用于治疗和/或预防睡眠过度的方法

用于治疗和/或预防睡眠过度的方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2019年10月21日提交的欧洲专利申请编号19183317.7的权益，其内容通过引用整体并入本文。
3.序列表
4.与本技术相关的序列表以文本格式代替纸质副本提供，并在此通过引用并入说明书中。包含序列表的文本文件的名称为pat7295pc00_st25.txt。
技术领域
5.用于治疗和/或预防神经性疾病(neurological disease)、神经精神性疾病(neuropsychiatric disease)、神经退行性疾病，优选发作性睡病和相关疾病或障碍的化合物、组合物和方法。


背景技术：

6.伴猝倒的发作性睡病(也称为1型发作性睡病或nt1)是一种睡眠障碍，其以白天过度嗜睡和猝倒(由强烈情绪引发的骨骼肌张力丧失)为特征。该疾病的最佳生物标志物是下丘脑泌素(hypocretin)缺乏(csf hcrt-1水平《40pg/ml)(nishino et al.,2000)。发作性睡病患者的下丘脑区域的尸检表明几乎没有下丘脑泌素神经元(peyron et al.,2000)。结合发作性睡病与hla-dqb1*06:02等位基因(tafti et al.,2014)和t细胞受体α(hallmayer et al.,2009)之间的强关联以及2019-2010 h1n1疫苗接种后儿童发作性睡病的急剧增加(dauvilliers et al.,2010)，人们普遍认为免疫或自身免疫过程导致了下丘脑泌素神经元丢失。最近也有报道称，自身反应性t细胞可针对各种抗原(latorre et al.,2018)。然而，仍然缺乏下丘脑泌素神经元损伤(死亡细胞或局部的外侧下丘脑炎症)的直接证据。
7.下丘脑泌素缺乏可由神经元死亡或没有下丘脑泌素产生引起。继发性发作性睡病(与wernicke脑病(kashiwagi m,2004)、多发性硬化症(oka et al.,2004)、抗水通道蛋白4抗体(nozaki et al.,2009)或肿瘤(dauvilliers et al.,2007)有关)患者中的证据表明csf hcrt-1可以在成功治疗后恢复正常，这强烈表明下丘脑损伤或炎症可能导致可逆的hcrt缺乏。更有趣的是，发明人报告了一名28岁的女性患者，其在第一次猝倒发作后15天被诊断为患有伴有猝倒和下丘脑泌素缺乏的发作性睡病，该患者已接受ivig治疗，并且她的csf hcrt-1水平与她的症状一起恢复正常(dauvilliers et al.,2009)。
8.我们最近将qrfp基因鉴定为hcrt神经元破坏的指标(seifinejad et al,2019)。在神经元消融的食欲肽-ataxin小鼠和食欲肽-dta小鼠(在这些转基因小鼠中，毒素ataxin-3或白喉毒素的表达导致hcrt神经元死亡)的大脑中qrfp表达丢失了60％至90％，而qrfp表达在hcrt基因缺失的小鼠中是正常的。该结果表明，qrfp可用作hcrt神经元破坏的指标，然而如果hcrt基因表达受到抑制(食欲肽敲除小鼠，但hcrt神经元完好无损)，qrfp保持不变(图1)。在患者的下丘脑中发现qrfp表达没有变化，这强烈表明hcrt神经元在发作性睡病的大脑中存在但不表达hcrt基因(类似于hcrt基因缺失的小鼠)。
9.尽管在这个领域取得了进展，但本领域仍然需要改进的化合物、组合物和方法，用于治疗和/或预防神经性疾病、神经精神性疾病、神经退行性疾病，优选发作性睡病和相关疾病或障碍。本公开满足这些和其他需要，如参考以下公开显而易见的。


技术实现要素：

10.本发明提供了用于治疗和/或预防发作性睡病之用途的剂，其中所述剂调节人类下丘脑泌素神经肽前体(hcrt)基因的转录起始位点上游5'区域内的至少一个甲基化位点的甲基化水平。
11.还提供了一种质粒或载体，包含一种或多种编码本发明的mirna、sirna、pirna、hnrna、snrna、sgrna、esirna、shrna和/或反义寡核苷酸的核酸。
12.还提供了一种宿主细胞，包含权利要求11的质粒或载体或一种或多种编码本发明的mirna、sirna、pirna、hnrna、snrna、sgrna、esirna、shrna和/或反义寡核苷酸的核酸。
13.还提供了一种药物组合物，包含治疗有效量的i)调节人类下丘脑泌素神经肽前体(hcrt)基因的转录起始位点上游5'区域内的至少一个甲基化位点的甲基化水平的剂，或ii)本发明的质粒或载体，或iii)本发明的宿主细胞，以及药学上可接受的载体或稀释剂。
14.还提供了一种在有需要的受试者中治疗和/或预防神经性疾病、神经精神性疾病、神经退行性疾病和相关疾病或障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的一种或多种药物组合物，所述一种或多种药物组合物包含i)调节人类下丘脑泌素神经肽前体(hcrt)基因的转录起始位点上游5'区域内的至少一个甲基化位点的甲基化水平的剂，或ii)本发明的质粒或载体，或iii)本发明的宿主细胞，或iv)本发明的核酸，以及药学上可接受的载体和/或稀释剂。
15.还提供了一种用于在受试者的生物样本中检测发作性睡病，优选地，伴猝倒的发作性睡病的方法，所述方法包括a)确定下丘脑泌素(1型和/或2型)的水平和/或浓度，其中当与对照样本相对比时，所述下丘脑泌素(1型和/或2型)的低水平和/或低浓度指示所述受试者容易发展为或患有神经性疾病、神经精神性疾病、神经退行性疾病，和相关疾病或障碍，b)施用至少一种药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的i)调节人类下丘脑泌素神经肽前体(hcrt)基因的转录起始位点上游5'区域内的至少一个甲基化位点的甲基化水平的剂，或ii)本发明的质粒或载体，或iii)本发明的宿主细胞，或iv)本发明的核酸，以及药学上可接受的载体和/或稀释剂。
16.还提供了一种用于在受试者的生物样本中检测发作性睡病，优选地，伴猝倒的发作性睡病的方法，所述方法包括a)确定qrfp的水平和/或浓度，其中当与对照样本相对比时，所述qrfp的低水平和/或低浓度指示所述受试者容易发展为或患有神经性疾病、神经精神性疾病、神经退行性疾病和相关疾病或障碍，b)施用至少一种药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的i)调节人类下丘脑泌素神经肽前体(hcrt)基因的转录起始位点上游5'区域内的至少一个甲基化位点的甲基化水平的剂，或ii)本发明的质粒或载体，或iii)本发明的宿主细胞，或iv)本发明的核酸，以及药学上可接受的载体和/或稀释剂。
附图说明
17.图1.小鼠和人类下丘脑的基因表达。虽然hcrt表达在hcrt敲除小鼠和神经元消融
小鼠(食欲肽-ataxin和食欲肽-dta)中丢失，但qrf表达仅在神经元消融小鼠中丢失，而在食欲肽敲除小鼠或人类发作性睡病中没有丢失(所有小鼠谱系n＝3，以及人类n＝4)。
18.图2.第一个外显子的近端hhcrt启动子上游的第一个500bp序列(转录起始位点，大写斜体)和cdna(大写粗体)，seq id no.1。cpg以粗体突出显示。一个关键的pax5-ets1结合位点(pax5-ebs)被加框，并且tata框为斜体并带有下划线。
19.图3.hhcrt启动子的12个cpg的甲基化。数据来自2个重叠的pcr片段的单分子深度测序(百分比 sem，每组n＝7)。
20.图4.hpdyn近端启动子的10个cpg的甲基化。数据来自单个pcr片段的单分子深度测序(百分比 sem，发作性睡病患者n＝5，对照n＝6)。
21.图5.hhcrt启动子的荧光素酶测定。
22.数值为在3次不同转染(n＝9/载体(vector))上重复测量的3个孔的平均值，报告为参照未甲基化的载体的百分比。误差棒＝1sd。
具体实施方式
23.尽管在本发明的实施或测试中可以使用与本文描述的方法和材料相似或等同的方法和材料，但下面描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用整体并入本文。提供本文讨论的出版物和申请仅仅是因为其公开早于本技术的申请日。本文中的任何内容均不应被解释为承认本发明无权因在先发明而早于此类出版物。此外，材料、方法和示例仅是说明性的并不旨在限制。
24.在矛盾的情况下，以本说明书(包括定义)为准。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本文主题所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。如本文所用，提供以下定义以便于理解本发明。
25.贯穿本说明书对“一个方面”、“方面”、“另一个方面”、“具体方面”、“其组合”的引用是指结合本发明的方面描述的具体特征、结构或特性包括在本发明的至少一个方面中。因此，贯穿本说明书的各个地方出现的前述短语不一定都指相同的方面。此外，具体特征、结构或特性可以在一个或多个方面中以任何合适的方式组合。
26.术语“包含(comprise(s))”或“包含(comprising)”通常以包括(include(s))/包括(including)的含义使用，也就是说，允许存在一个或多个特征或组件/组分。术语“包含(comprise(s))”和“包含(comprising)”还分别包括更受限制的术语“由
……
组成(consist(s))”和“组成(consisting)”。
27.如在说明书和权利要求中所使用的，单数形式的不定冠词(“a”,“an”)和定冠词(“the”)包括了复数的所指物，除非上下文另有明确规定。
28.术语“约”，特别是关于给定的量，是指包括正负百分之十(10)( /-10％)的偏差。
29.如本文所用，“一种或多种”剂/化合物是指“至少一种”剂或化合物，例如两种、三种、四种、五种、六种等
……
剂/化合物的组合。
30.术语“治疗(treatment)和/或预防(prevention)”或“治疗(treating)和/或预防(preventing)”是指向受试者施用本公开内容的任何组合物、药物组合物、剂、化合物等...，其目的是：(i)预防疾病，即导致疾病的临床症状不发展；(ii)抑制疾病，即阻止临床症状的发展；和/或(iii)缓解疾病，即导致临床症状的消退。
31.在本发明的上下文中，所述疾病选自包括以下的组或由以下组成的组：神经性疾病、神经精神性疾病、神经退行性疾病和相关疾病或障碍。神经性疾病的非限制性实例通常选自包括以下的组或由以下组成的组：神经炎性疾病(例如多发性硬化、外伤性脑损伤、cns和脊髓的自身免疫性神经炎症)和中枢源性睡眠过度。优选地，所述神经性疾病是睡眠过度，最优选为发作性睡病，更优选为伴猝倒的发作性睡病，也称为1型发作性睡病或nt1。
32.神经行为障碍选自包括以下的组或由以下组成的组：自闭症谱系、脆性x综合征、adhd、外伤性脑损伤或其组合。
33.神经退行性疾病选自包括以下的组或由以下组成的组：阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、脊髓小脑性共济失调和肌萎缩性侧索硬化症或其组合。
34.神经精神性疾病选自包括以下的组或由以下组成的组：精神分裂症、抑郁症、双相情感障碍(bipolar disease)、焦虑症或其组合。
35.如本文所用，术语“受试者”/“有需要的受试者”或“患者”/“有需要的患者”在本领域中是公认的，并且在本文中可互换使用以指代哺乳动物，包括狗、猫、大鼠、小鼠、猴、牛、马、山羊、绵羊、猪、骆驼，并且最优选人类。在一些情况下，所述受试者是需要治疗的受试者或患有疾病或障碍的受试者。然而，在其他方面，所述受试者可以是正常的受试者。该术语不表示具体的年龄或性别。因此，旨在涵盖成年和新生儿受试者，无论是男性还是女性。优选地，所述受试者是人类，最优选地，患有神经性疾病、神经精神性疾病、神经退行性疾病和相关疾病或障碍的人类，或者可能处于神经性疾病、神经精神性疾病、神经退行性疾病以及相关的疾病或障碍的风险中的人类。在本发明的一个方面，所述受试者是患有以下的人类，处于患以下的风险中的人类：睡眠过度，最优选发作性睡病，更优选为伴猝倒的发作性睡病(也称为1型发作性睡病或nt1)。
36.本发明部分基于一些令人惊讶的结果，这些结果显示，表观遗传沉默而不是hcrt神经元丢失导致了发作性睡病。表观遗传机制包括dna甲基化、组蛋白修饰、染色质结构和microrna。dna甲基化和组蛋白修饰是基因沉默的主要机制。发明人已经评估了7名患有伴猝倒的发作性睡病受试者和7名对照受试者的外侧下丘脑dna提取物中hcrt的启动子甲基化。如图2和实施例所示，人类hcrt启动子含有13个cpg。测试了13个cpg位点中的12个(除了图2中的第一个cpg之外的所有)。在发作性睡病的受试者中，12个cpg中的8个(位置：-130、-190、-242、-249、-324、-327、-360和-416)显示出了较高的甲基化，以及一个为显著高度甲基化(位置-242)。
37.本发明的一个方面涉及用于治疗和/或预防神经性疾病、神经精神性疾病或神经性行为疾病、神经退行性疾病和相关疾病或障碍，优选发作性睡病和睡眠过度之用途的剂，其中所述剂调节下丘脑泌素神经肽前体(hcrt)基因转录起始上游5'区域内的至少一个甲基化位点的甲基化水平。优选地，所述剂降低人类下丘脑泌素神经肽前体(hcrt)基因的转录起始位点上游的5'区域内的至少一个甲基化位点的甲基化水平。
38.通常，人类下丘脑泌素神经肽前体(hcrt)基因的转录起始位点上游5'区域包含一种或多种与所述hcrt基因相关的调节元件。优选地，所述至少一个甲基化位点是人类下丘脑泌素神经肽前体(hcrt)基因的转录起始位点上游的cpg区域，最优选地，位于17号染色体上的人类下丘脑泌素神经肽前体(hcrt)基因的转录起始位点上游的碱基对-241和-242之间的cpg。最优选地，所述cpg区域位于pax5-ets1结合位点(ccggag)中。
39.如本文所用，睡眠过度是表现为白天过度嗜睡(eds)，而不是由夜间睡眠障碍或昼夜节律失调引起的疾病。中枢性睡眠过度包括伴有猝倒或不伴有猝倒的发作性睡病、反复发作的睡眠过度、伴有长睡眠时间或不伴有长睡眠时间的特发性睡眠过度、行为诱发的睡眠不足综合征、由于医疗条件引起的睡眠过度和发作性睡病，最后是物质摄入诱发的睡眠过度。
40.在一个方面，本发明的剂选自包括以下的组或由以下组成的组：化合物、肽或其类似物或衍生物、抗体或所述抗体的抗原结合片段和核酸，或它们的组合。
41.如本文所用，“化学化合物”是由于其化学组成及其对活组织和生物体的影响而产生变化的化合物。所述化学化合物可以是dna甲基化的小分子抑制剂(smi)或具有dna去甲基化特性的小分子抑制剂，优选为非肽基分子。
42.优选地，具有抑制dna甲基化或dna去甲基化特性的非肽基化学化合物选自包括以下的组或由以下组成的组：核苷dnmt抑制剂(例如5-氮杂胞苷(vidaza)、5-氮杂-2'-脱氧胞苷(decitabine或dacogen)、5-氟代-2'-脱氧胞苷和泽布拉林(zebularine))，非核苷dnmt抑制剂肼苯哒嗪(hydrazinophthalazine)衍生物(肼酞嗪(hydralazine)和双肼酞嗪(dihydralazine))、多酚(-)-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(egcg)和普鲁卡因酰胺，或其组合以及hauser et al.,2018中描述的那些。最优选地，所述小分子抑制剂是dna甲基转移酶抑制剂。
43.用于测试化合物(非肽基化学化合物、肽或核酸)的dna去甲基化特性的方法在本领域中是众所周知的，并且包括在de la cruz-hernandez et al.,2011或p
é
rez-c
á
rdenas et al.,2018中描述的那些中。
44.如本文所用，术语“肽”、“蛋白质”、“多肽”、“多肽的”和“肽的”可互换使用，以表示一系列呈线性或环状构象的氨基酸残基，其通过相邻残基的α-氨基和羧基之间的肽键相互连接。
45.术语本发明的肽的“衍生物”应理解为衍生自如本文所述的本发明的抑制肽的肽，例如肽的片段或加工形式，其中基础肽的活性部分未被修饰，例如功能片段。此外，众所周知，肽的n-端和/或c-端的变化不会对其功能产生很大影响，甚至可以使其稳定。因此，本发明还涵盖了在提及的肽的n-端和/或c-端不同的肽(即衍生物)。
46.如本文所用，术语“类似物”应理解为其中活性部分被修饰，例如，以包含一种或多种天然存在的和/或非天然存在的氨基酸的肽，条件是肽类似物是例如能够部分阻止或完全阻止下丘脑泌素神经肽前体(hcrt)基因转录起始上游5'区域内的至少一个甲基化位点与dna甲基转移酶之间的相互作用。例如，术语“类似物”涵盖了包含一个或多个保守氨基酸变化的抑制肽。在另一个实例中，“类似物”包含一种或多种d-氨基酸、d-氨基酸和l-氨基酸的组合以及本领域已知的多种非天然氨基酸(例如，α-甲基氨基酸、cα-甲基氨基酸和nα-甲基氨基酸等)以传达特殊性质)。在这方面，这种逆序-翻转(retroinverso)肽类似物可以任选地包括另外的组分，例如蛋白质转导结构域，其也可以是逆转化的(retroinverted)。
47.优选地，本发明的肽、其类似物或衍生物能够调节表观遗传机制。肽、类似物或衍生物可以直接与下丘脑泌素神经肽前体(hcrt)基因转录起始上游5'区域内的至少一个甲基化位点中的dna相互作用，导致链分离和基因转录的启动。这些肽、其类似物或衍生物通常包含四个氨基酸，并被称为短肽(参见例如janssens et al.,2019)。或者，所述肽、其类
似物或衍生物可以结合到下丘脑泌素神经肽前体(hcrt)基因转录起始上游的5'区域内的至少一个甲基化位点，使其不能被dna甲基转移酶接近，导致未甲基化的调节区和基因激活。所述肽可以是内源性的、食源性的、在环境(微生物、真菌等)中发现的或合成的。
48.在合成所述肽、其类似物或衍生物时，优选使用技术人员已知的化学方法合成(例如固相、液相或肽缩合或其任何组合)，并且可以包括天然氨基酸和/或非天然氨基酸。用于肽合成的氨基酸可以是利用merrifield,j.am.chem.soc.,85:2149-2154,1963的原始固相程序的去保护、中和、偶联和洗涤方案的标准boc(nα-氨基保护的nα-叔丁氧羰基)氨基酸树脂，或可以是由carpino和han,j.org.chem.,37:3403-3409,1972描述的碱不稳定的nα-氨基保护的9-芴甲氧羰基(fmoc)氨基酸。fmoc和boc nα-氨基保护的氨基酸都可以从各种商业来源获得，例如fluka、bachem、advanced chemtech、sigma、cambridge research biochemical、bachem，或peninsula labs。
49.本发明的肽、其类似物或衍生物可以直接或通过间隔(spacer)(例如通过一种或多种甘氨酸)结合至细胞膜可渗透载体。在这种情况下，所述细胞膜可渗透载体优选为肽，最优选为富含带正电荷的氨基酸的肽，例如富含精氨酸的肽。通常，富含精氨酸的肽选自包括hiv-tat 48-57肽、fhv-外壳35-49肽、htlv-ii rex 4-16肽和bmv gag 7-25肽的组。优选地，所述富含精氨酸的肽是hiv-tat 48-57肽。
50.如本文所用，术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，并且指任何种类的脱氧核糖核苷酸(例如dna、cdna
……
)聚合物或核糖核苷酸(例如rna、mirna、sirna、pirna、hnrna、snrna、sgrna、esirna、shrna、反义寡核苷酸
……
)聚合物或脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸(例如dna/rna)聚合物的组合，所述聚合物呈线性或环状构象，并且以单链或双链形式。这些术语不应被解释为对聚合物长度的限制，并且可以涵盖天然核苷酸的已知类似物，以及在碱基、糖和/或磷酸盐部分中进行了化学修饰的核苷酸。
51.本发明的核酸选自包括以下的组或由以下组成的组：编码本发明的mirna、sirna、pirna、hnrna、snrna、sgrna、esirna、shrna、肽、类似物、或其衍生物和反义寡核苷酸(例如，靶向dnmt酶的反义寡核苷酸，例如针对dnmt1 mrna反义的3'非翻译区的mg98反义寡核苷酸并在medina-franco et al.,2015中进行描述)，或它们的组合的核酸。
52.所述核酸或核苷酸的化学修饰可以包括对所述寡核苷酸的核碱基、主链残基和/或核苷间接头的修饰。
53.对所述寡核苷酸的一种或多种核碱基的修饰可以包括一种或多种烷基化的嘌呤和嘧啶、酰化的嘌呤和嘧啶，以及其他杂环。这些类别的嘧啶和嘌呤是本领域已知的，并且包括假异胞嘧啶(pseudoisocytosine)、n4,n4-乙基胞嘧啶(n4,n4-ethanocytosine)、8-羟基-n-6-甲基腺嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫脲嘧啶、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、n6-异戊基-腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、n6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、-d-mannosylqueosine、5-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2甲硫基-n-6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯、假尿嘧啶(psueouracil)、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2硫脲嘧啶、2-硫脲嘧啶、4-硫脲嘧啶、5-甲基尿嘧啶、n-尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯、尿嘧啶5-羟乙酸、辫苷(queosine)、2-硫代胞嘧啶、5-丙基尿
嘧啶、5-丙基胞嘧啶、5-乙基尿嘧啶、5-乙基胞嘧啶、5-丁基尿嘧啶、5-戊基尿嘧啶、5-戊基胞嘧啶和2,6,二氨基嘌呤、甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤和1-甲基胞嘧啶。
54.对所述核酸或寡核苷酸的一个或多个主链残基的修饰可以包括以下中的一种或多种：2'糖修饰，例如2'-o-甲基(2'-ome)、2'-o-甲氧基乙基(2'-moe)、2'-o-甲氧基乙氧基、2'-氟代(2'-f)、2'-烯丙基、2'-o-[2-(甲胺基)-2-氧乙基]、2'-o-(n-甲基氨基甲酸酯)；4'糖修饰，包括4'-硫代、4'-ch2-o-2'-桥接、4-(ch2)2-o-2'-桥接；锁核酸(lna)；肽核酸(pna)；嵌入核酸(ina)；扭转嵌入核酸(tina)；己糖醇核酸(hna)；阿拉伯糖核酸(ana)；环己烷核酸(cna)；环己烯核酸(cena)；苏糖基核酸(tna)；吗啉代寡核苷酸；gap-mer；mix-mer；并入富含精氨酸的肽；在合成rna中添加5'-磷酸；rna适配子；或它们的任何组合。
[0055]
对所述寡核苷酸的一种或多种核苷间接头的修饰可包括以下中的一种或多种：硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、苯胺硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)和苯胺磷酸酯(phosphoranilidate)，或它们的任何组合。
[0056]
通常，特定核苷酸的类似物具有相同的碱基配对特异性。即，a的类似物将与t进行碱基配对。例如，根据本发明的核酸可以通过包括一种或多种修饰的核苷(例如使用假u或5-甲基-c)来修饰以增强表达并降低可能的毒性。
[0057]
术语“microrna”、“mirna”和“mir”是可互换的，并且指的是能够调节基因表达的内源性或人工非编码rna。人们认为mirna通过rna干扰发挥作用，例如通过调节编码dnmt酶的基因表达。
[0058]
术语“sirna”和“短干扰rna”是可互换的，并且指的是能够诱导rna干扰的单链或双链rna分子。sirna分子通常具有长度为18至30个碱基对的双链体(duplex)区域。在一个方面，sirna干扰dnmt酶的rna。
[0059]
术语“pirna”和“piwi-相互作用rna”是可互换的，并且指的是一类参与基因沉默的小rna。pirna分子的长度通常为26至31个核苷酸。在一个方面，pirna干扰dnmt酶的rna。
[0060]
术语“snrna”和“小核rna”是可互换的，并且指的是一类参与包括rna剪接和转录因子的调节的多个过程的小rna。还包括小核仁rna(snorna)的亚类。该术语还旨在包括人工snrna。在一个方面，snrna干扰dnmt酶的rna。
[0061]
术语“aso”和“反义寡核苷酸”是可互换的，并且指的是能够通过靶向编码dnmt酶的mrna来调节基因表达的内源性或人工非编码rna。aso的实例包括gapmer(参见yokota和maruyama，2020)。
[0062]
如本文所用，“抗体”是与特定抗原决定簇或表位反应的蛋白质分子并且基于结构特性属于一个或五个不同类别：iga、igd、ige、igg和igm。抗体可以是多克隆抗体(如多克隆血清)或单克隆抗体，包括但不限于全组装抗体(fully assembled antibody)、单链抗体、抗体片段和嵌合抗体、人源化抗体，只要这些分子仍然具有生物活性并且仍然结合至至少一种本发明的肽。优选地，所述抗体是单克隆抗体。优选地，所述单克隆抗体还将选自包括igg1、igg2、igg2a、igg2b、igg3和igg4或其组合的组。最优选地，所述单克隆抗体选自包括igg1、igg2、igg2a和igg2b或其组合的组。优选地，本发明的抗体是用作所述dnmt酶的活性抑制剂的抗dnmt酶抗体。
[0063]“抗原结合片段”包含全长抗体的一部分。抗原结合片段的实例包括fab、fab'、f
(ab')2和fv片段；双特异抗体(diabody)；小分子抗体(minobody)；纳米抗体；线性抗体(zapata et al.(1995)protein eng.8(10):1057-1062)；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
[0064]
本发明还预期了质粒或载体(vector)，优选为基因递送载体或质粒，其包含以下或由以下组成：一种或多种编码本发明的mirna、sirna、pirna、hnrna、snrna、esirna、shrna或反义寡核苷酸或其组合的核酸。如本文所用，“载体”能够将核酸序列转移至靶细胞，并且优选地选自包括以下或由以下组成的组：病毒载体、非病毒载体、微粒载体(carrier)和脂质体或其组合。
[0065]
合适的载体包括sv40的衍生物和已知的细菌质粒，例如，大肠杆菌质粒col el、pcr1、pbr322、pmb9及它们的衍生物，质粒如rp4；噬菌体dna，例如噬菌体x的众多衍生物，例如nm989，和其他噬菌体dna，例如ml 3和丝状单链噬菌体dna；酵母质粒如2μ质粒或其衍生物；可用于真核细胞的载体，例如可用于昆虫细胞或哺乳动物细胞的载体；衍生自质粒和噬菌体dna的组合的载体，例如已经被修饰以使用噬菌体dna或其他表达控制序列的质粒；等等。
[0066]
多种病毒载体用于在体外或体内将核酸递送至细胞。非限制性实例是基于疱疹病毒、痘病毒、腺相关病毒、慢病毒等的载体。原则上，它们都适合递送包含编码本发明的mirna、sirna、pirna、hnrna、snrna、esirna、shrna和反义寡核苷酸的可表达核酸分子的表达盒。在一个优选方面，所述病毒载体是腺病毒载体，优选地可复制型腺病毒。
[0067]
或者，本发明的基因递送载体，优选病毒载体，被公布用于递送基因编辑系统，例如大范围核酸酶、锌指核酸酶(zfn)、基于转录激活因子样效应物的核酸酶(talen)或基于crispr的系统，所述载体包含i)至少一种sgrna、或crrna和tracrrna，其靶向人类下丘脑泌素神经肽前体(hcrt)基因的转录起始位点上游5'区域内的调节序列，ii)结构引导的核酸内切酶，例如rna引导的核酸内切酶，以及ii)结构引导的包括用dna甲基化修饰酶dnmt或tet灭活的cas9(dcas9-dnmt/tet)。
[0068]
如本文所述，人类下丘脑泌素神经肽前体(hcrt)基因的转录起始位点上游的5'区域包含一种或多种与所述hcrt基因相关的调节元件。优选地，所述至少一个甲基化位点位于人类下丘脑泌素神经肽前体(hcrt)基因的转录起始位点上游的碱基对-241和-242之间的cpg区域中。最优选地，所述cpg区域位于pax5-ets1结合位点(ccggag)中，该位点将被至少一种sgrna或crrna和tracrrna靶向。
[0069]
可以使用任何合适的天然存在的或工程化的rna引导的核酸内切酶，只要它可有效地特异性结合本发明的人类下丘脑泌素神经肽前体(hcrt)基因的转录起始位点上游5'区域内的调控序列并且它可以选自包括cas9、cpf1和fen-1的非限制性的组。优选地，所述rna引导的核酸内切酶是催化失活的rna引导的核酸内切酶，最优选催化失活的cas9(dcas9)。
[0070]
更优选地，诸如dcas9的所述催化失活的rna引导的核酸内切酶与一种或多种dna甲基化修饰酶例如dnmt或tet融合，从而允许dna甲基化的靶向修饰(如在xu et al.,2016和liu et al.,2019中所述，其公开内容通过引用并入本文)。
[0071]
本发明还预期了宿主细胞，其包含本发明的质粒或载体或一种或多种编码本发明的mirna、sirna、pirna、hnrna、snrna、sgrna、esirna、shrna和/或反义寡核苷酸的核酸。所
述宿主细胞可以是任何原核细胞或真核细胞，优选地，所述宿主细胞是真核细胞，最优选地，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。甚至更优选地，所述宿主细胞是人类神经元细胞、神经胶质细胞和/或干细胞(例如ipsc)。
[0072]
本发明还提供了药物组合物，其包含治疗有效量的i)调节人类下丘脑泌素神经肽前体(hcrt)基因的转录起始位点上游5'区域内的至少一个甲基化位点的甲基化水平的剂，或ii)本发明的质粒或载体，或iii)本发明的宿主细胞，以及药学上可接受的载体和/或稀释剂。
[0073]
优选地，所述剂是如本文所述的化学化合物、肽或其类似物、抗体或所述抗体的抗原结合片段或核酸。
[0074]
如本文所用，术语“治疗有效量”是指在合理的医疗判断范围内，本发明的药物组合物的量足够高以显著积极地改变待治疗的症状和/或病症，但又足够低以避免严重副作用(以合理的风险/收益比率)。
[0075]
本发明的药物组合物的治疗有效量根据多种因素来选择，包括患者的类型、物种、年龄、体重、性别和医疗状况；待治疗病症的严重程度；施用途径；患者的肾功能和肝功能。本领域技术普通的医生可以容易地确定和开出预防、抵抗或阻止神经性疾病、神经精神性疾病、神经退行性疾病和相关疾病或障碍，优选发作性睡病的进展所需的药物的有效量。
[0076]
如本文所述的本发明的药物组合物的治疗有效量将根据所治疗的受试者和具体的施用方式而变化。例如，预期用于人类口服施用的延时释放制剂可包含约0.10mg至500mg的活性材料，其与合适且方便的量的载体材料复合，所述量可在总组合物的约5％至约95％变化。优选制备提供易于测量的施用量的药物组合物。通常，全身施用的治疗有效量为约0.1mg/kg至约100mg/kg，并取决于多种因素，包括例如受试者(例如，哺乳动物，例如人)的年龄和体重、需要治疗的确切病症及其严重程度、施用途径，并且最终将由主治医师或兽医自行决定。如本文所述，本发明的药物组合物的治疗有效量也将根据患者的乙酰化表型而变化。
[0077]
优选地，每天、每周或每月，例如每天，向受试者施用一次或多次剂量，例如每天1次至10次，或更多次(例如，每天1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次)。一旦与对照样本或参考范围相比，临床症状停止和/或下丘脑泌素(1型和/或2型)的水平和/或浓度被认为是正常的，将停止施用。本公开预期了能够确定下丘脑泌素(1型和/或2型)的水平和/或浓度的任何方法。
[0078]
本发明的药物组合物的合适施用途径包括肠胃外施用(例如皮下(sc)、腹膜内(ip)、肌内(im)、静脉内(iv)或输注)，口服的和肺部的，鼻腔的，局部的，透皮的，和栓剂。在所述组合物通过肺部递送施用的情况下，调整治疗有效剂量以使剂的可溶性水平等同于通过肠胃外施用(例如sc、ip、im或iv)的治疗有效剂量可获得的可溶性水平。在本发明的一些优选方面，所述药物组合物通过iv或鼻腔递送来施用。
[0079]
在本发明的其他方面，本发明的药物组合物是i)持续释放(sustained-release)制剂，或使用持续释放装置施用的制剂，ii)控制释放制剂或iii)缓慢释放(slow release)制剂。持续释放装置在本领域中是众所周知的，并且包括例如透皮贴剂和微型植入泵，它们可以以连续、稳态的方式以各种剂量随时间提供药物递送，以实现非持续释放药物组合物的持续释放效果。控制释放制剂和缓慢释放制剂也是本领域公知的。
[0080]“药学上可接受的载体或稀释剂”是指可用于制备药物组合物的载体或稀释剂，它们通常是安全的、无毒的和理想的，并且包括人类药用途可接受的载体或稀释剂。
[0081]
此类药学上可接受的载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油来源、动物来源、植物来源或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当所述药物组合物是静脉内施用时，水是优选的载体。生理盐水溶液以及葡萄糖和甘油水溶液也可以用作液体载体，特别是用于可注射溶液。
[0082]
药学上可接受的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。
[0083]
还预期了配制为用于将本发明的剂穿过血脑屏障(bbb)递送至大脑的药物组合物。这些药物组合物可包含例如i)由例如用聚山梨醇酯80或泊洛沙姆188包裹的聚(氰基丙烯酸丁酯)(pbca)或聚(乳酸-羟基乙酸共聚物)(plga)制成的纳米载体和纳米颗粒，以使本发明的化学化合物能够运输，ii)病毒载体，以使本发明的核酸能够运输，iii)外泌体或脂质体，iv)分子载体——也称为bbb梭(shuttle)(例如特洛伊木马抗体)，或v)如本文所述与peg和/或细胞膜载体结合的本发明的肽或类似物。
[0084]
所述药物组合物还可含有一种或多种药学上可接受的盐，例如无机酸盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；以及有机酸盐，如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。此外，本文中也可以存在辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、ph缓冲物质、凝胶或凝胶化材料、调味剂、着色剂、微球、聚合物、悬浮剂等。此外，还可以存在一种或多种其他常规的药物成分，例如防腐剂、保湿剂、悬浮剂、表面活性剂、抗氧化剂、抗结块剂、填充剂、螯合剂、包衣剂、化学稳定剂等，特别是如果剂型是可重构的形式。合适的示例性成分包括宏晶纤维素、羧甲基纤维素钠、聚山梨醇酯80、苯乙醇(phenyletbyl alcohol)、氯丁醇(chiorobutanol)、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯、乙基香草醛、甘油、苯酚、对氯苯酚、明胶、白蛋白及其组合。remington's pharmaceutical sciences(mack pub.co.,n.j.1991)中对药学上可接受的赋形剂进行了详尽的讨论，其通过引用并入本文。
[0085]
在一个方面，所述药物组合物还包含可以同时施用、分开施用或交错施用的一种或多种另外的治疗剂。所述一种或多种另外的治疗剂可以是任何药物组合物，特别是可用于治疗和/或预防神经性疾病、神经精神性疾病、神经退行性疾病，优选发作性睡病和相关疾病或障碍的任何药物组合物。
[0086]
优选地，所述一种或多种另外的治疗剂是组蛋白脱乙酰酶(hdac)剂，其通常选自包括以下的组或由以下组成的组：化学化合物、肽或其类似物和核酸(参见例如janssens et al.2019和hauser et al.,2018，其公开内容通过引用并入本文)。在所述组蛋白脱乙酰酶剂是非肽基化学化合物的情况下，其将选自包括以下的非限制性组或由以下组成的非限制性组：丙戊酸、丁酸钠、烟酰胺、伏立诺他、曲古抑菌素、givinostat和类似剂，或其组合。
[0087]
具有组蛋白脱乙酰酶特性的肽或其类似物将选自包括以下的非限制性组或由以下组成的非限制性组：romidepsin、burkholdacs、spiruchostatins、thailandepsin、fr901375、largazole、plitidepsin、chlamydocin、trapoxins、chap、apidicin、microsporins、azumamides、fr235222和as1387392，或其组合。
[0088]
本发明还提供了本发明的组合物和药物组合物在制备用于治疗和/或预防神经性
疾病、神经精神性疾病、神经退行性疾病，优选发作性睡病和相关疾病或障碍的药物中的用途。
[0089]
本发明还提供了一种在有需要的受试者中治疗和/或预防神经性疾病、神经精神性疾病、神经退行性疾病，优选发作性睡病和相关疾病或障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的一种或多种药物组合物，所述一种或多种药物组合物包含i)调节人类下丘脑泌素神经肽前体(hcrt)基因的转录起始位点上游5'区域内的至少一个甲基化位点的甲基化水平的剂，或ii)本发明的质粒或载体，或iii)本发明的宿主细胞，以及药学上可接受的载体和/或稀释剂。
[0090]
在一个方面，治疗和/或预防的方法还包括施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含一种或多种一种或多种另外的治疗剂，特别是可用于治疗和/或预防神经性疾病、神经精神性疾病、神经退行性疾病，优选发作性睡病和相关疾病或障碍的任何药物组合物。
[0091]
优选地，所述一种或多种另外的治疗剂是组蛋白脱乙酰酶(hdac)剂。
[0092]
本发明的组合物或药物组合物是同时施用的、分开施用的或交错施用的。
[0093]
联合或同时施用可以包括共同施用，以单一药物制剂或使用单独制剂，或以任一顺序但通常在一段时间内连续施用以使所有活性剂可以同时发挥其生物活性。此类剂的制备和剂量方案可根据制造商的说明使用或由熟练的从业人员凭经验确定。
[0094]
本公开还公开了一种用于在生物样本中检测神经性疾病、神经精神性疾病、神经退行性疾病，优选发作性睡病和相关疾病或障碍的方法，所述方法包括(a)确定下丘脑泌素(1型和/或2型)的水平和/或浓度，其中当与对照样本相对比时，所述下丘脑泌素(1型和/或2型)的低水平和/或低浓度指示所述受试者容易发展为或患有神经性疾病、神经精神性疾病、神经退行性疾病，优选发作性睡病和相关疾病或障碍。
[0095]
还公开了一种用于在受试者的生物样本中检测发作性睡病，优选伴猝倒的发作性睡病的方法，所述方法包括
[0096]
a)确定qrfp的水平和/或浓度，其中当与对照样本相对比时，所述qrfp的低水平和/或低浓度指示所述受试者容易发展为或患有神经性疾病、神经精神性疾病、神经退行性疾病和相关疾病或障碍，
[0097]
确定qrfp或下丘脑泌素(1型和/或2型)的水平和/或浓度包括确定蛋白质或它们各自的转录物(mrna)的水平和/或浓度。
[0098]
qrfp或下丘脑泌素(1型和/或2型)蛋白质的检测包括确定所述蛋白质的存在、量和/或水平。非限制性的检测和检查方法包括一维凝胶电泳和二维凝胶电泳，elisa，高效液相色谱(hplc)，质谱(ms)相关技术例如ms-ms、基质辅助激光解吸/电离飞行时间ms、表面增强激光解吸/电离飞行时间ms、液相色谱-ms、各种抗体阵列、多重珠分析、nmr、蛋白质印迹分析等。
[0099]
可以使用适合检测生物样本中的转录物表达水平的任何技术来测量或确定生物样本中qrfp或下丘脑泌素(1型和/或2型)转录物的水平和/或浓度。在本发明的方法中用于确定来自生物样本的细胞中的转录物表达水平的合适技术(例如，northern印迹分析、rt-pcr、定量rt-pcr、microrna微阵列、原位杂交、下一代测序(ngs))是本领域技术人员所周知的。
[0100]
或者，可以通过测量cdna、扩增的rna或dna的丰度水平，或通过测量rna或指示转录物的表达水平的其他分子的量或活性来间接测量或确定生物样本中转录物的水平。优选地，在本发明的方法中，通过测量cdna的丰度水平来间接确定生物样本中转录物的水平。
[0101]
上文公开的检测方法还包括步骤(c)：施用至少一种药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的i)调节本文所述的人类下丘脑泌素神经肽前体(hcrt)基因的起始转录位点上游5'区域内的至少一个甲基化位点的甲基化水平的剂，或ii)本发明的质粒或载体，或iii)本发明的宿主细胞，以及药学上可接受的载体和/或稀释剂。
[0102]
如本文所用，“生物样本”是指从受试者分离的一种或多种细胞、组织或液体的样本，包括但不限于例如血液，血浆，血清，粪便，尿液，骨髓，胆汁，脑脊液，淋巴液，皮肤样本，皮肤、呼吸道、肠道和泌尿生殖道外部分泌物，泪液，唾液，乳汁，血细胞，器官，活检组织以及体外细胞培养成分的样本，包括但不限于由细胞和组织在培养基中生长产生的条件培养基，例如重组细胞和细胞成分。优选地，所述生物样本是液体，最优选地，所述生物样本是脑脊液。
[0103]
本公开还公开了一种计算机实施方法，用于检测如上所述的神经性疾病、神经精神性疾病、神经退行性疾病，优选发作性睡病和相关疾病或障碍。
[0104]
本领域的技术人员将理解，本文描述的发明是易于进行除了具体描述的那些之外的变化和修改。应当理解，本发明包括所有不背离其本质或基本特征的这些变化和修改。本发明还包括在本说明书中单独或共同提及或指示的所有步骤、特征、组合物和剂，以及所述步骤或特征的任何和所有组合或任何两个或更多个。因此，本公开在所有方面都被认为是说明性的而不是限制性的，本发明的范围由所附权利要求表明，并且等同的含义和范围内的所有变化都旨在包含在其中。在本说明书中引用了多篇参考文献，其中的每一篇都通过引用整体并入本文。参考以下实施例将更充分地理解前述描述。
[0105]
实施例
[0106]
材料和方法
[0107]
脑组织，dna制备
[0108]
通过国际合作者获得来自7名发作性睡病患者和7名对照(4名患者和4名对照来自美国，2名患者和2名对照来自法国，以及1名患者和1名对照来自荷兰)的外侧下丘脑的福尔马林固定的切片(2至4张切片/受试者)。用pbs洗涤切片，并用aiamp dna ffpe组织试剂盒(qiagen)提取基因组dna。对于基因表达，如在honda，2009中所述，从4名发作性睡病患者和4名对照的新鲜冷冻的外侧下丘脑提取rna。
[0109]
dna甲基化分析
[0110]
使用epitect fast dna bisulfite试剂盒(qiagen)用亚硫酸氢钠处理500ng的dna。巢式pcr的引物(hcrt有2个片段，pdyn有1个)是用methprimer设计的(li和dahiya，2002)(表1)。
[0111]
表1.本研究中使用的亚硫酸氢盐引物。
[0112][0113][0114]
使用两种方法来量化cpg甲基化。在第一种方法中，凝胶纯化pcr扩增子，然后进行sanger测序。通过esme软件分析序列跟踪文件(lewin et al.,2004)，得到每个cpg的平均甲基化。在第二种方法中，将纯化的pcr扩增子(100ng)用于制备测序文库，并对truseq nano dna lt文库制备试剂盒(illumina)进行了以下修改。纯化的亚硫酸氢盐pcr产物没有被剪切，而是直接进行末端修复，然后用1.8x的比例的单轮纯化珠进行清理。后续步骤严格遵循标准协议。使用荧光法(qubit，thermo fischer)对文库进行量化，并使用片段分析仪(agilent)评估它们的尺寸模式。制备每个文库的等摩尔池并在10pm时上机((加入25％的phix以产生测序多样性)，用于在miseq仪器(illumina)上使用v2试剂盒运行150个循环的双端测序。使用bcl2fastq转换软件(2.20版，illumina)对测序数据进行解复用。进行质量控制以仅保留可以重建的读对(read-pairs)(59％至67％的读段)。平均而言，每个受试者(par subject)获得了287,852个读段(范围为219,476至349,712个读段)。考虑到亚硫酸氢盐处理引起的c到t变化，从参照序列制备了权重矩阵图谱，并使用pftool的pfsearch将读段与图谱对齐。产生了一个汇总表，计算了沿感兴趣片段的每个核苷酸的出现次数，并计算甲基化c核苷酸的比率作为每个位置的甲基化百分比。
[0115]
hcrt启动子克隆和定点诱变
[0116]
将转录起始位点上游的人类hcrt启动子的1800个碱基对克隆到萤火虫荧光素酶序列上游的pcpg-basic载体(来自michael rehli博士实验室的礼物)的多个克隆位点上。
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