley and sons，inc.)，current protocols in cell biology(cpcb)(juan s.bonifacino et.al.ed.，john wiley and sons，inc.)，以及culture of animal cells：a manual of basic technique by r.ian freshney，publisher：wiley-liss；第5版(2005)，animal cell culture methods(methods in cell biology，第57卷，jennie p.mather和david barnes编辑，academic press，第1版，1998)。以下部分提供了用于实施本发明的组合物和方法的另外的指导。
35.ii.定义
36.除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。以下参考文献为技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般定义：academic press dictionary of science and technology，morris(ed.)，academic press(第1版，1992)；oxford dictionary of biochemistry and molecular biology，smith et al.(eds.)，oxford university press(修订版，2000)；encyclopaedic dictionary of chemistry，kumar(ed.)，anmol publications pvt.ltd.(2002)；dictionary of microbiology and molecular biology，singleton et al.(eds.)，john wiley&sons(第3版，2002)；dictionary of chemistry，hunt(ed.)，routledge(第1版，1999)；dictionary of pharmaceutical medicine，nahler(ed.)，springer-verlag telos(1994)；dictionary of organic chemistry，kumar和anandand(eds.)，anmol publications pvt.ltd.(2002)；以及a dictionary of biology(oxford paperback reference)，martin和hine(eds.)，oxford university press(第4版，2000)。本文中提供了当这些术语中的一些具体应用于本发明时的进一步阐述。
37.如本文所用，未用数量词限定的名词是单数以及复数两种情况，除非上下文另外明确指出。例如，“env来源的三聚体”可以指单个或多个env来源的三聚体分子这两种情况，并且可以被认为等同于短语“至少一个env来源的三聚体”。
38.如本文所用，术语“抗原”或“免疫原”可互换使用，是指能够在对象中诱导免疫应答的物质，通常是蛋白质。该术语还指具有免疫活性的蛋白质，从这个意义上说，其一旦施用于对象(直接地或通过向对象施用编码该蛋白质的核苷酸序列或载体)就能够引起针对该蛋白质的体液和/或细胞类型的免疫应答。除非另有说明，否则术语“疫苗免疫原”与“蛋白质抗原”或“免疫原多肽”可互换使用。
39.术语“经保守修饰变体”适用于氨基酸和核酸序列二者。关于特定的核酸序列，经保守修饰变体是指编码相同或实质上相同的氨基酸序列的那些核酸，或在核酸不编码氨基酸序列的情况下，是指实质上相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任何给定的蛋白质。对于多肽序列，“经保守修饰变体”是指具有保守氨基酸替换的变体，即氨基酸残基被具有具类似电荷的侧链的其他氨基酸残基替代。具有具类似电荷的侧链的氨基酸残基的家族已经在本领域中定义。这些家族包括具有以下的氨基酸：碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β支化侧链(例如，
苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
40.表位是指抗原决定簇。这些是具有抗原性的分子上的特定化学基团或肽序列，以使得其引发特异性的免疫应答，例如，表位是b和/或t细胞响应的抗原区域。表位可以由连续氨基酸或通过蛋白质的三级折叠并列的非连续氨基酸形成。
41.疫苗或其他药剂的有效量足以产生期望的响应，例如减轻或消除病症或疾病(例如病毒感染)的体征或症状。例如，这可以是抑制病毒复制或可测量地改变病毒感染的外部症状所必需的量。通常，该量将足以可测量地抑制病毒(例如，hcv)的复制或感染性。当施用于对象时，通常使用将达到已显示足以对病毒复制进行体外抑制的靶浓度的剂量。在一些实施方案中，“有效量”是治疗(包括预防)任何病症或疾病的一种或更多种症状和/或根本原因(例如治疗hcv感染)的量。在一些实施方案中，有效量是治疗有效量。在一些实施方案中，有效量是防止特定疾病或病症的一种或更多种体征或症状发生(例如与hcv感染相关的一种或更多种体征或症状)的量。
42.如本文所用，融合蛋白是包含来自至少两个不相关蛋白质的氨基酸序列的重组蛋白，所述氨基酸序列已经通过肽键连接在一起以形成单个蛋白质。不相关的氨基酸序列可以彼此直接连接，或者其可以使用接头序列连接。如本文所用，如果在其天然环境中(例如，细胞内部)蛋白质的氨基酸序列通常被发现未通过肽键连接在一起，则蛋白质是不相关的。例如，细菌酶例如嗜热脂肪芽孢杆菌(b.stearothermophilus)二氢硫辛酰基酰基转移酶(dihydrolipoyl acyltransferase，e2p)的氨基酸序列和hcv e2糖蛋白的氨基酸序列被发现未通过肽键连接在一起。
43.如本文所用，“e1”是指丙型肝炎病毒上的包膜糖蛋白。e1多肽位于hcv多蛋白中紧接核芯蛋白之后对应于hcv基因型1a h77分离株多蛋白的第192至383位残基的氨基酸残基处。
44.如本文所用，hcv包膜糖蛋白2(e2)是指丙型肝炎病毒上的包膜糖蛋白。e2是具有通过两亲性的α-螺旋茎与羧基端跨膜螺旋连接的氨基端胞外结构域的i型跨膜蛋白。e2多肽位于hcv多蛋白中紧接e1多肽之后对应于hcv基因型1a h77分离株的第384至746位残基(seq id no：1)的氨基酸残基处。参见例如，goffard et al.，biochimie 85，295-301，2003。除非另有说明，否则本文提及的e2多肽还包括其截短形式，例如在其c端截短以去除跨膜结构域的可溶性形式，其保留特性(例如结合特性)；以及变体，例如来自不同hcv分离株和准种的那些变体，其包括与来自hcv基因型1a分离株h77的e2多肽(在seq id no：1中示出)具有至少40％、45％、50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同源性的多肽。
45.除非另有说明，否则e2多肽包括通过核酸翻译制备的合成分子、通过化学合成(例如包括通过重组方法连接较短多肽的合成)产生的蛋白质、从感染hcv的人和非人组织和细胞分离的蛋白质、嵌合e2多肽及其经修饰形式。e2多肽还包括具有足够长度的e2片段或部分，或包括保留全长e2多肽的至少一种特性(例如与抗e2抗体结合的能力)的适当区域。e2多肽还包括包含化学或翻译后修饰的那些和不含化学或翻译后修饰的那些。这样的修饰包括但不限于聚乙二醇化、白蛋白化、糖基化、法尼基化、羧化、羟基化、磷酸化和本领域已知的其他多肽修饰。
46.如本文所用，hcv e2胞外结构域(e2
ecto
或e2δtm)是指位于病毒膜外的e2多肽的
可溶性部分，即不包括跨膜螺旋的e2蛋白的n端部分。在原型h77分离株中，e2δtm或e2
ecto
由第384至717位氨基酸(seq id no：2)组成，并通过九个保守二硫键来稳定。它包含三个可变区，包括高变区1(hvr1，a.a.384至411)、vr2(a.a.460至484)和vr3(a.a.570至580)，并且覆盖有约11个n-连接的聚糖。如本文所用，vr2无序区是指跨越vr2的特定e2片段并且边界为两个半胱氨酸残基，这两个半胱氨酸残基形成两个二硫键以分别用于锚定到后层和β-夹心结构域。在h77分离株中，vr2无序区对应于第452至494位残基，并且两个锚定二硫键是c452至c620和c494至c564。
47.如本文所用，提及任何成熟的、经加工的hcv蛋白(例如e2)中的氨基酸位置是用相对于全长hcv多肽的编号而不是参考成熟多肽进行的。因此，例如，提及来自hcv基因型1a分离株h77的e2多肽中的第425位氨基酸对应于seq id no：1中所示成熟e2多肽的第42位。
48.如本文所用，相应的残基是指出现在比对基因座上的残基。通过本领域技术人员已知的任何方法对相关或变体多肽进行比对。这样的方法通常使匹配最大化，并且包括例如使用手动比对和通过使用大量可用比对程序(例如，blastp)的方法以及本领域技术人员已知的其他方法。通过比对多肽序列，本领域技术人员可使用保守和相同的氨基酸残基作为指导来确定相应的残基。例如，通过比对来自不同hcv分离株的e2多肽序列，本领域技术人员可使用保守和相同的氨基酸残基作为指导来确定相应的残基。相应的位置也可基于结构比对，例如通过使用计算机模拟的蛋白质结构比对。
49.如本文所用，术语“丙型肝炎病毒”或“hcv”包括不同的病毒基因型、亚型、准种和分离株。它包括具有单链和正链rna基因组的任何非细胞病变(noncytopathic)rna病毒，其属于黄病毒科(flaviviridae)的肝炎病毒(hepacivirus)属。该术语包括不同的hcv分离株，例如但不限于具有上文示出的多蛋白序列和登录号的那些，以及ncbi数据库中的任何其他。该术语所涵盖的不同基因型的实例包括但不限于基因型1、2、3、4、5和6，如simmonds et al(hepatology 42：962-973，2005)所述。提及hcv还包括已建立的任何另外的基因型的那些。不同亚型的实例包括但不限于1a、1b、1c、2a、2b、2c、2i、2k、3a、3b、3k、4a、4d、4f、5a、6a、6b、6c、6d、6e、6f、6g、6h、6i、6j、6k、61、6m、6n、6o、6q、6p和6t。该术语还包括细胞培养hcv(hcvcc)和假型hcv(hcvpp)，以及hcv准种。simmonds p.在genetic diversity and evolution of hepatitis c virus
‑‑
15 years on，j gen virol 85：3173-3188(2004)中以及simmonds et al.在consensus proposals for a unified system of nomenclature of hepatitis c virus genotypes，hepatology 42：962-973(2005)中描述了多种hcv。hcv核苷酸序列是本领域已知的。例如，参见病毒生物信息学研究中心(viral bioinfomatics research center)(hcvdb.org)和丙型肝炎病毒数据库(hcv.lanl.gov)。
50.如本文所用，免疫原是指能够在哺乳动物(例如被病原体感染或处于被病原体感染的风险之中的哺乳动物)中诱导免疫应答的蛋白质或其部分。免疫原的施用可导致针对目的病原体的保护性免疫和/或主动免疫(proactive immunity)。
51.免疫应答是指免疫系统的细胞(例如b细胞、t细胞或单核细胞)对刺激的应答。在一些实施方案中，应答对特定抗原是特异性的(“抗原特异性应答”)。在一些实施方案中，免疫应答是t细胞应答，例如cd4 应答或cd8 应答。在另一些实施方案中，应答是b细胞应答，并导致特异性抗体的产生。
52.免疫原性组合物是指包含免疫原性多肽的组合物，所述免疫原性多肽诱导针对表
达免疫原性多肽的病毒的可测量ctl应答，或诱导针对免疫原性多肽的可测量b细胞应答(例如抗体的产生)。
53.两个或更多个核酸序列或者两个或更多个氨基酸序列之间的序列同一性或相似性以序列之间的同一性或相似性表示。序列同一性可以以百分比同一性来衡量；百分比越高，序列越相同。当出于在比较窗口上或指定区域上针对最大对应性比较和比对时，如使用以下序列比较算法之一或通过手动比对和目测测量的，如果两个序列具有指定白分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即，在指定区域，或在未指定时在整个序列上，具有60％同一性，任选地65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性)，则该两个序列“实质上相同”。任选地，同一性存在于长度为至少约50个核苷酸(或10个氨基酸)的区域上，或更优选地存在于长度为100至500或者1000或更多个核苷酸(或20、50、200或更多个氨基酸)的区域上。
54.当使用标准方法比对时，核酸或氨基酸序列的同源物或直系同源物具有相对高度的序列同一性/相似性。用于比较的序列比对方法是本领域公知的。多种程序和比对算法在以下中进行了描述：smith&waterman，adv.appl.math.2：482，1981；needleman&wunsch，j.mol.biol.48：443，1970；pearson&lipman，proc.natl.acad.sci.usa 85：2444，1988；higgins&sharp，gene，73：237-44，1988；higgins&sharp，cabios 5：151-3，1989；corpet et al.，nuc.acids res.16：10881-90，1988；huang et al.computer appls.in the biosciences 8，155-65，1992；和pearson et al.，meth.mol.bio.24：307-31，1994。altschul et al.，j.mol.biol.215：403-10，1990给出了序列比对方法和同源性计算的详细考虑。
55.术语“对象”是指被分类为哺乳动物的任何动物，例如人和非人哺乳动物。非人动物的实例包括狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔等。除非另有说明，否则术语“患者”或“对象”在本文中可互换使用。优选地，对象是人。
56.术语“治疗”或“减轻”包括向对象施用化合物或药剂以阻止或延迟疾病(例如，hcv感染)的症状、并发症或生化指标的开始，减轻症状或者阻止或抑制疾病、病症或障碍的进一步发展。需要治疗的对象包括已经患有疾病或障碍的那些以及处于患疾病的风险之中的那些。治疗可以是预防性的(预防或延缓疾病的发作，或者预防其临床或亚临床症状的表现)，或是疾病表现之后症状的治疗性抑制或缓解。
57.疫苗是指在对象中引起预防性或治疗性免疫应答的药物组合物。在一些情况下，免疫应答是保护性免疫应答。通常，疫苗引起针对病原体(例如病毒病原体)的抗原或与病理状况相关的细胞成分的抗原特异性免疫应答。疫苗可包括多核苷酸(例如，编码公开的抗原的核酸)、肽或多肽(例如公开的抗原)、病毒、细胞或者一种或更多种细胞成分。在本发明的一些实施方案中，疫苗或疫苗免疫原或疫苗组合物从融合构建体表达并自组装到在表面上展示免疫原多肽或蛋白质的纳米粒中。
58.病毒样颗粒(vlp)是指来源于多种病毒中任一种的非复制性病毒壳。vlp通常由一种或更多种病毒蛋白质构成，例如但不限于被称为衣壳蛋白、外壳蛋白、壳蛋白、表面蛋白和/或包膜蛋白的那些蛋白质或者来源于这些蛋白质的颗粒形成多肽。在适当的表达系统中蛋白质的重组表达之后，vlp可以自发形成。用于产生特定vlp的方法是本领域中已知的。病毒蛋白质重组表达之后vlp的存在可以使用本领域中已知的常规技术(例如通过电子显微术、生物物理表征等)来检测。参见例如baker et al.(1991)biophys.j.60：1445-1456；
al.，nature 509：381-384，2014。
64.一般而言，本发明的重新设计的hcv e2多肽在vr2无序区和β-夹心环中包含一个或更多个修饰。原始vr2无序区包含43个残基，对应于h77分离株中的第452至494位残基cperlascrrltdfaogwgpisyangsglderpycwhypprpc(seq id no：5)。本领域已知的经改造e2c蛋白e2c和e2c3中的相应区域包含21个残基的序列cperlascgssgcwhypprpc(seq id no：6)。通常，本发明的重新设计的hcv e2多肽包含相对于本领域已知的经改造e2c蛋白e2c和e2c3进一步缩短的vr2无序区(tvr2)。在多个实施方案中，重新设计的hcv e2多肽中进一步缩短的vr2无序区(“tvr2”)包含少于约20、19、18、17、16或更少的残基。在一些优选实施方案中，tvr2包含少于约15、14、13、12或更少的残基。如重新设计的hcv e2多肽e2mc3的示例性tvr2序列cperasghyprpc(seq id no：10)所示，e2c和e2c3的vr2无序区的进一步缩短包括seq id no：6中多个残基的缺失。在一些实施方案中，本发明的重新设计的hcv e2多肽的tvr2可具有c(x)nhyprpc(seq id no：7)中所示的氨基酸序列，其中x为任意氨基酸残基，并且n在约3至约10之间。在这些实施方案中的一些中，tvr2包含如cxxxxxxhyprpc(seq id no：8)或cxxxxxhyprpc(seq id no：9)中所示的13或12个残基，其中x是任意氨基酸残基。重要的是，观察到现有技术的e2多肽(例如e2c3)不能以有意义的表达展示在纳米粒上。相比之下，本发明的重新设计的hcv e2多肽中vr2无序区的进一步修饰实现了多肽的令人满意的纳米粒展示，如本文所示例的。
65.除了缩短的长度之外，vr2无序区的修饰可另外包括序列的优化以进一步稳定hcv e2多肽。可使用基于系综的从头蛋白质设计进行tvr2序列的优化，如在例如kong et al.，nat.commun.7：12040，2016中所述。本文的实施例中还提供了通过选择随机序列、进行模拟退火和确定最低能量序列来优化tvr2序列的具体指南。在本发明的一些重新设计的hcv e2多肽中，tvr2序列来源于如seq id no：7至9中的任何一个所示的序列的优化。作为seq id no：27至38中所示的重新设计的hcv e2多肽的示例，经优化的tvr2序列可以是seq id no：65至74中的任何一个、其实质上相同的序列或经保守替换变体。
66.作为经修饰vr2无序区的补充或替代，本发明的重新设计的hcv e2多肽还包含β-夹心结构域中的修饰。如图1a所示，在线性序列hcv e2中，β-夹心结构域由第485至518位和第536至569位残基两部分构成。这两部分彼此相互作用，并形成三维结构的β-夹心结构域。该β夹心结构域由7条β链构成，其中cd81结合环(第519至535位残基)连接β链5和6之间的两部分结构域。本发明的重新设计的hcv e2多肽中β夹心结构域的修饰涉及将β-夹心结构域中β链6至7连接的β-夹心环，h77分离株e2的第540至550位残基(nntrpplgnwf；seq id no：21)。这种修饰旨在破坏e2上由非中和抗体识别的结合位点，从而使免疫应答集中于广泛中和抗体。该修饰涉及缺失形成三维结构中的尖端的β-夹心环序列中的一个或更多个残基。在h77分离株中，这些是第543至546位残基(rppl；seq id no：22)。任选地，还可以缺失一个或更多个相邻残基。因此，在多个实施方案中，β-夹心环的修饰可能涉及从第542至547位残基(trpplg；seq id no：23)中缺失1、2、3、4、5或6个残基的任何组合。在一些实施方案中，β-夹心环修饰包括缺失残基pp、rpp、ppl、rppl(seq id no：22)、trppl(seq id no：24)、rpplg(seq id no：25)或trpplg(seq id no：23)。在一些优选实施方案中，修饰涉及从β-夹心环中缺失残基rppl(seq id no：22)。
67.优选地，重新设计的hcv e2核芯多肽包含如上所述的vr2无序区的修饰和β-夹心
环的修饰二者。包含这样的修饰的重新设计的hcv e2核芯多肽的一些具体实例在seq id no：26至38中示出。如本文所示例的，虽然这些重新设计的hcv e2核芯多肽来源于不同的hcv分离株和基因型，但它们都显示出显著改善的产量和纯度，以及令人满意的免疫原性活性。除了这些特定的多肽之外，本发明的重新设计的hcv e2多肽还涵盖具有与这些序列之一实质上相同的氨基酸序列(包括经保守修饰变体序列)的多肽。在多个实施方案中，本发明的重新设计的hcv e2核芯多肽可具有与seq id no：26至38中的任何一个相同的氨基酸序列，除了不同hcv分离株或基因型之间的非保守残基的一个或更多个氨基酸残基替换，或在不同hcv分离株或基因型的e2序列的非保守区或基序中的替换。
68.如本文以分离株h77(基因型1a)和分离株hk6a(基因型6a)示例的，根据本文中所述的重新设计策略，来自多种hcv毒株的e2序列都可以容易地用于产生hcv免疫原多肽。hcv分离株被分成七种基因型和许多亚型，它们具有不同的地理分布。这些分离株中的许多分离株的e2序列是已知的。例如，可从由国家变态反应和感染性疾病研究所(national institute of allergy and infectious diseases，niaid)维护的丙型肝炎病毒数据库中获得hcv相关序列信息。虽然不同hcv分离株的e2序列之间存在相当程度的变异性，但在e2序列中已鉴定出一定数量的保守基序或中和表位。在根据本文中所述的策略重新设计具有给定hcv e2序列的e2核芯多肽时，可通过序列比对并还考虑本领域已知的保守基序来容易地确定用于修饰的适当残基。参见例如，simmonds et al.，hepatology 42：962-973，2005；wang et al.，viruses 3：2127-2145，2011；和krey et al.，plos pathog.6：e1000762，2010；bhattarai et al.，plos pathog.11：e1005183，2015；和kachko et al.，vaccine 30：69-77，2011。如本文以hk6a分离株所示例的，通过直接采用h77序列设计而不进行进一步修饰可获得来自其他分离株的重新设计的hcv e2多肽。这包括用针对h77分离株鉴定的相同经优化tvr2序列替换vr2无序区，并如本文所示例的重新设计的h77序列中一样使β-夹心环尖端中的相应残基缺失。
69.如以下所详述的，重新设计的hcv e2多肽可通过多种方式与呈递平台(例如纳米粒或vlp)缀合。优选地，缀合通过共价键实现，例如，蛋白质融合或插入。在一些优选实施方案中，蛋白质序列通过接头序列与呈递平台序列融合。在多个实施方案中，还可对重新设计的e2多肽或缀合配偶体进行其他修饰，以改善稳定性或抗原性。
70.本发明的多种重新设计的hcv e2多肽可根据本文中示例的方案或本领域公知的方法获得或产生。参见例如，sambrook et al.，molecular cloning：a laboratory manual，cold spring harbor press，n.y.，(第3版，2000)；和brent et al.，current protocols in molecular biology，john wiley&sons，inc.(ringbou ed.，2003)。在重组表达(例如，在如本文详述的hek293 f细胞中)之后，可通过任何常规操作程序纯化蛋白质。参见例如，guide to protein purification，ed.deutscher，meth.enzymol.185，academic press，san diego，1990；和scopes，protein purification：principles and practice，springer verlag，new york，1982。基本上纯化是指从其他蛋白质或细胞组分中纯化。基本上纯化的蛋白质为至少60％、70％、80％、90％、95％或98％纯。一旦纯化，重新设计的hcv e2多肽的抗原性和其他特性也可用标准方法容易地进行检查，所述标准方法例如，使用已知的bnab和非nab进行抗原分析、差示扫描量热法(dsc)、电子显微术、通过elisa进行的结合分析、生物层干涉法(bli)、表面等离子体共振(spr)，以及如本文中示例的共晶体学分
析。
71.iv.支架式hcv e2疫苗组合物
72.除了上述经改造或重新设计的hcv e2多肽之外，本发明还提供了基于hcv e2多肽的疫苗组合物，其包含呈递或并入重新设计的hcv e2蛋白的异源支架。在本发明疫苗的构建中，任何异源支架都可用于呈递重新设计的hcv e2多肽。这些包括纳米粒、病毒样颗粒、蛋白质载体(例如免疫球蛋白链或结构域例如fc、klh、bsa、破伤风类毒素和白喉类毒素)，以及多种化学支架。在一些实施方案中，可使用病毒样颗粒(vlp)例如噬菌体q
β
vlp和纳米粒。在一些优选实施方案中，用于呈递或展示重新设计的hcv e2多肽的异源支架是自组装纳米粒。多种纳米粒平台可用于产生本发明的疫苗组合物。通常来说，用于本发明的纳米粒需要由单亚基的多个拷贝形成。纳米粒通常是球样形状的，和/或具有旋转对称性(例如，具有3次对称和5次对称轴)，例如具有本文中示例的二十面体结构。作为补充或替代，颗粒亚基的氨基末端必须暴露于并紧邻3次对称轴，并且三个氨基末端的间隔必须紧密匹配hcv e2多肽的羧基末端的间隔。在一些优选实施方案中，免疫原包含具有约20nm或更小的直径和在颗粒表面上的3次对称轴的自组装纳米粒(通常由12个、24个或60个亚基组装)。
73.在一些优选实施方案中，免疫原蛋白或多肽(例如，hcv e2蛋白)呈递在自组装纳米粒上，例如来源于本文中示例的e2p、i3-01和铁蛋白(fr)的自组装纳米粒。e2p是来自嗜热脂肪芽孢杆菌的二氢硫辛酰基酰基转移酶的重新设计变体，已显示其自组装成热稳定的60聚体纳米粒。参见例如，he et al.，nat.commun.7：12041，2016。类似地，i3-01是可自组装成超稳定的纳米粒的经改造蛋白。参见例如hsia et al.，nature 535，136-139，2016。这些蛋白质的亚基序列在本领域是已知的。参见例如wo2017/192434。铁蛋白是存在于所有动物、细菌和植物中的球状蛋白质。铁蛋白的球状形式由作为分子量为约17至20kda的多肽的单体亚基蛋白质(也称为单体铁蛋白亚基)构成。如本文中示例的e2p、i3-01和铁蛋白纳米粒亚基的氨基酸序列分别显示在seq id no：39至41中。相对于原始序列，seq id no：39中所示的e2p序列在第92位残基(如以下序列中加下划线的)处包含ala替换。在多个实施方案中，本发明的hcv e2纳米粒疫苗可以使用任何这些已知的纳米粒，以及它们的经保守修饰变体或具有实质上相同(例如，至少90％、95％或99％相同)的序列的变体。
74.e2p亚基序列(seq id no：39)
[0075][0076]
i3-01亚基序列(seq id no：40)
[0077][0078]
铁蛋白序列(seq id no：41)
[0079]
[0080]
除了这些示例性的纳米粒序列外，本领域中已知的许多其他纳米粒或vlp也可用于本发明的实践中。这些包括，例如，风产液菌二氧四氢喋啶合酶、海栖热袍菌encapsulin、黄色黏球菌(myxococcus xanthus)encapsulin、噬菌体qβ病毒颗粒、兽棚病毒(flock house virus，fhv)颗粒、orsay病毒颗粒和传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus，ibdv)颗粒。可用作本发明纳米粒疫苗呈递平台的其他分子包括例如具有以下pdb id的分子：1jig(来自炭疽杆菌(bacillus anthracis)的12聚体dlp-2)、1uvh(来自耻垢分枝杆菌(mycrobacterium smegmatis)的12聚体dps)、2ygd(24聚体晶状体伴侣αb-晶体蛋白)、3cs0(24聚体degp24)、3mh6和3mh7(24聚体htra蛋白酶)、3pv2(12聚体htra同系物degq wt)、4a8c(来自大肠杆菌(e.coli.)的12聚体degq)、4a9g(来自大肠杆菌的24聚体degq)、4eve(来自幽门螺杆菌(helicobacter pylori)菌株ys29的12聚体hp-nap)和4gqu(来自结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)的24聚体hisb)。
[0081]
一些hcv e2纳米粒疫苗组合物可另外包含用于进一步增强所展示免疫原的稳定性和抗原性的其他结构组分。在一些实施方案中，例如通过与纳米粒亚基的c端共价融合，可将锁定蛋白结构域插入到纳米粒构建体中。锁定结构域可以是能够通过特定相互作用(例如疏水性(范德华力)接触、氢键和/或盐桥)形成界面的任何二聚体蛋白。本领域，例如pct2019/036917中描述了关于选择锁定结构域的一般指南和具体实例。在一些实施方案中，本发明的hcv e2纳米粒疫苗还可包含t细胞表位，以促进稳健的t细胞应答并引导b细胞向bnab发展。t细胞表位可以位于相对于其他结构组分的任何位置，只要其不影响免疫原多肽在纳米粒表面上的展示即可。本领域中已知的任何t细胞表位序列或肽均可用在本发明的实践中。其包括任何包含mhc ii类表位并且在免疫后可以有效活化cd4 和cd8 t细胞的多肽序列，例如活化cd4 t辅助细胞的t-辅助表位。参见例如，alexander et al.，immunity 1，751-761，1994；ahlers et al.，j.clin.invest.108：1677-1685，2001；fraser et al.，vaccine 32，2896-2903，2014；de groot et al.，immunol.cell biol.8：255-269，2002；和gene ther.21；225-232，2014。在一些实施方案中，本发明的hcv e2纳米粒疫苗还包含颈部区或结构域以促进免疫原在纳米粒表面上的展示。颈部区可以是来源于病毒蛋白的三螺旋束，例如亨德拉病毒结构域(pdb id：4heo)或麻疹病毒结构域(pdb id：1oks)。其通常插入在免疫原与纳米粒亚基之间，从而使免疫原多肽从纳米粒表面升高。在又一些实施方案中，本发明的纳米粒疫苗可包含用于使免疫原多肽稳定的蛋白质结构域。例如，蛋白质结构域可以是本领域中公知的t4纤维蛋白的c端三聚化基序(foldon)。该foldon结构域构成来自噬菌体t4的三聚体蛋白纤维蛋白的c端30个氨基酸残基，并用于促进纤维蛋白的折叠和三聚化。参见例如papanikolopoulou et al.，j.biol.chem.279：8991-8998，2004；和guthe et al.，j.mol.biol.337：905-915，2004。
[0082]
本发明的支架式hcv e2疫苗组合物可根据标准重组技术和本文中(例如，实施例4和8)所述的方法和/或本领域(例如，he et al.，nat.comm.7，12041，2016；kong et al.，nat.comm.7，12040，2016；和he et al.，sci adv.4(11)：eaau6769，2018)中已经描述的另一些方法来构建。在多个实施方案中，可通过将e2多肽与纳米粒的亚基(例如e2p亚基)融合来构建展示任何重新设计的hcve2多肽的纳米粒。优选地，将hcv e2多肽的c端与纳米粒亚基的n端融合。在一些实施方案中，连接的短肽可用于连接e2多肽和纳米粒，例如本文中示例的10gs接头(ggggsggggs)(seq id no：42)。一旦构建，纳米粒展示的hcv e2多肽的抗原
性和结构完整性可通过标准测定(例如抗体结合测定、生物层干涉法和负染色电子显微术(em))容易地进行分析。如本文中示例的，多种融合分子可以全部自组装成展示hcv e2多肽的免疫原性表位的纳米粒。通过引发稳健的中和抗体应答，这些纳米粒可用于为个体针对广泛的hcv病毒进行疫苗接种。
[0083]
v.多核苷酸和表达构建体
[0084]
本发明的重新设计的hcv e2多肽和纳米粒疫苗组合物通常是通过首先产生表达构建体(即表达载体)产生的，所述表达构建体包含可操作地连接的本文中所述的多种结构组分的编码序列。因此，在一些相关方面，本发明提供了基本上纯化的多核苷酸(dna或rna)，其编码如本文中所述的重新设计的hcv e2多肽和纳米粒展示的hcv e2免疫原，以及含有这样的多核苷酸的表达载体和用于产生hcv e2免疫原多肽和疫苗组合物的宿主细胞(例如，本文中示例的hek293f细胞和expicho细胞)。由多核苷酸编码或由载体表达的融合多肽也包括在本发明中。
[0085]
多核苷酸和相关载体可以通过标准分子生物学技术或本文中示例的方案容易地产生。例如，本领域例如sambrook et al.，molecular cloning：a laboratory manual，cold spring harbor press，n.y.，(第3版，2000)；和brent et al.，current protocols in molecular biology，john wiley&sons，inc.(ringbou edition，2003)中描述了用于克隆、转染、瞬时基因表达和获得稳定转染细胞系的一般方案。可以如例如以下中所述进行通过pcr向多核苷酸序列引入突变：pcr technology：principles and applications for dna amplification，h.a.erlich(ed.)，freeman press，ny，ny，1992；pcr protocols：a guide to methods and applications，innis et al.(ed.)，academic press，san diego，ca，1990；mattila et al.，nucleic acids res.19：967，1991；和eckert et al.，pcr methods and applications 1：17，1991。
[0086]
特定载体的选择取决于融合多肽的预期用途。例如，选择的载体必须能够驱动期望细胞类型中融合多肽的表达，无论该细胞类型是原核还是真核的。许多载体包含允许可操作地连接的基因序列的真核表达和原核载体复制二者的序列。可用于本发明的载体可以自主复制，即，该载体在染色体外存在，并且其复制不一定与宿主细胞基因组的复制直接联系。作为替代地，载体的复制可以与宿主染色体dna的复制联系，例如，载体可以整合到宿主细胞的染色体中，如通过逆转录病毒载体和在稳定转染的细胞系中所实现的。基于病毒的表达载体和基于非病毒的表达载体二者均可用于在哺乳动物宿主细胞中产生免疫原。非病毒载体和系统包括质粒、附加体载体(通常具有用于表达蛋白质或rna的表达盒)和人人工染色体(参见，例如，harrington et al.，nat.genet.15：345，1997)。可用的病毒载体包括：基于慢病毒或其他逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、巨细胞病毒、疱疹病毒的载体，基于sv40、乳头瘤病毒、hbp eb病毒、牛痘病毒载体和塞姆利基森林病毒(sfv)的载体。参见brent et al.，同上；smith，annu.rev.microbiol.49：807，1995；和rosenfeld et al.，cell 68：143，1992。
[0087]
取决于用于表达融合多肽的特定载体，多种已知细胞或细胞系可用于本发明的实践。宿主细胞可以是可引入携带本发明融合体的重组载体的任何细胞，并且其中允许驱动融合多肽表达的载体可用于本发明。其可以是原核的，例如许多细菌菌株中的任一种，或者可以是真核的，例如酵母或其他真菌细胞、昆虫或两栖动物细胞，或哺乳动物细胞包括例如
啮齿动物、猿猴或人细胞。表达本发明融合多肽的细胞可以是原代培养细胞或可以是已建立的细胞系。因此，除了本文中示例的细胞系(例如cho细胞)外，本领域中公知的许多其他宿主细胞系也可用于本发明的实践。这些包括例如多种cos细胞系、hela细胞、hek293、att20、bv2和n18细胞、骨髓瘤细胞系、转化的b细胞和杂交瘤。
[0088]
使用哺乳动物组织细胞培养物来表达多肽在例如winnacker，from genes to clones，vch publishers，n.y.，n.y.，1987中进行了一般讨论。可以通过本领域技术人员已知的许多合适方法中的任一种将融合多肽表达载体引入选择的宿主细胞。为了将融合多肽编码载体引入哺乳动物细胞，所使用的方法将取决于载体的形式。对于质粒载体，可以通过许多转染方法中的任一种引入编码融合多肽序列的dna，所述方法包括例如脂质介导的转染(“脂质转染(lipofection)”)、deae-葡聚糖介导的转染、电穿孔或磷酸钙沉淀。这些方法例如在上文的brent et al中有详细描述。适合于瞬时转染广泛多种转化的和未转化的或原代细胞的脂质转染试剂和方法是广泛可获得的，使得脂质转染成为将构建体引入真核尤其是培养的哺乳动物细胞的有吸引力的方法。例如，lipofectamine
tm
(life technologies)或lipotaxi
tm
(stratagene)试剂盒是可获得的。提供用于脂质转染的试剂和方法的其他公司包括bio-rad laboratories、clontech、glen research、life technologies、jbl scientific、mbi fermentas、panvera、promega、quantum biotechnologies、sigma-aldrich和wako chemicals usa。
[0089]
为了长期高产量地生产重组融合多肽，优选稳定表达。代替使用包含病毒复制起点的表达载体，可以用由适当的表达控制元件(例如启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)控制的融合多肽编码序列和选择标志物转化宿主细胞。重组载体中的选择标志物赋予对选择的抗性，并允许细胞将载体稳定整合到其染色体中。常用的选择标志物包括neo，其赋予对氨基糖苷g-418的抗性(colberre-garapin，et al.，j.mol.biol.，150：1，1981)；以及hygro，其赋予对潮霉素的抗性(santerre et al.，gene，30：147，1984)。通过适当的选择，转染的细胞可以包含融合多肽编码序列的整合拷贝。
[0090]
vi.药物组合物和治疗应用
[0091]
本发明提供了药物组合物或免疫原性组合物以及使用本文中所述的重新设计的hcv e2多肽和展示该多肽的纳米粒用于预防和治疗hcv感染的相关方法。在一些实施方案中，药物组合物中包含重新设计的hcv e2多肽或展示该多肽的纳米粒。药物组合物可以是治疗制剂或预防制剂。通常，该组合物还包含一种或更多种可药用载剂，以及任选地其他治疗成分(例如，抗生素或抗病毒药物)。组合物中也可以使用多种可药用添加剂。
[0092]
本发明的一些药物组合物是疫苗。对于疫苗组合物，还可以包含合适的佐剂。合适的佐剂的实例包括例如氢氧化铝、卵磷脂、弗氏佐剂、mpl
tm
和il-12。在一些实施方案中，本文公开的重新设计的hcv e2多肽可被配制成控制释放或时间释放制剂。这可以在包含缓释聚合物的组合物中或通过微囊化递送系统或生物黏附凝胶来实现。可根据本领域公知的标准程序制备多种药物组合物。参见例如，remington’s pharmaceutical sciences，19.sup.th ed.，mack publishing company，easton，pa.，1995；sustained and controlled release drug delivery systems，j.r.robinson，ed.，marcel dekker，inc.，new york，1978)；美国专利no.4,652,441和4,917,893；美国专利no.4,677,191和4,728,721；以及美国专利no.4,675,189。
[0093]
本发明的治疗方法涉及将本发明的重新设计的hcv e2多肽或包含该多肽的药物组合物施用于患有hcv感染或处于发生hcv感染的风险之中的对象。在一些实施方案中，本发明的药物组合物用于治疗hcv感染或在对象中引发针对hcv的保护性免疫应答的治疗或预防性应用。例如，可以将组合物施用于对象以诱导针对hcv的免疫应答，例如，诱导针对hcv的广泛中和抗体的产生。对于处于发生hcv感染的风险之中的对象，可以施用本发明的疫苗组合物以提供针对病毒感染的预防性保护。取决于具体的对象和病症，本发明的药物组合物可以通过本领域普通技术人员已知的多种施用方式例如，肌内、皮下、静脉内、动脉内、关节内、腹膜内或肠胃外途径施用于对象。通常，将药物组合物在足以预防、抑制和/或改善所选疾病或病症或者其一种或更多种症状的条件下施用于需要这样的治疗的对象持续一定时间。hcv暴露或感染的症状包括例如肝炎症、食欲下降、疲劳、腹痛、黄疸、流感样症状、瘙痒、肌肉痛、关节痛、间歇性低烧、睡眠障碍、恶心、消化不良、认知变化、抑郁性头痛和情绪变化。
[0094]
通常，以足以诱导针对hcv的免疫应答的量施用本发明的免疫原性组合物。对于治疗应用，组合物应包含治疗有效量的本文中所述的重新设计的hcv e2多肽或纳米粒疫苗组合物。对于预防应用，组合物应包含预防有效量的hcv e2多肽或展示该多肽的纳米粒。多肽免疫原或纳米粒组合物的合适的量可以基于待治疗或预防的特定疾病或病症、严重程度、对象的年龄以及特定对象的其他个人属性(例如，对象健康的总体状态和对象免疫系统的稳健性)来确定。有效剂量的确定还由动物模型研究随后进行人临床试验指导，并由显著降低对象中所靶向的疾病症状或病症的发生或严重程度的施用方案指导。
[0095]
对于预防应用，在任何症状之前(例如在感染之前)提供免疫原性组合物。免疫原性组合物的预防性施用用于预防或改善任何随后的感染。因此，在一些实施方案中，待治疗的对象是具有hcv感染或者例如由于暴露于或可能暴露于hcv而处于发生hcv感染的风险之中的对象。在施用治疗有效量的所公开的治疗组合物之后，可以监测对象的hcv感染、与hcv感染相关的症状、或二者。
[0096]
对于治疗应用，在疾病或感染的症状发作时或之后(例如在出现hcv感染的症状之后或在诊断出hcv感染之后)提供免疫原性组合物。因此，免疫原性组合物可以在预期暴露于hcv病毒之前提供以减弱预期的感染和/或相关的疾病症状的严重程度、持续时间或程度；在暴露于或怀疑暴露于病毒之后提供；或在实际感染开始之后提供。
[0097]
本发明的药物组合物可以与本领域中已知的用于治疗或预防hcv感染的其他药剂组合。这些包括：例如(1)达卡他韦(daclatasvir)，(2)艾尔巴韦(elbasvir)和格佐匹韦(grazoprevir)，(3)格拉卡匹韦(glecaprevir)和哌仑他韦(pibrentasvir)，(4)雷迪帕韦(ledipasvir)和索非布韦(sofosbuvir)，(5)奥比他韦(ombitasvir)、帕利瑞韦(paritaprevir)和利托那韦(ritonavir)，(6)西咪匹韦(simeprevir)(olysio)和索非布韦(sovaldi)，(7)索非布韦和维帕他韦(velpatasvir)(epclusa)，以及(8)索非布韦、维帕他韦和伏西瑞韦(voxilaprevir)(vosevi)。参见例如，kish et al.，p t.42：316-329，2017；和dahiya et al.，bcmj 61：72-77，2019。药物组合物和已知的抗hcv剂的施用可以同时或先后进行。
[0098]
包含本发明的重新设计的hcv e2多肽或纳米粒疫苗的药物组合物可作为药盒(kit)的组件提供。任选地，这样的药盒包含另外的组件，包括包装、说明书和多种其他试
剂，例如缓冲液、底物、抗体或配体(例如对照抗体或配体)以及检测试剂。药盒中可另外提供任选的说明书。
[0099]
实施例
[0100]
提供以下实施例以举例说明而非限制本发明。
[0101]
实施例1 hcv包膜糖蛋白e2核芯的基于结构的优化
[0102]
hcv f2胞外结构域(e2δtm或e2
ecto
)通过九个保守二硫键来稳定，包含三个可变区，其包括高变区1(hvr1，a.a.384至410)、vr2(a.a.460至485)和vr3(a.a.570至580)，并且覆盖有约11个n-连接的聚糖(参见goffard et al.，biochimie 85，295-301，2003)(图1a)。hvr1调节sr-bi相互作用并通过产生逃逸突变和屏蔽中和表位来促进宿主免疫逃避。经验工程(图6a)通过缩短n-/c-端和vr2、去除n448和n576处的聚糖(参见kong et al.，science 342，1090-1094，2013)以及另外的v3截短(参见tzarum et al.，sci adv 5，eaav1882，2019)实现了e2结构确定。e2核芯包含中心免疫球蛋白(ig)样β-夹心以及前层和后层(图6b)。cd81受体结合位点是由前层和cd81结合环形成的疏水性片，并且与e2中和面重叠(图6b，中)。然而，目前的e2c构建体仍然表现出高灵活性，涉及前层c端、缩短的vr2和β-夹心n端。
[0103]
在这里，我们重新设计了vr2无序区，其通过两个二硫键c452-c620和c494-c564锚定到后层和β-夹心(图1，a和b)。虽然该区域由野生型e2中的43个残基和e2c/e2c3中的21个残基组成，但对于h77 e2c，c452与c494之间的cα距离为(图6b)，其跨度可为仅7个残基。我们首先将vr2环手动截短到13个残基(tvr2)(图1，a和b；图6a)，并使β-夹心环(a.a.540至550)的尖端(aa 543至546)缺失以集中对bnab表位的免疫应答，因为非nab例如ar1b、e1和hepc46与该区域结合(图6，c至e)。新的e2核芯被称为e2迷你核芯3(e2mc3)。接下来，我们使用基于系综的从头蛋白质设计(参见kong et al.，nat.commun.7，12040，2016)将h77 e2mc3中的tvr2重新设计为两种环长度，13aa(如在e2mc3中)和12aa，以鉴定使e2mc3稳定的最佳tvr2序列(图1b)。对于每种tvr2长度(13和12aa)，生成环构象的系综(1,000)以连接c452和c494(图6f)，cα均方根波动(rmsf)范围分别为1.9至(平均)和1.6至(平均)(图6g)。在广泛的蒙特卡洛采样(monte carlo sampling)之后，对于每种环长度选择排名前五的序列e2mc3-v1-v5和v6-v10(图1b，右；图6h)进行进一步表征。由于hk6a e2c3和h77 e2c在与ar3bnab结合时共有高的结构相似性和无序区，我们设计了hk6a e2mc3和e2mc3-v1构建体(图6i)，没有进行进一步修饰。总共有11种h77 e2核芯和2种hk6a e2核芯进入实验评价。
[0104]
实施例2 hcv e2mc3设计的生物化学、生物物理和抗原评估
[0105]
将13种来自h77和hk6a的e2mc3构建体以及两种亲本e2c3构建体(参见tzarum et al.，sci adv 5，eaav1882，2019；和kong et al.，proc.natl.acad.sci.u.s.a.113，12768-12773，2016)在hek293f细胞中瞬时表达，并使用免疫亲和(参见kong et al.，science 342，1090-1094，2013)随后是尺寸排除色谱(sec)进行纯化。总的来说，经纯化的e2mc3变体显示出比其各自的e2c3构建体更高的产量，范围为来自1l 293f转染的5.0至11.5mg。经ar3a纯化的e2mc3主要为单体形式，具有小聚集峰(图1c和图7a)，并且经sec纯化的蛋白质在sds-page上以单条带(约50kda)运行(图1d和图7b)。然后，我们通过elisa在一组hcv抗体
上测试h77和hk6a e2mc3变体，这些hcv抗体包括靶向抗原位点412(as412)、as434、抗原区3(ar3)、ar2的(b)nab以及靶向ar1的非nab(图7c)。h77 e2mc3显示出对大多数bnab(不包括hepc3/74)和nab ar2a的结合比e2c3更大，对一些e2mc3变体具有进一步的改善(图1e，上图；图7，d和e)。如预期的，β-夹心环的截短降低了与非nab ar1b和e1的结合，对识别ar1但不识别β-夹心环的ar1a的影响忽略不计。除212.1.1外，对于hk6a e2mc3和e2mc3-v1观察到类似的模式(图1e，下图；图7，f和g)，其中没有可检测到的基因型特异性ar2a和ar1a/b结合。通过生物层干涉法(bli)，hk6a e2mc3变体显示出类似的抗原谱(图1f；图7，h至j)。差示扫描量热法(dsc)显示，相对于e2c3，e2mc3(h77)的tm提高了4.2℃，e2mc3-v1和v6分别进一步提高了1℃和0.2℃(图1g和图7k)。
[0106]
实施例3来源于h77和hk6a的最小化核芯的表征
[0107]
h77和hk6a e2核芯与来自ar3a/b/c/d bnab的fab的结晶导致分别在和处具有ar3c的h77 e2mc3-v1和e2mc3-v6的结构以及具有ar3b的hk6a e2mc3-v1的结构(图2)。e2mc3变体的总体折叠与h77 e2c和hk6a e2c3(pdb：4mwf和6bkb)(图8a)高度相似，但在与bnab ar3a-d的hcdr3相互作用的后层c端(a.a.629至640)和前层环(a.a.430至438)(图8a)上存在差异。然而，与hcdr3保持类似(亲水)接触(图8a)，进一步支持e2前层的构象可塑性。缩短的β-夹心环可在h77 e2mc3-v1与bnab ar3c的复合物中完全建模(图8b)，确认了其截短导致与非nab e1的关键相互作用丢失(图1e和图2b)。重新设计的tvr2可在bnab结合的h77和hk6a e2mc3-v1结构中完全建模，但在ar3c结合的h77 e2mc3-v6结构中仅部分可见(图2c和图9a)。tvr2的重新设计不对e2中和面引入任何构象变化(图2d)，该e2中和面通过c452至c620和c494至c564锚定到后层和β-夹心，并与截短的vr3和β-夹心相互作用(图9b)。虽然h77和hk6a e2mc3-v1构建体共有相同的tvr2序列，但构象的显著差异(图2c和图9c)可能来自于基因型1和6中相邻vr3和β-夹心环的序列和结构的差异(图8b和图9c)。当与来自具有bnab hepc3/74的基因型1的分离株1a53和1b09的最近截短的e2
ecto
结构相比时，tvr2重新设计的影响最小(图6b和图9d)。
[0108]
实施例4呈递经优化e2核芯的纳米粒的设计和表征
[0109]
最近，报道了携带包含三个全长免疫显性可变环的可溶性e2(se2，a.a.384至661)的铁蛋白纳米粒在小鼠中的免疫原性得到了改善(yan et al.，j.infect.dis.[epub ahead of print]，2019)。在这里，我们在自组装纳米粒上展示了我们的仅呈递保守bnab表位的e2mc3变体作为多价hcv疫苗候选物(图3a)。我们测试了三个纳米粒平台：24聚体铁蛋白(fr，作为对照)和60聚体e2p和i3-01，尺寸范围为24.5至37.5nm(图3b)。我们通过10-残基接头(g4s)2将e2mc3-v1的c端与纳米粒亚基的n端进行遗传融合。六种构建体在expicho或293f细胞中瞬时表达，并在ar3a柱上随后通过sec进行纯化(图3c和图10a)。对于h77，sec谱显示所有e2核芯纳米粒在24聚体与60聚体的不同模式下都有相当高的产量和纯度(图3c)。对于hk6a，纳米粒产量和纯度的降低伴随着低分子量种类的增加(图10a)，这表明h77 tvr2可能与hk6a不相容，并阻碍颗粒组装。然而，在蓝色天然page(bn-page)和负染色电子显微术(em)中观察到有效的颗粒组装(图3，d和e；图10，b和c)，以及增强的bnab与h77纳米粒的结合(ec
50
变化高至100倍)，以及没有与靶向β-夹心环的非nab的结合(图3f和图10d至g)。hk6a e2mc3-v1纳米粒表现出相似但基因型特异性的特性。在bli中，无论基因型如何，都观察到峰信号和抗原效价之间的相关性，其中60聚体＞24聚体＞e2核芯单体(图3g；图
10，h和i)，这与我们的hcv gp140纳米粒(he et al.，sci.adv.4，eaau6769，2018)一致。
[0110]
实施例5 e2核芯纳米粒比e2核芯引发更强的免疫应答
[0111]
我们使用短期方案(图4a)分别在研究#1和#2中在野生型balb/c小鼠中评估了h77和hk6a e2核芯纳米粒。n.2，如sec所示(图10a)，由于难以生产hk6a e2mc3-v1-10gs-i3-01纳米粒，未包括基于i3-01的构建体。在研究#1中，三种基于h77的疫苗在第2周时显示出e2特异性ec
50
滴度和抗原效价之间的相关性，具有显著的p值(图4b，上图；图11，a和b)。虽然e2特异性抗体滴度继续上升，但三个疫苗组之间的差异在第11周时减小。在研究#2中，我们比较了hk6a e2mc3-v1、其e2p纳米粒和hk6a/h77 e2mc3-v1 e2p纳米粒混合物(图4b，下图；图11，c和d)。hk6a e2mc3-v1 e2p组在第8周之前在抗体滴度方面保持其优势，而其h77对应物在第11周之前保持优势。在整个免疫接种过程中，e2p混合物对h77引发的滴度显著高于对hk6a引发的滴度。总体而言，e2核芯纳米粒比e2核芯诱导的抗体滴度更高，但e2仅占蛋白质质量的42％(e2p)至51％(fr)。然后，我们使用hcv假颗粒(hcvpp)评价血清中和。在研究#1中，自体中和随时间稳步提高，具有明显的时间模式(图4c，上图)。在第2周，fr组显示出h77中和最高，而e2p组出乎意料地最低(图4b，上图)。从第5周开始，fr组显示出较低的中和活性，在第11周时具有显著的p值，而e2p组在第8周和第11周时表现最好，具有统计学显著性。第11周的血清也中和了异源分离株hcv1(1a)、j6(2)和sa13(5a)，对于hcv1和j6具有显著的p值(图4c，下图)。对于组#2也观察到类似的趋势(图4d)，并且e2p混合组相当于仅hk6a的e2p组。五种hcv bnab和hcv bnab vrc01验证了hcvpp测定(图4e)。
[0112]
实施例6 e2核芯和纳米粒诱导的b细胞应答的独特模式
[0113]
我们将抗原特异性b细胞分选和抗体ngs组合以获得疫苗诱导的b细胞应答的定量读出，并确定与不同疫苗平台相关的b细胞模式(图5a)。我们使用具有c端avi标签的h77 e2mc3-v1探针(图12a)，通过流式细胞术对来自h77 e2mc3-v1和e2p纳米粒组中小鼠的e2特异性脾b细胞进行分选。观察到e2p组的e2特异性b细胞频率/数目更高，具有显著的p值(图5b和图12b)。对来自10只小鼠(每组5只)的分选的b细胞进行下一代测序(ngs)分析和组库分析(图12c)。e2p组使用的重链可变(vh)基因(5至8)明显多于e2核芯组(约1)(图5c)。e2p引发的抗体包含更多vh突变，具有0.0268的显著p值(图5d)。对于两组观察到hcdr3长度的不同模式，其中e2核芯组显示出两种主要hcdr3长度，而e2p组产生了更广泛的分布(图5e)。与e2核芯组(4.5aa与1.1aa)相比，e2p组产生了更大的平均rmsf(环长度变化的范围)，p值＜0.0001。
[0114]
实施例7 e2核芯和e2纳米粒诱导的nab靶向不同的表位
[0115]
小鼠血清包含非特异性抗病毒活性，这可能干扰hcvpp测定。我们在第11周时对来自研究#1的小鼠igg进行纯化以用于h77和sa13hcvpp的中和，起始igg为100μg/ml，随后进行一系列三倍稀释(图5f和图13a)。对于h77，虽然e2核芯组中没有小鼠血清在第一浓度下中和＞60％的病毒，但e2p组中的小鼠#9和#10显示出平稳的曲线，表明igg中存在高效的nab，对于sa13具有类似但不那么明显的趋势。未配对t检验表明，对于h77，e2p和e2核芯组之间存在显著性差异(p＜0.0001)，但对于sa13没有显著性差异(p＝0.1680)。fr组在血清中和方面排名最低，但在igg中和方面略优于e2核芯(图13a)。尽管如此，铁蛋白(fr)可能不是用于hcv纳米粒疫苗设计的最佳平台。在这里，使用两个表位特异性探针来检查针对以下两个突出的bnab表位的疫苗诱导的抗体应答：与e2中和面整合的前层(fl，a.a.421至459)
(tazrum et al.，front.immunol.9，1315，2018)和as412(图5g，中)。设计了三聚体支架来呈递fl，其通过经改造二硫键锚定到每个亚基(图13b)。这种三聚体fl支架展示在fr上。在elisa中，e2p组产生的平均ec
50
滴度为4281，而e2mc3-v1组为3044(图5g，左和图13c)。然而，未配对t检验报道两组之间的非显著p值为0.1192(图5g，左)。尽管如此，纳米粒展示改善了fl(包括抗原位点434(as434))(a.a.434至446)的识别。然后，我们使用先前设计的fr纳米粒(he et al.，sci.rep.5：12501，2015)(图13b，底部)探测as412特异性应答。在elisa中，e2p组对as412的β-发夹表现出一致、稳健的应答，平均ec
50
滴度为5584，是e2核芯组的38倍高，p值＜0.0001(图5g，右和图13c，底部)。因此，颗粒展示将应答集中在保守bnab表位上。这些表位探针也为用于评估hcv疫苗候选物的表位定位提供了有价值的工具。
[0116]
实施例8一些示例性材料和方法
[0117]
截短的vr2(tvr2)的结构设计：基于bnab ar3c结合的h77 e2c(pdb id：4mwf)的结构，将e2c中已经缩短的vr2环，即c452和c494之间的区段通过去除暴露的疏水残基和二硫键(c459至c486)手动截短，产生h77 e2mc3构建体(图6a)。截短的vr2(tvr2)由扭转空间环建模和预测程序loopy(xiang et al.，proc.natl.acad.sci.u.s.a.99：7432-7437，2002)建模。然后，使用基于系综的从头蛋白质设计方法(kong et al.，nat.commun.7：12040，2016)对tvr2进行计算重新设计，重点是c452和c494之间的肽序列perasghyprp(seq id no：62)的n端区。简而言之，使用loopy产生了11-aa(g6hyprp)(seq id no：63)或10-aa(g5hyprp)(seq id no：64)环构象的系综，以连接c452和c494。对于每种环构象，多甘氨酸(gn)区的起始序列是基于rapdf电位从50个随机序列的库中选择的(zhu et al.，proteins 65，463-479，2006)，并在温度从300k到10k线性降低的情况下进行500步蒙特卡洛模拟退火(monte carlo simulated annealing，mcsa)。记录每种环的最低能量序列，并基于过程完成时的能量对所有mcsa来源的设计进行排名。从g6和g5系综中选出前5个设计，分别命名为h77 e2mc3-v1-v5和v6-10，进行实验验证。hk6a e2mc3和e2mc3-v1构建体通过直接采用h77序列设计而不进行进一步修饰来设计。
[0118]
e2抗原的表达和纯化：所有e2核芯(e2c3、e2mc3和e2mc3v1-v10)和基于e2p的纳米粒在hek293f细胞(thermo fisher)中瞬时表达，用于生物化学、生物物理和抗原分析。简而言之，将293 f细胞解冻，并在摇床培养箱中在37℃、135rpm和8％co2下与freestyle
tm 293表达培养基(life technologies，ca)一起进行孵育。当细胞达到2.0
×
106/ml的密度时，添加表达培养基以将细胞密度降低至1.0
×
106/ml，用于用聚乙烯亚胺(pei)转染(polysciences，inc.)。接下来，将在25ml opti-mem转染培养基(life technologies，ca)中的900μg质粒与在25ml opti-mem中的5ml pei-max(1.0mg/ml)混合。孵育30分钟之后，将dna-pei-max复合物添加至1l 293f细胞。转染之后5天收获培养上清液，将其通过以1800rpm离心20分钟进行澄清并使用0.45μm过滤器(thermo scientific)过滤。如前所述(long et al.，science 342，1090-1094，2013；和tzarum et al.，sci adv 5，eaav1882，2019)，使用ar3a抗体柱从上清液中提取e2蛋白。将结合蛋白洗脱三次，每次用5ml 0.2m甘氨酸(ph＝2.2)洗脱并用0.5ml tris-碱(ph＝9.0)中和。通过在superdex 75 increase 10/300gl柱(ge healthcare)(对于e2核芯)和superose 6 10/300gl柱(ge healthcare)(对于e2p纳米粒)上进行尺寸排阻色谱(sec)对蛋白质进行进一步纯化。在expicho细胞(thermo fisher)中产生e2mc3-v1附着的铁蛋白和i3-01纳米粒。简而言之，将expicho细胞
解冻，并在摇床培养箱中在37℃、135rpm和8％co2下与expicho
tm
表达培养基(thermo fisher)一起孵育。当细胞达到10
×
106ml-1
的密度时，添加expicho
tm
表达培养基以将细胞密度降至6
×
106ml-1
用于转染。按照制造商的说明，制备expifectamine
tm cho/质粒dna复合物用于在expicho细胞中进行100-ml转染。对于这两种纳米粒，将100μg质粒和320μl expifectamine
tm cho试剂在7.7ml冷optipro
tm
培养基(thermo fisher)中混合。在第一天第一次进料之后，按照max titer方案将expicho细胞在摇床培养箱中在32℃、120rpm和8％co2下培养，并且在第五天再次进料(thermo fisher)。在转染之后13至14天收获培养上清液，将其通过以4000rpm离心20分钟进行澄清并使用0.45μm过滤器(thermo fisher)过滤。使用ar3c抗体柱从上清液中提取e2mc3附着的纳米粒，然后在superose 6 10/300gl柱上进行sec。对于e2核芯和纳米粒，使用uv
280
吸光度和理论消光系数确定蛋白质浓度。
[0119]
蓝色天然聚内烯酰胺凝胶电泳(blue native polyacrylamide gel electrophoresis，bn-page)：将hcv e2核芯纳米粒通过蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(bn-page)进行分析并用考马斯蓝进行染色。将蛋白质样品与g250负载染料混合，并添加到4至12％的bis-tris nupage凝胶(life technologies)。使用nativepage
tm
运行缓冲液(life technologies)根据制造商的说明在150v下运行bn-page凝胶2.5小时。
[0120]
酶联免疫吸附测定(elisa)：costar
tm 96孔测定板(coming)的每个孔首先包被50μl包含0.2μg适当抗原的pbs。将板在4℃下孵育过夜，然后用包含pbs和0.05％(v/v)吐温20的洗涤缓冲液洗涤五次。然后将每个孔包被150μl的封闭缓冲液，该缓冲液由pbs、20mg ml-1
印迹级封闭剂(bio-rad)和5％(v/v)fbs组成。将板在室温下与封闭缓冲液一起孵育1小时，然后用洗涤缓冲液洗涤五次。在小鼠样品分析中，将血清或血浆在封闭缓冲液中稀释50倍，并进行10倍稀释系列。对于每种样品稀释，向孔添加总共50ul体积。将每个板在室温下孵育1小时，然后用洗涤缓冲液洗涤五次。然后在洗涤缓冲液中制备1∶2000稀释的辣根过氧化物酶(hrp)标记的山羊抗小鼠igg抗体(jackson immunoresearch laboratories)，向每个孔添加50μl该稀释的二抗。将板与二抗在室温下一起孵育1小时，然后用洗涤缓冲液洗涤五次。最后，用50ul tmb(lite sciences)对孔进行显影3至5分钟，然后用50μl的2n硫酸使反应停止。在450nm波长下测量所得板读出。
[0121]
生物层干涉法(bli)：使用octet red96仪器(fort
é
bio，pall life sciences)测量e2核芯和纳米粒与hcv特异性抗体结合的动力学。所有测定均在fort
é
bio 1
×
动力学缓冲液中搅拌设定为1000rpm时进行。所有溶液的最终体积为200μl/孔。在30℃下，在实心黑色96孔板(geiger bio-one)中进行测定。将1
×
动力学缓冲液中的5μg ml-1
抗体加载到抗人fc捕获生物传感器(ahc)的表面(对于e2核芯)和抗人fc定量生物传感器(ahq)的表面(对于纳米粒)300秒。应用60秒生物传感器基线步骤，然后在溶液中分析生物传感器上的抗体与抗原的缔合，持续200秒。在六个滴定系列中使用两倍浓度梯度的抗原，对于e2核芯从3.57μm开始并且对于纳米粒从52.08nm开始，取决于尺寸。相互作用的解离持续300秒。通过减去对于负载有抗体但未与抗原孵育的传感器和对于没有抗体但与抗原孵育的传感器所记录的平均位移值，来进行基线漂移校正。通过fort
é
bio的数据采集软件v.8.1处理octet数据。实验数据用描述2∶1相互作用的结合方程拟合，以实现最佳拟合。值得注意的是，e2mc3-v1结合也使用ahq进行测量，以促进将抗体结合信号与纳米粒的比较。
[0122]
差示扫描量热法(dsc)：用microcal vp-capillary量热仪(malvern)获得hcv e2
microscopy facility)处进行。简而言之，制备浓度为0.01mg/ml的纳米粒样品。对碳包被的铜网格(400目)进行辉光放电，并将8μl的每个样品吸附2分钟。吸走多余的样品，并用2％甲酸铀酰对网格进行负染色2分钟。将多余的染料吸走，并使网格干燥。使用talos l120c透射电子显微镜(thermo fisher)在80kv下分析样品，并使用ceta 16m cmos相机获取图像。
[0127]
小鼠免疫接种和样品收集：免疫接种研究中受试的动物对象遵循机构动物护理和使用委员会(institutional animal care and use committee，iacuc)指南。八周大的balb/c小鼠购自the jackson laboratory。按照批准的iacuc协议和aaalac指南，将小鼠饲养在tsri处的环境受控室内的通风笼中。在第0周，按照制造商的说明通过肌内(i.m.)途径，用200μl抗原/佐剂混合物(包含50μg抗原和100μl addavax佐剂(invivogen))对每只小鼠进行免疫接种。在第3周、第6周和第9周时，用50μg在addavax佐剂中配制的抗原对动物进行加强免疫。在第11周时，使用肝素化毛细管将动物最终通过眶后膜放血。样品用等体积的pbs稀释，然后覆盖在15ml sepmate管(stemcell)中的4.5ml ficoll/histopaque上，并在20℃下以1200rpm旋转10分钟，以分离血浆和细胞。血浆在56℃下热灭活30分钟，在1200rpm下旋转10分钟，并进行无菌过滤。将细胞在pbs中洗涤一次，然后重悬于1ml ack红细胞裂解缓冲液(lonza)中。用pbs洗涤两轮之后，将pbmc重悬于2ml bambanker冷冻培养基(lymphotec inc.)中。还收获脾，并针对40-μm的细胞过滤器(bd falcon)进行研磨以将脾细胞释放到细胞悬液中。将细胞离心，在pbs中洗涤，按照制造商的说明用10ml rbc裂解缓冲液处理，并重悬于bambanker冷冻培养基中以用于细胞冷冻。在hcvpp中和测定中使用血清和血浆的同时，对来自研究#1中的单独小鼠(第1组、第2组和第3组中分别为9、10和10只)的80％的血清使用0.2-ml蛋白g旋转试剂盒(thermo scientific)按照制造商的说明进行纯化。使用经纯化的igg来评估hcvpp测定中的多克隆血清nab应答。
[0128]
hcv中和测定：使用hcv假型颗粒(hcvpp)测定来评估小鼠血清中疫苗诱导的抗体应答的中和活性，以及来自大量分选小鼠脾b细胞的下一代测序(ngs)分析的合成抗体。简而言之，通过用pnl4-3.lucr-e-质粒和编码e1e2基因的相应表达质粒以4∶1的比例通过聚乙烯亚胺共转染293t细胞来产生hcvpp，如bazzill et al.，nano lett.18：7832-7838，2018先前所述。使用对于小鼠血清1∶50的单一稀释和对于抗体的三种浓度(10μg/ml、1.0μg/ml和0.1μg/ml)对huh7.5细胞进行体外中和。用100μg/ml的起始igg浓度和一系列三倍稀释液确定了从研究#1中小鼠纯化的针对自体h77(1a)和异源sa13(5a)的igg的完全中和曲线。
[0129]
hcv e2特异性小鼠b细胞的大量分选：在最后一次免疫接种之后15天从经免疫接种的小鼠收获脾，并制备细胞悬液。如下对细胞进行染色：通过用fixable aqua死细胞染色试剂盒(thermo fisher l34957)染色来排除死细胞。通过添加20μl 2.4g2 mab(bd pharmigen n553142)阻断受体fcγiii(cd16)和fcγii(cd32)。然后将细胞与10μg/ml生物素化hcv e2mc3蛋白一起孵育。简而言之，通过使用生物素连接酶bira根据制造商的说明(avidity llc)对单独的经avi标记hcv e2mc3进行生物素化来产生e2mc3。通过在superdex 200柱(ge healthcare)上进行的sec去除过多的生物素。在sec谱中，avi标记的e2mc3峰集中在14.5ml，而生物素连接酶的更宽峰可在18至23ml处发现。将细胞和生物素化蛋白质在4℃下孵育5分钟，然后添加2.5μl用fitc(jackson immunoresearch 115-095-071)荧光标记的抗小鼠igg，并在4℃下孵育15分钟。最后，向细胞添加5μl优质级别藻蓝蛋白(apc)标记的
链霉亲和素，并在4℃下孵育15分钟。在每个步骤中，用dpbs洗涤细胞，并且分选缓冲液为0.5ml facs缓冲液。使用bd facsaria ii将fitc

apc

e2mc3特异性b细胞分选到具有500μl facs缓冲液的eppendorf管中。
[0130]
小鼠b细胞的下一代测序(ngs)和生物信息学分析：已报道了用于小鼠b细胞组库无偏测序的5
′
快速扩增cdna末端(race)方案。参见he et al.，sci.adv.4，eaau6769，2018；和morris et al.，mbio 8，e00036-00017，2017。在这里，该方案被应用于大量分选的e2特异性小鼠脾b细胞。简而言之，使用smart-seq v4超低输入rna测序试剂盒(takara)从每只小鼠的大量分选的脾b细胞中获得5
′‑
race cdna。免疫球蛋白pcr用platinum taq高保真dna聚合酶(life technologies)总体积为50μl，5μl的作为模板的cdna，1μl的5
′‑
race引物和1μl的10μm反向引物来建立。5
’‑
race引物包含pgm/s5p1衔接子，而反向引物包含pgm/s5a衔接子。我们采用了小鼠3
′‑cγ
1-3/3
′‑cμ
内引物和3
′‑
mc
κ
外引物作为反向引物以用于重和轻(κ)链的5
′‑
race pcr处理。共进行了25个pcr循环，并对预期的pcr产物(500至600bp)进行了凝胶纯化(qiagen)。在ion s5 genestudio系统上进行ngs。简而言之，使用带有dsdna hs测定试剂盒的2.0荧光计对来自同一小鼠的重和轻(κ)链文库进行定量，然后使用3∶1的比例混合，然后以相等的比例与其他小鼠的抗体文库合并以用于测序。使用ion 520/530 ext kit在ion chef上进行模板制备和(ion 530)芯片加载，然后在ion s5系统上使用缺省设置进行测序。使用小鼠抗体组学线路(pipeline)处理原始数据，并确定种系基因使用、体细胞超突变(shm)、种系分化和h/kcdr3环长度的分布。
[0131]
本文公开的一些序列的列表。
[0132]
e2(h77基因型1a)(seq id no：1)，hcv多蛋白第384至746位残基
[0133][0134]
e2atm(h77分离株)(seq id no：2)，hcv多蛋白第384至717位残基
[0135][0136]
e2c(h77分离株)(seq id no：3)，经改造核芯序列
[0137][0138]
(vr2无序区具有下划线)
[0139]
e2c3(h77分离株)(seq id no：4)，经改造核芯序列
[0140][0141]
(vr2无序区具有下划线)
[0142]
e2mc3(seq id no：26)，重新设计的e2核芯
[0143][0144]
(tvr2序列具有下划线)
[0145]
e2mc3变体1至10(seq id no：27至36)：分别用seq id no：11至20中所示的6aa或5aa序列替换persag(seq id no：52)基序。
[0146]
e2mc3(hk6a基因型6a)，重新设计的e2核芯(seq id no：37)
[0147][0148]
(tvr2序列具有下划线)
[0149]
e2mc3(hk6a基因型6a)变体1(seq id no：38)：
[0150][0151]
(tvr2中变化的残基具有下划线)
[0152]
e2mc3变体1至10的tvr2序列：cqnwdephyprpc(seq id no：65)、ckvnidphyprpc(seq id no：66)、cekveelhyprpc(seq id no：67)、cpdenmkhyprpc(seq id no：68)、ckreekmhyprpc(seq id no：69)、cpktevhyprpc(seq id no：70)、ckrvdihyprpc(seq id no：71)、cpsdmvhyprpc(seq id no：72)、cpneeehyprpc(seq id no：73)和ckkeirhyprpc(seq id no：74)。
[0153]
***
[0154]
因此，已参考上述代表性实施方案对本发明进行了广泛地公开和举例说明。应理解，可在不脱离本发明的精神和范围的情况下对本发明进行多种修改。
[0155]
还应注意，本文引用的所有出版物、序列登录号、专利和专利申请均通过引用整体地并出于所有目的明确地并入于此，如同各自单独地被如此指出。在与本公开内容中的定义相抵触的程度上，排除了包含在通过引用并入的文本中的定义。