一种基于放线菌素的抗菌丝素蛋白纤维、蛋白膜及应用

1.本发明涉及一种丝素蛋白，尤其是涉及一种基于放线菌素的抗菌丝素蛋白纤维、蛋白膜及应用。


背景技术：

2.伤口感染是伤口护理中最重要的问题，致病微生物的入侵会引发持续的炎症反应，并阻碍表皮组织的再生、修复和伤口愈合。一旦细菌粘附在固体表面，它们就会分泌多糖、蛋白质、糖蛋白、糖脂和细胞外dna，形成生物膜。生物膜可以保护细菌免受抗生素和免疫系统的伤害，并释放内毒素，直接破坏组织，甚至危及生命。因此，预防细菌感染和生物膜形成在伤口护理中具有重要意义。
3.丝素蛋白(silk fibroin,sf)是一种从蚕丝中提取的天然高分子纤维蛋白，具有优越的力学性能、良好的细胞相容性、可控的生物降解性以及低免疫原性。这些性质使其在生物医学领域中有着广泛的运用，如伤口敷料、组织工程和药物缓释等。因此，丝素蛋白是一种理想安全的生物医用材料。但是，丝素蛋白本身不具备抗菌、抗病毒和抗肿瘤的特性，在应用上受到了一定的限制。抗菌材料如重金属(银、硒、或锶)、抗生素(庆大霉素或万古霉素)和天然抗菌物质(如壳聚糖)已被用于防止皮肤伤口和敷料上的细菌感染和生物膜形成。但此类丝素蛋白抗菌材料存在易产生耐药性、抗菌性能不足或不可控、抗菌效率低、对环境和人体有较大副作用等局限性。
4.放线菌素，代表了一个染色体肽内酯抗生素家族，仅在分子的肽部分有所不同。迄今为止，已有30多种天然和合成类似物被描述，其中放线菌素d因其优良的抗菌、抗肿瘤和抗病毒活性而被广泛研究和应用于临床。但由于其潜在的细胞毒性，放线菌素的使用受到限制。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是提供一种具备高抗菌性能，低细胞毒，促进伤口愈合的基于放线菌素的抗菌丝素蛋白纤维、蛋白膜及应用。
6.本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一为：一种基于放线菌素的抗菌丝素蛋白纤维，该抗菌丝素蛋白纤维是由丝素蛋白通过化学共价接枝的方式负载放线菌素得到的。
7.所述的放线菌素是通过高温染色工艺共价接枝负载到丝素蛋白上的。
8.将所述的放线菌素共价接枝负载到丝素蛋白上的高温染色工艺的具体方法为：
9.步骤一：去除蚕茧上的不溶物后进行干燥，脱胶、干燥后得到丝素蛋白纤维；
10.步骤二：将丝素蛋白纤维和放线菌素一同放入染缸中经高温染色工艺得到结合有放线菌素固定化丝素蛋白纤维。
11.优选地，将所述的放线菌素负载到丝素蛋白上的染色工艺的方法为：
12.步骤一：将桑蚕茧碎片加入适量超纯水，放置于超声清洗仪中震荡洗涤，后用超纯
水冲洗，重复3次后放入60℃恒温干燥箱中进行烘干，将烘干后的蚕茧碎片放入含碳酸钠的沸腾溶液中进行脱胶处理，脱胶完成后，用超纯水冲洗以去除附着丝胶，清洗完成后放入60℃恒温干燥箱中干燥后得到丝素蛋白纤维；
13.步骤二、放线菌素和分散剂nno(亚甲基联苯磺酸钠)按质量比2：1混合并充分研磨，将丝素蛋白纤维和研磨混合后的放线菌素一同放入染缸中，用超纯水制备1：60的水浴比悬浮液，并用醋酸将染浴的ph值调节到4，在水浴比条件下，室温始染，并按1℃/min升温速率从室温升温到100℃，然后保温60min，得到放线菌素固定化丝素蛋白纤维。
14.优选地，所述的放线菌素相对于丝素蛋白纤维的重量百分比为0.05～10％。
15.优选地，将步骤二得到的放线菌素固定化丝素蛋白纤维烘干，用蒸馏水漂洗10次，再用透析袋透析2h，重复10次，充分去除游离放线菌素。这一过程充分证明了放线菌素和丝素蛋白之间的共价结合，排除了游离放线菌素可能的物理吸附。
16.优选地，所述的放线菌素为放线菌素x2或放线菌素d。
17.本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之二为：一种基于放线菌素的抗菌丝素蛋白膜，是由上述的抗菌丝素蛋白纤维制备得到的。
18.蛋白膜制备的具体方法为：
19.步骤一：去除蚕茧上的不溶物后进行干燥，脱胶、干燥后得到丝素蛋白纤维；
20.步骤二：将丝素蛋白纤维和放线菌素一同放入染缸中经高温染色工艺得到结合有放线菌素固定化丝素蛋白纤维；
21.步骤三：将放线菌素固定化丝素蛋白纤维溶解，再经过透析得到抗菌丝素蛋白水溶液。
22.步骤四：将抗菌丝素蛋白水溶液经流延法成膜，再经过恒温恒湿后处理得到不溶性抗菌丝素蛋白膜。
23.优选地，蛋白膜制备的具体方法为：
24.步骤一：将桑蚕茧碎片加入适量超纯水，放置于超声清洗仪中震荡洗涤，后用超纯水冲洗，重复3次后放入60℃恒温干燥箱中进行烘干，将烘干后的蚕茧碎片放入含碳酸钠的沸腾溶液中进行脱胶处理，脱胶完成后，用超纯水冲洗以去除附着丝胶，清洗完成后放入60℃恒温干燥箱中干燥后得到丝素蛋白纤维；
25.步骤二、将丝素蛋白纤维和放线菌素一同放入染缸中，在1：60水浴比条件下，室温始染，并按1℃/min升温速率从室温升温到100℃，然后保温60min，得到放线菌素固定化丝素蛋白纤维；
26.步骤三、将放线菌素固定化丝素蛋白纤维溶解于9.3m溴化锂溶液中，放入60℃的恒温水浴锅中溶解4～6h，后将溶解得到的抗菌丝素蛋白溶液倒入透析袋，置于超纯水中进行透析，离心，得到抗菌丝素蛋白水溶液。
27.步骤四、将得到抗菌丝素蛋白水溶液在室温下通过流延法自然晾干成膜，后放入65℃、90％相对湿度的温恒湿箱中后处理100min，得到不溶性抗菌丝素蛋白膜。
28.本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之三为：所述的基于放线菌素的抗菌丝素蛋白膜在制备创面敷料中的应用。
29.与现有技术相比，本发明的优点在于将放线菌素通过化学共价接枝的方式负载到丝素蛋白上，充分利用放线菌素所具有的抗肿瘤、抗菌、抗病毒等广泛的生物活性，使得丝
素蛋白功能化，制备出一种从纤维到蛋白膜均具备高抗菌性、低细胞毒且能够促进伤口愈合的丝素蛋白材料；放线菌素对丝素蛋白具有很好的接枝效果，当重量比为4％时，放线菌素x2对丝素蛋白的接枝率高达89.50％。此外，俩者通过化学方式牢固结合，使得制备的丝素蛋白具有稳定且持久的抑菌性能，结合放线菌素的丝素蛋白对金黄色葡萄球菌具有明显的抑制作用。当俩者重量比为0.1％时，放线菌素固定化丝素蛋白膜的抑菌率即可高达100％。此外，放线菌素菌素固定化丝素蛋白膜还可用于大鼠全层皮肤伤口愈合，相较于纯丝素蛋白膜，可有效促进伤口愈合。另外，细胞毒性试验结果显示，相较于纯放线菌素x2，放线菌素x2固定化丝素蛋白膜的细胞毒性大幅降低，细胞存活率均超过80％。放线菌素来源于海洋微生物，是一种由海洋微生物制备得到的一类色素肽类抗生素，可通过发酵培养的方式大批量生产，具有培养周期短、生产成本低、不受资源、环境限制等优点；不含任何有机化学成分，符合绿色环保的发展理念；运用不同的制作工艺，可进一步将其制作成具有抗菌性能的丝素蛋白水凝胶、海绵、纤维、微管、微球和支架等复合结构，扩展了丝素蛋白在生物医学领域中的运用。
附图说明
30.图1为本发明实施例1的不同重量比的放线菌素x2对丝素蛋白接枝前后的反应液吸光值变化结果，其中，a-d分别重量比为1％、4％、6％和8％反应液前后的吸光值变化；
31.图2是本发明实施例1的放线菌素x2(ac.x2)、物理混合(ac.x2 sf)、sf、放线菌素x2固定化丝素蛋白膜(0.1％wt—asf-0.1和10％wt—asf-10)的傅里叶变换红外(ftir)光谱；
32.图3是本发明实施例1的sf、放线菌素x2(ac.x2)和放线菌素x2固定化丝素蛋白膜(10％wt—asf-10)的
13
c cp-mas核磁共振谱；
33.图4是本发明实施例1的不同重量比放线菌素x2固定化丝素蛋白纤维的抗菌实验结果图(菌液浓度约为105cfu/ml)，其中，a为空白组，b为对照组，c-f分别为实验组1％、4％、6％和8％wt；
34.图5是本发明实施例1的不同重量比放线菌素x2固定化丝素蛋白膜的抗菌实验结果图(菌液浓度约为105cfu/ml)，其中，a为纯丝素蛋白膜组，b-d分别为实验组asf-0.05，asf-0.1和asf-0.5；
35.图6是本发明实施例1的不同重量比放线菌素x2固定化丝素蛋白膜及当量放线菌素x2共孵育24h后cck8法检测的l929细胞活力结果；
36.图7是本发明实施例1的放线菌素x2固定化丝素蛋白膜在大鼠全层皮肤缺损模型中的皮肤再生能力；
37.图8是本发明实施例2的不同重量比放线菌素d固定化丝素蛋白纤维的抗菌实验结果图(菌液浓度约为105cfu/ml)，其中，a为空白组，b为对照组，c-f分别为实验组0.1％、0.25％、1％、和2％wt。
具体实施方式
38.以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
39.以下具体实施例用来进一步说明本发明，但本发明绝非限于这些例子。下述实施
例中所用的实验材料如无特殊说明均为市购产品，实验步骤如无特殊说明均为标准步骤。
40.实施例1
41.本实施例的放线菌素x2是由采自温州南麂岛附近海域的蓝藻lyngbya sp.分离得到的蓝微褐链霉菌streptomyces cyaneofuscatus，经发酵培养、萃取、纯化等制备得到的，纯度》99％，化学结构式为：
[0042][0043]
，其中数字表示碳原子的标位。
[0044]
具体制备方法如下：
[0045]
(1)将桑蚕茧碎片后放入容器中，加入适量超纯水并置于超声清洗仪中，100hz功率震荡洗涤5min，洗涤结束后取出并用超纯水冲洗。重复3次，放入60℃恒温干燥箱中进行干燥。
[0046]
(2)将烘干的蚕茧放入0.02m碳酸钠溶液中，脱胶30～45min。脱胶完成后，取出蚕丝用超纯水冲洗以去除附着丝胶，清洗完成后放入60℃恒温干燥箱中干燥彻底，得到丝素蛋白纤维。
[0047]
(3)根据不同的重量比，将丝素蛋白纤维与放线菌素x2进行化学结合实验。具体为：
[0048]
a.按丝素蛋白纤维重量(0.5g)的1％、4％、6％和8％配置相应的含放线菌素x2的溶液(5mg、20mg、30mg和40mg)，按放线菌素x2：分散剂nno(亚甲基联苯磺酸钠)＝2：1混合并充分研磨，加超纯水制备60：1的水浴比悬浮液。用醋酸将染浴ph值调节到4。
[0049]
b.丝素蛋白纤维用水润湿后挤干，分别投入到对应反应浴中。反应过程在配有6个500毫升钢烧杯的染色装置中进行。
[0050]
c.接枝工艺为：从室温开始，每分钟升温1℃，至100℃，保温60min。反应结束后，将结合放线菌素x2的丝素蛋白纤维烘干，40℃条件下水洗多次，60℃烘干。
[0051]
d.用datacolcolor 600型分光光度计在d65光源下，10
°
标准观测仪测量放线菌素x2固定化丝素蛋白纤维的色强(k/s值)和cie l*,a*,b*。cie系统是由国际照明委员会设计的专用色彩系统。l*表示明度值(明度值越高，颜色产量越低)；a*表示红绿度( value＝红，-value＝绿)；b*表示黄-蓝( value＝黄色，-value＝蓝色)。通过反应前后的丝素蛋白纤维颜色对比，明显地，与纯丝素蛋白纤维相比，反应后的丝素蛋白纤维呈黄色，说明放线
菌素x2已经成功与丝素蛋白纤维结合。如表1所示，放线菌素x2固定化丝素蛋白纤维的k/s值随放线菌素x2比例的增加而逐渐增大。
[0052]
e.按反应的重量比单独配置一份5ml反应液作为对照组，另收集反应结束后的反应液作为实验组，测反应液前后的吸光值变化计算接枝率：
[0053]
接枝百分率(a
总
)＝(1-ei/e0)
×
100％ (1)
[0054]
式中，e0和ei分别为反应液初始od值和反应后滤液od值。放线菌素x2对丝素蛋白纤维具有很好的接枝效果，不同重量比的放线菌素x2对丝素蛋白纤维接枝前后的反应液吸光值变化结果如图1所示。当重量比为4％时，放线菌素x2对丝素蛋白的接枝率高达89.50％。
[0055]
表1不同重量比下放线菌素x2-丝素蛋白纤维样品在ph＝4，温度＝100℃反应条件下的色强、比色参数、色差(δe*)和接枝率。
[0056][0057]
(4)将放线菌素x2固定化丝素蛋白纤维溶解于9.3m溴化锂溶液中，放入60℃的恒温水浴锅中充分溶解4～6h。
[0058]
(5)将溶解得到的放线菌素x2固定化丝素蛋白溶液倒入透析袋中，置于超纯水中进行持续72h的透析以除去溴化锂，期间需磁力搅拌器持续搅拌，并在第1、4、8、12、24、36、48、60h及时更换透析液(超纯水)。
[0059]
(6)将透析得到的粗制放线菌素x2固定化丝素蛋白水溶液在9000rpm和4℃的条件下冷冻离心20min(重复2次)，去沉淀取上清，得到精制放线菌素x2固定化丝素蛋白水溶液。
[0060]
(7)将得到的精制放线菌素x2固定化丝素蛋白水溶液在室温下通过流延法自然晾干成膜，后放入65℃、90％相对湿度的温恒湿箱中后处理100min，得到不溶性抗菌丝素蛋白膜。
[0061]
(8)将得到的放线菌素x2固定化丝素蛋白膜进行傅里叶变换红外光谱和
13
c cp-mas核磁共振谱表征，以证明俩者的共价结合机制。如图2中所示，放线菌素x2和物理混合均显示出c＝o的伸缩振动峰，而纯丝素蛋白未显示出该峰；同时随着放线菌素x2含量的增加，放线菌素x2固定化丝素蛋白膜的酰胺键逐渐增加，而放线菌素x2内酯键消失，说明放线菌素x2的内酯键打开与丝素蛋白发生了酰胺反应，形成新的酰胺键。图3的固态
13
c-nmr进一步支持了放线菌素x2与sf之间的化学交联结构。如图中所示，δ＝172.92和50.17ppm处的峰归属于sf中的c＝o和ala cα。δ＝～168.74、75.69和71.61ppm处的共振峰归属于放线菌素x2中存在的thr-和meval-部分。在放线菌素x2固定化sf中，放线菌素x2的三个特征峰消失了，而在δ＝～172.43和50.35ppm处出现了两个新峰，这对应于放线菌素x2上的内酯键打开和
与sf形成新的酰胺键(-co-nh-)，证实了两者的成功共价交联。
[0062]
放线菌素x2固定化丝素蛋白纤维的抗菌活性实验
[0063]
根据《纺织品抗菌标准》(gb/t 20944.3-2008)采用振荡法进行放线菌素x2固定化丝素蛋白纤维的抗菌实验，选定的试验菌株是金黄色葡萄球菌(s.aureus,atcc 6538，革兰氏阳性)。按2cm
×
2cm真丝0.0182
±
0.0001g对放线菌素x2固定化丝素蛋白纤维称重，剪碎后，121℃20min灭菌。之后将样品放入含有约105cfu/ml细菌的pbs试管中，37℃振荡孵育18h。梯度稀释后，取1ml，用平板法接种于营养琼脂上。样品的抗菌活性以抑菌率表示：
[0064]
r(％)＝(a-b)/a
×
100％ (2)
[0065]
式中，a和b分别为未染色样品和染色样品的目视菌落数。
[0066]
结合放线菌素x2的丝素蛋白纤维对金黄色葡萄球菌具有显著抑制作用，重量比1％时，抑菌率即可高达100％。放线菌素x2固定化丝素蛋白纤维对金黄色葡萄球菌的抗菌效果如图4所示。
[0067]
放线菌素x2固定化丝素蛋白膜的抗菌活性实验
[0068]
采用改良的gb/t 31402-2015方法检测放线菌素x2固定化丝素蛋白膜对金黄色葡萄球菌的表面抗菌活性，以纯丝素蛋白膜为对照。简单地说，将50μl的细菌悬液(1
×
105cfu/ml)接种到样品(2
×
2cm)上，在37℃和90％的相对湿度下孵育18h。孵育后，用1ml pbs稀释样品，充分吹匀，使粘附的细菌重新悬浮。配制10倍系列稀释的悬浮液，将稀释后的悬浮液1ml接种到lb琼脂平板上。37℃孵育24h，计数菌落数在30～300之间。
[0069]
放线菌素x2固定化丝素蛋白膜对金黄色葡萄球菌具有显著抑制作用，重量比为0.1％时，抑菌率即可高达100％。放线菌素x2固定化丝素蛋白膜对金黄色葡萄球菌的抗菌效果如图5所示。
[0070]
放线菌素x2固定化丝素蛋白膜的体外细胞毒试验
[0071]
采用标准cck8法检测放线菌素x2固定化丝素蛋白膜对小鼠成纤维细胞l929(icell bioscience inc，上海)的细胞毒性。简单地说，将细胞(6
×
103细胞/孔)置于96孔板中，在添加10％马血清的mem高糖培养基中37℃、5％co2的湿空气培养箱培养过夜。然后，将不同重量比的放线菌素x2固定化丝素蛋白膜及当量浓度的放线菌素x2加入细胞孔中，37℃孵育24h。孵育结束后，移去培养基，加入含10％cck8的培养基，37℃孵育2h。用酶标仪测定450nm波长下的吸光度。对照组加100μl/孔完全培养液。
[0072]
细胞毒性试验结果显示，相较于纯放线菌素x2，放线菌素x2固定化丝素蛋白膜的细胞毒性大幅降低。asf-0.1和asf-0.2膜孵育24h后的细胞存活率均超过80％，说明低浓度的asf膜具有良好的生物相容性。放线菌素x2固定化丝素蛋白膜对l929的细胞毒结果如图6所示。
[0073]
放线菌素x2固定化丝素蛋白膜的体外全层伤口愈合实验
[0074]
实验动物为spf级成年雄性sd大鼠(6-8周龄，体重200
±
20g)，由上海slac实验动物有限公司提供。所有流程均在杭州研选生物科技有限公司实验动物伦理委员会的指导下进行。用组织拳和手术剪刀在大鼠背部建立两个直径为15mm的圆形缺损。将大鼠随机分为空白对照组、丝素蛋白组(sf)组和放线菌素x2固定化丝素蛋白(asf-0.1)组，每组6只。对照组用纱布覆盖创面，实验组用sf和asf-0.1蛋白膜覆盖创面，每组用3m透明粘性敷料固定。术后第0、3、7、10、14和21天，用数码相机拍摄伤口。
[0075]
放线菌素x2固定化丝素蛋白膜可有效促进皮肤创面愈合。图7中展示了对照组、丝素蛋白组和放线菌素x2固定化丝素蛋白组处理后第0、3、7、14天创面代表性图像。在每个时间点，放线菌素x2固定化丝素蛋白膜的创面愈合能力最强，创面面积在三组中最小。与对照组和丝素蛋白膜组相比，放线菌素x2固定化丝素蛋白膜能更好地促进皮肤再生和创面功能恢复，有望成为一种新型的功能性抗菌创面敷料，可供临床应用。
[0076]
实施例2
[0077]
本实施例的放线菌素d购自南京罗迈美生物科技有限公司，纯度≥98％，化学结构式为：
[0078][0079]
按重量比0.1％、0.25％、1％和2％进行放线菌素d和丝素蛋白纤维的反应结合实验，具体实施步骤同实施例1。通过反应前后的丝素蛋白纤维颜色对比，明显地，与纯丝素蛋白相比，反应后的丝素蛋白纤维呈黄色，说明放线菌素d已经成功与丝素蛋白纤维结合。如表2所示，结合放线菌素d的丝素蛋白纤维其k/s值随重量比的增加而逐渐增大。
[0080]
表2不同重量比下放线菌素d固定化丝素蛋白纤维样品在ph＝4，温度＝100℃反应条件下的色强、比色参数和色差(δe*)。
[0081][0082]
根据《纺织品抗菌标准》(gb/t 20944.3-2008)采用振荡法检测放线菌素d固定化丝素蛋白纤维的抗菌活性，具体实施步骤同实施例1。放线菌素d固定化丝素蛋白纤维对金黄色葡萄球菌具有显著抑制作用，重量比为1％时，抑菌率可达91.73％。放线菌素d固定化丝素蛋白纤维对金黄色葡萄球菌的抗菌效果如图8所示。
[0083]
上述两组实验结果证明，本发明所涉及的放线菌素不但能很好的与丝素蛋白结合，且制备的丝素蛋白纤维和蛋白膜均具有很好的抑菌性能，同时还可以促进大鼠全层皮
肤伤口愈合，可用于生物医学和功能材料领域。
[0084]
天然的放线菌素类化合物的发色团母核均为吩噁嗪酮，即2-氨基-4,6-二甲基吩噁嗪-3-酮-1,9-二羧酸。发色团c-1和c-9位通过酰胺键与两个五肽内酯环相连，其结构的多样性主要来自两个五肽内酯环上的氨基酸种类的变化。放线菌素d的两个五肽内酯中氨基酸组成及连接顺序完全相同，即l-苏氨酸(l-thr)、d-缬氨酸(d-val)、l-脯氨酸(l-pro)、肌氨酸(sar)、甲基缬氨酸(meval)；放线菌素x2的β环第3位氨基酸为4-氧代-l-脯氨酸，其余氨基酸组成和顺序与放线菌素d相同。由于放线菌素d与放线菌素x2的化学结构相近，且俩者与丝素蛋白的接枝条件一致，得到的功能化丝素蛋白纤维和蛋白膜均具有较强的抗菌效果。因此可以推论，所有具有内酯环结构的放线菌素与丝素蛋白结合，均能形成一种新型抗菌丝素蛋白并具有本发明的效果。
[0085]
以上所述仅是对本发明的优选实施例及原理进行了详细说明，对本领域的普通技术人员而言，依据本发明提供的思想，在具体实施方式上会有改变之处，而这些改变也应视为本发明的保护范围。