一种肝素钠粗品纯化的方法与流程

1.本发明属于肝素钠纯化领域，特别是涉及一种肝素钠粗品纯化的方法。


背景技术：

2.肝素是由糖醛酸(l-艾杜糖醛酸，idoa和d-葡糖醛酸，glca)和氨基己糖(α-d-氨基己糖，glcn)及其衍生物(乙酰化、硫酸化)组成的具有不同链长的多糖混合物。肝素的硫酸基和羧基含量高，是已知负电荷密度最高的生物大分子。肝素为长度不均一的粘多糖片段，其相对分子质量(mr)在3000～30000，平均mr为12000-15000。其主要二糖单位如下：
3.肝素在动物组织内与蛋白质结合，存在于肥大细胞中，经过提取纯化后的肝素钠为白色至类白色的粉末，有引湿性，易溶于水，不溶于乙醇、乙醚、丙酮等有机溶剂。
4.在我国，肝素的提取以猪小肠粘膜为主要原料，其制备过程主要分两个阶段，即粗品肝素的生产和精品肝素的制备。粗品的生产主要是采用盐解、酶解及离子交换树脂去除大部分蛋白质和核酸，有的结合超滤技术去除杂质和浓缩。肝素的纯化过程主要是去除杂质和脱色。
5.现有肝素钠制备方法包括粗品肝素钠除杂、胰酶和纤维素酶酶解、酸性条件除杂、乙醇分级、氧化等步骤。现阶段，如若采用酸性条件除杂的方法去除杂质蛋白、核酸等物质，对温度要求较苛刻。由于肝素钠在酸性条件下极其不稳定(j.pharm.pharmacol.，167(7)：487-489，1964.)，导致肝素钠分子部分断裂、肝素钠部分失活、低分子量肝素钠偏多、难以得到高效价的肝素钠，使收率下降，稳定性下降，在制备后期肝素钠相关制剂时会影响产品质量及稳定性。
6.为了保证肝素钠的质量及稳定性，国内有发明专利阐述低温条件下进行酸性条件除杂来保证肝素钠的活性不受影响。
7.专利cn 101824099 b《一种粗品肝素钠的纯化方法》描述了一种低温条件下酸性条件除杂工艺，其除杂条件所需温度为5℃。
8.专利cn 103755838 b《一种肝素钠的制备方法》中描述了一种低温条件下酸性除杂工艺，其除杂条件所需温度为低温0-5℃。
9.上述两种方法中，酸性条件除杂需在低温条件下进行，若进行放大生产则所需能耗较高，不利于生产的成本控制和节能降耗。
10.如何在已有酸性条件除杂的方法基础上改变低温限制，使得酸性条件除杂能在常温下正常进行，既能除去杂质，又能不破坏肝素钠的结构，成为本发明的关键。


技术实现要素：

11.针对现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种肝素钠粗品纯化的方法。该方法的关键在于肝素钠粗品在酸性条件除杂开始前，在10-35℃的肝素钠粗品溶液中加入单糖或二糖作为保护剂，其中单糖为氨基葡萄糖、葡萄糖、果糖或甘露糖，二糖为蔗糖或麦芽糖。
12.本发明方案概述如下：
13.(1)将肝素钠粗品除杂后水溶液升温至45-50℃，调节ph至8.0-9.0，加入胰酶反应，再加入氯化钙，溶解后升温至80-85℃，再降温至40℃以下，加入碳酸钠，离心取上清液；
14.(2)步骤(1)离心后上清液升温至45-50℃，调节ph至4.5-5.5，加入纤维素酶反应，再加入氯化钙，溶解后升温至80-85℃，再降温至40℃以下，加入碳酸钠，离心取上清液。
15.(3)向步骤(2)离心后上清液中加入肝素钠粗品重量0.01-0.1倍(w/w)的糖类溶解。控制温度在10-35℃。调节料液ph至1-3，离心取上清液，调节料液ph至6.0-7.5。
16.(4)步骤(3)离心后上清液经乙醇分级、脱色后制备成品。
17.本发明的优点和积极效果是：1.保护剂有效保护肝素钠，减少酸性状态下对肝素钠的影响；2.对温度要求低，10-35℃范围内皆可进行，达到节能降耗的目的；3.安全性高：皆为药用辅料，不存在毒性残留问题；4.成本低廉：使用的保护剂原料易得，成本低廉，适用于工业化生产；5.操作简单：可用于实验室样品制作，也适用于规模化生产。6.所引入的保护剂易去除，残留少，对产品质量指标无影响。
具体实施方式
18.实施例1，
19.(1)称取80g肝素钠粗品，用400ml水溶解，经初步除杂后料液升温至45-50℃，调节ph至8.9，加入肝素钠重量0.5％(w/w)胰酶0.4g反应5小时，加入料液体积2％(w/v)的氯化钙8g，溶解后升温至80-85℃，保温搅拌20分钟，降温至40℃以下，加入料液体积2％(w/v)的碳酸钠8g搅拌20分钟，离心取上清液。
20.(2)上清液升温至45-50℃，调节ph至5.4，加入肝素钠重量0.5％(w/w)的纤维素酶0.4g反应5小时，加入料液体积2％(w/v)的氯化钙8g，溶解后升温至80-85℃，保温搅拌20分钟，降温至40℃以下，加入料液体积2％(w/v)的碳酸钠8g搅拌20分钟，离心取上清液。
21.(3)向上清液中加入0.1倍肝素钠粗品重量的氨基葡萄糖8g溶解。控制温度10-14℃，用6m盐酸调节料液ph至2.2，离心取上清液，调节料液ph至6.7。
22.(4)步骤(3)料液经乙醇分级及脱色后制粉，烘干，制得肝素钠成品。
23.实施例2，
24.(1)称取30g肝素钠粗品，用150ml水溶解，经初步除杂后料液升温至45-50℃，调节ph至8.5，加入肝素钠重量0.5％(w/w)胰酶0.15g反应5小时，加入料液体积2％(w/v)的氯化钙3g，溶解后升温至80-85℃，保温搅拌20分钟，降温至40℃以下，加入料液体积2％(w/v)的碳酸钠3g搅拌20分钟，离心取上清液。
25.(2)上清液升温至45-50℃，调节ph至5.2，加入肝素钠重量0.5％(w/w)的纤维素酶0.15g反应5小时，加入料液体积2％(w/v)的氯化钙3g，溶解后升温至80-85℃，保温搅拌20分钟，降温至40℃以下，加入料液体积2％(w/v)的碳酸钠3g搅拌20分钟，离心取上清液。
26.(3)向上清液中加入0.08倍肝素钠粗品重量的葡萄糖2.4g溶解。控制温度14-18℃，用6m盐酸调节料液ph至1.5，离心取上清液，调节料液ph至6.7。
27.(4)步骤(3)料液经乙醇分级及脱色后制粉，烘干，制得肝素钠成品。
28.实施例3，
29.(1)称取40g肝素钠粗品，用200ml水溶解，经初步除杂后料液升温至45-50℃，调节ph至8.3，加入肝素钠重量0.5％(w/w)胰酶0.2g反应5小时，加入料液体积2％(w/v)的氯化钙4g，溶解后升温至80-85℃，保温搅拌20分钟，降温至40℃以下，加入料液体积2％(w/v)的碳酸钠4g搅拌20分钟，离心取上清液。
30.(2)上清液升温至45-50℃，调节ph至5.0，加入肝素钠重量0.5％(w/w)的纤维素酶0.2g反应5小时，加入料液体积2％(w/v)的氯化钙4g，溶解后升温至80-85℃，保温搅拌20分钟，降温至40℃以下，加入料液体积2％(w/v)的碳酸钠4g搅拌20分钟，离心取上清液。
31.(3)向上清液中加入0.07倍肝素钠粗品重量的果糖2.8g溶解。控制温度18-22℃，用6m盐酸调节料液ph至2.0，离心取上清液，调节料液ph至7.0。
32.(4)步骤(3)料液经乙醇分级及脱色后制粉，烘干，制得肝素钠成品。
33.实施例4，
34.(1)称取50g肝素钠粗品，用250ml水溶解，经初步除杂后料液升温至45-50℃，调节ph至9.0，加入肝素钠重量0.5％(w/w)胰酶0.25g反应5小时，加入料液体积2％(w/v)的氯化钙5g，溶解后升温至80-85℃，保温搅拌20分钟，降温至40℃以下，加入料液体积2％(w/v)的碳酸钠5g搅拌20分钟，离心取上清液。
35.(2)上清液升温至45-50℃，调节ph至4.8，加入肝素钠重量0.5％(w/w)的纤维素酶0.25g反应5小时，加入料液体积2％(w/v)的氯化钙5g，溶解后升温至80-85℃，保温搅拌20分钟，降温至40℃以下，加入料液体积2％(w/v)的碳酸钠5g搅拌20分钟，离心取上清液。
36.(3)向料液中加入0.05倍肝素钠粗品重量的甘露糖2.5g溶解。控制温度22-26℃。用6m盐酸调节料液ph至2.7，离心取上清液，调节料液ph至6.7。
37.(4)步骤(3)料液经乙醇分级及脱色后制粉，烘干，制得肝素钠成品。
38.实施例5，
39.(1)称取60g肝素钠粗品，用300ml水溶解，经初步除杂后料液升温至45-50℃，调节ph至8.6，加入肝素钠重量0.5％(w/w)胰酶0.3g反应5小时，加入料液体积2％(w/v)的氯化钙6g，溶解后升温至80-85℃，保温搅拌20分钟，降温至40℃以下，加入料液体积2％(w/v)的碳酸钠6g搅拌20分钟，离心取上清液。
40.(2)上清液升温至45-50℃，调节ph至4.6，加入肝素钠重量0.5％(w/w)的纤维素酶0.3g反应5小时，加入料液体积2％(w/v)的氯化钙6g，溶解后升温至80-85℃，保温搅拌20分钟，降温至40℃以下，加入料液体积2％(w/v)的碳酸钠6g搅拌20分钟，离心取上清液。
41.(3)向料液中加入0.03倍肝素钠粗品重量的蔗糖1.8g溶解。控制温度26-30℃。用6m盐酸调节料液ph至2.1，离心取上清液，调节料液ph至6.9。
42.(4)步骤(3)料液经乙醇分级及脱色后制粉，烘干，制得肝素钠成品。
38.实施例6，
39.(1)称取20g肝素钠粗品，用100ml水溶解，经初步除杂后料液升温至45-50℃，调节ph至8.2，加入肝素钠重量0.5％(w/w)胰酶0.1g反应5小时，加入料液体积2％(w/v)的氯化
钙2g，溶解后升温至80-85℃，保温搅拌20分钟，降温至40℃以下，加入料液体积2％(w/v)的碳酸钠2g搅拌20分钟，离心取上清液。
40.(2)上清液升温至45-50℃，调节ph至4.7，加入肝素钠重量0.5％(w/w)的纤维素酶0.1g反应5小时，加入料液体积2％(w/v)的氯化钙2g，溶解后升温至80-85℃，保温搅拌20分钟，降温至40℃以下，加入料液体积2％(w/v)的碳酸钠2g搅拌20分钟，离心取上清液。
41.(3)向料液中加入0.01倍肝素钠粗品重量的麦芽糖0.2g溶解。控制温度30-35℃。用6m盐酸调节料液ph至1.7，离心取上清液，调节料液ph至7.0。
42.(4)步骤(3)料液经乙醇分级及脱色后制粉，烘干，制得肝素钠成品。表1：实施例1-6所得产品检测结果