一种短肽及以其为载体材料的具有长效镇痛或/和长效局部麻醉作用的缓释制剂

surgery,2020 dec 2.doi:10.1097/sla.0000000000004424；am j obstetgynecol,2018,219(5):500.e1-.e8；am j obstetgynecol,2021,224(1):70.e1-.e11)。并且，脂质体的制备比较复杂，稳定性较差，临床推广应用成本较高。
6.因此，亟需开发一种生物相容性好且制备简单的载体材料作为局部麻醉药物的递药系统，以实现长效镇痛或长效局部麻醉的作用。


技术实现要素：

7.为了解决现有局部麻醉药物缓释制剂所使用的高分子材料降解缓慢且毒性较大、延长镇痛效果不显著、制剂制备复杂等问题，本发明提供了一种自组装短肽，以及以该自组装短肽为载体材料的局部麻醉药物缓释递药系统及其制备方法。
8.本发明具体提供了一种短肽，它的氨基酸序列如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7或seq id no.8所示。
9.本发明还提供了一种纳米结构载体，它是由一种或两种以上的上述短肽在水性溶液中自组装得到的。
10.进一步地，所述水性溶液为水或缓冲溶液，所述缓冲溶液优选为磷酸盐缓冲液。
11.进一步地，所述水性溶液的ph值为7.4-8.0。
12.本发明还提供了上述短肽或上述纳米结构载体在制备局部麻醉药物的药物载体中的用途。
13.本发明还提供了一种局部麻醉药物缓释制剂，它是以局部麻醉药为活性成分，以上述短肽或上述纳米结构载体为药物载体制得的制剂。
14.进一步地，所述局部麻醉药为酰胺类局部麻醉药或酯类局部麻醉药。
15.进一步地，所述酰胺类局部麻醉药或酯类局部麻醉药为布比卡因碱、罗哌卡因碱、利多卡因碱、甲哌卡因碱、丙胺卡因碱、丁卡因碱、普鲁卡因碱、布比卡因的盐、罗哌卡因的盐、利多卡因的盐、甲哌卡因的盐、丙胺卡因的盐、丁卡因的盐、普鲁卡因的盐中的一种或者两种以上。
16.进一步地，所述盐为盐酸盐。
17.进一步地，所述制剂是固体制剂或液体制剂。
18.进一步地，所述固体制剂为冻干粉剂，所述液体制剂为注射制剂。
19.进一步地，所述液体制剂中，局部麻醉药的浓度为1.0-200mg/ml，药物载体的浓度为1mm-10mm。
20.进一步地，所述液体制剂中，局部麻醉药的浓度为7.5-120mg/ml，药物载体的浓度为5mm。
21.进一步地，所述液体制剂的ph值为6.0-9.0。
22.进一步地，所述液体制剂的ph值为6.0-8.5。
23.进一步地，所述液体制剂的ph值为6.0-7.0。
24.本发明还提供了一种制备上述局部麻醉药物缓释制剂的方法，所述方法包括以下步骤：
25.将药物载体在水性溶液中溶解，得到药物载体溶液，然后加入局部麻醉药，混合均匀，用ph调节剂调节ph至目标值，即得。
26.进一步地，所述水性溶液为水或缓冲溶液，所述缓冲溶液优选为磷酸盐缓冲液。
27.进一步地，所述药物载体溶液的ph值为7.0。
28.本发明中，pb缓冲液指磷酸盐缓冲液。
29.本发明的短肽序列中，“ac”指乙酰基。
30.布比卡因碱又称布比卡因，罗哌卡因碱又称罗哌卡因，利多卡因碱又称利多卡因，甲哌卡因碱又称甲哌卡因，丙胺卡因碱又称丙胺卡因，丁卡因碱又称丁卡因，普鲁卡因碱又称普鲁卡因。与现有的局部麻醉药物载体材料相比，本发明提供的短肽具有以下优势：
31.目前用作局部麻醉药物缓释制剂载体的材料主要包括脂质体、微球、水凝胶、固体脂质以及前述材料结合的复杂体系。这些材料在体内降解较慢，存在一定的毒性，并且制备工艺复杂、成本较高。本发明提供的短肽是一类由天然氨基酸构成的短肽分子，在氢键、疏水作用、π-π堆积等非共价作用力的驱动下可在水溶液中自组装成多种纳米结构，其具有良好的生物安全性。
32.目前临床上使用的局部麻醉药物盐溶液存在毒性大、作用时间短的问题。以本发明的短肽为载体材料的局部麻醉药物缓释制剂具有以下优势：
33.1.本发明的局部麻醉药物缓释制剂药物负载量大、包封率高；
34.2.本发明的局部麻醉药物缓释制剂具有优异的神经阻滞作用，有效作用时间明显延长；
35.3.本发明的局部麻醉药物缓释制剂稳定性好，在长时间保存后仍然能显著延长镇痛作用时间；
36.4.本发明的局部麻醉药物缓释制剂毒性和副作用低，具有优良的全身安全性和局部安全性；
37.5.本发明的局部麻醉药物缓释制剂制备方法简单，在纳米生物医药领域具有很好的应用前景。
38.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
39.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
40.图1：5mm gqy短肽纳米粒载体溶液的外观图片及透射电镜图。
41.图2：gqy载不同浓度布比卡因碱体系的外观图。
42.图3：gqy载罗哌卡因碱体系的外观图。
43.图4：gqy载甲哌卡因碱体系的外观图。
44.图5：5mm gqy-ac短肽纳米粒载体溶液、gqy-ac包载罗哌卡因碱体系gqy-ac包载布比卡因碱体系的外观图。
45.图6：yq5t包载普鲁卡因碱体系的外观图。
46.图7：g2yq4yg2包载利多卡因碱体系的外观图。
47.图8：gq5yg及包载布比卡因碱体系的外观图。
48.图9：gqy载不同浓度布比卡因碱体系的扫描电镜图。
49.图10：gqy载布比卡因碱体系的xrd图谱。
50.图11：gqy载不同浓度布比卡因碱体系的体外释放曲线。
51.图12：gqy载布比卡因碱体系坐骨神经阻滞模型感觉阻断时长。
52.图13：gqy载布比卡因碱体系坐骨神经阻滞模型运动阻断时长。
53.图14：gqy载不同浓度布比卡因碱体系坐骨神经阻滞后血浆药时曲线。
54.图15：gqy载不同浓度布比卡因碱体系snb给药后4天解剖大体观及he染色。
55.图16：gqy载不同浓度布比卡因碱体系snb给药后14天解剖大体观及he染色。
具体实施方式
56.本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
57.实施例1：合成本发明的短肽
58.采用常规多肽固相合成法合成，分别合成以下短肽。所得短肽纯度均大于98％。
59.1.gqy短肽
60.序列为gly-gln-gln-gln-gln-gln-tyr(seq id no.1)。
61.2.gqy-ac短肽
62.序列为ac-gly-gln-gln-gln-gln-gln-tyr(seq id no.2)。
63.3.yq5t短肽
64.序列为tyr-gln-gln-gln-gln-gln-thr(seq id no.3)。
65.4.g2yq4yg2短肽
66.序列为ac-gly-gly-tyr-gln-gln-gln-gln-tyr-gly-gly-nh2(seq id no.4)。
67.5.gq5yg短肽
68.序列为gly-gln-gln-gln-gln-gln-tyr-gly(seq id no.5)。
69.6.t4y4短肽
70.序列为ac-thr-tyr-thr-tyr-thr-tyr-thr-tyr-nh2(seq id no.6)。
71.7.tyq短肽
72.序列为ac-thr-tyr-gln-thr-tyr-gln-thr-tyr-gln-nh2(seq id no.7)。
73.8.yqt短肽
74.序列为ac-tyr-gln-thr-tyr-gln-thr-tyr-gln-thr-nh2(seq id no.8)。
75.实施例2：制备本发明的短肽纳米粒载体
76.1.制备gqy短肽纳米粒载体
77.精密称取定量的gqy短肽，加入一定量的10mm pb缓冲液(ph为7.4-8.0)，充分吹打混匀后水浴超声15-20分钟，得到gqy短肽纳米粒载体溶液，其中短肽终浓度为5mm。
78.用透射电镜(tem)观察gqy短肽纳米粒载体溶液，看出gqy短肽自组装形成了纳米粒，gqy短肽纳米粒载体溶液的外观及tem图像如图1所示。
79.2.制备gqy-ac短肽纳米粒载体
80.参照步骤1的方法，将gqy短肽替换为gqy-ac短肽，得到gqy-ac短肽纳米粒载体溶液，其中短肽终浓度为5mm。
81.3.制备yq5t短肽纳米粒载体
82.参照步骤1的方法，将gqy短肽替换为yq5t短肽，得到yq5t短肽纳米粒载体溶液，其中短肽终浓度为5mm。
83.4.制备g2yq4yg2短肽纳米粒载体
84.参照步骤1的方法，将gqy短肽替换为g2yq4yg2短肽，得到g2yq4yg2短肽纳米粒载体溶液，其中短肽终浓度为5mm。
85.5.制备gq5yg短肽纳米粒载体
86.参照步骤1的方法，将gqy短肽替换为gq5yg短肽，得到gq5yg短肽纳米粒载体溶液，其中短肽终浓度为5mm。
87.6.制备t4y4短肽纳米粒载体
88.参照步骤1的方法，将gqy短肽替换为t4y4短肽，得到t4y4短肽纳米粒载体溶液，其中短肽终浓度为5mm。
89.7.制备tyq短肽纳米粒载体
90.参照步骤1的方法，将gqy短肽替换为tyq短肽，得到tyq短肽纳米粒载体溶液，其中短肽终浓度为5mm。
91.8.制备yqt短肽纳米粒载体
92.参照步骤1的方法，将gqy短肽替换为yqt短肽，得到yqt短肽纳米粒载体溶液，其中短肽终浓度为5mm。
93.实施例3：制备本发明的缓释制剂
94.1.制备不同bup浓度的gqy载布比卡因碱体系
95.精密称取定量布比卡因碱(大连美仑，纯度≥98.5％，简称bup)，依照表1中不同的bup终浓度加入实施例2制备的gqy短肽纳米粒载体溶液，磁力搅拌20小时，使用naoh和hcl将ph调至7.4，水浴超声15-20分钟，得到不同bup浓度的bup-gqy制剂：bg007、bg015、bg030、bg060、bg120。
96.表1.不同bup浓度的bup-gqy制剂配方
[0097][0098]
bup-gqy制剂的外观图片如图2所示，可以看出不同浓度的布比卡因碱可以充分分散于5mm gqy短肽纳米粒载体溶液中，形成乳白色性状均一的混悬液。
[0099]
2.制备不同ph的gqy载布比卡因碱体系
[0100]
表2.不同ph的bg060制剂
[0101]
制剂编号phbg060606.0bg060646.4bg060707.0bg060747.4
bg060848.4
[0102]
取上述制备的bg060制剂，使用1-6m的hcl和naoh将bg060的ph分别调节至6.0、6.4、7.0、7.4和8.4，得到不同ph的bup-gqy制剂：bg06060、bg06064、bg060670、bg06074、bg06084。
[0103]
3.制备不同ph的gqy载罗哌卡因碱体系
[0104]
精密称取定量的罗哌卡因碱(购自麦克林，纯度98％，简称rop)，按照rop终浓度为60mg/ml加入到5mm gqy短肽纳米粒载体溶液中，用naoh和hcl调节ph至表3中的目标值，磁力搅拌20小时，水浴超声15-20分钟，得到不同ph的rop-gqy制剂：rg06060、rg06070、rg06085。
[0105]
表3.不同ph的rop-gqy制剂配方
[0106][0107]
如图3所示，罗哌卡因碱能够充分分散在gqy短肽纳米粒载体溶液中，形成性状均一的乳白色混悬液。
[0108]
4.制备gqy包载甲哌卡因碱体系
[0109]
精密称取定量的甲哌卡因碱(购自阿拉丁，纯度97％，简称mep)，按照mep终浓度为60mg/ml加入到5mm gqy短肽纳米粒载体溶液中，用naoh和hcl调节ph至8.2，磁力搅拌20小时，水浴超声15-20分钟，得到mep-gqy制剂：mg06082。
[0110]
表4.mep-gqy制剂配方
[0111][0112]
如图4所示，甲哌卡因碱可以充分分散在gqy短肽纳米粒载体溶液中，形成性状稳定的乳白色混悬液。
[0113]
5.制备gqy-ac包载罗哌卡因碱及布比卡因碱体系
[0114]
表5.gqy-ac包载罗哌卡因碱及gqy-ac包载布比卡因碱体系配方
[0115][0116]
精密称取定量的罗哌卡因碱或布比卡因碱，加入5mm gqy-ac短肽纳米粒载体溶液中，用naoh和hcl调节ph至目标值，磁力搅拌20小时，水浴超声15-20分钟，分别得到gqy-ac包载罗哌卡因碱体系：rgac06070，及gqy-ac包载布比卡因碱体系：bgac06074。
[0117]
从图5可以看出，罗哌卡因碱和布比卡因碱均可充分分散在gqy-ac短肽纳米粒载体溶液中形成性状稳定的乳白色混悬液。
[0118]
6.制备yq5t包载普鲁卡因碱体系
[0119]
精密称取定量的普鲁卡因碱(购自麦克林，纯度98％，简称pro)，加入5mm yq5t短肽纳米粒载体溶液中，用naoh和hcl调节ph至目标值，磁力搅拌20小时，水浴超声15-20分钟，得到yq5t包载普鲁卡因碱体系：py06090。
[0120]
表6.yq5t载普鲁卡因碱体系配方
[0121][0122]
如图6所示，普鲁卡因碱可充分分散于yq5t短肽纳米粒载体溶液中形成乳白色混悬液。
[0123]
7.制备g2yq4yg2包载利多卡因碱体系
[0124]
精密称取定量的利多卡因碱(购自阿拉丁，纯度≥99％，简称lido)，加入5mm g2yq4yg2短肽纳米粒载体中，用naoh和hcl调节ph至目标值，磁力搅拌20小时，水浴超声15-20分钟，得到g2yq4yg2包载利多卡因碱体系：lgyg06085。
[0125]
表7.g2yq4yg2包载利多卡因碱体系配方
[0126][0127]
如图7所示，利多卡因碱可充分分散于g2yq4yg2短肽纳米粒载体溶液中形成乳白色混悬液。
[0128]
8.制备gq5yg包载布比卡因碱体系
[0129]
精密称取定量的布比卡因碱，加入5mm gq5yg短肽纳米粒载体溶液中，用naoh和hcl调节ph至目标值，磁力搅拌20小时，水浴超声15-20分钟，得到gq5yg包载布比卡因碱体系：gg03074。
[0130]
表8.gq5yg载布比卡因碱配方
[0131][0132]
从图8可以看出，布比卡因碱可充分分散于gq5yg短肽纳米粒载体溶液中形成乳白色混悬液。
[0133]
以上制备方法表明，本发明的局部麻醉药物缓释制剂可以以本发明的短肽和局麻药碱为原料制得。
[0134]
9.制备t4y4包载布比卡因碱体系
[0135]
按终浓度5mm称取定量t4y4冻干粉末，加入10mm pb，水浴超声15-20分钟；再称取定量盐酸布比卡因(购自麦克林，纯度99％，简称为bup-hcl)加入t4y4短肽纳米粒载体溶液中，调节体系的ph至目标值，继续磁力搅拌20小时，得到t4y4包载布比卡因碱体系：bht03074。
[0136]
表9.t4y4包载布比卡因碱体系配方
[0137][0138]
t4y4包载布比卡因碱体系呈性状均一的乳白色混悬液。
[0139]
10.制备tyq包载罗哌卡因碱体系
[0140]
按终浓度5mm称取定量tyq冻干粉末，加入10mm pb，水浴超声15-20分钟；再称取定量盐酸罗哌卡因(购自麦克林，纯度99％，简称为rop-hcl)加入tyq短肽纳米粒载体溶液中，调节体系的ph至目标值，继续磁力搅拌20小时，得到tyq包载罗哌卡因碱体系：rhtyq04070。
[0141]
表10.tyq包载罗哌卡因碱体系配方
[0142][0143]
tyq包载罗哌卡因碱体系外观呈性状均一的、乳白色混悬液。
[0144]
11.制备yqt包载罗哌卡因碱体系
[0145]
表11.yqt包载罗哌卡因碱体系配方
[0146]
制剂编号载体材料/溶媒rop-hcl(mg/ml)phrhyqt040705mm yqt407.0
[0147]
按终浓度5mm称取定量yqt冻干粉末，加入10mm pb，水浴超声15-20分钟；再称取定量盐酸罗哌卡因(购自麦克林，纯度99％，简称为rop-hcl)加入yqt短肽纳米粒载体溶液中，调节体系的ph至目标值，继续磁力搅拌20小时，得到yqt包载罗哌卡因碱体系：rhyqt04070。
[0148]
yqt包载罗哌卡因碱体系外观呈性状均一、乳白色混悬液。
[0149]
以上制备方法表明，本发明的局部麻醉药物缓释制剂也可以以本发明的短肽和局麻药盐为原料制得。
[0150]
对照例：制备bup-gqy制剂的对照样品
[0151]
使用不同浓度的游离布比卡因盐酸盐(麦克林，纯度99％，简称为bup-hcl)、0.9％ns(生理盐水)、5mm gqy短肽纳米粒载体溶液(ph7.0)，以及未用短肽材料包载的布比卡因碱粉末作为对照。
[0152]
表12.bup-gqy体系对照组配方
[0153][0154]
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
[0155]
实验例1：bup-gqy制剂微观形态的观察
[0156]
在实施例3制备的样品中，分别取2μl bg007、bg015、bg030、bg060、bg120于5
×
5mm大小的干净玻片上使其均匀、薄层分布，待样品自然风干。喷金后在扫描电子显微镜(scanning electron microscope,sem,zeiss evo10)下观察其微观形态。以对照例5样品作为对照。
[0157]
如图9所示，在sem下观察可见，bup-gqy呈0.5-2.5μm大小的颗粒，并且随着体系中布比卡因碱浓度的增加颗粒直径趋于增加；而未用短肽包载的布比卡因碱则团聚成5μm以上的大颗粒，表明布比卡因碱可以充分分散在gqy载体中。
[0158]
实验例2：bup-gqy结构的x射线衍射分析
[0159]
取2ml实施例3中制备的bg060、对照例2及对照例4样品的冻干粉末，以对照例5样品的冻干粉末为参照，进行粉末x射线衍射分析(powder x-ray diffraction,pxrd)。测试参数：最大管压：60kv；最大管流：60ma，2θ角度范围：5
°‑
50
°
，角度重现性： /-0.0001
°
，步长：0.0262606
°
，探测器计数矩阵：256
×
256pixcel，像素大小：55mm
×
55mm，分辨率：fwhm＝0.028
°
。
[0160]
结果表明，bg060与对照例5的特征峰高度一致，表明bg060中，载体材料gqy未与布比卡因碱发生化学结合，也无共晶现象发生(图10)。
[0161]
实验例3：bup-gqy载药量(loadingcapacity,lc)和包封率(encapsulationefficiency,ee)的测定
[0162]
在实施例3制备的样品中，取bg007、bg030、bg060、bg120等bup-gqy制剂各1ml，使用孔径220μm的滤器过滤以得到上清，每个制剂制作3份上清，使用高效液相色谱仪(high performance liquid chromatograph,hplc)检测上清中布比卡因的浓度，从而计算bup-gqy体系的载药量和包封率。
[0163]
色谱条件：
[0164]
仪器：岛津lc-20ad
[0165]
色谱柱：swell chromplus c18(4.6mm
×
150mm，5μm)；
[0166]
流动相：a：0.1％tfa，c：乙腈，a:c＝65:35；
[0167]
运行时间：5min；
[0168]
流速：1ml/min；
[0169]
进样量：5ul。
[0170]
表13.bup-gqy制剂的载药参数
[0171]
体系编号lc(％)ee(％)
bg00760.2688.84bg01587.0998.84bg03093.1199.05bg06096.4599.52
[0172]
结果表明，gqy短肽能够高效包载布比卡因碱，本发明的bup-gqy制剂具有高载药量和高包封率的优点(表13)。
[0173]
实验例4：bup-gqy制剂的体外释放研究
[0174]
测试样品：实施例3制备的不同浓度的bup-gqy样品，以对照例2作对照。取各样品1ml于透析装置float-a-lyzer g2中(上海源叶)，将透析装置封闭后置于50ml离心管中，透析液为40ml磷酸盐缓冲体系(pbs，ph7.4)，37℃恒温水浴振摇(70次/分)，分别于0.17h、0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h取样，24小时后每24小时取一次，每次取出20ml透析液，再加入等量复温后的新鲜pbs缓冲液，每次留取1ml样品，使用hplc检测留样中布比卡因的浓度。色谱条件同实验例3。
[0175]
结果表明，在体外ph 7.4磷酸盐缓冲溶液中，bup-gqy制剂具有明显的体外缓释作用；与对照例2相比，无突释现象的发生(见图11)。
[0176]
基于上述实验结果，本发明进一步利用以下体内实验测试了以本发明短肽为载体制得的药物制剂的体内长效镇痛或局部麻醉作用。
[0177]
实验例5：长效局麻镇痛作用测试
[0178]
(一)bup-gqy制剂的长效局麻镇痛作用
[0179]
1.实验方法
[0180]
使用坐骨神经阻滞(sciatic nerve block,snb)模型考察bup-gqy的局麻镇痛作用。选取体重250-300g，健康雄性sd大鼠(成都达硕实验动物有限公司提供)，严格按照美国实验动物护理和使用指南饲养1-2周，实验开始前3天监测大鼠体重，并根据热板缩足时间(paw withdraw latency,pwl)进行筛选，剔除在56℃热板上缩足时间超过4秒以及体重明显下降的大鼠。取筛选合格的大鼠64只，随机分为8组，每组8只，分组如下：gb007、gb030、gb060、gb120及对照例1-4。
[0181]
将大鼠放进自制密闭塑料盒中，使用4％异氟烷进行麻醉诱导，待大鼠镇静后，取出大鼠置于实验台上使其呈侧卧位，使用自制面罩通气，改用2％异氟烷进行麻醉维持，剔除实验侧骶尾部毛发，在股骨大转子和坐骨结节连线中点处进针，针尖接触骨头后匀速给予各样品0.2ml，棉签按压止血后放回笼中。
[0182]
使用改良热板实验评估大鼠的感觉功能，热板(成都泰盟科技有限公司)恒温设置为56℃，垂直提起大鼠使其给药侧后足踩踏在热板上，用秒表读取大鼠缩足时间，每个时间点测3次后取平均值，每次间隔10秒，如大鼠超过12秒后仍未缩足，应使大鼠后足离开热板以避免烫伤。缩足时间在7秒以上视为有效的感觉阻滞。
[0183]
使用后肢蹬踏试验(postural extensor thrust,pet)评价大鼠的运动功能，一手握持大鼠头部，另一手固定大鼠尾部，使大鼠给药侧后足蹬踏在电子天台面上，身体呈一条线，待天平测值稳定后记录读数。蹬力为基线的一半以下视为有效的运动阻滞。
[0184]
分别于给药后10min、30min、1h，12h内每2h，及24h、28h、32h、36h、40h、44h、48h、52h、56h、72h评估大鼠的感觉和运动功能，并密切观察大鼠是否出现不良反应(全身毒性：
焦躁不安、震颤、惊厥、抽搐甚至死亡；局部刺激：肌肉痉挛、注射部位坏死、自残、舔爪和毛发直立)。
[0185]
2.实验结果
[0186]
结果见表14及图12和图13。对照例3和对照例4两组大鼠均无神经阻滞现象发生，且未观察到不良反应。bup-gqy制剂跟对照例1和对照例2相比，起效时间相当，但是作用时间明显延长；并且随着bup-gqy制剂中布比卡因浓度的增加，神经阻滞作用时间也显著增加。
[0187]
bup-gqy各组及对照例1组大鼠未出现明显不良反应，而对照例2组大鼠给药后半小时内出现精神萎靡，给药后2-4小时不良反应消失。
[0188]
表14.bup-gqy体系的snb效果
[0189][0190]
注：onset表示起效时间；offset表示有效阻滞时间。
[0191]
上述实验结果表明，本发明以gqy短肽为载体制得的bup-gqy制剂具有优异的神经阻滞作用，有效作用时间明显延长，可以用于制备长效镇痛或长效局部麻醉的药物。
[0192]
(二)mep-gqy制剂的长效局麻镇痛作用
[0193]
使用snb模型评估mep-gqy制剂的麻醉镇痛作用，方法同部分(一)。盐酸甲哌卡因购自阿拉丁，纯度≥98％，简称为mep-hcl。
[0194]
表15.mep-gqy制剂配方及snb效果
[0195][0196]
与游离盐酸甲哌卡因相比，mep-gqy制剂的坐骨神经阻滞镇痛时间明显延长，且未见严重的中毒反应(表15)。
[0197]
(三)gqy-ac包载罗哌卡因碱及布比卡因碱体系的长效局麻镇痛作用
[0198]
使用snb模型评估gqy-ac包载罗哌卡因碱及布比卡因碱体系的麻醉镇痛作用，方法同部分(一)。
[0199]
gqy-ac载罗哌卡因碱体系及gqy-ac载布比卡因碱体系的坐骨神经阻滞效果较游离盐酸罗哌卡因及游离盐酸布比卡因显著延长，未观察到明显的中毒反应。并且，与gqy-ac载布比卡因碱体系相比，gqy-ac载罗哌卡因碱的镇痛效果更好(表16)。
[0200]
表16.gqy-ac包载罗哌卡因碱及布比卡因碱体系配方及snb效果
[0201][0202]
(四)yq5t包载普鲁卡因碱体系的长效局麻镇痛作用
[0203]
使用snb模型评估yq5t包载普鲁卡因碱体系的麻醉镇痛作用，方法同部分(一)。盐酸普鲁卡因购自麦克林，纯度99％，简称pro-hcl。
[0204]
表17.yq5t包载普鲁卡因碱体系配方及snb效果
[0205][0206]
与游离盐酸普鲁卡因相比，yq5t包载普鲁卡因碱体系的坐骨神经阻滞镇痛时间可延长至8-10小时，并且未观察到明显的中毒反应(表17)。
[0207]
(五)g2yq4yg2包载利多卡因碱体系的长效局麻镇痛作用
[0208]
使用snb模型评估g2yq4yg2包载利多卡因碱体系的麻醉镇痛作用，方法同部分(一)。盐酸利多卡因购自麦克林，纯度99％，简称lido-hcl。
[0209]
与游离盐酸利多卡因相比，g2yq4yg2包载利多卡因碱体系的坐骨神经阻滞效果有所延长，并且未观察到明显的中毒反应(表18)。
[0210]
表18.g2yq4yg2包载利多卡因碱体系配方及snb效果
[0211][0212]
(六)gq5yg包载布比卡因碱体系的长效局麻镇痛作用
[0213]
使用snb模型评估gq5yg包载布比卡因碱体系的麻醉镇痛作用，方法同部分(一)。
[0214]
表19.gq5yg包载布比卡因碱体系配方及snb效果
[0215][0216]
gq5yg包载布比卡因碱体系在坐骨神经阻滞模型中的镇痛作用可延长至11-14小时，并且未观察到明显的中毒反应(表19)。
[0217]
(七)t4y4包载布比卡因碱体系的长效局麻镇痛作用
[0218]
使用snb模型评估t4y4包载布比卡因碱体系的麻醉镇痛作用，方法同部分(一)。
[0219]
表20.t4y4包载布比卡因碱体系配方及snb效果
[0220][0221]
t4y4包载布比卡因碱体系在坐骨神经阻滞模型中的镇痛作用可延长至12-16小时，并且未观察到明显的中毒反应(表20)。
[0222]
(八)tyq包载罗哌卡因碱体系的长效局麻镇痛作用
[0223]
使用snb模型评估tyq包载罗哌卡因碱体系的麻醉镇痛作用，方法同部分(一)。
[0224]
tyq包载罗哌卡因碱体系在坐骨神经阻滞模型中的镇痛作用可延长至16-24小时，并且未观察到明显的中毒反应(表21)。
[0225]
表21.tyq包载罗哌卡因碱体系配方及snb效果
[0226][0227]
(九)yqt包载罗哌卡因碱体系的长效局麻镇痛作用
[0228]
使用snb模型评估yqt包载罗哌卡因碱体系的麻醉镇痛作用，方法同部分(一)。
[0229]
表22.yqt包载罗哌卡因碱体系配方及snb效果
[0230][0231]
yqt包载罗哌卡因碱体系在坐骨神经阻滞模型中的镇痛作用可延长至16-24小时，并且未观察到明显的中毒反应(表22)。
[0232]
以上实验表明，以本发明短肽为载体包载局部麻醉药制得的药物制剂具有优异的神经阻滞作用，有效作用时间明显延长，可以用于制备长效镇痛或长效局部麻醉的药物。
[0233]
实验例6：ph对缓释制剂的载药量、包封率和局麻镇痛作用的影响
[0234]
(一)ph对bup-gqy制剂的影响
[0235]
取实施例3制备的bg060制剂，使用1-6m的hcl和naoh将bg060的ph分别调节至6.0、6.4、7.0、7.4和8.4。使用hplc检测上清中布比卡因的浓度，检测方法同实验例3。
[0236]
使用snb模型评估上述不同ph的bg060制剂的麻醉镇痛作用效果，实验方法和给药体积同实验例5。
[0237]
结果表明，随着ph的升高，gqy对布比卡因碱的载药量和包封率也相应增加(表23)。
[0238]
另外，不同ph下bg060制剂的感觉和运动神经阻滞均起效迅速；在ph6.0～8.4的bg060制剂中，随着ph的变化，神经阻滞时间有差异，但与实验例5中对照例1和2比较，阻滞时间仍然显著延长，说明不同ph下的bg060制剂都具有显著延长镇痛时间的效果(表23)。
[0239]
表23.不同ph下bg060制剂的载药参数及snb效果
[0240][0241]
(二)ph对rop-gqy制剂的影响
[0242]
使用hplc检测rg06060、rg06070和rg06085的上清浓度，方法同实验例3。并使用snb模型考察实施例3中不同ph的rop-gqy制剂的局麻镇痛作用。筛选健康雄性sd大鼠32只，体重250-300g，随机分为4组，每组8只，分组如下：rg06060、rg06070、rg06085及对照例6。盐酸罗哌卡因购自麦克林(纯度99％，简称rop-hcl)。
[0243]
表24.对照例6配方
[0244][0245]
表25.不同ph的rg060制剂的载药参数及snb效果
[0246][0247]
结果表明，gqy可以高效包载罗哌卡因碱形成均匀制剂。在ph6.0～8.5的rop-gqy制剂中，随着ph的变化，神经阻滞时间略有变化，但与游离盐酸罗哌卡因相比，不同ph值的rop-gqy体系坐骨神经阻滞时间均明显延长(表25)。
[0248]
以上实验结果表明，在不同的ph条件下，以本发明短肽为载体制得的药物制剂均能显著延长神经阻滞的时间。
[0249]
实验例7：bg06064冻干制剂的稳定性考察
[0250]
1.实验方法
[0251]
本实验考查bup-gqy制剂在冻干后长时间保存的稳定性。将定量的bg06064制剂进行冻干处理后，冷冻保存6个月；然后加入跟冻干前等体积的超纯水复溶，使用snb模型考察
该冻干制剂的麻醉镇痛效果。实验方法和给药体积同实验例5。
[0252]
2.实验结果
[0253]
表26.冷冻保存6个月后的bg06064冻干制剂的snb效果
[0254][0255]
结果表明，bg06064制备成冻干制剂后能长期保存，复溶后仍然能显著延长镇痛作用时间(表26)。
[0256]
上述实验结果表明，以本发明短肽为载体制得的药物制剂稳定性好，在长时间保存后仍然能显著延长镇痛作用时间。
[0257]
以上体内实验证明了以本发明短肽为载体制得的药物制剂具有长效镇痛或长效局部麻醉的作用，既可以用于术前、术中或术后疼痛的治疗，也能够满足手术时的长时间局部麻醉需求。在此基础上，本发明进一步测试了以本发明短肽为载体制得的药物制剂的全身安全性和局部安全性。
[0258]
实验例8：bup-gqy制剂在大鼠体内的全身安全性测试
[0259]
1.实验方法
[0260]
参照实验例5，筛选健康雄性sd大鼠(250-300g)48只，随机分成6组，即bg007、bg030、bg060、bg120、对照例1和对照例2，每组8只。将大鼠放入固定器露出尾巴，使用24g静脉穿刺针行尾静脉穿刺并留置鞘管。而后将大鼠麻醉后，经股骨大转子与坐骨结节连线中点进针，针尖接触到骨头后匀速推注各样品0.2ml。给药后10min、30min、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、10h、12h、24h、28h、32h、48h、52h、56h、72h、76h、80h采集0.15ml静脉血，提取血浆，并使用液相色谱-质谱联用仪检测不同时间点血浆中布比卡因的浓度。
[0261]
仪器：agilent 1200高效液相色谱仪；agilent g6460型三重四级杆质谱仪(agilent mass-hunter工作站)；beckman低温高速离心机(alle 64r，beckman coulter公司，美国)；十万分之一电子分析天平(sartorius me215s)；漩涡混匀仪(ika ms3 basic)，milli-q超纯水纯化仪
[0262]
试剂：乙腈，色谱纯，美国fisher公司；甲醇，色谱纯，美国fisher公司；乙酸乙酯，色谱纯，美国fisher公司；甲酸，色谱纯(sigma-aldrich，美国)；罗哌卡因盐酸盐(中国药品生物制品检定所，纯度94.2％)；罗哌卡因-d7盐酸盐(加拿大trc)。
[0263]
色谱条件：
[0264]
色谱柱：agilent extend c18(3.0
×
100mm,3.5μm)，流动相：a：0.05％甲酸水溶液，b：乙腈，流速：0.3ml/min，梯度洗脱。b初始比例21％，2-3min，b从21％梯度升至40％，3-3.1min，b从40％梯度升至100％，维持至4.5min，4.6minb从100％降至21％，运行时间7min。柱温：35℃，进样量：1μl。洗针液：meoh-h2o(1:1，v/v)，洗针15s。
[0265]
质谱条件：
[0266]
电喷雾离子化源(esi源)，多反应监测(mrm)，正离子检测模式。
[0267]
干燥气温度：350℃，干燥气流速(gas flow)：5l/min，喷雾器压力45psi，鞘气温
度：350℃，鞘气流速：11l/min，毛细管电压3500v。
[0268]
用于定量离子对：
[0269]
布比卡因，m/z 289.2-m/z 140.1，碎裂电压：110v，碰撞能：16ev；
[0270]
罗哌卡因-d7(内标)，m/z 282.5-m/z 133.3，碎裂电压：92v，碰撞能：16ev。
[0271]
2.实验结果
[0272]
表27.bup-gqy制剂药代动力学参数
[0273][0274]
结果见表27和图14。同等浓度下，bup-gqy制剂的达峰时间及半衰期较盐酸布比卡因更长，说明bup-gqy制剂在体内仍具有明显的缓释特性。并且，bg007跟同等药物浓度的对照例1相比，峰值血药浓度约为对照例1的64％；而bg030跟同等药物浓度的对照例2对比，峰值血药浓度约为对照例2的三分之一；虽然随着布比卡因浓度的升高，bup-gqy制剂的峰值血药浓度有所增加，但跟对照例1的峰值血药浓度没有显著差异，说明bup-gqy制剂的中毒剂量范围稍广。
[0275]
上述实验结果表明，本发明不同布比卡因浓度的bup-gqy制剂均具有优良的缓释的效果和全身安全性。
[0276]
实验例9：bup-gqy制剂在坐骨神经阻滞模型中的局部病理损伤评价
[0277]
1.实验方法
[0278]
实验方法参照实验例5，筛选健康雄性大鼠56只，随机分为7组，即bg007、bg030、bg060、bg120、对照例1、对照例3和对照例4，每组8只，每只大鼠给予0.2ml前述制剂，分别于给药后4天和14天(n＝4/组)进行组织取材。
[0279]
尾静脉注射丙泊酚使大鼠安乐死，解剖暴露坐骨神经，从给药点附近截取2厘米长坐骨神经和附近的肌肉，放入10％中性甲醛固定48小时。将组织脱水、透明后进行石蜡包埋，切片厚度为5μm，将切片脱蜡、水化后进行he染色，在光学显微镜下进行观察，并由不了解实验分组的病理医师评估组织的炎细胞浸润和肌细胞毒性情况。表28、表29分别为炎细胞浸润和肌细胞毒性评分标准。
[0280]
2.实验结果
[0281]
表28.炎细胞浸润评分标准
[0282]
显微镜下观评分无炎细胞浸润0周围区域炎细胞浸润1深层区域炎症2半肌束炎细胞浸润3
全肌束炎细胞浸润4
[0283]
表29.肌细胞毒性评分标准
[0284]
显微镜下观评分无异常0肌束周边核内化1》5个细胞层核内化2肌束周边再生3深度再生4半肌束再生5全肌束再生6
[0285]
表30.bup-gqy缓释体系snb给药后4天病理损伤评分
[0286][0287]
*，跟对照例1比较。
[0288]
表31.bup-gqy缓释体系snb给药后14天病理损伤评分
[0289][0290]
*，跟对照例1比较。
[0291]
实验结果表明，跟0.9％生理盐水相比，局部给予5mm gqy在给药后4天引起轻度炎症，在给药后14天恢复，对肌细胞和坐骨神经无病理损伤，说明作为载体材料的gqy短肽具有良好的生物相容性。给予各阳性制剂后4天，均产生一定程度的炎症反应，对肌细胞和神经也有一定的损伤作用；但跟对照例1相比，bg030组的炎症反应更轻一些，其他病理损伤则没有差异；同样地，bg007、bg060和bg120的病理损伤程度跟对照例1相似，没有统计学差异(表30和图15)。在给药后14天，前述病理损伤评估指标有所恢复，并且bg007、bg030组、bg060组及bg120组的病理损伤均跟对照例1相比没有差异(表31和图16)。
[0292]
上述实验结果表明，本发明不同布比卡因浓度的bup-gqy制剂引起的病理损伤小，局部安全性优良。
[0293]
以上体内实验数据证明了以本发明短肽为载体制得的药物制剂不仅具有长效镇痛或长效局部麻醉的作用，同时还具有优良的全身安全性和局部安全性。
[0294]
综上所述，本发明提供了一种短肽及以其为载体材料的具有长效镇痛或/和长效局部麻醉作用的缓释制剂。上述短肽可以作为局部麻醉药的载体，以上述短肽为载体的局部麻醉药物缓释制剂药物负载量大、包封率高，稳定性好，神经阻滞作用优异，能够显著延长有效作用时间，同时还具有优良的全身安全性和局部安全性，在制备具有长效镇痛或/和长效局部麻醉作用的药物中应用前景广阔。