一种重组胶原蛋白冻干纤维及其制备方法与流程

1.本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种重组胶原蛋白冻干纤维及其制备方法。


背景技术：

[0002]ⅲ型胶原蛋白孔径较为细小，存在于表皮层和真皮层之间，称之为“婴儿胶原蛋白”，是撑起表皮的关键蛋白之一。ⅲ型胶原蛋白具有独特的结构，能够实现不同组织中对力学的不同要求，能够起到稳定、支撑，提供强度的作用，并且，其与肌肤塌陷息息相关。补充胶原蛋白可以给予含有胶原蛋白的皮肤层所必需的养分，进而使皮肤中的胶原蛋白活性加强，保持胶原纤维结构的完整性，改善皮肤细胞生存环境和促进皮肤组织的新陈代谢，增加循环。但是，现有技术中的重组胶原蛋白产品在应用过程中降解快、力学性能差、机械强度低，在使用过程中难以维持自身固有的形态，容易崩塌。并且，现有技术中的重组胶原蛋白在液体或固体制剂中还存在活性易消失的缺陷。


技术实现要素：

[0003]
针对现有技术中重组胶原蛋白在应用过程中存在的降解快、力学性能差、机械强度低等不足，本发明提供了一种重组胶原蛋白冻干纤维及其制备方法。在本发明中，将预处理后的重组胶原蛋白溶解后层析去除杂质，然后利用疏水和分子筛层析对稳定性结构胶原纯化、脱盐、浓缩和冻干得到所述重组胶原蛋白冻干纤维；所述重组胶原蛋白冻干纤维结构致密，稳定性强，耐高温，极大的保持原有的胶原蛋白活性，且所述重组胶原蛋白冻干纤维纯度大于95%，便于工业化生产，可满足三类医疗器械原料的使用。
[0004]
本发明中首先提供了一种重组胶原蛋白冻干纤维，所述重组胶原蛋白冻干纤维为白色粉末状，所述重组胶原蛋白冻干纤维成纤维状有序排列，结构致密，所述重组胶原蛋白冻干纤维的纯度高于95%。
[0005]
本发明中还提供了上述重组胶原蛋白冻干纤维的制备方法，具体包括如下步骤：步骤1：将重组胶原蛋白溶于氯化钠水溶液中，调节ph值为6.0~8.0，然后在75~85℃下进行加热；步骤2：调节加热后的溶液的ph值，接着将调节ph后的溶液通过阳离子层析洗脱纯化；步骤3：向纯化后的溶液中加入nacl，然后调节ph值，接着利用疏水层析来洗脱调节ph值后的溶液，层析结束后脱盐浓缩，最后将浓缩液冷冻干燥，得到所述重组胶原蛋白冻干纤维。
[0006]
进一步的，步骤1中，所述重组人源胶原蛋白为重组iii型人源胶原蛋白，所述重组iii型人源胶原蛋白全长474个氨基酸，其中第1～229个氨基酸和第233～461个氨基酸为相同的片段，两段氨基酸片段之间由eft连接，第233～461的氨基酸片段后采用dhhhhhhtglarf进行修饰；所述重组iii型人源胶原蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
[0007]
进一步的，步骤1中，所述重组人源胶原蛋白在氯化钠水溶液中的浓度为50~80 mg/ml；所述氯化钠水溶液的浓度为48~52 mmol/l。
[0008]
进一步的，步骤1中，所述加热时间为15~20min。
[0009]
进一步的，步骤2中，所述ph值采用0.1mol/l盐酸调ph至4.0~5.0，调节完ph值后用0.22
ꢀµ
m膜过滤。
[0010]
进一步的，步骤2中，所述阳离子交换层析柱洗脱纯化的具体步骤为：先用流动相a平衡层析柱，电导和ph值稳定后上样，用流动相a平衡层析柱，再用流动相a和30%流动相b进行洗杂，待杂质峰完全洗出后，用流动相a和60%流动相b洗脱重组胶原蛋白。
[0011]
优选的，所述流动相a为ph为4.0 、浓度40 ~60 mm 的甘氨酸（gly）溶液；流动相b为gly和nacl的混合溶液，所述混合溶液中，gly的浓度为40~60 mm，nacl的浓度为0.4~0.6mol/l，该混合溶液的ph为4.0。
[0012]
进一步的，步骤3中，所述nacl的终浓度为为0.8~1.2mol/l， 所述ph调节用0.1mol/l盐酸调ph值至4.0~5.0，调节完后用0.22
ꢀµ
m膜过滤。
[0013]
进一步的，步骤3中，所述疏水层析的步骤为：将调节完ph值的溶液加入疏水层析柱，然后用流动相a平衡层析柱，再用流动相a和40%流动相b进行洗杂，待杂质峰完全洗出后，用流动相b进行洗脱重组胶原蛋白。
[0014]
优选的，所述流动相a为gly和nacl的混合溶液，所述混合溶液中，gly的浓度为40 ~60 mm，nacl的浓度为0.4~0.6 mol/l，该混合溶液的ph为4.0；流动相b为ph为4.0、浓度40 ~60 mm 的gly溶液。
[0015]
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明通过对胶原蛋白原料热处理，去除不稳定片段，保留完整的胶原蛋白产品结构。在本发明中通过采用75~85℃制备得到的重组胶原蛋白冻干纤维纯度高，稳定性好，结构致密，更耐高温。当加热温度过低时不完整结构的胶原蛋白片段得以保留，而温度过高又会把完整片段的胶原蛋白结构进行了破坏，不利于后续胶原蛋白纤维的组装。此外，本发明中对胶原蛋白进行了ph调节使得胶原蛋白片段进行初步组装成有结构的冻干纤维。过酸或者过碱性，容易破坏完整的胶原蛋白片段，不利于蛋白纤维结构的组装。而 ph调至6.0～8.0制备得到的重组胶原蛋白冻干纤维纯度高，稳定性好，结构致密，更耐高温。
[0016]
本发明中，利用层析纯化和冻干工艺，将组装得到的有结构的冻干纤维制备成无菌重组胶原蛋白冻干纤维，解决了传统重组胶原蛋白不稳定，容易降解，活性难以保持的问题。此外该胶原蛋白冻干纤维结构致密，稳定性强，耐高温，极大的保持了原有胶原蛋白的活性且纯度大于95%。
[0017]
传统重组胶原蛋白稳定性差，作为医疗器械原材料容易降解，纯度较低难以满足使用需求，本发明所述制备胶原蛋白冻干纤维的方法简单，便于操作，适合工业化生产，在医学美容、生物医药等领域有巨大的应用前景。
附图说明
[0018]
图1为重组胶原蛋白冻干纤维实物图。
[0019]
图2为重组胶原蛋白冻干纤维的电泳图。
[0020]
图3为重组胶原蛋白冻干纤维扫描电镜图。
[0021]
图4为重组胶原蛋白冻干纤维加热后的电泳图。
[0022]
图5为不同温度下制备的重组胶原蛋白冻干纤维的电泳图。
[0023]
图6为不同ph条件下制备的重组胶原蛋白冻干纤维的电泳图。
[0024]
图7两条泳道均为对比例1中制备得到的重组胶原蛋白冻干纤维加热后的电泳图。
[0025]
图8两条泳道均为对比例2中制备得到的重组胶原蛋白冻干纤维加热后的电泳图。
具体实施方式
[0026]
下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。本发明实施例中所采用的重组iii型人源胶原蛋白来自专利201310033299.6中制备的重组iii型人源胶原蛋白，也可采用其他市售的重组胶原蛋白。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0027]
实施例1：步骤1：选用重组iii型人源胶原蛋白，用浓度为50 mmol/l氯化钠溶液进行溶解，使其重组胶原蛋白的浓度为50 mg/ml，ph调至6.0进行体外组装，然后在75℃加热20 min。
[0028]
所述重组iii型人源胶原蛋白全长474个氨基酸，其中1～229和233～461为相同的人ⅲ型胶蛋白原片段，两段人ⅲ型胶原蛋白片段之间有eft连接，233～461的人ⅲ型胶蛋白原片段后采用dhhhhhhtglarf进行修饰；所述重组iii型人源胶原蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
[0029]
seq id no.1：agntgapgspgvsgpkgdagqpgekgspgaqgppgapgplgiagitgarglagppgmpgprgspgpqgvkgesgkpganglsgergppgpqglpglagtagepgrdgnpgsdglpgrdgspggkgdrgengspgapgapghpgppgpvgpagksgdrgesgpagpagapgpagsrgapgpqgprgdkgetgergaagikghrgfpgnpgapgspgpagqqgaigspgpaeftagntgapgspgvsgpkgdagqpgekgspgaqgppgapgplgiagitgarglagppgmpgprgspgpqgvkgesgkpganglsgergppgpqglpglagtagepgrdgnpgsdglpgrdgspggkgdrgengspgapgapghpgppgpvgpagksgdrgesgpagpagapgpagsrgapgpqgprgdkgetgergaagikghrgfpgnpgapgspgpagqqgaigspgpadhhhhhhtglarf。
[0030]
步骤2：阳离子层析：（1）流动相a: 50 mm gly （盐酸调ph至4.0）；流动相b:50 mm gly 0.5 mol/l nacl（盐酸调ph至4.0）；层析柱：ge 强阳离子层析柱。
[0031]
（2）样品处理：步骤1中加热后的溶液用0.1 mol/l盐酸调ph至4.0，用0.22
ꢀµ
m膜过滤。
[0032]
（3）纯化工艺路线：设置波长a225，先用流动相a平衡层析柱，待电导和ph稳定后上样，然后用流动相a平衡层析柱，再用流动相a 30%流动相b进行洗杂，待杂质峰完全洗出后，用流动相a 60%流动相b进行洗脱，收集洗脱的后的蛋白溶液，备用。
[0033]
洗脱结束后，用0.5 mol/l 氢氧化钠清洗和再生层析柱。
[0034]
步骤3：疏水层析：（1）流动相a:50
±
5 mm gly 1.0mol/l nacl（盐酸调ph至4.5）；
流动相b:50
±
5 mm gly（盐酸调ph至4.5）；层析柱：ge疏水层析柱。
[0035]
（2）样品处理：在步骤2中收集的洗脱的后的蛋白溶液中加入1.0 mol/l nacl，溶解后，用0.1 mol/l盐酸调ph至4.5，用0.22 um膜过滤；（3）纯化工艺路线：设置波长a225，先用流动相a平衡层析柱，待电导和ph稳定后。上样，然后用流动相a平衡层析柱，再用流动相a 40%流动相b进行洗杂，待杂质峰完全洗出后，用流动相b洗脱，收集洗脱的后的蛋白溶液，备用。
[0036]
洗脱结束后，用0.5 mol/l 氢氧化钠清洗和再生层析柱。
[0037]
步骤4：将步骤3中收集的洗脱的后的蛋白溶液经过g25分子筛层析对胶原蛋白进行脱盐和浓缩，冷冻干燥后得到重组胶原蛋白冻干纤维。
[0038]
所述重组胶原蛋白冻干纤维如图1所示，从图中可以看出，重组胶原蛋白冻干纤维呈白色粉末状。
[0039]
本实施例中对制备得到的组胶原蛋白冻干纤维进行了纯度检测，具体检测方法为：采用sds-page进行蛋白分离，然后用考马斯亮蓝进行蛋白染色。检测结果如图2所示。图2为重组胶原蛋白冻干纤维的电泳图，从图中可以看出，得到的胶原蛋白冻干纤维单一成分，纯度高达95%以上，远优于现有技术得到的产品。
[0040]
图3为重组胶原蛋白冻干纤维扫描电镜图。从图中可以看出，成纤维状有序排列，结构致密。
[0041]
本实施例中还分别将制备得到的重组胶原蛋白冻干纤维进行60℃，70℃，80℃，90℃加热1小时处理，来考察制备得到的重组胶原蛋白冻干纤维的热稳定性，考察结果如图4所示。
[0042]
图4为重组胶原蛋白冻干纤维经加热后的电泳图，从图中可以看出，制备得到的重组胶原蛋白冻干纤维保持稳定，电泳条带单一，未发生纤维断裂和降解情况。
[0043]
实施例2：步骤1：选用重组iii型人源胶原蛋白，用浓度为52 mmol/l氯化钠溶液进行溶解，使其重组胶原蛋白的浓度为80 mg/ml，ph调至7.0进行体外组装，然后在80℃加热15 min。
[0044]
步骤2：阳离子层析：（1）流动相a: 50 mm gly （盐酸调ph至5.0）；流动相b:50 mm gly 0.5m nacl（盐酸调ph至5.0）；层析柱：ge强阳离子层析柱。
[0045]
（2）样品处理：样品处理：步骤1中加热后的溶液用0.1m盐酸调ph至4.0，用0.22
ꢀµ
m膜过滤。
[0046]
（3）纯化工艺路线：设置波长a225，先用流动相a平衡层析柱，待电导和ph稳定后上样，然后用流动相a平衡层析柱，再用流动相a 30%流动相b进行洗杂，待杂质峰完全洗出后，用流动相a 60%流动相b进行洗脱，收集洗脱的后的蛋白溶液，备用。
[0047]
洗脱结束后，用0.5 mol/l 氢氧化钠清洗和再生层析柱。
[0048]
步骤3：疏水层析：（1）流动相a:50 mm gly 1.0 mol/l nacl（盐酸调ph至5.5）；流动相b:50 mm gly（盐酸调ph至5.5）；
层析柱：ge疏水层析柱。
[0049]
（2）样品处理：在步骤2中收集的洗脱的后的蛋白溶液中加入1.0 mol/l nacl，溶解后，用0.1 mol/l盐酸调ph至4.5，用0.22 um膜过滤。
[0050]
（3）纯化工艺路线：设置波长a225，先用流动相a平衡层析柱，待电导和ph稳定后。上样，然后用流动相a平衡层析柱，再用流动相a 40%流动相b进行洗杂，待杂质峰完全洗出后，用流动相b洗脱，收集洗脱的后的蛋白溶液，备用。
[0051]
洗脱结束后，用0.5mol/l 氢氧化钠清洗和再生层析柱。
[0052]
步骤4：将步骤3中收集的洗脱的后的蛋白溶液经过g25分子筛层析对胶原蛋白进行脱盐和浓缩，冷冻干燥后得到重组胶原蛋白冻干纤维。
[0053]
实施例3：步骤1：选用重组iii型人源胶原蛋白，用浓度为48mmol/l氯化钠溶液进行溶解，使其重组胶原蛋白的浓度为65 mg/ml，ph调至8.0进行体外组装，然后在77℃加热18 min。
[0054]
步骤2：阳离子层析：（1）流动相a: 50
±
5 mm gly （盐酸调ph至5.0）；流动相b:50
±
5 mm gly 0.5 mol/l nacl（盐酸调ph至5.0）；层析柱：ge强阳离子层析柱（2）样品处理：样品处理：步骤1中加热后的溶液用0.1m盐酸调ph至4.0，用0.22
ꢀµ
m膜过滤。
[0055]
（3）纯化工艺路线：设置波长a225，先用流动相a平衡层析柱，待电导和ph稳定后上样，然后用流动相a平衡层析柱，再用流动相a 30%流动相b进行洗杂，待杂质峰完全洗出后，用流动相a 60%流动相b进行洗脱，收集洗脱的后的蛋白溶液，备用。
[0056]
洗脱结束后，用0.5 mol/l 氢氧化钠清洗和再生层析柱。
[0057]
步骤3：疏水层析：（1）流动相a:50
±
5 mm gly 1.0 mol/l nacl（盐酸调ph至5.5）；流动相b:50
±
5 mm gly（盐酸调ph至5.5）；层析柱：ge疏水层析柱。
[0058]
（2）样品处理：在步骤2中收集的洗脱的后的蛋白溶液中加入1.0 mol/l nacl，溶解后，用0.1 mol/l盐酸调ph至4.5，用0.22 um膜过滤；（3）纯化工艺路线：设置波长a225，先用流动相a平衡层析柱，待电导和ph稳定后。上样，然后用流动相a平衡层析柱，再用流动相a 40%流动相b进行洗杂，待杂质峰完全洗出后，用流动相b洗脱，收集洗脱的后的蛋白溶液，备用。
[0059]
洗脱结束后，用0.5m 氢氧化钠清洗和再生层析柱。
[0060]
步骤4：将步骤3中收集的洗脱的后的蛋白溶液经过g25分子筛层析对胶原蛋白进行脱盐和浓缩，冷冻干燥后得到重组胶原蛋白冻干纤维。
[0061]
实施例4：本实施例中通过改变重组胶原蛋白冻干纤维制备过程中的加热温度来探讨不同温度对制备的重组胶原蛋白冻干纤维的纯度影响，具体考察步骤如下所示：将实施例1中的步骤1中的加热温度分别调整为60℃、65℃、75℃、80℃、85℃和90℃，其他条件同实施例1中的步骤1。步骤2~4的制备步骤与实施例1中相同，分别得到在不同
温度下制备的重组胶原蛋白冻干纤维。
[0062]
考察上述得到的重组胶原蛋白冻干纤维的电泳情况，考察结果如图5所示。从图5中可以看出，温度60℃、65℃和90℃制备得到的重组胶原蛋白冻干纤维纯度很低，不稳定，这是因温度较低，不完整结构的胶原蛋白片段得以保留，温度较高把完整片段的胶原蛋白结构进行了破坏，不利于后续胶原蛋白纤维的组装。而在75℃~85℃制备得到的重组胶原蛋白冻干纤维纯度高，稳定性好，结构致密，更耐高温。
[0063]
实施例5：本实施例中通过改变重组胶原蛋白冻干纤维制备过程中的ph值来探讨ph值对制备的重组胶原蛋白冻干纤维的纯度影响，具体考察步骤如下所示：将实施例1中的步骤1中的ph值分别调整3.5、4.5、5.5、6、7、8、8.5、9和10，其他条件同实施例1中的步骤1。步骤2~4的制备步骤与实施例1中相同，分别得到在不同ph值下制备的重组胶原蛋白冻干纤维。
[0064]
考察上述得到的重组胶原蛋白冻干纤维的电泳情况，考察结果如图6所示。从图6中可以看出，ph值为8~10和ph值为3.5~5.5制备得到的重组胶原蛋白冻干纤维纯度很低，不稳定，这是因为过酸或者过碱性，容易破坏完整的胶原蛋白片段，不利于蛋白纤维结构的组装。而 ph调至6.0～8.0制备得到的重组胶原蛋白冻干纤维纯度高，稳定性好，结构致密，更耐高温。
[0065]
综上所述，在重组胶原蛋白冻干纤维的制备过程中，将ph调至6.0～8.0进行体外自组装，然后在75℃~85℃加热15 min~20 min能够得到纯度高，稳定性好的重组胶原蛋白冻干纤维。
[0066]
对比例1：本对比例中在不采用实施例1中步骤1加热和调节ph值的操作步骤，仅仅利用步骤2~4中的操作步骤制备得到了重组胶原蛋白冻干纤维，具体操作步骤如下所示：步骤1：选用重组iii型人源胶原蛋白，用浓度为50 mmol/l氯化钠溶液进行溶解，使其重组胶原蛋白的浓度为50 mg/ml。
[0067]
步骤2：阳离子层析：（1）流动相a: 50 mm gly （盐酸调ph至4.0）；流动相b:50 mm gly 0.5mol/l nacl（盐酸调ph至4.0）；层析柱：ge 强阳离子层析柱（2）样品处理：步骤1中得到的溶液用0.1mol/l盐酸调ph至4.0，用0.22
ꢀµ
m膜过滤。
[0068]
（3）纯化工艺路线：设置波长a225，先用流动相a平衡层析柱，待电导和ph稳定后上样，然后用流动相a平衡层析柱，再用流动相a 30%流动相b进行洗杂，待杂质峰完全洗出后，用流动相a 60%流动相b进行洗脱，收集洗脱的后的蛋白溶液，备用。
[0069]
洗脱结束后，用0.5m 氢氧化钠清洗和再生层析柱。
[0070]
步骤3：疏水层析：（1）流动相a:50
±
5 mm gly 1.0m nacl（盐酸调ph至4.5）；流动相b:50
±
5 mm gly（盐酸调ph至4.5）；层析柱：ge疏水层析柱（2）样品处理：在步骤2中收集的洗脱的后的蛋白溶液中加入1.0 mol/l nacl，溶
解后，用0.1 mol/l盐酸调ph至4.5，用0.22 um膜过滤；（3）纯化工艺路线：设置波长a225，先用流动相a平衡层析柱，待电导和ph稳定后。上样，然后用流动相a平衡层析柱，再用流动相a 40%流动相b进行洗杂，待杂质峰完全洗出后，用流动相b洗脱，收集洗脱的后的蛋白溶液，备用。
[0071]
洗脱结束后，用0.5m 氢氧化钠清洗和再生层析柱。
[0072]
步骤4：将步骤3中收集的洗脱的后的蛋白溶液经过g25分子筛层析对胶原蛋白进行脱盐和浓缩，冷冻干燥后得到重组胶原蛋白冻干纤维。
[0073]
图7中两条泳道均为对比例1中制备得到的重组胶原蛋白冻干纤维加热后的电泳图。从图中可以看出，不进行加热或调节ph，得到的胶原蛋白弥散，且结构遭到破坏稳定性差。
[0074]
对比例2：本对比例中，仅仅采用阳离子层析来纯化加热和调节ph处理后的重组胶原蛋白溶液，具体步骤如下所示：步骤1：选用重组iii型人源胶原蛋白，用浓度为50 mmol/l氯化钠溶液进行溶解，使其重组胶原蛋白的浓度为50 mg/ml，ph调至6.0进行体外组装，然后在75℃加热20 min。
[0075]
步骤2：阳离子层析：（1）流动相a: 50 mm gly （盐酸调ph至4.0）；流动相b:50 mm gly 0.5 mol/l nacl（盐酸调ph至4.0）；层析柱：ge 强阳离子层析柱。
[0076]
（2）样品处理：步骤1中加热后的溶液用0.1 mol/l盐酸调ph至4.0，用0.22
ꢀµ
m膜过滤。
[0077]
（3）纯化工艺路线：设置波长a225，先用流动相a平衡层析柱，待电导和ph稳定后上样，然后用流动相a平衡层析柱，再用流动相a 30%流动相b进行洗杂，待杂质峰完全洗出后，用流动相a 60%流动相b进行洗脱，收集洗脱的后的蛋白溶液，备用。
[0078]
洗脱结束后，用0.5 mol/l 氢氧化钠清洗和再生层析柱。
[0079]
步骤3：将步骤2中收集的洗脱的后的蛋白溶液浓缩，冷冻干燥后得到重组胶原蛋白冻干纤维。
[0080]
图8中两条泳道均为对比例2中制备得到的重组胶原蛋白冻干纤维加热后的电泳图。从图中可以看出，仅仅采用阳离子层析纯化重组胶原蛋白，会有一个杂质片段无法分开，不能得到高纯的胶原蛋白冻干纤维。
[0081]
所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。